Tạo chủng Vibrio Harveyi đột biến gen WZZ có khả năng biểu hiện Protein vỏ VP28 của vi rút gây bệnh đốm trắng WSSV (White spot syndrome virus) trên tôm

117
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
Plumb, J. A., Vinitnantharat, S., Paterson, W. D., 
Salonius, K., A.F.S.F.H.S, 1995. Prevention of 
enteric septicemia in catfish by vaccination. Diseases 
in Asia Aquaculture, 2: 399 - 404.
Reed, L.J., & H. Muench, 1938. A simple method 
of estimaing fifty percent endpoints. Journal of 
Epidemiology, 27 (3): 493 - 497.
Shoemaker C, Klesius P, Bricker J, 1999. Efficacy 
of a modified live Edwardsiella ictaluri vaccine in 
channel catfish as young as seven days post hatch. 
Aquaculture 176(3):189 - 193. 
Thune, R.L., Fernandez, D.H., & Battista, J.R, 1999. 
An aroA Mutant of Edwardsiella ictaluri Is Safe and 
Efficacious as a Live, Attenuated Vaccine. Journal of 
Aquatic Animal Health 11(4):358–372. 
Waltman, W.D., Shotts, E.B., & Hsu, T.C., 1986. 
Biochemical characteristics of Edwardsiella ictaluri. 
Applied and environmental microbiology, 51(1): 101 - 4. 
Yuasa, K., Kholidin, E.B., Panigoro, N., & Hatai, K, 
2003. First Isolation of Edwardsiella ictaluri from 
Cultured Striped Catfish Pangasius hypophthalmus 
in Indonesia. Fish Pathology, 38 (4): 181-183.
Edwardsiella ictaluri wzz mutant as a potential vaccine for preventing 
bacillary necrosis on catfish (Pangasionodon hypophthalmus)
Bui Thi Thanh Tinh, Tran Hanh Triet, Tran Van Huong, 
Vu Thi Thanh Huong, Duong Hoa Xo, Nguyen Quoc Binh 
Abstract 
Bacillary necrosis on catfish (P. phthalmus) infected by Edwardsiella ictaluri causes major economic losses because 
of high mortality rates (60 - 80 %) and occur at high frequency. Vaccination is an urgent issue as use of antibiotic 
leads to drug resistance and hinders export. However, the type of the vaccine as well as the mode of vaccination, 
stage of fish development to vaccinate is the problems to resolve. Biotechnology Center of Ho Chi Minh conducted 
studies on live attenuated Edwardsiella ictaluri strains against bacillary necrosis and found the Edwardsiella ictaluri 
wzz mutant (O-antigen chain length determinant gene) was created by knockout gene method which gave the best 
results. Laboratory-scale experiments showed that this strain was safe and had efficacious in Tra catfish by one time 
immersion at fried stage and 2.5-month-old Tra catfish with relative percent survival were 30% and 65%, respectively, 
while it was 95% for the twice immersion fish at fried stage and 2.5-month-old Tra catfish. This is an attenuated 
Edwardsiella ictaluri strains have potentials used as immersion vaccine for Tra catfish.
Keywords: Edwardsiella ictaluri, modified live Edwardsiella ictaluri vaccine, Tra catfish (Pangasionodon hypophthalmus), 
Bacillary necrosis
Ngày nhận bài: 2/6/2018
Ngày phản biện: 20/6/2018
Người phản biện: PGS.TS. Phạm Minh Đức
Ngày duyệt đăng: 16/7/2018
1 Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh 
TẠO CHỦNG VIBRIO HARVEYI ĐỘT BIẾN GEN WZZ CÓ KHẢ NĂNG 
BIỂU HIỆN PROTEIN VỎ VP28 CỦA VI RÚT GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG WSSV 
(WHITE SPOT SYNDROME VIRUS) TRÊN TÔM
Mai Thu Thảo1, Trần Phạm Vũ Linh1, Ngô Huỳnh Phương Thảo1, 
Lâm Vỹ Nguyên1, Nguyễn Quốc Bình1
TÓM TẮT
Trên thế giới đã có nhiều cách tiếp cận để phát triển các chế phẩm ngăn ngừa bệnh đốm trắng ở tôm. Trong 
nghiên cứu này, nhóm tác giả tiếp cận bằng cách gây đột biến gen trên chủng Vibrio harveyi gây bệnh phát sáng trên 
tôm và biểu hiện protein vỏ VP28 của vi rút gây bệnh đốm trắng trên chủng này. Cassette HKTwzz (ΔHKTwzz) gồm 
trình tự Hwzz (phần đầu gen wzz); K (trình tự gen kháng Kanamycin), Twzz (phần cuối gen wzz) được tạo ra bằng 
PCR overlap. Sau đó, trình tự Ptac-VP28 được chèn vào ΔHKTwzz nhờ vào vị trí enzyme NdeI nằm trên cassette. 
