Nghiên cứu khả năng gây bệnh và gây đáp ứng miễn dịch của virut gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú nuôi ở Việt Nam

 1 
Nghiên cứu khả năng gây bệnh và gây đáp ứng miễn dịch của virut gây 
bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú nuôi ở Việt Nam 
Phạm Thị Tâm1, Phạm Công Hoạt2, Nguyễn Thị Thu Hiền1, 
Vũ Tiến Lâm3, Nguyễn Thị Vui4 và Nguyễn Thị Thanh4 
Tóm tắt 
 8 chủng virut gây bệnh hoại tử thần kinh (NNV) được sử dụng để nghiên cứu khả năng 
gây bệnh và gây đáp ứng miễn dịch trên cá mú nuôi ở Việt Nam. Các chủng virut này có độc lực 
khác nhau khi đánh giá mức độ gây bệnh trên tế bào mẫn cảm và cá mú con, với giá trị TCID50 
đạt từ 10-2,7-10-3,9, LD50 đạt từ 10
-1,5
-10
-7,5
. Trong đó 4 chủng NNV ký hiệu QN 02, QN 05, QN 
07, KH 05 đã được xác định có độc lực mạnh, gây chết 100% cá sau 3 ngày gây nhiễm. Đánh giá 
khả năng gây miễn dịch của các chủng virut này đã xác định được chủng KH 05 có tính đại diện 
kháng nguyên cao nhất, chủng này bị bất hoạt bởi formalin 0,3%. NNV KH 05 được nhũ hóa 
bằng Montanide ISA 70 có thể tạo kháng thể trung hòa với NNV cường độc ở ngày thứ 15 trên 
thỏ và kháng thể bảo hộ trên cá là 80- 85% ở ngày thứ 20 sau khi gây miễn dịch. Kết quả này là 
cơ sở để sản xuất vacxin phòng bệnh hoại tử thần kinh. 
Từ khóa: Cá mú, Virut gây bệnh hoại tử thần kinh (NNV), TCID50, LD50, Kháng thể trung 
hòa, Kháng thể bảo hộ 
Study on the pathogenicity and immune response of Nervous Necrosis Virus 
(NNV) in grouper culture in Vietnam 
Pham Thi Tam, Pham Cong Hoat, Nguyen Thi Thu Hien, 
 Vu Tien Lam, Nguyen Thi Vui and Nguyen Thi Thanh 
Summary 
Eight strains of Nervous Necrosis Virut (NNV) were used to study on pathogenecity and 
inducing immune response in grouper being cultured in Vietnam. These virus strains having 
different virulences obtained through assessment of pathogenous levels in susceptible cells and 
grouper fry/fingerlings, with index TCID50 reached from 10
-2,7
 to 10
-3,9
, index LD50 reached from 
10
-1,5
 to 10
-7,5
. Of which, four NNV strains namely QN 02, QN 05, QN 07, KH 05 were 
determined to have high virulence, causing 100 % groupers died after 3 post infection. Evaluation 
of inducing immune response of these virus strains was determined that KH 05 virus strain was 
highest antigen representative. This virus strain was inactivated by formalin 0.3 %, NNV KH 05 
was emulsified by Montanide ISA 70 that could generate antibody, neutralized with high 
virulence NNV at day 15
th
 in rabbits and antibody protected 80 – 85 % in groupers at day 20th 
after inducing immunity. This result could be used as basis for producing vaccine against VNN 
disease. 
Key words: Grouper, Nervous Necrosis Virus (NNV), TCID50, LD50, Neutralizing antibody, 
Protective antibody 
---------------------------------------------------------------------------------------- 
1
 Khoa C«ng nghÖ sinh häc, ViÖn §¹i häc Më Hµ Néi 
2 Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ 
3 Công ty Cổ phần phát triển Công nghệ Nông thôn-RTD 
4 
 Khoa Nông lâm ngư, trường Đại học Vinh 
 2 
I. Đặt vấn đề 
Bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous necrosis-VNN) do Nervous Necrosis Virut- NNV là 
bệnh cấp tính, xuất hiện trên 22 loài cá, trong đó có các loài: cá mú (Epinephelus sp.), cá chình 
(Anguilla anguilla), cá chẽm (Lates calcarifer), cá giò (Racycentron canadum). Bệnh chủ yếu 
trên cá giống, gây tỷ lệ chết có thể lên đến 90 – 100%. Ở Việt Nam, virut này đã được phát hiện 
thấy trên cá mú ngoài tự nhiên và cá chình nước ngọt [1,2]. 
