Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactic có họat tính kháng Vibrio Parahaemolyticus từ nội tạng tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 181
THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC
¹ Khoa Kỹ thuật Hóa học và Môi trường, Trường Đại học Lạc Hồng
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ HỌAT TÍNH KHÁNG 
Vibrio parahaemolyticus TỪ NỘI TẠNG TÔM THẺ CHÂN TRẮNG 
(Litopenaeus vannamei)
ISOLATION AND SELECTION OF LACTIC ACID BACTERIA AGAINST Vibrio 
parahaemolyticus FROM GASTROINTESTINAL TRACT OF PACIFIC WHITE SHRIMP 
(Litopenaeus vannamei)
Đoàn Thị Tuyết Lê¹*,Đỗ Minh Anh¹, Lê Thị Thu Hương¹
Ngày nhận bài: 20/5/2019; Ngày phản biện thông qua: 16/12/2019; Ngày duyệt đăng: 24/12/2019
TÓM TẮT
Các chủng vi khuẩn lactic (LAB) được sử dụng để tạo chế phẩm sinh học trong nuôi tôm nhờ những đặc 
tính có lợi như hỗ trợ tiêu hóa và ức chế các vi khuẩn gây bệnh. Nghiên cứu này nhằm thu nhận một số chủng 
vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus từ tôm Thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) 
ở huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai làm cơ sở sản xuất chế phẩm sinh học cho tôm. Các chủng có khả năng 
sinh acid được phân lập nhanh bằng cách tăng sinh mẫu trên môi trường tiền chọn lọc MRS Broth + 50mg/l 
Nystatin, rồi chọn lọc trên môi trường MRS agar có bổ sung 0,5% CaCO3 và định tính acid lactic bằng thuốc 
thử Uffelmann; các chủng có hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus cao được tuyển chọn; định danh bằng 
sinh hóa và sinh học phân tử. Kết quả khảo sát khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus của các chủng đã 
được định danh thu được ba chủng Lactobacillus salivarius LIITA1.2.2, Lactobacillus reuteri LIVTA2.4.1 và 
Lactobacillus plantarum LVIITA3.3.9 có khả năng tiết acid lactic và kháng V. parahaemolyticus ở mật độ 105 
cfu/ml, 106 cfu/ml và 107 cfu/ml. 
Từ khóa: Probiotic, lactic acid bacteria (LAB), Vibrio parahaemolyticus, Lactobacillus rhamnosus, 
Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Litopenaeus vannamei
ABSTRACT
The lactic acid bacteria (LAB) are used to create probiotics in shrimp farming due to benefi cial effects 
such as supporting digestion and inhibiting pathogenic bacteria in shrimp. This study aims to acquire certain 
strains of lactic acid bacteria against Vibrio parahaemolyticus from gut of White leg shrimp (Litopenaeus 
vannamei) in Nhon Trach district, Dong Nai province in order to produce probiotic for the shrimp basically. 
The research was carried out by isolating some strains on pre-selective medium MRS Broth + 50mg/l Nystatin 
and seletive medium MRS agar + 0,5% CaCO3; determining lactic acid by the Uffelmann reagent; selecting 
strains with high antibacterial activity; identifying by biochemical and molecular biology methods. Next, 
Vibrio parahaemolyticus antibacterial ability of the identifi ed strains was investigated. The results showed that 
Lactobacillus salivariu LIITA1.2.2, Lactobacillus reuteri LIVTA2.4.1 and Lactobacillus plantarum LVIITA3.3.9 
were selected. These strains could produce lactic acid and resistant to V. parahaemolyticus in density of 105 cfu 
/ml, 106 cfu/ml and 107 cfu/ml.
