Ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thủy phân Protein từ phụ phẩm cá lưỡi trâu bằng Enzyme Alcalase

106 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC
ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN TỪ 
PHỤ PHẨM CÁ LƯỠI TRÂU BẰNG ENZYME ALCALASE
EFFECTS OF FACTORS ON PROTEIN HYDROLYSIS OF TONGUEFISH PROECESSING 
BY-PRODUCTS BY ENZYME ALCALASE
Nguyễn Chí Thanh¹,²*, Nguyễn Ngọc Hà²,³, Nguyễn Phúc Cẩm Tú³,²
Ngày nhận bài: 29/07/2019; Ngày phản biện thông qua: 23/11/2019; Ngày duyệt đăng: 16/12/2019
TÓM TẮT
Thủy phân phụ phẩm thủy sản bằng phương pháp hóa học/enzyme để tận dụng protein là một hướng 
nghiên cứu đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Trong đó nghiên cứu, xác định các yếu tố ảnh hưởng đến 
quá trình thủy phân là việc quan trọng để thu được kết quả tối ưu nhất. Một trong những chỉ tiêu quan trọng 
để đánh giá hiệu quả của quá trình thủy phân là độ thủy phân (DH). Nghiên cứu này được thực hiện nhằm 
đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme/cơ chất và thời gian thủy phân lên quá trình thủy phân phụ 
phẩm cá lưỡi trâu bằng enzyme Alcalase. Phụ phẩm được thủy phân bằng enzyme Alcalase 2L ở ba mức nhiệt 
độ (50oC, 55oC và 60oC), ba mức pH (7, 8 và 9), ba tỷ lệ enzyme/cơ chất (0,05%, 0,1% và 0,2%) và tiến hành 
xác định DH tại các thời điểm 0h, 2h, 4h và 6h. Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng protein trong phụ phẩm 
chế biến cá lưỡi trâu là 18,74%. Đây là nguồn nguyên liệu có tiềm năng dùng trong sản xuất thủy phân/cô đặc. 
Kết quả của nghiên cứu này cho thấy điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân phụ phẩm cá lưỡi trâu bằng 
enzyme Alcalase 2L là ở nhiệt độ 60oC, pH 8 và tỷ lệ enzyme/cơ chất 0,2% và cho mức DH cao nhất là 33,42%.
Từ khóa: độ thủy phân, nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme/cơ chất.
ABSTRACT
Enzymatic or chemical hydrolysis of by-products from aquatic product processing is one of science’s 
most promising fi elds. Of which, a determination of effects of factors on hydrolysis plays an important role in 
optimizing hydrolysis. The objective of this study was to evaluate effects of temperature, pH value, enzyme/
substance ratios and time on hydrolysis of tonguefi sh processing by-products by enzyme Alcalase. The 
tonguefi sh by-product was hydrolyzed by Alcalase 2L in turn at three temperature (50oC, 55oC and 60oC), three 
pH values (7, 8 and 9) and three enzyme/substance ratios (0.05%, 0.1% and 0.2%) and degree of hydrolysis 
was determined at 0, 2, 4 and 6 h. The results showed that protein content in tonguefi sh by-product was 18.74%, 
suggesting that this is a potential material in protein hydrolysate/concentrate production. A temperature of 
60°C, pH of 8.0 and enzyme to substrate level of 0.2% were found to be the optimum conditions to obtain the 
highest degree of hydrolysis (33.42%) using Alcalase 2L for hydrolysis of tonguefi sh by-product.
Keywords: degree of hydrolysis, enzyme/substance ratios, pH, temperature.