Hầu hết những nghiên cứu về VNN đều cho thấy: mô đích của NNV là hệ thần kinh trung 
ương (gồm não và tuỷ sống) và võng mạc [5]. Virut này gây hoại tử các nơron thần kinh dẫn đến 
những biểu hiện bất thường như bơi không định hướng, chủ yếu theo hình trôn ốc hoặc lao thẳng, 
nhanh về phía trước [4]. 
Hiện tại, việc phòng bệnh hoại tử thần kinh được thực hiện theo 2 hướng: Loại trừ con 
giống mang mầm bệnh và sử dụng vacxin [3]. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích 
xác định khả năng gây đáp ứng miễn dịch của NNV trên cá mú để làm cơ sở cho sản xuất vacxin 
sau này. 
II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 
2.1. Đối tượng 
8 chủng NNV ký hiệu là QN 02, QN 05, QN 07, HP 11, NĐ 01, NĐ 11, KH 05, KH 09 
phân lập được từ cá mú mắc bệnh hoại tử thần kinh (VNN) thu thập từ các vùng biển Quảng 
Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Khánh Hòa. 
2.2 Phương pháp nghiên cứu 
2.2.1 Nuôi cấy virut trên tế bào 
NNV được nuôi bằng tế bào GS 1 (grouper spleen). Trước khi sử dụng, tế bào được hoạt 
hóa trong chai nuôi cấy với môi trường Leibovitz’s L-15 (L 15) có bổ xung 10% huyết thanh bào 
thai bê (FCS). Tế bào được nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 27oC, 5% CO2 
 trong 2 ngày để đạt mật độ 
10
5 tế bào/ml. 
Mẫu NNV được lây nhiễm trên tế bào GS 01 đã hoạt hóa. Chai đối chứng chỉ có tế bào GS 
và môi trường L-15 có bổ sung 10% FCS. 
Theo dõi hiệu ứng huỷ hoại tế bào (CPE-cytopathic effect) mỗi ngày. Khi CPE đạt khoảng 
90-95% thu dịch virut khỏi chai nuôi cấy rồi ly tâm thu dịch nổi có chứa virut. 
2.2.2. Chuẩn độ virut 
* TCID50 
 Chuẩn độ virut được thực hiện trên đĩa nhựa 96 giếng nuôi tế bào GS 1. 
Dịch virut được tiến hành pha loãng theo hệ số 10 trong môi trường Hank’s rồi bổ sung vào 
các giếng tế bào. Virut được hấp phụ vào tế bào trong 2 giờ. Tiếp tục nuôi tế bào bằng Leibovitz’s 
L-15 có 10% FCS. 
Quan sát hiện CPE trong vòng 5 ngày đê xác định TCID50 theo phương pháp của Reed và 
Muench. 
* LD50 
Cá mú con có kích thước 1,5 cm được chia thành 8 lô, mỗi lô 30 con gây nhiễm với 8 
chủng VNN phân lập được từ các vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Khánh Hòa, 
Bình Thuận. Lô đối chứng được tiêm Leibovitz’s L-15 10%. 
+Phương pháp gây nhiễm: Dịch virut được pha loãng theo hệ số 10 trong môi trường 
Leibovitz’s L-15 rồi tiêm 0,1ml/con. 
 3 
+ Vị trí tiêm: Dưới gốc vây đuôi. 
+ Thời gian theo dõi cá: bắt đầu từ 6 giờ đến 15 ngày sau khi gây nhiễm. 
Sau tiêm truyền, quan sát các biểu hiện lâm sàng, tỷ lệ chết, kiểm tra gen mã hóa kháng 
nguyên bề mặt. 
LD50 được tính dựa theo phương pháp của Reed và Muench (1938). 