Keywords: Probiotic, lactic acid bacteria (LAB), Vibrio parahaemolyticus, Lactobacillus rhamnosus, 
Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Litopenaeus vannamei
182 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
I. MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, ngành nuôi trồng 
thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng phát 
triển mạnh mẽ do nhu cầu các sản phẩm thủy 
hải sản gia tăng. Việc lạm dụng thuốc kháng 
sinh và chất khử trùng trong nuôi trồng thủy 
sản để ngăn chặn, kiểm soát dịch bệnh đã gây 
nhiều hậu quả nghiêm trọng, ảnh hưởng đến 
sức khỏe người tiêu dùng (Dorsey, Robertson, 
2013). Hiện nay, probiotics được sử dụng để 
thay thế chất kháng sinh trong thủy sản, giúp 
tăng tỉ lệ sống và phát triển của động vật thủy 
sản (Reyes-Becerril và cs, 2014; Swain và cs, 
2009). Trong số vi sinh vật probiotics, các 
chủng vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng 
trong đường tiêu hóa của vật chủ do cải thiện 
khả năng miễn dịch, cân bằng hệ vi sinh đường 
ruột và tiết ra chất kháng khuẩn như acid lactic, 
acid acetic, bacteriocin ức chế sự phát triển 
của các vi khuẩn gây bệnh (Ige, 2013; Maeda 
và cs, 2014). Những nghiên cứu gần đây cho 
thấy khi bổ sung các chủng vi khuẩn lactic 
vào thức ăn tôm đã hỗ trợ tăng sức đề kháng, 
chống lại vi khuẩn gây bệnh giúp tôm sinh 
trưởng khỏe mạnh (Võ Thị Thứ, 2006; Khuất 
Hữu Thanh, 2010; Chiu và cs, 2007). Các vi 
khuẩn gây bệnh trên tôm hiện nay phải kể đến 
là các chủng vi khuẩn Vibrio. Trong đó, chủng 
V. parahaemolyticus là nguyên nhân gây bệnh 
hoại tử gan tụy cấp trên tôm đặc biệt ở tôm 
thẻ chân trắng (Vaseeharan, Ramasamy, 2003; 
Nguyễn Trọng Nghĩa, 2015)
Đã có một số nghiên cứu trong và ngoài 
nước về các chủng vi khuẩn probiotic phục vụ 
sản suất probiotic cho tôm (Chiu và cs, 2007; 
Ariole, Nyeche, 2013; Võ Thị Thứ, 2006; 
Khuất Hữu Thanh, 2010). Tuy nhiên, những 
nghiên cứu về phân lập các chủng lactic có 
tiềm năng probiotic còn hạn chế trên tôm thẻ 
chân trắng (Litopenaeus vannamei). Hơn nữa, 
hiện nay vẫn chưa có công trình nào công bố 
về phân lập vi khuẩn lactic trên tôm thẻ chân 
trắng ở huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai, địa 
phương được Ủy ban nhân dân tỉnh chọn để 
thực hiện đề án nuôi tôm siêu thâm canh (báo 
Đồng Nai). 
Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện với 
mục tiêu xây dựng quy trình phân lập, tuyển 
chọn, định danh vi khuẩn lactic đơn giản, dễ 
thực hiện, không trùng lặp với các quy trình 
đã công bố và khảo sát hoạt tính kháng Vibrio 
parahaemolyticus từ tôm thẻ chân trắng ở 
Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai. Trên cơ sở đó góp 
phần chủ động về nguồn giống sản xuất chế 
phẩm sinh học cho tôm, nâng cao hiệu quả nuôi 
tôm thẻ chân trắng.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Vật liệu
Mẫu: 60 mẫu nội tạng tôm thẻ chân trắng 
(Litopenaeus vannamei) khỏe mạnh từ 10 
ao nuôi tôm ở huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng 
Nai. Chủng vi sinh vật kiểm định Vibrio 
parahaemolyticus được phân lập từ ao tôm 
bệnh chết (được cung cấp bởi Trung tâm Công 
nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh).