¹ Viện Công nghệ Nano, Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh 
² Khoa Thủy sản, Trường Đại học Nông lâp Tp. Hồ Chí Minh
³ Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, 
Trường Đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy 
Sản Việt Nam (VASEP), kim ngạch xuất khẩu 
thủy sản năm 2018 ước đạt 9 tỷ USD, tăng 
8,4% so với năm 2017, đóng góp quan trọng 
vào tăng trưởng của toàn ngành nông nghiệp 
(Nguyễn Kiểm, 2019); trong đó cá lưỡi trâu 
(thờn bơn, Cynoglossus sp.) là một trong những 
mặt hàng xuất khẩu quan trọng. Cá lưỡi trâu 
thường được chế biến thành các sản phẩm đông 
lạnh như nguyên con, philê thanh, philê ống, 
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 107
philê ghép miếng, Định mức thu hồi của sản 
phẩm cá lưỡi trâu philê đông lạnh là 2,85, như 
vậy chỉ có khoảng 35% khối lượng sản phẩm 
thu được so với nguyên liệu ban đầu; còn lại 
là phụ phẩm bao gồm đầu, xương, nội tạng, 
da (chiếm 65%) (Lê Hoàng Trí, 2014). Trong 
phụ phẩm chế biến thủy sản nói chung và cá 
lưỡi trâu nói riêng có rất nhiều thành phần có 
giá trị như protein, gelatin, collagen, Thông 
thường, các loại phụ phẩm này được chế biến 
thành các sản phẩm có giá trị gia tăng thấp như 
phân bón, bột cá, Tuy nhiên, các loại phụ 
phẩm này rất giàu protein có thể dùng để sản 
xuất protein thủy phân/cô đặc. Nhiều nghiên 
cứu khoa học trên thế giới đã chỉ ra rằng dịch 
thủy phân protein từ phụ phẩm thủy sản có 
chứa hàm lượng acid amin khá cao và có giá trị 
về mặt sinh học (Hoyle và Merritt, 1994; Lian 
và ctv, 2005; Kechaou và ctv, 2009; Herpandi 
và ctv, 2012). Thủy phân protein từ phụ phẩm 
thủy sản thường được thực hiện bằng các 
phương pháp sinh học, đặc biệt là bằng enzyme 
thương mại. Alcalase, protease kiềm được sản 
xuất từ vi khuẩn Bacillus licheniformis, được 
xem là một trong những loại enzyme tốt nhất 
dùng trong quá trình sản xuất dịch thủy phân 
cá (Guérard và ctv, 2001; Klompong và ctv, 
2008; Ovissipour và ctv, 2009b; Ovissipour 
và ctv, 2010). Tuy nhiên, đối với mỗi loại phụ 
phẩm khác nhau, chúng ta cần phải xác định 
các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân 
bằng enzyme Alcalase. Vì vậy, nghiên cứu này 
được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của 
ba yếu tố nhiệt độ, pH và tỷ lệ enzyme/cơ chất 
lên hiệu quả của quá trình thủy phân phụ phẩm 
cá lưỡi trâu bằng enzyme Alcalase thông qua 
các chỉ tiêu đạm formol (N
formol
), đạm ammonia 
(N
ammonia
), đạm amin (N
amin
) và độ thủy phân 
(DH).
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU
1. Nguyên vật liệu
Phụ phẩm cá lưỡi trâu (Cynoglossus sp.) 
dùng trong nghiên cứu thủy phân được thu 
nhận từ quy trình philê cá lưỡi trâu của Công 
ty Thủy sản số 5, Khu Công nghiệp Vĩnh Lộc, 
Q. Bình Tân, Thành phố Hồ Chí Minh (Tp. 
HCM). Thành phần phụ phẩm bao gồm đầu, 
xương, da, nội tạng của cá. Nguyên liệu được 
thu nhận trực tiếp từ xưởng chế biến và được 
vận chuyển ngay bằng thùng xốp cách nhiệt có 
bảo quản nước đá ở nhiệt độ < 5oC về phòng thí 
nghiệm Khoa Thủy sản, Trường Đại học Nông 
Lâm Tp. HCM. Nguyên liệu được loại bỏ các 
tạp chất, rửa sạch, để ráo nước và được chuẩn 
bị một lần để sử dụng trong suốt quá trình 
nghiên cứu. Nguyên liệu được xay nhuyễn, 
chia thành các gói nhỏ 200 g và đem bảo quản 
đông ở nhiệt độ là -18 ± 2oC.
Enzyme protease sử dụng để thủy phân là 
enzyme Alcalase hoạt độ 2 AU/g và được bảo 
quản ở nhiệt độ 5oC.
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm gồm ba yếu tố là nhiệt độ, pH và 
tỷ lệ enzyme/cơ chất và được bố trí theo kiểu 
hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức (NT) 
lặp lại ba lần. Mỗi mẫu chứa 8 g protein được 
xay nhuyễn trong 200 mL dung dịch đệm borat 
(với các giá trị pH khác nhau), bổ sung thêm 
enzyme (theo tỷ lệ) và tiến hành thủy phân ở 
các mức nhiệt độ khác nhau theo các điều kiện 
như trong Bảng 1. Tiến hành lấy mẫu lúc thời 
gian thủy phân là 0h, 2h, 4h và 6h. Sau khi lấy 
mẫu, bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85oC trong 
15 phút và tiến hành xác định thành phần đạm 
trong dịch thủy phân (N
amin
, N
ammonia
 và N
formol
) 
và độ thủy phân và thu được ở mỗi thời điểm.
