Bài giảng Kỹ thuật di truyền trong nuôi trồng thủy sản

KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 
I- NGUYÊN TẮC KỸ THUẬT CHUYỂN GEN 
II- BỘ CÔNG CỤ 
III- CÁC BƯỚC CỦA KỸ THUẬT CHUYÊN GEN 
IV- ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN 
I-NGUYÊN TẮC 
SV CHO gen 
VECTOR 
DNA TÁI TỔ HỢP 
CHUYỂN VÀO TB ĐÍCH 
BIỂU HIỆN GEN MONG MUỐN 
SƠ ĐỒ CHUYỂN GEN 
Một số thuật ngữ : 
 DNA tái tổ hợp = DNA lai in vitro từ 2 DNA khác nhau ( đ oạn DNA ng ư ời “ghép” trên DNA virus hay plasmid vi khuẩn). 
 Tạo dòng gene: quá trình cô lập và thu nhận nhiều bản sao của một gene hay một đ oạn gene . 
 Dòng: một số lớn tế bào hay phân tử giống nhau sinh ra từ một tế bào hay phân tử ban đ ầu . 
 Ngân hàng (th ư viện): bộ s ư u tập của nhiều dòng khác nhau. 
 cDNA: bản sao bổ sung của mRNA (không intron, nhờ retrotranscriptase) 
II. BỘ C Ơ NG CỤ 
II.1- Các loại Enzyme: enzyme giới hạn, ligase, 
Phosphatase alkaline, Taq polimerase 
II.2- Các loại Vector: Plasmid, Phagemid, Cosmid, Nhiễm sắc thể nhân tạo 
II.1- CÁC LOẠI ENZYME 
 II.1.1- RESTRICTASE ENZYME 
(Enzym cắt hạn chế) 
 Enzyme giôùi haïn 
Caét DNA sôïi keùp ôû nhöõng vuøng 4-6 caëp-base = vò trí giôùi haïn = trình töï thuaän nghòch theo höôùng 5’ 3’ ( RADAR ). 
TÊN GỌI CÁC ENZYME GIỚI HẠN 
Chữ đầu viết hoa: Tên giống vi khuẩn (ly trích enzyme) 
Hai chữ kế không viết hoa: Tên loài VK 
Chữ số La Mã: Thứ tự RE được phát hiện 
Đôi khi có thêm chữ viết hoa sau tên loài VK là tên chủng 
Ví dụ: Eco RI (Eco: Escherichia coli , chủng Ry13), Eco RV 
Bacterial 
 genus 
species 
strain 
type 
Named (e.g., EcoRI) for bacterial genus, species, strain, and type. 
RESTRICTASE ENZYME 
 (Enzym cắt hạn chế) 
MỘT SỐ CÁCH CẮT CỦA ENZYM GIỚI HẠN 
- HpaI cắt thẳng 
 EcoRI cắt so le 
- HindIII cắt so le 
- PstI cắt so le 
 ( restriction enzyme) 
 digested DNA 
 double stranded DNA 
CÁCH CẮT CỦA ENZYM GIỚI HẠN 
Cohesive ends (sticky ends) COHESIVE ENDS 
EcoRI	5’GAATTC3’	5’G	 AATT C3’ 
	3’CTTAAG5’	3’C TTAA 	 G5’ 
PstI	5’CTGCAG3’	5’C TGCA G3’ 
	3’GACGTC5’	3’G	 ACGT C5’ 
Blunt ends (flush ends) BLUNT ENDS 
HaeIII	5’GGCC3’	 5’GG	 CC3’ 
	3’CCGG5’	 3’CC	 GG5’ 
 SẢN PHẨM CỦA CÁC ENZYME GIỚI HẠN 
Cohesive ends 
Enzym cắt tạo đầu dính 
 ( restriction enzyme) 
 digested DNA 
 double stranded DNA 
II.1.2- ENZYME LIGASE 
Xúc tác phản ứng nối hai đầu của 2 trình tự DNA (DNA ligase) hay RNA (RNA ligase) 
Ví dụ: T4 DNA ligase 
Enzyme ligase 
Xúc tác phản ứng 
 nối hai đầu 
 của 2 trình tự DNA 