2.2.3. Phương pháp gây bất hoạt virut 
NNV được bất hoạt bởi formalin với 3 nồng độ: 0,1%; 0,3%; 0,5% ở nhiệt độ 37°C trong 
12h. Sau 12h trung hòa formalin bằng sodium phosphate, thực hiện lắc dịch liên tục trong 24 giờ. 
2.2.4. Phương pháp RT-PCR 
 ARN tổng số của NNV được tách bằng kit RNA extraction (Qiagen). ADN bổ sung 
được tạo thành từ phản ứng RT- PCR với bộ kit RT-PCR (Invitrogen) và cặp mồi PCR F1 
–R3 [4] (5’-GGATTTGGACGTGCGACCAA-3’; 5’-CGAGTCAACACGGGTGAAGA-
3’) (Invitrogen). Phản ứng được thực hiện với 30 chu kỳ theo các chu trình nhiệt: 900C/5 
phút, 55
0
C/45 giây, 72
0C/1 phút. Sau đó, phản ứng được tiếp tục ở 720C/10 phút. 
2.2.5. Phương pháp ELISA trực tiếp 
Phản ứng được thực hiện với kháng thể pha loãng trong dung dịch đệm carbonate, mỗi 
giếng phủ 100l rồi ủ qua đêm ở nhiệt độ 40C; Dịch kháng nguyên pha loãng theo tỷ lệ 1/400 
trong PBS, ủ ở nhiệt độ 370C/ 1 giờ; Goat anti-rabbit IgG HRPO (Sigma) pha loãng 1/10.000, ủ ở 
nhiệt độ phòng trong 45 phút; cơ chất sinh màu TMB ủ trong 15 phút ở 370C và dừng phản ứng 
bằng H2SO4 1M. Đọc kết quả phản ứng trên máy đọc đĩa ELISA, bước sóng 450nm. 
III. Kết quả nghiên cứu 
3.1 Nghiên cứu khả năng gây nhiễm của NNV 
3.1.1 Xác định liều TCID50 của NNV trên tế bào mẫn cảm 
Liều TCID50 của 8 chủng NNV thí nghiệm được xác định dựa trên mức độ hủy hoại tế bào 
GS 1 sau 5 ngày gây nhiễm Kết quả trình bày trong bảng 1. 
Bảng 1. Kết quả gây nhiễm virut trên tế bào GS 01 
STT 
Ký hiệu 
mẫu 
CPE theo các độ pha loãng virut (%) 
TCID50 
10
-1 
10
-2
 10
-3
 10
-4
 10
-5
 10
-6
 10
-7
 10
-8
 10
-9
1 QN 02 100 100 98 85 80 70 50 25 10 10
-6,9 
2 QN 05 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10
-6,8 
6 QN 07 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10
-6,8 
8 HP 11 70 70 60 50 35 20 5 + + 10
-3,9
9 NĐ 01 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10-6,8 
12 NĐ 11 95 95 80 75 60 52 35 20 5 10-5,9 
17 KH 05 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10
-6,8
19 KH 09 60 60 50 40 15 5 + - - 10
-3
25 HP 11 55 55 50 30 15 5 + - - 10
-2,7
 4 
3.1.2. Kết quả xác định liều gây chết và gây nhiễm 50% (LD50) trên cá mú 
8 chủng virut phân lập được từ các vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, 
Khánh Hòa được sử dụng để gây nhiễm trên cá mú có kích thước 1,5cm. Theo dõi tỷ lệ cá 
chết có biểu hiện lâm sàng của bệnh hoại tử thần kinh ở các lô thí nghiệm trong 15 ngày 
đồng thời xác định gen mã hóa kháng nguyên của NNV để khẳng định sự có mặt của virut 
trong các mẫu cá chết. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 2. 