Bảng 1. Các điều kiện thủy phân trong thí nghiệm
Enzyme Nhiệt độ (oC) pH Tỷ lệ enzyme/cơ chất (%)
Alcalase
50 7 0 ,05
55 8 0,10
60 9 0,20
108 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
2.2. Phương pháp xác định hàm lượng protein 
Xác định hàm lượng protein bằng phương 
pháp Kjeldah. Phương pháp Kjeldahl dựa trên 
nguyên lý chuyển toàn bộ N hữu cơ thành 
muối ammonium bằng cách công phá bằng 
H2SO4 đậm đặc (xúc tác bằng hỗn hợp CuSO4 
và K2SO4). Xác định hàm lượng NH4
+ bằng 
thiết bị Kjeldahl khi cho muối ammonium tác 
dụng với dung dịch NaOH, thu được NH3 bằng 
dung dịch acid boric (H3BO3) và chuẩn độ 
amon borat bằng H2SO4 0,05N. Sử dụng hỗn 
hợp chỉ thị màu methyl đỏ với bromocresol để 
mở rộng khoảng đổi màu và phối hợp màu để 
nhận biết sự đổi màu rõ rệt hơn.
Hàm lượng Nitơ tổng số trong dung 
dịch thủy phân được tính theo công thức:
N% = ((V
s
-VB) × NH2SO4 × 14,01) / (V × 10) 
(g/L)
Protein = N% × 6,25 (g/L)
Trong đó:
V: Thể tích mẫu mang đi phân tích 
(mL)
V
S
: Thể tích dung dịch acid sử dụng để 
chuẩn độ mẫu (mL)
VB: Thể tích dung dịch acid sử dụng để 
chuẩn độ mẫu trắng (mL)
N: Nồng độ đương lượng của H2SO4.
2.3. Phương pháp xác định đạm ammonia
Do hàm lượng đạm ammonia trong dịch 
thủy phân không cao, nên N
ammonia
 được xác 
định bằng phương pháp so màu. Quá trình 
chưng cất được tiến hành như sau: 5 mL dịch 
mẫu thủy phân được cho vào ống chưng cất 
+ 0,5 gam (MgCO3)4×Mg(OH)2. 5H2O + 5 
giọt phenolphthalein pH = 8,1 với mục đích 
ổn định pH của dịch thủy phân. Trong môi 
trường kiềm yếu, đạm ammonia có trong dịch 
thủy phân sẽ giải phóng khí NH3 được hấp 
thụ bởi H2SO4 0,02N. Hỗn hợp dung dịch thu 
được sau quá trình chưng cất sẽ được định 
mức thành 200 mL và tiến hành phân tích 
bằng phương pháp phenate để xác định lượng 
N
ammonia
 có trong dịch thủy phân.
2.4. Phương pháp xác định độ thủy phân phụ 
phẩm cá
Mẫu được thu ở từng thời điểm khác nhau 
của quá trình thủy phân. Do đặc tính của 
mẫu là phế phẩm cho nên phương pháp xác 
định DH được dùng là phương pháp chuẩn 
độ formol. Xác định đạm formol trong dịch 
thủy phân bằng cách lấy 2 mL dịch thủy phân 
được cho vào ống ly tâm 50 mL và được định 
mức thành 5 mL, chỉnh pH = 8,1 bằng NaOH 
0,25N. Sau đó, thêm 5 mL formaldehyde 
35% đã được điều chỉnh pH = 8,1 vào dịch 
mẫu và ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 phút. 
Tiến hành chuẩn độ lại với NaOH 0,25N và 
ghi nhận lại thể tích NaOH sử dụng.
N 
formol
 = ( V
NaOH
 * N
NaOH
 × 14,01) / (V
mẫu
 ×1000) (mg/L)
N
amin
 = N
formol
 – N
ammonia 
(mg/L)
DH (%) = 
Trong đó:
N 
formol
: Hàm lượng đạm formol có trong 
mẫu (mg/L)
V 
NaOH
: Thể tích NaOH chuẩn độ 0,25N 
(mL)
N 
NaOH
: Nồng độ đương lượng của NaOH
V 
mẫu
: Thể tích mẫu chuẩn độ formol (mL)
2.5. Các phương pháp xử lý số liệu
Các chỉ tiêu đạm formol, đạm ammonia, 
đạm amin và độ thủy phân được phân tích bằng 
phân tích phương sai ba yếu tố mẫu đo lường 
lặp lại (repeated measures ANOVA) với các yếu 
tố nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme/cơ chất là yếu tố 
chính và thời diểm lấy mẫu là đo lường lặp lại. 
Mức xác suất p < 0,05 được chấp nhận như tiêu 
chuẩn đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa thống 
kê. Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện 
bằng phần mềm IBM SPSS version 19.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Kết quả khảo sát hàm lượng đạm tổng 
trong mẫu phụ phẩm
Hàm lượng protein trong phụ phẩm cá lưỡi 
trâu được thể hiện trong Bảng 2. Hàm lượng 
protein trong phụ phẩm cá lưỡi trâu tương tự 
hoặc cao hơn các loại phụ phẩm của các loài 
cá khác như: cá capelin là 13,9% (Shahidi và 
ctv, 1995), cá tầm là 15,48% (Ovissipour và 
ctv, 2009a), cá ngừ là 20% (Ovissipour và ctv, 
2010).