 II.1.3- Enzyme Alkaline Phosphatase  X úc tác sự loại bỏ nhóm 5 ‘ phosphate của DNA, RNA và các nucleotide tự do 
II.1.4- Các enzyme polymerase : 
DNA polymerase: DNA polymerase I, T4 DNA polymerase,Taq polymerase, Reverse transcriptase 
- RNA polymerase 
 DNA POLYMERASE ENZYME 
Xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5 ' → 3 ‘ 
- Các DNA polymerase gồm: DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase, Reverse transcriptase (RT), Terminal transferase 
Tổng hợp DNA 
RNA POLYMERASE 
	- Xúc tác sự tổng hợp RNA theo chiều 5 ' → 3 ‘- Các RNA polymerase như: SP6 RNA polymerase (có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm Salmonella typhymurium) , T3 và T7 RNA polymerase (có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm vi khuẩn E.coli), 
RIBONUCLEASE ENZYME 	 - Ribonuclesae là nhóm enzyme phân cắt RNA	- Gồm các enzyme: Ribonuclease A ( RNase A), Ribonuclease H ( RNase H),  
VECTOR 
1- PLASMID 
2- COSMID 
3- PHAGEMID 
4- NST NHÂN TẠO 
VECTOR 
	Vector chuyển gen là 1 phân tử DNA có khả năng tự nhân đôi, tồn tại độc lập trong tế bào và mang được gen cần thiết. 
	Vector cần có các đặc điểm: có các trình tự khởi đầu sự tự nhân đôi Ori, có các trình tự nhận biết (nơi cắt của RE), các trình tự điều hòa (promoter giúp phiên mã gen lạ), có các gen đánh dấu, đảm bảo sự bền vững của DNA tái tổ hợp trong TB đích 
Gen INSULIN của người xen vào plasmid Vi khuẩn 
Small DNA molecule 
Circular DNA molecule 
Can be considered as a minichromosome able to self-replicate 
Allows antibiotic resistance 
 II.2.1- VECTOR LÀ PLASMID 
Plasmid: là những đoạn DNA ngắn(2-5kb), dạng vòng, nằm ngoài NST, tim thấy đầu tiên ở VK. 
Đặc điểm plasmid: có khả năng tự nhân đôi, có điểm khởi đầu Ori, có mang các gen kháng kháng sinh hay gen dùng đánh dấu. 
Chuyên chở đoạn gen có kích thước 5-10 kb 
Thí dụ: pPR322, pVT46, pUC 18 
Cấu trúc của pBR322 
 CẤU TRÚC CỦA PLASMID pBR322 
Structure of pBR322 - a common cloning vector 
 derived from a naturally occurring plasmid 
 has antibiotic resistance genes for selection of 
	transformants containing the plasmid 
 has unique restriction enzyme cleavage sites for 
	insertion of foreign DNA 
 has origin of DNA replication (ori) for propagation in E. coli 
EcoRI 
Sal I 
 gene for 
 ampicillin 
resistance 
gene for 
 tetracycline 
 resistance 
Pst I 
ori 
PLASMID pUC18/19 
VECTOR PLASMID VỚI 4 ĐOẠN DNA 
II.2.2 PHAGEMID 
	Các phage là virus xâm nhiễm và làm phân giải vi khuẩn. 