Môi trường và hóa chất: MRSA (Man, 
Rogosa, Sharpe Agar) xuất xứ: Biokar - Pháp; 
MRSB (Man, Rogosa, Sharpe Broth) xuất xứ: 
Biokar - Pháp; NA (Nutrient Agar) xuất xứ: 
Biokar - Pháp; APW: peptone 10g, NaCl 10g, 
nước cất vừa đủ 1 lít, Nystatin 100.000 UI 
(Pharmedic, Việt Nam)
2. Phương pháp nghiên cứu 
2.1. Thu nhận mẫu
Mẫu được lấy ở 10 ao nuôi tôm tại Huyện 
Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai. Lấy 500g tôm tại 
5 vị trí đại diện trên 1 ao nuôi. Các mẫu được 
mã hóa và bảo quản ở 4ºC, chuyển về phòng 
thí nghiệm (Trần Linh Thước, 2007). Mẫu tôm 
được rửa bằng cồn 70%, giải phẫu và thu nhận 
60 mẫu nội tạng (Kongnum, Hongpattarakere, 
2012). Kí hiệu mẫu lần lược là L a b c d e. 
Trong đó: L: Chủng dự định phân lập; a: Số 
đợt lấy mẫu: I, II, II, IV, V,; b: Loại mẫu: T 
(tôm); c: Ao thu mẫu: A1, A2, A3,A10; d: 
Số thứ tự mẫu phân lập: 1,2,3,; e: Số thứ tự 
chủng phân lập: 1,2,3,
2.2. Phân lập 
Cân chính xác 10g mẫu cho vào túi PE 
chứa 90 ml môi trường MRS Broth có bổ sung 
50mg/l Nystatin, ủ kỵ khí ở 37ºC (Nguyen, 
2014; Ishola, Adebayo-Tayo, 2012 có cải tiến). 
Sau 24 giờ, tiến hành pha loãng mẫu tăng sinh 
ở độ pha loãng 10-7. Hút 100 μl dịch pha loãng 
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 183
trải trên môi trường MRS agar + 0,5% CaCO3 
(Khuất Hữu Thanh, 2010), ủ kỵ khí ở 37ºC 
trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng, có 
vòng phân giải CaCO3 và quan sát tế bào dưới 
kính hiển vi. Tiếp theo, khuẩn lạc lựa chọn 
được tăng sinh trong MRS Broth rồi định tính 
acid lactic bằng thuốc thử Uffelmann, bảo quản 
giống trong ống nghiệm thạch nghiêng MRS 
agar ở 4ºC. (Kongnum & Hongpattarakere, 
2012; Nguyen, 2014; Nguyễn Lân Dũng và cs, 
1976).
Định danh bằng sinh hóa: Khả năng 
sinh Catalase, khả năng lên men các nguồn 
carbohydrate, khả năng di động (Vos và cs, 
2011; Trần Linh Thước, 2007).
Định danh bằng phương pháp sinh học 
phân tử
Định danh bằng phương pháp sinh học phân 
tử tại công ty Nam Khoa, địa chỉ: 793/58 Trần 
Xuân Soạn, Phường Tân Hưng, Quận 7, Thành 
phố HCM. Khuếch đại và giải trình tự vùng 
16S rRNA bộ gen vi khuẩn phân lập được. 
So sánh và định danh các chủng bằng chương 
trình BLAST online của NCBI.
Hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn được xác định 
bằng phương pháp đục lỗ (Schillinger, Lücke, 
1989). Môi trường thạch NA bổ sung 15‰ 
NaCl (Kongnum & Hongpattarakere, 2012) 
được trải 100µl V. parahaemolyticus ở mật độ 
105 cfu/ml, sau đó tạo các lỗ thạch đường kính 
10mm. Hút 100µl phần dịch nuôi cấy của mỗi 
chủng vi khuẩn mục tiêu vào các lỗ thạch, ủ 
37ºC. Sau 24 giờ, đo đường kính vòng kháng 
khuẩn (∆D). ∆D = D – d (mm) với D: đường 
kính vòng kháng khuẩn (mm); d: đường kính 
lỗ thạch (mm).
Hoạt tính kháng khuẩn theo thời gian
Nhằm ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh 
học cho tôm, nên việc khảo sát khả năng kháng 
khuẩn của các chủng vi khuẩn tiềm năng 
ở các mật độ khác nhau theo thời gian được 
tiến hành là cần thiết. Vi sinh vật kiểm định V. 
parahaemolyticus được khảo sát ở các mật độ 
105 cfu/ml, 106 cfu/ml và 107 cfu/ml. Quan sát 
và đo đường kính vòng kháng khuẩn theo thời 
gian (24 - 36 - 48 giờ).
III. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
1. Phân lập 
Từ 60 mẫu nội tạng tôm phân lập được 78 
chủng vi khuẩn có khả năng phân giải CaCO3 
(hình 1). Trong đó, 24 chủng vi khuẩn có hình 
que, Gram dương; 54 chủng vi khuẩn còn lại 
Gram âm và Gram dương (hình cầu) bị loại bỏ. 
Tiến hành tăng sinh 24 chủng vi khuẩn nghi 
ngờ và thử nghiệm Uffelmann. Kết quả cho 
thấy 24 chủng vi khuẩn đều có khả năng đổi 
màu Uffelmann, chứng tỏ các chủng vi khuẩn 
đều sinh acid lactic trong quá trình nuôi cấy. 
Bên cạnh đó, các chủng vi khuẩn lựa chọn 
cũng đều có hình que, Gram dương phù hợp 
với các nghiên cứu đã công bố trước đây về 
phân lập các chủng vi khuẩn lactic (Kongnum, 
Hongpattarakere, 2012).
Hình 1: Các khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc 
MRS có bổ sung 0,5% CaCO3.
Vi khuẩn lactic được phân lập từ ruột tôm 
có thể có nguồn gốc từ probiotics được trộn với 
thức ăn. Trong quá trình nuôi tôm, có thể người 
nông dân đã bổ sung các vi khuẩn probiotic như 
Lactobacillus, Bacillus vào thức ăn. Vì thế, sự 
hiện diện của những vi khuẩn này trong đường 
tiêu hóa của tôm là hoàn toàn bình thường. Kết 
quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Khuất 
Hữu Thanh và cs (2009), 60 dòng vi khuẩn LAB 
được tìm thấy trong ruột tôm.
Việc kết hợp tăng sinh mẫu trên môi 
trường tiền chọn lọc (MRS Broth + 50mg/l 
Nystatin), chọn lọc trên môi trường MRS agar 
+ 0,5% CaCO3 và quan sát hình thái tế bào 
đã giúp phân lập nhanh các chủng vi khuẩn 
có khả năng sinh acid. Ngoài ra, thử nghiệm 
khả năng chuyển màu Uffelmann ngay sau 
khi quan sát hình thái tế bào đặc trưng của vi 
khuẩn lactic giúp định tính nhanh khả năng 
sinh acid lactic của các chủng vi khuẩn ngay 
thời điểm phân lập.
184 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
Nystatin đã được Ishola và Adebayo-Tayo 
(2012) bổ sung vào môi trường thạch để phân 
lập vi khuẩn lactic. Quy trình phân lập này đã 
có sự cải tiến khi bổ sung Nystatin vào môi 
trường tiền chọn lọc, bước đầu kiềm hãm sự 
phát triển của nấm. Bên cạnh đó, các chủng vi 
khuẩn lactic được đặc trưng về khả năng sinh 
acid, nên việc lựa chọn môi trường trải mẫu có 
bổ sung CaCO3 là thích hợp. Quy trình cải tiến 
này đã giúp cho việc quan sát, lựa chọn các 
khuẩn lạc đặc trưng và có khả năng sinh acid 
dễ dàng hơn. Trong quá trình phân lập, việc 
chọn các khuẩn lạc đặc trưng của chủng cần 
phân lập là một bước rất quan trọng để phân lập 
chính xác các chủng mục tiêu.
2. Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn lactic 
có hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus 
Kết quả ở hình 2, bảng 1 cho thấy, trong 
24 chủng vi khuẩn phân lập có 8 chủng không 
có khả năng kháng V. parahaemolyticus. 