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 109
Bảng 2. Hàm lượng protein tổng số trong mẫu phụ phẩm cá lưỡi trâu
Nitrogen tổng số (%) Protein thô (%)
3,00 ± 0,11† 18,75 ± 0,65
2,91 – 3,17‡ 18,2 – 19,8
† trung bình ± độ lệch chuẩn; ‡ khoảng biến thiên.
dùng Alcalase đạt 22% ở 65oC. Trong khi 
đó, khi thủy phân phụ phẩm cá thu Thái 
Bình Dương (Merluccius productus) bằng 
enzyme Alcalase ở các mức nhiệt độ khác 
nhau, Benjakul và Morrissey (1997) ghi 
nhận hoạt độ của Alcalase cao ở khoảng 
nhiệt độ cao và tối ưu ở nhiệt độ 60oC. Lian 
và ctv (2005) đã kết luận rằng thủy phân 
protein có nguồn gốc sản phẩm từ cá bằng 
cách bổ sung Alcalase thì có hàm lượng 
đạm cao và hoạt động tốt trong khoảng 
(50oC – 60oC). Tương tự, nghiên cứu 
thủy phân phụ phẩm cá tầm bằng enzyme 
Alcalase ở ba mức nhiệt độ 35, 45 và 55oC, 
Ovissipour và ctv (2009a) ghi nhận tốc độ 
thủy phân thấp nhất là ở nhiệt độ 35oC và 
cao nhất là ở nhiệt độ 55oC. Độ thủy phân 
cao nhất là 46,13% đạt được ở 55oC trong 
205 phút; trong khi đó, tốc độ thủy phân 
gần như không thay đổi ở nhiệt độ 35oC 
(DH đạt 15%).
Điều này được giải thích dựa vào 
cơ chế hoạt động của Alcalase là một 
endopeptidase xúc tác sự phân cắt của 
các liên kết nội bộ trong một polypeptide 
hoặc protein. Khi nhiệt độ tăng, làm tăng 
năng lượng động học và tần số phức hợp 
enzyme - cơ chất phát triển trên một đơn 
vị thời gian do đó tốc độ phản ứng và sản 
phẩm tăng theo. Vì thế, hoạt độ enzyme 
càng cao thì sau quá trình thủy phân các 
protein được phân cắt thành các acid amin 
nhiều nên DH tăng tỉ lệ thuận với nhiệt độ 
60ºC > 55ºC > 50ºC. Theo Shahidi và ctv 
(1995), nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy 
phân phụ phẩm bằng enzyme Alcalase phụ 
thuộc vào thời gian thủy phân. Nhiệt độ 
tối ưu để thủy phân trong 60 phút là 60ºC; 
trong khi đó thủy phân trong 120 phút thì 
nhiệt độ là 55oC.
Phụ phẩm cá lưỡi trâu có chứa lượng 
đạm với tỷ lệ tương đối cao 18,75% cùng 
với lượng phụ phẩm tương đối nhiều nên 
việc thu hồi lượng đạm này để nâng cao 
hiệu quả kinh tế là điều cần thiết.
2. Xác định điều kiện tối ưu cho quá trình thủy 
phân phụ phẩm cá lưỡi trâu
Trong nghiên cứu này, phản ứng thủy 
phân phụ phẩm cá lưỡi trâu bằng enzyme 
sẽ được tiến hành trong các điều kiện khác 
nhau để đánh giá hiệu quả phản ứng thủy 
phân bằng cách xác định hàm lượng đạm 
formol, đạm ammonia, đạm amin và độ 
thủy phân để lựa chọn điều kiện tối ưu nhất.
2.1. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình 
thủy phân
Theo Bảng 3, giá trị N
formol
, N
ammonia
, 
N
amin
 và DH trung bình giữa các NT khác 
biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Trong 
đó, hàm lượng N
formol
, N
ammonia
, N
amin
 và DH 
thủy phân ở nhiệt độ 60oC là cao nhất, tiếp 
theo là ở 55oC và thấp nhất là ở. Ngoài ra, 
giá trị N
formol
, N
ammonia
, N
amin
 và DH trung 
bình ở tất cả NT tăng theo thời gian thủy 
phân (p < 0,05) (Bảng 3 và Hình 1). Tốc 
độ thủy phân thấp nhất là ở nhiệt độ 50oC 
và cao nhất là ở nhiệt độ 60oC và tốc độ 
cao nhất là trong 4 giờ đầu của quá trình 
thủy phân (Hình 1).