 5 
Bảng 2: Kết quả gây nhiễm NNV trên cá mú con 
STT 
Ký 
hiệu 
mẫu 
(n=30) 
Tỷ lệ chết cộng dồn sau 15 ngày (%) theo các độ pha loãng 
virut 
LD50 
Gen T2 
10
-1 
10
-2
 10
-3
 10
-4
 10
-5
 10
-6
 10
-7
 10
-8
 10
-9
 10
-1 
10
-2
 10
-3
 10
-4
 10
-5
 10
-6
 10
-7
 10
-8
 10
-9
1 QN 02 100 100 100 100 80 60 53,3 13,3 13,3 10
-6,2 
+ + + + + + + + + 
2 QN 05 100 100 100 93,3 93,3 80 66,7 53,3 33,3 10
-7,5 
+ + + + + + + + + 
3 QN 07 100 100 100 80 80 73,3 60 46,7 40 10
-7,5
 + + + + + + + + + 
4 NĐ 01 100 100 100 93,3 66,7 53,3 30 26,6 13,3 10-5,5 + + + + + + + + + 
5 NĐ 11 100 100 100 86,7 86,7 66,7 53,3 30 15 10-6,5 + + + + + + + + + 
6 KH 05 100 100 100 73,3 66,7 53,3 53,3 13,3 13,3 10
-6,2
 + + + + + + + + + 
7 KH 09 80 80 53,3 26,6 13,3 6,7 6,7 0 0 10
-2,6
 + + + + + + + + + 
8 HP 11 66,7 53,3 30 13,3 6,7 6,7 6,7 0 0 10
-1,5
 + + + + + + + + + 
9 ĐC 0 0 0 0 0 0 0 0 0 nd - - - - - - - - - 
Ghi chú: nd: không tính toán, gen T2: gen mã hóa kháng nguyên của NNV [4] +: dương tính với gen T2, -: âm tính với gen T2, 
 ĐC: tiêm Leibovitz’s L-15 
 76 
8 chủng NNV tiếp tục được gây nhiễm cho cá mú con với liều LD50 để đánh 
giá độc lực của virut thông qua mức độ gây chết cá tại các thời điểm theo dõi thí 
nghiệm. Các mẫu cá chết có biểu hiện của bệnh hoại tử thần kinh được giám định 
đồng thời gen T2. 
Bảng 3. Kết quả gây nhiễm cá mú con với các chủng NNV đã phân lập 
Bố trí lô thí 
nghiệm (n=30) 
LD50 
Tỷ lệ chết tích lũy (%) theo thời gian gây nhiễm 
(h) Gen T2 
24 36 72 96 120 
QN 02 10
-6,2
 13,3 46,7 100 + 
QN 05 10
-7,5
 23,3 63,3 100 + 
QN 07 10
-7,5
 26,7 50 100 + 
NĐ 01 10
-5,5
 16,7 23,3 40 56,7 73,3 + 
NĐ 11 10
-6,5
 23,3 43,3 63,3 83,3 100 + 
KH 05 10
-6,2
 30 36,7 100 + 
KH 09 10
-2,6
 10 16,7 33 40 75 + 
HP 11 10
-1,5
 3,3 13,3 30 46,7 72 + 
Đối chứng âm 
(n=15) 
nd 
0 0 0 6,67 6,67 - 
Kết quả trình bày trong bảng 3 cho thấy, ở lô đối chứng âm, 1 cá bị chết khi 
được tiêm Leibovits L15 10%, tỷ lệ chết cộng dồn sau 120 giờ là 6,67%, kiểm tra 
gen T2 cho kết quả âm tính. 
 Có 4/8 chủng gây chết 100% cá ở thời điểm 72 giờ là các chủng QN 02, QN 
05, QN 07 và KH 05, 1 chủng gây chết 100% cá ở thời điểm 120 giờ là NĐ 11, 3 
chủng gây chỉ gây chết 72-75% cá ở thời điểm 120 giờ là các chủng NĐ 01, KH 
09, HP 11. Như vậy, 4 chủng ký hiệu QN 02, QN 05 QN 07 và KH 05 có độc lực 
mạnh hơn các chủng còn lại, các chủng này được sử dụng trong phản ứng trung 
hòa để kiểm tra kháng thể ở động vật thí nghiệm được tiêm NNV. 
3.2. Nghiên cứu khả năng gây đáp ứng miễn dịch của NNV 
3.2.1. Kết quả nghiên cứu khả năng gây đáp ứng miễn dịch của NNV trên thỏ 
 8 chủng NNV phân lập được trên cá mú ở các tỉnh Quảng Ninh, Hải 
Phòng, Nam Định và Khánh Hòa được sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ 
nhằm 2 mục đích: i) lựa chọn được chủng đại diện kháng nguyên, ii) đánh giá khả 
năng trung hòa virut cường độc của kháng thể thu được. 