Trong 16 chủng có khả năng kháng thì 5 
chủng (LIITA1.2.2, LIITA2.1.2, LIVTA2.4.1, 
LIVTA2.4.3, LVIITA3.3.9) có đường kính 
vòng kháng V. parahaemolyticus cao dao 
động từ 5 mm - 10 mm. Các chủng này được 
tuyển chọn để thực hiện định danh tiếp theo. 
Ngoài khả năng tạo acid lactic trong quá trình 
phát triển, vi khuẩn lactic còn sinh ra các hợp 
chất có hoạt tính kháng khuẩn là tiềm năng 
rất quan trọng đang được khai thác trong sản 
xuất probiotic. Một số nghiên cứu trước đây 
cho thấy V. parahaemolyticus trong nước với 
mật độ 105 cfu/ml được nghiên cứu thử nghiệm 
invitro là có khả năng gây bệnh hoại tử gan tụy 
cấp trên tôm (Ariole, Nyeche, 2013; Nguyễn 
Trọng Nghĩa và cs, 2015). Trong nghiên cứu 
này, các chất kháng khuẩn được tạo ra bởi các 
chủng LAB không được xác định. Tuy nhiên, 
nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khả năng kháng 
khuẩn có thể là do sự hiện diện của acid hữu cơ 
như acid lactic và acid acetic (Ma và cs 2009); 
hydro peroxide, carbon dioxide, diacetyl và 
bacteriocin (Ammor và cs, 2006); cạnh tranh 
về chất dinh dưỡng và ngăn cản hình thành 
khuẩn lạc của nhiều vi khuẩn (Tambekar và cs, 
2009). Những chất này có thể được tạo ra bởi 
các chủng LAB được phân lập và có thể ức chế 
sự phát triển của V. parahaemolyticus gây ra 
bệnh hoại tử gan tụy trên tôm.
3. Định danh 
• Đinh danh sinh hóa 
Các chủng vi khuẩn LIITA1.2.2, LIITA2.1.2, 
LIVTA2.4.1, LIVTA2.4.3, LVIITA3.3.9 được 
định danh sơ bộ bằng một số thử nghiệm sinh 
hóa. Kết quả thử sinh hóa cho thấy cả 5 chủng 
đều cho Catalase âm tính, không có khả năng di 
động và có khả năng lên men đường (glucose, 
fructose, maltose, lactose, saccharose). Theo 
khóa phân loại vi khuẩn của Bergey, kết quả 
sinh hóa trên phù hợp với đặc điểm sinh hóa 
của vi khuẩn lacic (Vos và cs, 2011).
Qua các đặc điểm sinh hóa đặc trưng, cả 5 
chủng LIITA1.2.2, LIITA2.1.2, LIVTA2.4.1, 
LIVTA2.4.3 và LVIITA3.3.9 đều nghi ngờ là 
vi khuẩn lactic. Để phân loại đến loài, 5 chủng 
vi khuẩn này được giải trình tự vùng 16s rRNA 
và so sánh trình tự trên chương trình BLAST 
Online của NCBI.
• Định danh phân tử
Trình tự đoạn gen mã hóa 16s rRNA của các 
chủng LIITA1.2.2, LIITA2.1.2, LIVTA2.4.1, 
LIVTA2.4.3 và LVIITA3.3.9 được tra cứu trên 
Genbank bằng chương trình BLAST online 
của NCBI.
Trong 5 chủng nghi ngờ là vi khuẩn lactic 
có 2 chủng là Lactobacillus salivarius, 2 chủng 
là Lactobacillus reuteri, 1 chủng còn lại là 
Lactobacillus plantarum. Trong kết quả định 
danh có xuất hiện 2 loài giống nhau Lactobacillus 
salivarius LIITA1.2.2, Lactobacillus salivarius 
LIITA2.1.2 và Lactobacillus reuteri LIVTA2.4.1, 
Lactobacillus reuteri LIVTA2.4.3 sẽ tiến hành 
lựa chọn các chủng dựa vào kết quả tuyển chọn 
các chủng Lactobacillus có khả năng kháng V. 
parahaemolyticus. Dựa vào bảng 1, đã lựa chọn ra 
2 chủng có khả năng kháng V. parahaemolyticus 
cao là Lactobacillus salivarius LIITA1.2.2 và 
Lactobacillus reuteri LIVTA2.4.1. Tóm lại, từ 
các kết quả tuyển chọn và định danh trên đã 
lựa chọn được 3 chủng Lactobacillus salivarius 
LIITA1.2.2, Lactobacillus reuteri LIVTA2.4.1 
và Lactobacillus plantarum LVIITA3.3.9 để 
tiến hành các khảo sát khả năng kháng khuẩn 
theo thời gian.