ΔHKTwzz có gắn Ptac-VP28 được chèn vào pGP704 và tạo dòng trong E. coli SM10λpir. Chủng đột biến được tạo 
ra bằng phương pháp tiếp hợp giữa chủng cho là E. coli SM10λpir::pGP704::ΔHKTwzz::Ptac-VP28 và chủng nhận 
Vibrio harveyi hoang dại BL1 (được thu nhận từ ao tôm bệnh ở Bạc Liêu) dựa trên cơ chế tái tổ hợp tương đồng trên 
vùng trình tự Hwzz và Twzz. Các kết quả kiểm tra biểu hiện bằng phương pháp SDS-PAGE và Western Blot cho thấy 
chủng đột biến có khả năng biểu hiện protein vỏ VP28.
Từ khóa: Knock-out gen, pGP704, SM10λpir, tiếp hợp, tái tổ hợp tương đồng
118
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh đốm trắng luôn là dịch bệnh nguy hiểm 
nhất đối với ngành nuôi tôm. Một khi đã mắc bệnh, 
tôm có thể chết cả ao trong vòng 3 - 10 ngày. Nghiên 
cứu vắc xin cho tôm đang đặt ra thách thức đối với 
các nhà khoa học. Đối với tôm không thể gây đáp 
ứng miễn dịch 1 lần và đòi hỏi bộ nhớ miễn dịch duy 
trì lâu dài để bảo vệ tôm khỏi các kháng nguyên xâm 
nhập (Rowley and Powell, 2007). VP28 là protein cấu 
trúc của WSSV và cũng là protein quan trọng nhất 
cho cơ chế xâm nhiễm vào tế bào của WSSV. Protein 
dung hợp VP28-EGFP có khả năng bám vào tế bào 
tôm ở pH=6 trong vòng 0,5 h. Nhóm nghiên cứu 
đã tìm thấy VP28-EGFP có mặt trong tế bào chất. 
Điều này có thể giải thích VP28 đã xâm nhập vào tế 
bào tôm bằng cơ chế nhập bào (endocytosis) với cấu 
trúc protein bám vào tế bào tôm tương tự như trên 
màng tế bào WSSV (Qi Y et al., 2004). Ở vi khuẩn, 
chiều dài chuỗi O-antigen được điều hòa bởi gen 
wzz, còn được gọi là Cld [chain length determinant] 
hay Rol [regulator of O-antigen length]. Khi chủng 
vi khuẩn bị đột biến gen wzz thì chiều dài chuỗi 
O-antigen sẽ phân bố một cách ngẫu nhiên (Franco 
et al., 1998; Najdenski et al., 2003). Từ đó, chủng đột 
biến sẽ bị giảm tính độc hoặc mất đi tính độc do 
chuỗi O-antigen gây ra. Nghiên cứu này đã sử dụng 
Vibrio harveyi, là một vi khuẩn gây bệnh phát sáng 
trên tôm (Liu et al., 1996) được gây đột biến bằng 
phương pháp loại bỏ một phần gen wzz và biểu hiện 
protein vỏ VP28 trong chủng này với mục tiêu sử 
dụng chủng này như một vật mang protein vỏ VP28 
vào trong cơ thể tôm.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Chủng hoang dại Vibrio harveyi BL1 được phân 
lập từ ao nuôi tôm tại tỉnh Bạc Liêu; các chủng E. 
coli SM10 λpir, E. coli BL21 được cung cấp bởi Trung 
tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM; các véc tơ tạo 
dòng: pJET 1.2/blunt, pKD4, pGP704; môi trường 
TCBS (Thiosulfate - Citrate Bile - Sucrose), VHA 
(Vibrio harveyi agar) để phân lập V. harveyi; hóa chất 
sinh học phân tử: primer, master mix PCR, enzyme 
cắt giới hạn NedI, enzyme bất hoạt đầu 3’-P.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập và định danh vi khuẩn
Đĩa TCBS phân lập Vibrio spp. được thu nhận tại 
Chi cục nuôi trồng Thủy Sản tỉnh Bạc Liêu. Khi đem 
về Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh, 
tiến hành phân lập trên môi trường VHA (Harris et 
al., 1996), môi trường dùng để định danh V. harveyi 
và tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi F-luxN, 
R-luxN (Hernandez and Olmos, 2004) đặc hiệu cho 
V. harveyi khuếch đại vùng trình tự dài 2048 bp trên 
gen luxN của V. harveyi (Bảng 1). 