	Phase làm vector có các ưu điểm: 
	- Hiệu quả xâm nhiễm cao ( có hệ thống giúp xâm nhiễm VK và sinh sản nhanh) 
	- Chuyển đoạn gen có kích thước lớn(10- 20 kb) 
 	Các phage như Phage ג , Phage M13 
l Phage cycle 
1.2.2. Phages sử dụng như vectors 
l Phage cycle 
PHAGE LÀ VECTOR 
Bacteriophage genome 
Cloning with a λ insertion vector 
Cloning in l phage 
Lambda bacteriophage 
 Viral linear DNA 
 until ~20 kb 
Or lambda phage 
 (bacteria) 
Cosmide 
 Hybride de plasmide 
 jusqu’à ~50 
kb 
(bactérie) 
 et de phage 
YAC or 
Yeast artificial 
ADN contenant 
~200 à ~1000 
kb 
Chromosome	 
telomères 
, 
 (levure) 
 et origines de réplication 
 de levure 
centromère, 
Vector 
(and host) 
 Characteristics 
Insert length 
Plasmid 
 Little circular DNA 
 <5 - 10 kb 
(bacteria, yeast) 
Usual cosmid 
COSMID LÀ VECTOR 
II.2.3- COSMID 
	Cosmid là những vector nhân tạo được ghép nối giữa plasmid và trình tự cos của phage ג . Các trình tự này giúp đóng gói DNA tái tổ hợp vào phần đầu của phage. Sau khi đóng gói phage xâm nhập vào VK. Trong tế bào VK phage hoạt động như 1 plasmid và không phá vỡ VK (tạo khuẩn lạc) 
	Cosmid chuyển đoạn gen 20- 50kb 
Cloning by cosmids 
Cosmid 
 Hybrid plasmid 
 until ~50 kb 
(bacteria) 
 and phage 
YAC or 
Yeast artificial 
ADN contenant 
~200 à ~1000 
kb 
Chromosome	 
telomères 
, 
 (levure) 
 et origines de réplication 
 de levure 
centromère, 
Lambda bacteriophage 
 Viral linear DNA 
 until ~20 kb 
Or lambda phage 
 (bacteria) 
Vector 
(and host) 
 Characteristics 
Insert length 
Plasmid 
 Little circular DNA 
 <5 - 10 kb 
(bacteria, yeast) 
II.2.3- NHIỄM SẮC THỂ NHÂN TẠO 
Nhiễm sắc thể nhân tạo là vector mới cho phép chuyển đoạn gen có kích thước từ 200-1000 kb. 
Các NST nhân tạo gồm NST nhân tao của nấm men YAC (Yeast Artificial Chromosome), NST nhân tạo của động vật hữu nhũ MAC (Mammifere Artificial Chromosome) 
Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC (Yeast Artificial Chromosome) muốn nhân đôi và phân ly cần 3 trình tự: 
TEL (Telomeric Sequence) trình tự đầu cuối của NST 
CEN (Centromeric Sequence) trình tự trung tâm của NST 
ARS (Autonomous Replicating Sequence) trình tự sao chép tự chủ 
Sau khi nhận gen các NST nhân tạo này sẽ được đưa vào nấm men bằng phương pháp biến nạp. 
1.2.4. YAC as cloning vectors 
CÁC VECTOR THƯỜNG SỬ DỤNG 
YAC or 
Yeast artificial 
DNA chứa centromere CEN, 
Telomeres TEL và yeast replication origin ARS 
~200 à ~1000 
kb 
Chromosome	 
 (yeast) 
Cosmid 
Lai plasmid 
 until ~50 kb 
(bacteria) 
 và phage 
Lambda bacteriophage 
DNA virus, thẳng 
 until ~20 kb 
Or lambda phage 
 (bacteria) 
Vector 
(và TB chủ) 
Đặc điểm Vector 
Đoạn gen chuyển 
Plasmid 
DNA nhỏ, vòng 
 <5 - 10 kb 
(bacteria, yeast) 
Two plasmids designed as vectors for DNA cloning 
III- CÁC BƯỚC CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN 
Bước 1: Thu nhận gen 
Bước 2: Chọn vector 
Bước 3: Tạo DNA tái tổ hợp 
Bước 4: Chuyển DNA tái tổ hợp vào TB đích 
Bước 5: Chọn dòng TB có DNA tái tổ hợp 
Bước 6: Tạo dòng TB có DNA tái tổ hợp 
Bước 7: Biểu hiện gen mong muốn 
Bước 1: Thu nhận gen 
Có 3 phương pháp: 
	- Thu nhận gen từ bộ gen (genom) 
	- Thu nhận gen bằng con đường tổng hợp hóa học 
	- Thu nhận gen từ mRNA với enzyme phiên mã ngược 
 Thu nhận gen từ bộ gen (genom) 
	Thu nhận gen từ bộ gen là sử dụng các enzyme RE cắt bộ gen ra thành những gen rời và trích đoạn gen mong muốn ra khỏi genom. Thí dụ: Bộ gen người có khoảng 30.000 gen, xác suất để có 1 gen mong muốn là 1/30.000. 