3.2.1.1. Kết quả lựa chọn chủng NNV đại diện kháng nguyên 
Chủng đại diện kháng nguyên là chủng phải đạt ít nhất 2 tiêu chí: i) có khả 
năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch nhanh, mạnh nhất, ii) kháng thể sinh ra bởi 
chủng này phải nhận biết được nhiều chủng virut NNV khác nhau. 
Để lựa chọn được chủng này, chúng tôi đã tiêm NNV vào thỏ thí nghiệm 
với 2 lần nhắc lại ở các ngày thứ 7 và 15. Theo dõi biến động hiệu giá kháng thể 
trên thỏ bằng phản ứng ELISA. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong đồ thị 1. 
 77 
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
d0 d7 d15 d21 d35 d45 d60
số ngày
E
L
IS
A
 O
D
 4
5
0
n
m
QN02 
QN05
QN07 
NĐ01 
NĐ11
KH05 
KH09 
HP11
Đối chứng âm (L15)
Đồ thị 1. Biến động kháng thể trong máu thỏ được tiêm NNV (ELISA OD450) 
 Kết quả trong đồ thị cho thấy chủng KH 05, KH 09, QN 07 có khả năng gây 
đáp ứng miễn dịch nhanh và mạnh hơn cả trên thỏ thí nghiệm, các chủng còn lại 
gây đáp ứng chậm và kém hơn. Do đó, kháng thể của 3 chủng KH 05, KH 09, QN 
07 được lựa chọn để kiểm tra khả năng nhận biết chéo với các chủng virut gây 
bệnh hoại tử thần kinh khác nhau nhằm tìm ra mẫu kháng thể nhận biết nhiều 
chủng NNV nhất . Thí nghiệm này được thực hiện bởi phản ứng ELISA trực tiếp. 
Kết quả trình bày trong bảng 4. 
Bảng 4. Kết quả kiểm tra khả năng phát hiện chéo các chủng NNV của 
 kháng thể đặc hiệu với 3 chủng KH 05, KH 09, QN 07 (ELISA OD450=1,2) 
Kháng thể 
Chủng virut 
KH 05 KH 09 QN 07 
KH 05 + + - 
KH 09 + + - 
QN 07 + + + 
QN 02 + + + 
QN 05 + + + 
NĐ 01 + + + 
NĐ 11 + + + 
HP 11 + + + 
 Kết quả phản ứng ELISA trực tiếp cho thấy, kháng thể đặc hiệu với hai 
chủng KH 05 và KH 09 có khả năng gây phản ứng chéo với 7 chủng còn lại, trong 
khi đó kháng thể của chủng QN 07 lại không phát hiện được 2 chủng NNV phân 
lập được tại Khánh Hòa. Có thể chủng QN 07 thuộc phân typ khác của NNV. 
Từ kết quả ở bảng 2 và biểu đồ 1, chủng KH 05 được chúng tôi lựa chọn 
làm chủng đại diện kháng nguyên vì chủng này đạt được 2 tiêu chí: có khả năng 
kích thích sinh đáp ứng miễn dịch nhanh, mạnh nhất và kháng thể sinh ra bởi KH 
05 nhận biết được nhiều chủng virut NNV khác nhau. 
NNV KH 05 được bất hoạt bởi formalin ở các nồng độ: 0,1%; 0,3% và 
0,5%. Sau 5 ngày bất hoạt và trung hòa bởi sodium phosphate, virut được tiêm 
 78 
truyền trở lại trên cá mú để đánh giá mức độ bất hoạt. Kết quả thí nghiệm thu được 
trình bày trong bảng 5:. 