Bảng 1. Danh sách các cặp mồi sử dụng trong quá trình tạo cassette HKTwzz
STT Tên mồi Gen Trình tự
1
F-luxN
luxN
5’- CTGTGTACTCACTGTTTATC-3’
R-luxN 5’- GTCTAATTCGCGTTCTCCA -3’
2
KF
Kanamycin
5’- GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
KR 5’- GACATGGGAATTAGCCATGGTCC -3’
3
WF1
Hwzz
5’- ACGGTCAGATGCCAATAGCTCCTG-3’
WR1 5’-GAAGCAGCTCCAGCCTACACAGACGAAAAGCT-GTTCAGCGAAGC -3’
4
WF2
Twzz
5’- GGACCATGGCTAATTCCCATGTCGGGACTTGATTC-
GTAGGGGC-3’
WR2 5’- GTGGCAATCAATAGCTTCCGCCT-3’
5 Fi-K Vùng trình tự 435 bp bên trong gen 
kanamycin
5’- CTGGACGAAGAGCATCAGGG -3’
Ri-K 5’- CGGAAAACGATTCCGAAGCC -3’
6
Fo-wzz Vùng trình tự 
2384 bp bên ngoài 
gen wzz
5’-TTACCGAAAGCAGAGGTGGG-3’
Ro-wzz 5’-TCCTGATCACTTCAGACGGC-3’
7
VP28-F
VP28
5’-ATGGATCTTTCTTTCACTCTTTCGG-3
VP28-R 5’-TTACTCGGTCTCAGTGCCAGAG-3’
119
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
2.2.2. Tạo chủng E.coli SM10λpir mang plasmid 
pGP704 có chèn cassette HKTwzz gắn vùng trình tự 
Ptac-VP28 (ΔHKTwzz::Ptac-VP28)
Đoạn đầu Hwzz và đoạn cuối Twzz được khuếch 
đại từ bộ gen chủng V. harveyi với các cặp mồi 
WF1+WR1 và WF2+WR2; gen Kanamycin (K) 
được khuếch đại từ plasmid pKD4 bằng cặp mồi 
KF+KR (Bảng 1). 
Ba đoạn gen được tiến hành PCR overlap để tạo 
trình tự HKTwzz. Cassette HKTwzz được chèn vào 
trong véc tơ pGP704 (trường Đại học Harvard) và 
tạo dòng trong E.coli DH5αλpir (Biomedal). Trình 
tự Ptac-VP28 được gắn vào vector pAmCyanN1-1 
đã được kiểm tra biểu hiện tốt trong E.coli BL21. Tiến 
hành cắt mở vòng pGP704::HKTwzz tại vị trí NdeI để 
gắn trình tự Ptac-VP28 vào véc tơ tái tổ hợp tại vị trí 
này. Véc tơ tái tổ hợp pGP704::HKTwzz::Ptac-VP28 
được tạo dòng trong E.coli SM10λpir (Biomedal). 
ΔHKTwzz::Ptac-VP28 được sử dụng để gây đột biến 
gen wzz và có gen kháng kanamycin là chỉ thị để 
chọn lọc dòng đột biến (Hình 1). 
Hình 1. Sơ đồ vị trí cắt NdeI trên Δ HKTwzz 
để chèn Ptac-VP28
2.2.3. Tiếp hợp
SM10λpir chứa cassette được sử dụng làm chủng 
cho vì nó có yếu tố chuyển RP4 nằm trên nhiễm sắc 
thể và chứa gen pir mã hóa cho protein π cho phép 
các véc tơ pGP704 mang điểm khởi đầu sao chép 
oriR6K nhân lên; đồng thời pGP704 cũng mang yếu 
tố di động mob nên có thể sát nhập vào nhiễm sắc 
thể SM10 λpir và di chuyển vào trong chủng nhận là 
Vibrio harveyi (Thune et al., 2011). 