	Thu nhận gen với phương pháp này tốn thời gian, chi phí nhiều. Phương pháp này được sử dụng để lập ngân hàng DNA của bộ gen (Bank of genomic DNA) hay thư viện của DNA bộ gen (Genomic DNA libraries). 
	Thí dụ ngân hàng bộ gen người: 
	Cắt Genom thành các đoạn dài 300.000-400.000pb gắn vào NST nhân tạo của nấm men (YAC) để tạo dòng, từ các dòng này tạo các đoạn 30.000- 40.000pb với các vector cosmid và sau cùng tạo các đoạn trung bình 4.000pb với plasmid để giải trình tự chuỗi DNA này. 
	Thu nhận gen bằng con đường tổng hợp hóa học 
	 Gồm các bước: 
	- Xác định trình tự gen 
	- Tổng hợp các đoạn oligonucleotides (3- 16 Nucleotide) 
	- Nối các đoạn oligonucleotides với enzyme DNA ligase. 
 	Năm 1977, Itakura và Boyer tổng hợp được gen mã hóa hormone somatostatine gồm 14 amino acid và biểu hiện trong E.coli ( tạo 3 triệu phân tử hormon tăng trưởng của người/TB E.coli ) 	 
	Thu nhận gen từ mRNA với enzyme phiên mã ngược 
	 mRNA của các SV dễ ly trích. Từ phân tử 
	mRNA dùng enzyme sao mã ngược Retrotranscriptase để tạo cDNA ( đoạn DNA có trình tự bổ sung với mRNA – c = comlpementary), tổng hợp DNA kép (đoạn gen mong muốn) 
	Phương pháp này ít tốn thời gian, chi phí và thông tin nhận được chính xác 
	mRNA → cDNA → DNA kép (DNA 2 mạch hay gen) 
Bước 2: Chọn vector 
	Sau khi thu nhận gen, tùy theo kích thước gen chọn vector thích hợp. 
	Thí dụ đoạn gen có kích thước 5- 9kb chọn vector plasmid. Chọn Nhiễm sắc thể nhân tạo là vector nếu chuyển đoạn gen có kích thước từ 200-1000 kb. 
Bước 3: Tạo DNA tái tổ hợp 
	 Từ gen và vector phù hợp người ta tạo các DNA tái tổ hợp bằng các enzyme công cụ . 
	 Thí dụ sử dụng enzyme cắt hạn chế EcoRI để cắt gen và plasmid, sau đó dùng DNA ligase nối gen và plasmid tạo DNA tái tổ hợp. 
	 Enzyme cắt hạn chế EcoRI để cắt gen và plasmid tạo 2 đầu dính tương ứng. Vì vậy sau đó người ta có thể nối chúng bằng enzyme DNA ligase tạo DNA tái tổ hợp. 
Xen DNA vào plasmid 
Bước 4: Chuyển DNA tái tổ hợp vào TB đích 
	Sau khi tạo DNA tái tổ hợp, người ta chuyển DNA tái tổ hợp này vào tế bào đích. 