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 185
4. Khả năng kháng khuẩn theo thời gian
Đường kính vòng kháng vi sinh vật kiểm 
định V. parahaemolyticus ở mật độ 105 cfu/
ml, 106 cfu/ml, 107 cfu/ml sau 24 giờ nuôi cấy 
của L. salivarius LIITA1.2.2, L. plantarum 
LVIITA3.3.9, L. reuteri LIVTA2.4.1 nằm ở 
khoảng từ 6 mm - 15 mm. Đường kính vòng 
kháng V. parahaemolyticus sau 36 giờ và 48 
giờ nuôi cấy của 3 chủng Lactobacillus khảo 
sát với V. parahaemolyticus ở mật độ 105 
cfu/ml, 106 cfu/ml cho thấy khả năng kháng 
V. parahaemolyticus không có sự thay đổi 
nhiều (bảng 2).
Tuy nhiên, trong khoảng từ 24 giờ đến 48 
giờ khi mật độ vi khuẩn gây bệnh đạt 107 cfu/
ml, khả năng kháng V. parahaemolyticus của 3 
chủng đã có sự thay đổi nhất định. Đường kính 
vòng kháng V. parahaemolyticus của 3 chủng 
phân lập hẹp dần do sự phát triển của chủng 
kiểm định (bảng 2). Kết quả này cũng phù hợp 
với những nghiên cứu về khả năng kháng V. 
parahaemolyticus của các chủng Lactobacillus 
đã công bố trước đây (Khuất Hữu Thanh và cs, 
2009).
Tóm lại, từ các kết quả kháng V. 
parahaemolyticus trên cho thấy các chủng vi 
khuẩn lactic phân lập được có khả năng kháng 
vi sinh vật kiểm định V. parahaemolyticus ở các 
mật độ 105 cfu/ml, 106 cfu/ml và 107 cfu/ml.
Lactobacillus salivarius LIITA1.2.2
CTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAAACTTTCTTACACCGAATGCTTGCATTCACCGTA-
AGAAGTTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTAAAAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCG-
TATATCTCTAAGGATCGCATGATCCTTAGATGAAAGATGGTTCTGCTATCGCTTTTAGATGGACCCGCGGCGTATTAACTAGTTGGTGGGG-
TAACGGCCTACCAAGGTGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAG-
GCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTT-
GTTAGAGAAGAACACGAGTGAGAGTAACTGTTCATTCGATGACGGTATCTAACCAGCAAGTCACGGCTAACTACGTG
Lactobacillus reuteri LIVTA2.4.1 
AGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAA-
CACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTT-
GAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGC-
CGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCG-
CAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACT-
GTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCC
Lactobacillus plantarum LVIITA3.3.9 
GAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCAT-
CATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTA-
ATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTCTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATG-
GTGAGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTAC-
GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAA-
ACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCA
GCC
Hình 2: Đường kính vòng kháng V. parahaemolyticus của các chủng vi khuẩn (D-d (mm)).
Hình 3: Trình tự đoạn gen mã hóa 16s rRNA của các chủng vi khuẩn lactic được lựa chọn.
186 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
IV. KẾT LUẬN
Ba chủng Lactobacillus salivarius LIITA1.2.2, 
Lactobacillus reuteri LIVTA2.4.1 và Lactobacillus 
plantarum LVIITA3.3.9 phân lập được có khả 
năng tiết acid lactic và kháng V. parahaemolyticus 
ở mật độ 105 cfu/ml, 106 cfu/ml và 107 cfu/ml.