Trộn 2 chủng E. coli SM10λpir và V. harveyi theo 
tỷ lệ 1 : 1 và ủ qua đêm ở 28oC để diễn ra quá trình 
tái tổ hợp tương đồng. Sau quá trình tiếp hợp véc 
tơ pGP704 mang cassette đi vào trong bộ gen chủng 
nhận nhưng không thể nhân lên vì thiếu gen pir, 
ΔHKTwzz::Ptac-VP28 có thể sát nhập vào bộ gen 
nhiễm sắc thể bằng tái tổ hợp tương đồng nhờ sự 
trao đổi chéo giữa 2 vùng trình tự tương đồng trên 
véc tơ và gen tương ứng trên nhiễm sắc thể. Quá 
trình chọn lọc chủng đột biến trên môi trường LB 
có chứa kháng sinh kanamycin và colistin. Vì véc tơ 
pGP704 không tự nhân lên được trong chủng nhận 
V. harveyi nên các khuẩn lạc V. harveyi mọc trên 
môi trường có chứa kháng sinh được nghi ngờ là 
các dòng vi khuẩn đột biến gen (Hình 2). Chủng đột 
biến được ký hiệu VH-WzM::Ptac-VP28.
Hình 2. Sơ đồ trao đổi chéo giữa 2 vùng trình tự tương 
đồng trong quá trình tiếp hợp giữa E. coli và V. harveyi 
2.2.4. Ki2.4. -WzM::Ptac-VP28. 
Vùng trình tự bị loại bỏ của gen wzz dài 1521 
bp thay vào đó là trình tự gen kháng Kanamycin và 
Ptac-VP28 dài 2200 bp. Tiến hành kiểm tra trước và 
sau đột biến bằng PCR với các cặp mồi sau theo như 
sơ đồ (Hình 3).
Hình 3. Sơ đồ các cặp mồi kiểm tra chủng đột biến
120
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
- Fo-wzz + Ri-K và Ro-wzz + Fi-K: trình tự mồi 
Fo-wzz nằm trên genome của V. harveyi, nằm ngoài 
mồi WF1, trình tự mồi Ro-wzz nằm trên genome 
của V. harveyi, nằm ngoài mồi WR2. Chạy kết hợp 
2 cặp mồi này cho phép xác định cassette có được 
chèn thẳng trực tiếp vào trong bộ gen của V. harveyi 
hay không. 
- Fi-wzz + Ri-wzz: khuếch đại vùng trình tự nằm 
bên trong gen wzz từ vị trí 460070 đến vị trí 460365. 
Vùng này sẽ bị loại bỏ trong quá trình gây đột biến.
- KF + KR: phát hiện vùng trình tự gen kháng 
kanamycin trong chủng đột biến, có kích thước là 
1498 bp.
2.2.5. Biểu hiện protein vỏ VP28 trong chủng đột biến
Chủng đột biến được lên men ở 280C cho đến khi 
đạt được OD=1. Thu nhận sinh khối và huyền phù 
cặn trong dung dịch đệm (100 mM NaCl, 25 mM Tris 
HCl, pH=8). Tiến hành phá màng tế bào bằng sóng 
siêu âm. Ly tâm để loại bỏ xác tế bào và thu nhận 
dịch protein tổng số. Sau đó, tiến hành tủa protein 
tổng bằng TCA 20%, ủ đá lạnh trong 10 phút, rửa 
cặn 3 lần với acetone lạnh. Sau đó, tiến hành hòa 
tan cặn trong nước. Tiến hành phân tích SDS-PAGE 
và WESTERN BLOT bằng kháng thể thỏ đa dòng 
đặc hiệu kháng VP28 được cung cấp bởi Trung tâm 
Công nghệ Sinh học.
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm 
Công nghệ sinh học Thủy sản, Trung tâm Công nghệ 
Sinh học từ tháng 4/2012 đến tháng 12/2015.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu
3.1.1. Phân lập và định danh vi khuẩn
Đĩa Vibrio phân lập trên môi trường TCBS từ 
Chi cục nuôi trồng Thủy Sản tỉnh Bạc Liêu sau khi 
mang về được cấy truyền lại trên môi trường VHA 
để quan sát hình thái khuẩn lạc trên môi trường này. 
Qua quan sát thấy rằng chủng phát sáng sau khoảng 
18 giờ cấy (Hình 4). Đồng thời, khuẩn lạc trên môi 
trường VHA có hình tròn, nhỏ, đường kính khoảng 
1-2 mm, có màu xanh lá cây sáng bóng ở bên ngoài 
và màu xanh đậm tối ở giữa. Một số khuẩn lạc có 
vòng sáng viền bên ngoài giống với mô tả về hình 
thái khuẩn lạc V. harveyi lạc trên môi trường VHA 
trong nghiên cứu của Lachlan Harris và cộng tác 
viên (1996).
DNA bộ gen được sử dụng làm bản mẫu để 
khuếch đại vùng trình tự 2048 bp từ vị trí 1759 
đến vị trí 3806 của operon LuxN (gb/L13940.1/
VIBLUXLMN) với cặp mồi F-luxN + R-luxN. Kết 
quả chạy điện di sản phẩm PCR có băng đặc trưng 
2048 bp đặc hiệu của V. harveyi (Hình 5).