Trong quá trình thủy phân, N
formol
, 
N
ammonia
, N
amin
 và DH ở hai mức nhiệt độ 
50oC và 55oC luôn thấp hơn nghiệm thức 
mức 60oC là do tốc độ phản ứng tỷ lệ 
thuận với nhiệt độ phản ứng. Các tác giả 
khác cũng báo cáo các kết quả tương tự 
cũng (Shahidi và ctv, 1995; Benjakul 
và Morrissey, 1997; Lian và ctv, 2005; 
Ovissipour và ctv, 2009a). Shahidi và ctv 
(1995) cũng báo cáo ở nhiệt độ cao hơn 
thì tốc độ thủy phân cao hơn. Theo các tác 
giả này độ thủy phân protein của cá capelin 
110 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
Bảng 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hàm lượng N
formol
, N
ammonia
, N
amin
 và độ thủy phân
Chỉ tiêu
Nhiệt độ (oC) Mức ý nghĩa#
50 55 60 Nhiệt độ Thời điểm Tương tác
Đạm formol (mg/L)
1,31†a ± 0,01 1,41b ± 0,01 1,50c ± 0,02 ** ** ns
1,310 – 1,316‡ 1,404 – 1,406 1,485 – 1,506
Đạm ammonia (mg/L)
0,18a ± 0,02 0,21b ± 0,03 0,25c ± 0,03 ** ** ns
0,183 – 0,184 0,204 – 0,260 0,246 – 0,251
Đạm amin (mg/L)
1,31a ± 0,01 1,40b ± 0,01 1,51c ± 0,01 ** ** ns
1,308 – 1,313 1,402 – 1,405 1,483 – 1,507
Độ thủy phân DH (%) 16,4a ± 0,00 17,5b ± 0,00 18,8c ± 0,00 ** ** ns
16,4 – 16,4 17,5 – 17,5 18,5 – 18,8
† trung bình ± độ lệch chuẩn; ‡ khoảng biến thiên.
# kết quả từ phân tích phương sai một yếu tố đo lường lặp lại: Nhiệt độ = ba mức nhiệt độ; Thời điểm = các thời điểm thu mẫu; Tương tác = Nhiệt độ × 
Thời điểm. Các giá trị trung bình trong cùng một hàng có cùng ký tự chỉ sự khác biệt không có ý nghĩa (p > 0,05); *, ** và *** chỉ mức ý nghĩa ở p < 
0,05, 0,05).
Hình 1. Biến động của hàm lượng N
formol
 (A), N
ammonia 
(B), N
amin
 (C) và DH (D) trung bình theo thời gian 
thủy phân ở các mức nhiệt độ khác nhau.
2.2. Sự ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy 
phân
Độ pH có ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ 
chất và độ bền của enzym nên có tác động đến 
khả năng hoạt động của enzym. Ảnh hưởng 
của pH lên hàm lượng N
formol
, N
ammonia
, N
amin
 và 
độ thủy phân trong nghiên cứu này được trình 
bày ở Bảng 4 và Hình 2. Kết quả cho thấy có sự 
ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê của các mức pH 
khác nhau đến phản ứng thủy phân phụ phẩm 
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 111
cá thông qua hàm lượng N
 formol, 
N
ammonia,
 N
amin
và độ thủy phân (p < 0,05). Hàm lượng N
 formol, 
N
amin
 và độ thủy phân đạt cao nhất ở pH = 8, 
tiếp theo là ở pH = 9 và thấp nhất là ở pH= 
7. Trong khi đó, hàm lượng N
ammonia
 ở hai NT 
pH = 8 và pH = 9 cao hơn có ý nghĩa so với ở 
pH = 7 (Bảng 4). Ngoài ra, hàm lượng N
formol
, 
N
ammonia
, N
amin
 và độ thủy phân ở tất cả NT có 
xu hướng tăng theo thời gian thí nghiệm (p < 
0,05); chỉ trừ NT pH = 7 ở thời điểm sau 4 giờ 
thủy phân, các chỉ tiêu này có xu hướng giảm 
(Hình 2).
Bảng 4. Ảnh hưởng của pH lên hàm lượng N
formol
, N
ammonia
, N
amin
 và độ thủy phân
Chỉ tiêu
pH Mức ý nghĩa#
7 8 9 pH Thời điểm Tương tác
Đạm formol 
(mg/L)
1,30a ± 0,01† 1,51b ± 0,02 1,41c ± 0,01 ** ** ns
1,299 – 1,302‡ 1,499 – 1,519 1,404 – 1,409
Đạm ammonia 
(mg/L)
0,20a ± 0,03 0,22b ± 0,02 0,22b ± 0,03 ** ** ns
0,194 – 0,197 0,222 – 0,224 0,218 – 0,220
Đạm amin (mg/L)
1,30a ± 0,01 1,51b ± 0,01 1,41c ± 0,01 ** ** ns
1,296 – 1,300 1,510 – 1,516 1,405 – 1,410
Độ thủy phân DH 
(%)
16,2a ± 0,00 18,9b ± 0,00 17,6c ± 0,00 ** ** ns
16,2 – 16,2 18,8 – 18,9 17,5 – 17,6
†trung bình ± độ lệch chuẩn; ‡ khoảng biến thiên.