Bảng 5. Kết quả đánh giá mức độ bất hoạt của NNV ở các nồng độ formalin 
Nồng độ 
Formalin 
(%) 
Số 
con/lô 
Liều tiêm 
Biểu hiện cá tiêm truyền virut sau 
khi xử lý bằng formalin 
Gen T2 
0,1% 15 0,1ml/con 
Bơi không định hướng trong 3 
ngày đầu, sau đó bơi đứng, bỏ ăn; 
100% lô cá bị chết sau 7 ngày 
+ 
0,3% 15 0,1ml/con 
Cá bình thường, không có biểu 
hiện đặc biệt 
- 
0,5% 15 0,1ml/con 
Cá bình thường, không có biểu 
hiện đặc biệt 
- 
Kết quả thí nghiệm cho thấy, 100% cá chết sau 7 ngày tiêm truyền dịch virut được xử lý 
formalin 0,1%, cho kết quả dương tính với gen T2. Như vậy, nồng độ formalin 0,1% không gây 
bất hoạt hoàn toàn đối với chủng NNV KH 05. 
Ở hai lô virut được xử lý formalin 0,3% và 0,5% chúng tôi không phát hiện cá chết cũng 
như các triệu chứng của bệnh hoại tử thần kinh. Bằng phản ứng RT-PCR, đoạn gen T2 cũng 
không được phát hiện trên cá gây nhiễm. Như vậy hai nồng độ này đã bất hoạt hoàn toàn chủng 
NNV KH 05. 
Từ kết quả trên cho phép chúng tôi xác định rằng, nồng độ formalin 0,3% thích hợp để 
bất hoạt virut, phục vụ gây miễn dịch cho cá thí nghiệm. 
3.2.1.2. Kết quả đánh giá khả năng trung hòa NNV cường độc của kháng thể thu được trên thỏ 
Phản ứng trung hòa được thực hiện với 3 chủng virut cường độc ký hiệu là QN 02, QN 
05 và QN 07 và kháng thể thu được từ thỏ gây miễn dịch với chủng KH 05. Định kỳ thu huyết 
thanh của thỏ để làm phản ứng trung hòa với 03 chủng virut NNV cường độc. Các mẫu kháng thể 
và virut được ủ trong 6 giờ, 370C rồi tiêm trở lại cá mú sạch bệnh. Theo dõi cá trong 3 ngày, kết 
quả trung hòa virut được đánh giá bằng tỷ lệ các nhiễm bệnh và chết được trình bày trong bảng 6. 
Bảng 6. Kết quả trung hòa các chủng NNV cường độc của kháng thể kháng NNV KH 05 
Tên 
chủng 
Tỷ lệ cá mắc bệnh/ chết 
(%) 
Ngày thu huyết thanh 
d0 d7 d15 d21 d35 d45 d60 
QN 02 
(n=20) 
Tỷ lệ cá mắc bệnh (%) 100 100 20 5 0 0 0 
Tỷ lệ cá chết (%) 100 100 0 0 0 0 0 
QN 05 
(n=20) 
Tỷ lệ cá mắc bệnh (%) 100 100 25 10 0 0 0 
Tỷ lệ cá chết (%) 100 75 0 0 0 0 0 
QN 07 
(n=20) 
Tỷ lệ cá mắc bệnh (%) 100 100 35 5 0 0 0 
Tỷ lệ cá chết (%) 100 90 5 0 0 0 0 
Ghi chú: d: ngày thu huyết thanh thỏ 
 79 
Số liệu trong bảng 6 cho thấy, kháng thể trung hòa ở thỏ được sinh ra từ ngày thứ 
35 sau khi gây miễn dịch bằng NNV, 100% cá được tiêm dịch virut trung hòa không bị 
chết với triệu chứng của bệnh hoại tử thần kinh, cũng như không bị nhiễm NNV (giám định 
bằng sự có mặt của gen T2 trong mô não cá và quan sát triệu chứng lâm sàng). Ở ngày thứ 
15, tỷ lệ cá chết và mắc bệnh có sự sai khác ở 03 chủng thí nghiệm, chênh lệch giữa tỷ lệ cá 
mắc bệnh và chết từ 20-30% . 