3.1.2. Tạo chủng E.coli SM10λpir mang plasmid 
pGP704 có chèn cassette HKTwzz gắn vùng trình tự 
Ptac-VP28 (ΔHKTwzz::Ptac-VP28)
Ở lần PCR thứ 1, khuếch đại trình tự các đoạn 
H-wzz (346 bp), T-wzz (303 bp) và gen kháng 
Kanamycin (1498 bp). Kết quả điện di trên gel 
agarose cho ra kết quả đúng với lý thuyết (Hình 6). 
Ở lần PCR thứ 2 khi trộn các đoạn H-wzz, R-wzz, 
Kan theo tỉ lệ 0,1 pmol mỗi đoạn với mồi WF1 và 
WR2 cho sản phẩm có nhiều băng trên bản gel điện 
di. Tinh sạch băng cho kết quả đúng kích thước của 
ΔHKTwzz trên gel bằng kit Introns (Hàn Quốc) cho 
ra đúng một băng có kích thuớc khoảng hơn 2000 
bp (Hình 7).
Véc tơ pGP704::HKTwzz được cắt mở vòng 
với NdeI sẽ cho sản phẩm có 1 băng có kích thước 
khoảng 5845 bp vì pGP704 có kích thước là 3703 bp 
và ΔHKTwzz có kích thước là 2142 bp. Sản phẩm 
Hình 4. Đĩa khuẩn lạc V. harveyi 
phát sáng sau 18 giờ
Hình 5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 
khuếch đại gen luxN. (1): chứng âm nước; (2), 
(3): khuẩn lạc V. harveyi; (4): thang DNA
1 2 3 4
121
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
Hình 6. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 
khuếch đại gen Hwzz (1), Twzz (2), kanamycin (3), 
chứng âm là nước (4), thang DNA (5)
Hình 8. Kết quả điện di sản phẩm 
cắt pGP704::HKTwzz. 
(1): sản phẩm cắt pGP704::HKTwzz 
với NdeI; (2) thang DNA
Hình 7. Kết quả điện di sản phẩm 
tinh sạch ΔHKTwzz
Hình 9. Sản phẩm cắt 
pJET::Ptac-VP28. 
(1): thang DNA; (2): sản phẩm 
cắt pJET::TAC-VP28 với NdeI
Hình 10. Kết quả điện di sản phẩm 
PCR khuẩn lạc với cặp mồi KF và KR. 
(1) Khuẩn lạc E. coli SM10λpir::pG-
P704::ΔHKTwzz::Ptac-VP28; (2) chứng 
âm là nước; (3): SM10λpir::pGP704:: 
HKTwzz; (4): thang DNA
cắt cho ra kết quả khoảng gần 6000 bp (Hình 8) và 
được bất hoạt 2 đầu 5’-P bằng enzyme Antarctic 
Phosphatase. Sản phẩm cắt sau khi bất hoạt đầu 5’-P 
được tinh sạch bằng cồn để thu nhận phân đoạn 
pGP704::HKTwzz ở dạng thẳng có 2 đầu là vị trí cắt 
của NdeI. 
Plamid tái tổ hợp pJET::Ptac-VP28 được cắt với 
NdeI cho ra sản phẩm có 2 băng. Một băng là phân 
đoạn của Ptac-VP28 có kích thước là ~ 700 bp có 2 
đầu là vị trí cắt so le của NdeI. Một băng là phân đoạn 
còn lại của pJET có kích thước là 2974 bp (Hình 9).
Sản phẩm nối được tạo dòng trong E. coli 
SM10λpir và chọn lọc trên môi trường LB + 
ampicilin (100 µg/ml) + kanamycin (100 µg/ml). Vì 
trong ΔHKTwzz có chứa gen kháng kanamycin nên 
các khuẩn lạc được tạo dòng thành công sẽ mọc trên 
môi trường chọn lọc này. 
Kết quả kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi KF và KR, 
cặp mồi khuếch đại gen kháng kanamycin và nằm 2 
bên vị trí cắt NdeI: khi không có gen VP28 chèn vào 
tại vị trí NdeI thì sản phẩm khuếch đại từ cặp mồi KF 
và KR cho kích thước là 1498 bp; nếu có Ptac-VP28 
chèn vào thì sản phẩm khuếch đại cho kích thước là 
2196 bp (Hình 10).