	Các phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào đích: phương pháp biến nạp, phương pháp dung hợp, phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium , phương pháp điện xoi (Electroporation), phương pháp bắn gen, phương pháp vi tiêm 
Phương pháp biến nạp 
	Nếu chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn người ta sử dụng phương pháp biến nạp. 
	Sử dụng dung dịch Clorur calcium CaCl 2 cho vào môi trường nuôi cấy tế bào E. coli sau đó để vào tủ lạnh ở nhiệt độ -20 o C trong 12 giờ. Với phương pháp biến nạp người ta có thể chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn 
Phương pháp dung hợp 
	1960 Barski thực hiện sự dung hợp các tế bào thể hệ giữa 2 dòng chuột. Tế bào lai mang cả 2 bộ NST của cha mẹ. Sau đó hiện tượng dung hợp thực hiện với nhiều cặp tế bào, kể cả các cặp tế bào có nguồn gốc xa nhau (người và chuột). 
	Phương pháp dung hợp gồm: phương pháp hóa dung hợp, phương pháp điện dung hợp 
	Phương pháp hóa dung hợp 
	 Trộn 2 kiểu tế bào trần trong một dung dịch đậm đặc polyethylen glycol PEG (25-40%) và dung dịch CaCl 2 0,3M. 
	Hiệu quả phương pháp hóa dung hợp 
	không cao khoảng 20%( nếu trộn 2 kiểu tế bào trần với tỷ lệ bằng nhau sẽ có 10% tế bào trần là các tế bào lai). 80% TB trần nằm trong chuỗi, 50% TB trần nằm trong chuỗi dung hợp nhưng chỉ có 20% là dung hợp đôi (sản phẩm có ý nghĩa) 
Phương pháp điện dung hợp 
	 Nguyên tắc: khi đặt các tế bào trần trong 1 điện trường cao tần, chúng sẽ xếp thành chuỗi (các TB nằm cạnh nhau như chuỗi hạt). Sau đó dùng 1 xung điện ngắn để gây các vết đứt trên màng, sự dung hợp có thể sẽ xảy ra ở những nơi các tế bào trần tiếp xúc nhau 
Cô lập, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần 
Sản phẩm dung hợp 
Phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium 
	 Trong tự nhiên hiện tượng chuyển gen xảy ra nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (chứa plasmid Ti) tạo mô bướu ở mức cổ rễ, vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes làm xuất hiện nhiều rễ con ở vị trí vết thương (chứa plasmid Ri). 
	Trong thực nghiệm nếu đưa các VK này vào cây thích ứng sẽ dẫn tới sự xuất hiện mô bướu hay rễ. Như vậy có sự truyền, gia nhập và biểu hiện 1 phần của plasmid Ti hay Ri trong bộ gen nhân của TB thực vật. 
	Người ta áp dụng kỹ thuật chuyển gen thiên nhiên này trong thực nghiệm (có kiểm soát) 
Phương pháp bắn gen 
Nguyên tắc: 
	 Cơ sở vật lý: Phân tử DNa đoực bắn với tốc độ lớn vào tế bào để vượt qua các vật cản (vách, màng) và có thể xen vào bộ gen của tế bào đích. 
	 Cơ sở sinh học: Màng tế bào có tính dẽo hoàn hão với khả năng tái cấu trúc dễ dàng sau khi bị tổn thương. Nhờ phương pháp đánh dấu người ta theo dõi được phân tử DNA trong tế bào 
	Bộ máy và cách vận hành: 
	* Cố định các phân tử DNA trên bề mặt các hạt vàng hay Tungsten nhờ lực hút tĩnh điện( hỗn hợp hạt Tungsten trong glycerol + dung dịch DNA). 
	* Đặt 1 giọt 2 µl chứa các vi hạt tungsten được phủ DNA vào hốc của viên đạn lớn. 
	* Đưa viên đạn lớn vào vào thân súng bắn gen (giọt Tungsten quay xuống dưới) 
	 * Đặt ngòi nỗ vào thân súng, phía trên viên đạn lớn. 