Bảng 1: Đường kính vòng kháng V. parahaemolyticus của các chủng vi khuẩn lactic (∆D =D-d (mm))
STT Chủng ∆D STT Chủng ∆D
1 LIITA1.2.2 9,67 13 LTVIIA1.1.8 1
2 LIITA2.1.2 5 14 LVIITA2.1.2 1,67
3 LIIITA1.1.1 1.5 15 LVIITA2.1.7 0,5
4 LIITA1.2.3 4 16 LVIITA2.1.10 3,5
5 LIIITA2.4.3 1 17 LVIITA2.1.11 0
6 LIVTA1.1.1 1,5 18 LVIITA2.1.1 0
7 LIVTA2.4.1 8 19 LVIITA2.2.3 4
8 LIVTA2.4.3 6,17 20 LVIITA2.1.12 0
9 LVIITA1.1.1 0 21 LVIITA3.1.6 1
10 LVIITA1.1.3 0 22 LVIITA3.1.9 0
11 LVIITA1.1.4 0 23 LVIITA3.2.4 2
12 LVIITA1.1.5 0 24 LVIITA3.3.9 10
V.parahaemolyticus 
(cfu/ml)
Thời gian (giờ)
24 36 48
L. salivarius LIITA1.2.2
(∆D = D-d, mm)
 105 15,5±0,1 9,5±0,1 9±0,1
106 12±0,1 8,7±0,5 7±0,1
107 11,7±0,5 7,2±0,3 7,3±0,5
L. reuteri LIVTA2.4.1
(∆D = D-d, mm)
105 10,8±0,6 5,3±0,2 4,7±0,5
106 7,2±0,3 4,2±0,1 4±0,1
107 6,3±0,5 4±0,1 3±0,1
L. plantarum LVIITA3.3.9
(∆D = D-d, mm)
105 15,7±0,5 12,3±0,5 7,3±0,5
106 12,2±0,3 10,3±0,5 7,7±0,5
107 11,8±0,6 8,7±0,1 7,3±0,5
Bảng 2: Đường kính vòng kháng V. parahaemolyticus của các chủng vi khuẩn lactic theo thời gian 
LỜI CẢM ƠN
Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn 
Trường Đại học Lạc Hồng đã hỗ trợ kinh phí 
để chúng tôi hoàn thành nghiên cứu này (Mã đề 
tài: LHU-RS-TE-18-01-10).
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 187
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Khuất Hữu Thanh, Nguyễn Đăng, Phúc Hải, Bùi Văn Đạt, Võ Văn Nha, 2009. Phân lập và tuyển chọn một 
số chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic trong tạo chế phẩm nuôi tôm sú. Tạp chí khoa học & công nghệ các 
trường đại học kỹ thuật 47: 113-116.
2. Khuất Hữu Thanh, Bùi Văn Đạt, Bùi Kim Hoa, Nguyễn Thị Hoàng Mai, 2010. Nghiên cứu ứng dụng công 
nghệ sinh học hoàn thiện chế phẩm BIO TS3 có khả năng tăng sức đề kháng của tôm trong nuôi tôm sú thâm 
canh. Nhiệm vụ Khoa học và Công nghệ quốc gia. Trường Đại học quốc gia Hà Nội, Viện công nghệ sinh học 
và công nghệ thực phẩm.
3. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, 1976. Một số 
phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 2. Nhà xuất bản khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.
4. Nguyễn Trọng Nghĩa, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trương Quốc Phú và Phạm Anh Tuấn, 2015. Phân lập và 
xác định khả năng gây hoại tử gan tụy của vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus phân lập từ tôm nuôi ở Bạc 
Liêu. Tạp chí Khoa hoc Trường Đại học Cần Thơ 39: 99-107.
5. Trần Linh Thước, 2007. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm. Nhà xuất 
bản Giáo dục, Hà Nội.
6. Võ Thị Thứ, 2006. Dự án hoàn thiện và triển khai công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ xử lý môi 
trường nuôi trồng thủy sản. Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
7. 