3.1.3. Tiếp hợp và kiểm tra chủng đột biến
Quá trình tạo đột biến gen hoang dại đã được 
thay thế bằng gen kháng kanamycin gắn với vùng 
trình tự Ptac + VP28 nhờ cơ chế tái tổ hợp tương 
đồng ở vị trí H và T của cassette với vị trí H và T 
trên gen hoang dại. Khi kiểm tra khuẩn lạc tiếp hợp 
với mồi KF+KR phát hiện vùng trình tự gồm gen 
kháng kanamycin gắn với trình tự Ptac::VP28 có 
kích thước khoảng 2200 bp so với đối chứng dương 
là SM10λpir::pGP704::Ptac-VP28 (Hình 11).
1 2 3 4 5 MΔHKTwzz
1 1 1 32 2 2 4
122
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
Hình 11. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR 
khuẩn lạc trên đĩa tiếp hợp với cặp mồi KF và KR. 
1: khuẩn lạc tiếp hợp; 2: SM10λpir::pGP704:: HKTwzz; 
3: SM10λpir::pGP704:: ΔHKTwzz::Ptac-VP28; 
4: thang DNA 
Khi kiểm tra với mồi Fi-wzz + Ri-wzz để khuếch 
đại vùng trình tự nằm bên trong gen wzz từ vị trí 
460070 đến vị trí 460365. Vùng này sẽ bị loại bỏ 
trong quá trình gây đột biến. Kết quả kiểm tra các 
khuẩn lạc đột biến sau khi cấy truyền đều không có 
sự tồn tại của vùng này (Hình 12) so với đối chứng 
dương là chủng V. harveyi hoang dại cho băng có 
kích thước khoảng 300 bp. Khi kiểm tra với cặp mồi 
Fo-wzz + Ri-K với mồi Fo-wzz nằm trên genome 
của V. harveyi, nằm ngoài mồi WF1 cho kích thước 
khoảng 1700 bp; tương tự kiểm tra với cặp mồi 
Ro-wzz + Fi-K với trình tự mồi Ro-wzz nằm trên 
genome của V. harveyi, nằm ngoài mồi WR2 cho 
kích thước khoảng 2000 bp. Cả hai cặp mồi cho phép 
xác định cassette có được chèn thẳng trực tiếp vào 
trong bộ gen của V. harveyi hay không (Hình 13). 
3.1.4. Biểu hiện protein vỏ VP28 trong chủng đột biến
Kháng thể đa dòng chuột kháng VP28 có khả 
năng bắt đặc hiệu kháng nguyên VP28 trên màng lai. 
Đồng thời, kháng thể sơ cấp này sẽ bị bắt đặc hiệu 
bởi kháng thể sơ cấp (kháng thể thỏ kháng kháng 
thể chuột) và hiện màu khi tiếp xúc với chất tạo màu 
DAB (3,3’-diaminobenzidine). Kết quả kiểm tra biểu 
hiện cho thấy có sự biểu hiện protein vỏ VP28 trong 
chủng V. harveyi đột biến gen wzz mang gen mã hóa 
protein vỏ VP28 của vi rút gây bệnh đốm trắng. 
Ở kết quả phân tích SDS-PAGE không cho 
thấy sự khác biệt rõ ràng trong hệ protein tổng 
giữa chủng V. harveyi đột biến gen wzz mang gen 
mã hóa protein vỏ VP28 của vi rút gây bệnh đốm 
trắng (VH-WzM::Ptac-VP28) và chủng V. harveyi 
đột biến gen wzz không chứa gen mã hóa protein 
vỏ VP28 (VH-WzM) cũng như chủng V. harveyi 
hoang dại BL1 so với đối chứng dương là chủng 
E. coli BL21::pAmCyan1-N1::Ptac-VP28 biểu hiện 
mạnh protein vỏ VP28 ở băng 28 KDa (Hình 14). 
Khi phân tích Western Blot thấy rằng chủng đột 
biến VH-WzM::Ptac-VP28 có khả năng biểu hiện 
protein vỏ VP28 so với đối chứng dương là E.coli 
BL21::pAmCyan1-N1::Ptac-VP28 (Hình 15).