	* Kích hoạt ngòi nỗ bằng cách lên cò và bấm cò súng. Sự nỗ tạo một áp lực mạnh làm tung viên đạn lớn đi tới một mức chận. Mức chận được đặt xa viên đạn lớn trước khi bắn (khoảng cách này được tính toán trước). Sự cản trở này làm viên đạn xẹp xuống và tung các viên đạn nhỏ là các hạt Tungsten đi tới các TB đích với vận tốc 150-200km/giờ. 
Phương pháp vi tiêm 
	 Phương pháp này thường sử dụng để chuyển gen ở động vật. Ở phương pháp này DNA được bơm thẳng vào hợp tử ở giai đoạn nhân non (pronucleus) 
	Bước 5: Chọn dòng TB có DNA tái tổ hợp 
	 Sau khi chuyển được DNA tái tổ hợp vào TB đích chúng ta phải tiến hành chọn lọc dòng tế bào có mang DNA tái tổ hợp. 
	Nhờ vào các gen đánh dấu chúng ta có thể xác định dòng tế bào có DNA tái tổ hợp. 
	Thí dụ: nếu sử dụng plasmid có gen kháng Amp và Tet (Amp Rvà Tet R ), nếu xen gen lạ vào giữa gen Tet R thì dùng môi trường có Ampicycline và không có Tetracycline làm môi trường chọn lọc dòng tế bào có DNA tái tổ hợp. 
Selection with 
 pBR322 
CHỌN LỌC DNA TÁI TỔ HỢP 
	Thí dụ: nếu sử dụng plasmid có gen kháng Amp và gen Lac Z (Amp R và Lac Z), xen gen lạ vào giữa gen Lac Z thì dùng môi trường có Ampicycline và có chất X- Gal làm môi trường chọn lọc dòng tế bào có DNA tái tổ hợp. 
	 Vi khuẩn có mang gen Lac Z có thể sử dụng đường Lactose nhờ enzyme β - galactosidase. Chất X-Gal cũng được VK n à y sử dụng (tạo m à u xanh dương bleu). 
Structure of pBR322 
Selection with 
 pUC18 
CHỌN LỌC DNA TÁI TỔ HỢP 
VỚI pUC18 
Two plasmids designed as vectors for DNA cloning 
	Bước 6: Tạo dòng TB có DNA tái tổ hợp 
	Sau khi chọn lọc được dòng tế bào có DNA tái tổ hợp chúng ta phải tiến hành nuôi cấy dòng tế bào này bằng các môi trường thích hợp. 
Nuôi cấy dòng tế bào có DNA tái tổ hợp 
Bước 7: Biểu hiện gen mong muốn 
	Sau khi tạo được dòng tế bào có DNA tái tổ hợp chúng ta phải biểu hiện được gen mong muốn. 
	Thí dụ: Chuyển gen Insulin của người vào tế bào E. coli , E. coli phải sản xuất được Insulin của người. chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào thực vật thì cây con phải có tính kháng thuốc trừ cỏ. 
SƠ ĐỒ KỸ THUẬT CHUYỂN GEN ở TẾ BÀO VI KHUẨN E. COLI 
Thermic shock at 42°C 
Complete procedure 
Ứng dụng: Chuyển gene somatotropin bò 
1994, Monsanto tạo somatotropin bò (hormone) đ ể cho vào thức ă n và làm t ă ng sản l ư ợng sữa. 
Các nhà CNSH tin t ư ởng somatotropin bò không có hại, vì nó là protein bị tiêu hóa trong dạ dày (?) 
 Sản xuất somatotropin 
(1) Plasmid E. coli + RE 
(2) Cô lập gene BST 
(3) Xen vào plasmid 
(4) Đ ư a plasmid trở lại vi khuẩn. 
(5) Vi khuẩn t ă ng tr ư ởng trong bể lên men. 
(6) Ly trích somatotropin từ vi khuẩn 
(7) Cho somatotropin vào thức ă n của bò sữa.