Tiếng Anh
8. Ammor, S., Tauveron, G., Dufour, E., and Chevallier, I., 2006. Antibacterial activity of lactic acid bacteria 
against spoilage and pathogenic bacteria isolated from the same meat small-scale facility: 1-Screening and 
characterization of the antibacterial compounds. Food Control, 17(6): 454-461. 
9. Ariole, C. N., Nyeche G. E., 2013. In vitro antimicrobial activity of Lactobacillus isolates against shrimp 
(Penaeus monodon) pathogens. International Journal of Biosciences, 3 (1): 7-12.
10. Chiu, C.H., Guu, Y.K., Pan, T.M., Cheng, W., 2007. Immune responses and gene expression in white 
shrimp, Litopenaeus vannamei, induced by Lactobacillus plantarum. Fish & Shellfish Immunology, 23: 364-
377.
11. Dorsey, D., Robertson, W., 2013. Recent advances in fi sh diseases treatment: probiotics as alternative 
therapy to antibiotics in aquaculture. Eur. J. Ocean, Mar 11: 20-28.
12. Ige, B.A. 2013. Probiotics use in intensive fi sh farming. Afr. J. Microbiol. Res, 7: 2701-2711.
13. Ishola, R.O., Adebayo Tayo, B.C., 2012. Screening lactic acid bacteria isolated from Fermented food for 
Bio-molecules production. Aust. J. Tech, 15(4): 205-217.
14. Kongnum, K., Hongpattarakere, T., 2012. Effect of Lactobacillus plantarum isolated from digestive tract of 
wild shrimp on growth and survival of white shrimp (Litopenaeus vannamei) challenged with Vibrio Harveyi. 
Fish and Shellfish Immunology, 32: 170-177.
15. Ma, C.W., Cho, Y.S., and Oh, K.H., 2009. Removal of pathogenic bacteria and nitrogens by Lactobacillus 
spp. JK-8 and JK-11. Aquaculture, 287: 266-270.
16. Maeda, M., Shibata, A., Biswas, G., Korenaga, H., Kono, T., Itami, T., Sakai, M., 2014. Isolation of lactic 
acid bacteria from kuruma shrimp (Marsupenaeus japonicus) intestine andassessment of immunomodulatory 
role of a selected strain as probiotic. Biotechnol, 16: 181-192.
188 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2019
17. Nguyen, P.M., 2014. Isolation, identifi cation and characterization of Lactobacillus on black tiger shrimp. 
International Journal of Multidisciplinary Research and Development, 6: 153-158.
18. Reyes-Becerril, M., Ascencio, F., Gracia-Lopez, V., Macias, M,E,, Roa, M.C., Esteban, M.A., 2014. Single 
or combined effects of Lactobacillus sakei and inulin on growth, nonspecifi c immunity and IgM expression in 
leopard grouper (Mycteroperca rosacea). Fish Physiol. Biochem, 40: 1169-1180.
19. Schillinger, U., Lücke, F. K., 1989. Antibacterial activity of Lactobacillus sakei isolated from meat. Applied 
and Environmental Microbiology, 55: 1901-1906.
20. Swain, S.M., Singh, C., Arul, V., 2009. Inhibitory activity of probiotics Streptococcus phocae PI80 and 
Enterococcus faecium MC13 against Vibriosis in shrimp Penaeus monodon. World J. Microbiol. Biotechnol 
25:697-703.
21. Tambekar, D.H., Bhutada, S.A., Choudhary, S.D., and Khond, M.D., 2009. Assessment of potential 
probiotic bacteria isolated from milk of domestic animals. Journal of applied biosciences, 15: 815-819.
22. Vaseeharan, B., Ramasamy, P., 2003. Control of pathogenic Vibrio spp. by Bacillus subtilis BT23, a possible 
probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus monodon. Letters in Applied Microbiology, 36: 83-87. 
23. Vos, P., Garrity, G., Jones, D., Krieg, N.R., , W., Rainey, F.A., Schleifer, K.H., Whitman, W., 2011. Bergey’s 
Manual Of Systematic Bacteriology, Second Edition, Volume Three, The Firmicutes: 465-512.