3.2. Thảo luận
Nghiên cứu này đã tạo được chủng V. harveyi 
đột biến gen wzz biểu hiện protein vỏ VP28 của vi 
rút gây bệnh đốm trắng bằng phương pháp gây đột 
biến gen dựa vào cơ chế trao đổi chéo giữa 2 vùng 
trình tự tương đồng ở vi khuẩn. Hiện nay, trên thế 
giới vẫn chưa có công bố nào về việc gây đột biến 
bằng phương pháp loại bỏ một phần gen wzz trên 
V. harveyi hướng đến như là vắc xin phòng bệnh cho 
tôm. Năm 2011, chủng V. harveyi bất hoạt đã được 
chứng minh là có khả năng làm gia tăng đáp ứng 
miễn dịch ở tôm (Rowley et al., 2011). Năm 2012, một 
Hình 12. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR 
các khuẩn lạc đột biến với cặp mồi Fi-wzz + Ri-wzz. 
(1): thang DNA; (2-6): các khuẩn lạc cấy truyền từ 
khuẩn lạc đột biến trên đĩa tiếp hợp; (7): khuẩn lạc 
V. harveyi hoang dại BL1; (8): chứng âm là nước
Hình 13. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR 
các khuẩn lạc đột biến với cặp mồi kết hợp Fo-wzz 
+ Ri-K và Ro-wzz + Fi-K. (1, 4): khuẩn lạc đột biến; 
(2, 5): khuẩn lạc V. harveyi hoang dại BL1; (3, 6): 
SM10λpir::pGP704:: ΔHKTwzz::Ptac-VP28
1
1
3
3
2
2
4
4 5 6 7 8
1M 32 4 5 6
123
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
hướng nghiên cứu về việc gây đột biến ngẫu nhiên 
chủng V. harveyi T4D bằng kháng sinh rifampicin 
để tạo vắc xin cho cá bơn (Sun et al., 2012). Điều 
này chứng tỏ V. harveyi bất hoạt hoặc nhược độc có 
khả năng sinh miễn dịch. Tạo vi khuẩn nhược độc 
bằng knock-out gen là một hướng nghiên cứu rất 
mới hướng đến việc tạo vắc xin vi khuẩn sống nhược 
độc để tiếp cận bằng con đường ngâm hoặc cho ăn 
đối với tôm. Nghiên cứu sử dụng promoter TAC 
(Ptac) trong chủng V. cholerae để biểu hiện độc tố B 
của E. coli (CtxB) bằng véc tơ pETR1, Ptac đã được 
chứng minh là phù hợp nhất khi biểu hiện trong 
chủng V. cholerae (John M et al., 1999). Do không 
thể tiến hành các phương pháp biến nạp véc tơ tái 
tổ hợp biểu hiện VP28 vào V. harveyi nên nhóm 
nghiên cứu đã chèn trực tiếp Ptac-VP28 vào bộ gen 
của vi khuẩn V. harveyi. Chủng VH-WzM::Ptac-
VP28 có khả năng biểu hiện protein vỏ VP28 nhưng 
hiệu quả không cao so với đối chứng dương E.coli 
BL21:: pAmCyan1-N1::Ptac-VP28. Có thể giải thích 
nguyên nhân là do việc chèn trực tiếp gen mã hóa 
cho protein vỏ VP28 vào bộ gen V. harveyi làm giảm 
đi rất nhiều số lượng bản sao của gen này so với việc 
sử dụng véc tơ tái tổ hợp để biểu hiện. Tuy nhiên, 
hiệu quả bảo vệ chủng V. harveyi đột biến này cần 
phải được thử nghiệm trên tôm ở giai đoạn tiếp theo.
Hình 14. Kết quả phân tích SDS-PAGE kiểm tra biểu hiện 
protein vỏ VP28. (1): thang protein; (2): chủng đột biến 
VH-WzM::Ptac-VP28; (3): chủng BL21::pAmCyan1-
N1::Ptac-VP28; (4): chủng đột biến gen wzz không chứa 
Ptac-VP28; (5): chủng V. harveyi hoang dại BL
Hình 15. Kết quả phân tích Western Blot kiểm tra biểu 
hiện protein vỏ VP28. (1): chủng đột biến VH-WzM::P-
tac-VP28; (2): chủng BL21:: pAmCyan1-N1::Ptac-VP28; 
(3): chủng đột biến gen wzz không chứa Ptac-VP28; 
(4): chủng V. harveyi hoang dại BL1; (5): thang protein
IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
Đã tạo được chủng Vibrio harveyi đột biến gen 
wzz bằng phương pháp knock-out gen và có khả 
năng biểu hiện protein vỏ VP28 của vi rút gây bệnh 
đốm trắng (WSSV) trên tôm.
4.2. Đề nghị
Đây là chủng vi khuẩn đột biến có tiềm năng bảo 
vệ tôm kháng lại vi rút gây bệnh đốm trắng. Do đó, 
cần triển khai các nghiên cứu về thử nghiệm độc lực 
của chủng đột biến và đánh giá hiệu quả bảo vệ của 
chủng này kháng lại WSSV.