# kết quả từ phân tích phương sai một yếu tố đo lường lặp lại: pH = ba mức pH; Thời điểm = các thời điểm thu mẫu; 
Tương tác = pH × Thời điểm. Các giá trị trung bình trong cùng một hàng có cùng ký tự chỉ sự khác biệt không có ý nghĩa 
(p > 0,05); *, ** và *** chỉ mức ý nghĩa ở p 0,05).
Khi so sánh với các loại enzyme có nguồn 
gốc động – thực vật và đứng trên quan điểm 
kỹ thuật và kinh tế, đa số các tác giả đều công 
nhận việc sử dụng các loại enzyme có nguồn 
gốc vi khuẩn đem lại nhiều thuận lợi như có 
hoạt độ xúc tác phản ứng rộng, bền ở pH và 
nhiệt độ cao (Hoyle và Merritt, 1994; Guérard 
và ctv, 2001; Ovissipour và ctv, 2009a). Trong 
đó, enzyme Alcalase được xem là một trong 
những loại ezyme thủy phân phụ phẩm thủy 
sản hiệu quả nhất do đạt được độ thủy phân 
cao trong một thời gian tương đối ngắn. Các 
nghiên cứu đều cho rằng enzyme Alcalase 
là loại enzyme hoạt động tốt nhất trong môi 
trường kiềm nhẹ (pH = 8,0 – 8,5). Thủy phân 
cá trích (Clupea harengus) ở điều kiện nhiệt 
độ và pH tối ưu (50 – 55°C và pH = 8,0 – 
8,5) bằng Alcalase, Hoyle và Merritt (1994) 
thu được giá trị DH là 44,7% chỉ trong 60 
phút. Trong một nghiên cứu tương tự, thủy 
phân phụ phẩm cá ngừ vây vàng (Thunnus 
albacares) bằng Alcalase ở nhiệt độ và pH tối 
ưu (50°C và pH = 8,0), Guérard và ctv (2001) 
ghi nhận giá trị DH cao nhất là 23% ở nồng 
độ enzyme 85 AU/kg sau 5,5 giờ. Ovissipour 
và ctv (2009a) cũng báo cáo độ thủy phân đạt 
46,13% khi thủy phân phụ phẩm cá tầm bằng 
enzyme Alcalase ở pH = 8,5 và nhiệt độ 55oC 
trong 205 phút.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian 
đến hiệu quả quá trình thủy phân (Hình 2) cho 
thấy, thời gian thủy phân càng dài thì càng tạo 
ra nhiều sản phẩm. Trong quá trình thủy phân 
các liên kết peptit nhạy cảm sẽ được phân cắt 
trước với tốc độ nhanh, sau đó các liên kết ít 
nhạy cảm hơn sẽ được phân cắt với tốc độ chậm 
hơn. Thời gian thủy phân càng dài thì lượng 
đạm formol sinh ra càng nhiều do các mạch 
protein đã được phân cắt thành các acid amin 
càng tăng từ 0, 2, 4 và 6 giờ thủy phân (Nguyễn 
Trọng Cẩn và ctv, 1998). Thời gian thủy phân 
còn ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy 
phân, thời gian thủy phân càng dài thì protease 
càng có điều kiện thủy phân cơ chất triệt để.
112 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
 2.3. Sự ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất 
đến quá trình thủy phân
Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến 
quá trình thủy phân được trình bày ở Bảng 
5 và Hình 3. Kết quả cho thấy tỷ lệ enzyme/
cơ chất ảnh hưởng có ý nghĩa lên hàm 
lượng N
 formol, 
N
ammonia,
 N
amin
 và độ thủy phân 
(p < 0,05) và giá trị của các chỉ tiêu này có 
khuynh hướng tăng theo theo thời gian thí 
nghiệm (p < 0,05) (Bảng 5 và Hình 3). Khi 
tỷ lệ enzym/cơ chất tăng, hàm lượng N
 formol, 
N
ammonia,
 N
amin
 và độ thủy phân tăng: cao nhất 
là ở tỷ lệ enzym/cơ chất 0,20%, tiếp theo là 
ở 0,10% và thấp nhất là ở 0,05%.
Hình 2. Biến động của hàm lượng N
formol
 (A), N
ammonia 
(B), N
amin
 (C) và DH (D) trung bình theo thời gian 
thủy phân ở các mức pH khác nhau.