3.2.2. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của NNV trên cá mú 
Chủng NNV KH 05 bất hoạt được nhũ hóa bằng dầu Montanide ISA70 rồi gây 
đáp ứng miễn dịch cho cá mú 3 lần ở các ngày thứ 1, 7, 10 với liều 0,1 ml/con (hiệu giá 
virut là 10
-6,2) , lô đối chứng tiêm L15 10%. Sau khi gây miễn dịch, cá mú được công 
cường độc bởi các chủng QN 02, QN 05, QN 07 để đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn 
dịch của cá với NNV. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 7: 
Bảng 7: Kết quả tạo đáp ứng miễn dịch của NNV trên cá mú 
Tên chủng 
Tỷ lệ cá mắc bệnh/ chết 
(%) 
Ngày công cường độc (n=20) 
d15 d20 d25 D30 d35 d40 d45 
QN 02 
Tỷ lệ cá mắc bệnh (%) 30 25 25 20 20 15 15 
Tỷ lệ cá chết (%) 15 10 15 15 10 10 10 
QN 05 
Tỷ lệ cá mắc bệnh (%) 35 25 20 15 15 15 15 
Tỷ lệ cá chết (%) 25 15 10 10 10 10 10 
QN 07 
Tỷ lệ cá mắc bệnh (%) 30 20 20 15 15 15 15 
Tỷ lệ cá chết (%) 25 15 20 15 15 10 10 
Theo số liệu trong bảng 7, NNV bất hoạt đã tạo ra kháng thể trong cá thí nghiệm. 
Ở ngày thứ 15, kháng thể sinh ra bảo hộ được 65-70% cá bị công cường độc. Từ ngày thứ 
20-30 kháng thể sinh ra bảo hộ được 80-85% cá bị công cường độc. Lô đối chứng tiêm 
virut bất hoạt nhưng không công cường độc đã không phát hiện thấy gen T2 có trong não 
cá (số liệu không thể hiện trong bảng 7), chứng tỏ cá bị bệnh ở các lô thí nghiệm là do các 
chủng cường độc QN 02, QN 05, QN 07. Kết quả này chỉ ra rằng có thể sản xuất được 
vacxin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho tỷ lệ bảo hộ cao hơn nếu như lựa chọn liều kháng 
nguyên và số lần tiêm nhắc lại phù hợp. 
IV. Kết luận và đề nghị 
- Đã xác định được liều TCID50
, 
LD50 của 8 chủng virut gây bệnh hoại tử thần kinh 
trên cá mú, mức độ gây nhiễm của các chủng khác nhau, trong đó có 4 chủng có độc lực 
mạnh hơn cả là QN 02, QN 05, QN 07 và KH 05. 
- Đã lựa chọn được chủng đại diện kháng nguyên là KH 05. Chủng virut này bị bất 
hoạt bởi formalin 0,3%. 
- NNV KH 05 bất hoạt tạo kháng thể trung hòa với NNV cường độc ở ngày thứ 15 
trên thỏ và kháng thể bảo hộ trên cá là 80- 85% ở ngày thứ 20 sau khi gây miễn dịch. 
 80 
Đề nghị nghiên cứu lặp lại để có cơ sở vững chắc cho SX vacxin. Đề nghị nghiên 
cứu sản xuất vacxin vô hoạt nhũ dầu để phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú. 
Tài liệu tham khảo 
1. Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt (2011). Phát hiện, phân lập và xác định một số đặc 
tính của virut gây bệnh hoại tử thần kinh (Nervous Necrosis Virus) trên cá mú tự nhiên tại 
vùng biển Quảng Ninh. Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, ISSN 0866-7020, số 20, 2011. 
2. Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Thị Vui, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn 
Quang Linh (2012). Xác định virut gây bệnh hoại tử thần kinh (Nervous Necrosis Virut) 
trên cá chình nuôi tại vùng biển miền Trung. Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, ISSN 0866-
7020, số 12, 2012. 
3. Liu W, Hsu CH, Chang CY, Chen HH, Lin CS. (2006). Immune response against 
grouper nervous necrosis virus by vaccination of virus-like particles. Vaccine 24(37-
39):6282-7 
4. Renault, T., Haffner, P., Baudin, L.F., Breuil, G., Bonami, J.R., 1991. Mass 
mortalities in hatchery-reared sea bass Lates calcarifer larvae associated with the 
presence in the brain and retina of virus-like particles. Bull. Eur. Assoc. Fish 
Pathol. 11, 68–73.