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
Franco AV, Liu D, Reeves PR, 1998. The Wzz (Cld) 
Protein in Escherichia coli: Amino Acid Sequence 
Variation Determines O-Antigen Chain Length 
Specificity. Journal of bacteriology, 180: 2670-2675.
Hernandez G, Olmos J, 2004. Molecular identification 
of pathogenic and nonpathogenic strains of V. 
harveyi using PCR and RAPD. Applied Microbiology 
Biotechnology, 63: 722-727.
Harris L, Owens L, Smith S, 1996. A selective and 
differential medium for Vibrio harveyi. Applied and 
Environmetal Microbiology, 62: 3548-3550.
John M, Crean TI, Calderwood SB, and Ryan ET, 2000. 
In Vitro and In Vivo Analyses of Constitutive and In 
Vivo-Induced Promoters in Attenuated Vaccine and 
Vector. Infection and immunity, 68: 1171-1175.
Liu PC, Lee KK, Yii KC, Kou GH, Chen SN, 1996. 
Isolation of Vibrio harveji from diseased kuruma 
prawns Penaeus laponicils. Curr Microbiol, 33: 129-132.
Najdenski H1,  Golkocheva E,  Vesselinova 
A,  Bengoechea JA,  Skurnik M, 2003. Proper 
expression of the O-antigen of lipopolysaccharide is 
essential for the virulence of Yersinia enterocolitica 
O:8 in experimental oral infection of rabbits. FEMS 
Immunology & Medical Microbiology, 38: 97-106.
Qi Y, Yi G, Wang Z, Yao L, Qian J and Hu L, 2004. VP28 
of Shrimp White Spot Syndrome Virus Is Involved in 
the Attachment and Penetration into Shrimp Cells. 
Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 37: 
726-734.
Rowley AF, Powell A, 2007. Invertebrate Immune 
Systems-Specific, Quasi-Specific, or Nonspecific?. 
The Journal of Immunology, 179:7209-7214.
1 13 32 24 45 5
124
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
Rowley AF, Powell A, Pope EC, 2011. Enhanced 
immune defences in Pacific white shrimp 
(Litopenaeus vannamei) post-exposure to a vibrio 
vaccine. Journal of Invertebrate Pathology, 107: 95-9.
Sun L, Hu YH, Deng T, Sun BG, 2012. Development 
and efficacy of an attenuated Vibrio harveyi 
vaccine candidate with cross protectivity against 
Vibrio alginolyticus. Fish & Shellfish Immunology, 
32: 1155 -1161.
Thune RL, Fernandez DH, Battista JR, 2011. An 
aroA Mutant of Edwardsiella ictaluri Is Safe and 
Efficacious as a Live Attenuated Vaccine. Journal of 
Aquatic Animal Health, 11: 358-372.
A mutant Vibrio harveyi strain knocked-out wzz gene expressing 
the VP28 antigen of white spot syndrom virus
Mai Thu Thao, Tran Pham Vu Linh, Ngo Huynh Phuong Thao, 
Lam Vy Nguyen, Nguyen Quoc Binh
Abstract 
There are many approaches to develop biological products which can protect shrimp from serious diseases. In this 
study, we created a mutant Vibrio harveyi strain, the bacteria causes the luminescent disease on shrimp by knocking-
out wzz gene (O-antigen gene determinant chain length) and inserted VP28 gene encoding the envelop protein of the 
virus WSSV causing White spots syndrome in gene knocking-out site. Firstly, HKTwzz cassette (ΔHKT) including 
Hwzz sequence (the head of wzz gene); K (kanamycin resistance gene), Twzz (the tail of wzz gene) was generated by 
PCR overlap. Then Ptac-VP28 sequence was inserted into the site of NdeI enzyme located on the HKTwzz cassette. 
The ΔHKTwzz::Ptac-VP28 cassette was inserted into pGP704 and cloned into E. coli SM10λpir. The mutant Vibrio 
harveyi strain was generated by conjugating between the donor E. coli SM10λpir::pGP704::ΔHKT::Ptac-VP28 strain 
and the wild type receipt of Vibrio harveyi BL1 strain (Bac Lieu province). The test of SDS-PAGE and Western Blot 
showed that the mutant Vibrio harveyi strain have been able to express VP28 protein.
Key words: Conjugation, knock-out gene, pGP704, SM10λpir, Vibrio harveyi
Ngày nhận bài: 7/6/2018
Ngày phản biện: 15/6/2018
Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước
Ngày duyệt đăng: 16/7/2018