Bảng 5. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất lên hàm lượng N
formol
, N
ammonia
, N
amin
 và độ thủy phân
Chỉ tiêu
Tỷ lệ enzyme/cơ chất (%) Mức ý nghĩa#
0,05 0,10 0,20
 Enzyme/
Cơ chất
Thời điểm Tương tác
Đạm formol (mg/L)
1,19a ± 0,02† 1,45b ± 0,01 1,59c ± 0,01 ** ** ns
1,181 – 1,193‡ 1,442 – 1,449 1,583 – 1,586
Đạm ammonia (mg/L)
0,18a ± 0,02 0,21b ± 0,02 0,24c ± 0,03 ** ** ns
0,184 – 0,185 0,214 – 0,215 0,240 – 0,240
Đạm amin (mg/L)
1,19a ± 0,01 1,44b ± 0,01 1,58c ± 0,01 ** ** ns
1,187 – 1,195 1,439 – 1,444 1,583 – 1,585
Độ thủy phân DH (%)
14,9a ± 0,00 18,0b ± 0,00 19,8c ± 0,00 ** ** ns
14,8 – 14,9 18,0 – 18,1 19,7 – 19,8
†trung bình ± độ lệch chuẩn; ‡ khoảng biến thiên.
# kết quả từ phân tích phương sai một yếu tố đo lường lặp lại: Enzyme/Cơ chất = ba tỷ lệ Enzyme/Cơ chất; Thời điểm = các thời điểm thu mẫu; 
Tương tác = Enzyme/Cơ chất × Thời điểm. Các giá trị trung bình trong cùng một hàng có cùng ký tự chỉ sự khác biệt không có ý nghĩa (p > 0,05); 
*, ** và *** chỉ mức ý nghĩa ở p 0,05).
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 113
Các kết quả tương tự cũng được ghi nhận bởi 
các tác giả khác (Benjakul và Morrissey, 1997; 
Guérard và ctv, 2001; Salwanee và ctv, 2013): 
độ thủy phân tăng khi tăng nồng độ enzyme. Khi 
thủy phân phụ phẩm cá thu Thái Bình Dương 
(M. productus) bằng enzyme Alcalase, Benjakul 
và Morrissey (1997) ghi nhận khi tăng nồng độ 
enzyme thì Dh cũng tăng. Tuy nhiên, sự thay đổi 
DH chỉ có ý nghĩa ở khoảng nồng độ 0 – 34 AU/
kg, ở nồng độ > 57 AU/kg, sự gia tăng DH không 
có ý nghĩa. Trong một nghiên cứu tương tự, thủy 
phân phụ phẩm cá ngừ vây vàng (T. albacares) 
bằng Alcalase ở nhiệt độ và pH tối ưu (50°C và 
pH = 8,0) và các nồng độ enzyme Alcalase khác 
nhau, Guérard và ctv (2001) nhận thấy khi tăng 
nồng độ enzyme từ 0 – 85 AU/kg thì giá trị DH 
tăng từ khoảng 10% đến 23% sau 5,5 giờ thủy 
phân. Tương tự, khi thủy phân phụ phẩm cá 
ngừ (Euthynnus affi nis) bằng enzyme Alcalase, 
Salwanee và ctv (2013) báo cáo độ thủy phân 
tăng có ý nghĩa khi tăng nồng độ enzyme từ 1,0% 
đến 1,5%, nhưng DH không tăng nữa khi nồng độ 
enzyme > 1,5%. Theo các tác giả này khi enzyme 
được thêm vào cơ chất, enzyme sẽ hấp phụ trên 
bề mặt các hạt cơ chất tại đó sẽ xảy ra phản ứng 
thủy phân các liên kết peptide dễ bị thủy phân bởi 
enzyme. Sau giai đoạn thủy phân nhanh ban đầu, 
tốc độ thủy phân có khuynh hướng giảm, đi vào 
giai đoạn ổn định. Tại thời điểm này, việc tăng 
nồng độ enzyme sẽ không làm tăng độ thủy phân 
vì nồng độ của các liên kết peptide dùng cho quá 
trình thủy phân trở nên giới hạn.
Với cùng một lượng nguyên liệu, tiến hành 
phản ứng thủy phân với Alcalase ở các tỷ lệ 
enzym/cơ chất khác nhau, kết quả thu được như 
ở Bảng 5 cho thấy N
 formol, 
N
ammonia,
 N
amin
 và DH của 
NT tỷ lệ enzyme/cơ chất 0,2% khác biệt không 
đáng kể so với ở tỷ lệ enzyme/cơ chất 0,1%. Vì 
vậy, chúng tôi kiến nghị sử dụng tỷ lệ enzyme/cơ 
chất 0,1% để nâng cao hiệu quả kinh tế.
Hình 3. Biến động của hàm lượng N
formol
 (A), N
ammonia 
(B), N
amin
 (C) và DH (D) trung bình theo thời gian 
thủy phân ở các tỷ lệ enzyme/cơ chất khác nhau.
IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Phụ phẩm cá lưỡi trâu có thể sử dụng 
làm dịch thủy phân protein do có hàm lượng 
protein tương đối cao (18,75%). Kết quả cho 
thấy nhiệt độ, pH và tỷ lệ enzyme/cơ chất có 
ảnh hưởng có ý nghĩa lên thành phần đạm của 
114 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
dịch thủy phân và DH. Ngoài ra, hàm lượng 
N
formol
, N
ammonia
, N
amin
 và DH trung bình ở các 
nghiệm thức tăng dần theo thời gian: thời gian 
thủy phân càng dài thì hàm lượng đạm của 
dịch thủy phân và DH sinh ra càng nhiều do 
các mạch protein đã được phân cắt thành các 
acid amin. Dựa trên các kết quả của nghiên cứu 
này, chúng tôi rút ra kết luận điều kiện tối ưu 
cho quá trình thủy phân phụ phẩm cá lưỡi trâu 
khi sử dụng enzyme Alcalase là: pH, nhiệt độ 
và tỷ lệ enzyme/cơ chất lần lượt là 8,0, 60oC và 
0,2% trong thời gian 6h. Ở điều kiện này, sau 
6h thủy phân, giá trị DH của dịch thủy phân 
dao động trong khoảng từ 18,8 ± 0,00% đến 
19,8 ± 0,00%.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Benjakul S., Morrissey M.T., 1997. Protein hydrolysates from Pacifi c whiting solid wastes. Journal of 
Agricultural and Food Chemistry 45 (9): 3423-3430.
2. Guérard F., D ufossé L., De La Broise D., Binet A., 2001. Enzymatic hydrolysis of proteins from yellowfi n tuna 
(Thunnus albacares) wastes using Alcalase. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 11 (4–6): 1051-1059.
3. Herpandi, Huda N., Rosma A., Wan Nadiah W.A., 2012. Degree of hydrolysis and free tryptophan content of 
Skipjack Tuna (Katsuwonus pelamis) protein hydrolysates produced with different type of industrial proteases. 
International Food Research Journal 19 (3): 863-867.
4. Hoyle N.T., Merritt J.H., 1994. Quality of fi sh protein hydrolysates from herring (Clupea harengus). Journal 
of Food Science 59 (1): 76-79.
5. Kechaou E.S., Dumay J., Donnay-Moreno C., Jaouen P., Gouygou J.-P., Bergé J.-P., Amar R.B., 2009. 
Enzymatic hydrolysis of cuttlefi sh (Sepia offi cinalis) and sardine (Sardina pilchardus) viscera using commercial 
proteases: Effects on lipid distribution and amino acid composition. Journal of Bioscience and Bioengineering 
107 (2): 158-164.
6. Klompong V., Benjakul S., Kantachote D., Hayes K.D., Shahidi F., 2008. Comparative study on antioxidative 
activity of yellow stripe trevally protein hydrolysate produced from Alcalase and Flavourzyme. International 
Journal of Food Science & Technology 43 (6): 1019-1026.
7. Lê Hoàng Trí, 2014. Khảo sát qui trình công nghệ và hiệu suất thu hồi cá lưỡi trâu fi llet đông lạnh tại Công 
ty TNHH Thủy sản Minh Khuê, Kiên Giang. Trường Đại học Cần Thơ, 60 trang.
8. Lian P.Z., Lee C.M., Park E., 2005. Characterization of squid-processing byproduct hydrolysate and its 
potential as aquaculture feed ingredient. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53 (14): 5587-5592.
9. Nguyễn Kiểm, 2019. Triển vọng mới cho xuất khẩu thủy sản Việt Nam năm 2019. Báo Quân đội Nhân dân 
(Truy cập Ngày 18/06/2019).
10. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, 1998. Công nghệ enzyme. Nhà xuất 
bản Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh trang.
11. Ovissipour M., Abedian A., Motamedzadegan A., Rasco B., Safari R., Shahiri H., 2009a. The effect of 
enzymatic hydrolysis time and temperature on the properties of protein hydrolysates from Persian sturgeon 
(Acipenser persicus) viscera. Food Chemistry 115 (1): 238-242.
12. Ovissipour M., Taghiof M., Motamedzadegan A., Rasco B., Molla A.E., 2009b. Optimization of enzymatic 
hydrolysis of visceral waste proteins of beluga sturgeon Huso huso using Alcalase. International Aquatic 
Research 1: 31-38.
13. Ovissipour M., Benjakul S., Safari R., Motamedzadegan A., 2010. Fish protein hydrolysates production from 
yellowfi n tuna Thunnus albacares head using Alcalase and Protamex. International Aquatic Research 2 (2): 87-95.
14. Salwanee S., Wan Aida W.M., Mamot S., Maskat M.Y., 2013. Effects of enzyme concentration, temperature, 
pH and time on the degree of hydrolysis of protein extract from viscera of tuna (Euthynnus affi nis) by using 
alcalase. Sains Malaysiana 42 (3): 279-287.
15. Shahidi F., Han X.-Q., Synowiecki J., 1995. Production and characteristics of protein hydrolysates from 
capelin (Mallotus villosus). Food Chemistry 53 (3): 285-293.