Luận án Đánh giá kết quả điều trị lơ xê mi cấp dòng tủy bằng ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài giai đoạn 2012 - 2015

LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Nguyễn Hữu Chiến nghiên cứu sinh khóa 32 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Huyết học và Truyền máu, xin cam đoan:
1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương dưới sự hướng dẫn của:
- GS.TS. Nguyễn Anh Trí, Viện trưởng Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Phó Chủ nhiệm Bộ môn Huyết học - Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội;
- PGS.TS. Bạch Khánh Hòa, Bộ môn Huyết học - Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2017
NGUYỄN HỮU CHIẾN
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tận tình của các thầy cô, các anh chị và các bạn đồng nghiệp. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:
Ban Lãnh đạo Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Ban Giám hiệu trường Đại học Y Hà Nội, Phòng Đào tạo sau đại học trường Đại học Y Hà Nội, Bộ môn Huyết học - Truyền máu Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này.
Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
- GS.TS.AHLĐ Nguyễn Anh Trí, Viện trưởng Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương; Phó trưởng Bộ môn Huyết học - Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội.
- PGS.TS. Bạch Khánh Hòa, Bộ môn Huyết học - Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội.
Những người thầy yêu quý đã dành rất nhiều tâm sức đào tạo, hướng dẫn, động viên và chỉ bảo tận tình em trong suốt quá trình làm việc, thực hiện và hoàn thành luận án.
Xin trân trọng được gửi cảm ơn tới GS.TSKH. Đỗ Trung Phấn, người thầy kính yêu của các thế hệ, mặc dù tuổi đã cao nhưng thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em những kinh nghiệm quý báu trong quá trình thực hiện luận án.
Xin trân trọng được gửi lời cảm ơn tới GS.TS. Phạm Quang Vinh, Trưởng Bộ môn Huyết học - Truyền máu và PGS.TS. Nguyễn Hà Thanh, Phó trưởng Bộ môn Huyết học - Truyền máu Trường Đại học Y Hà Nội, các thầy luôn nhiệt tình, tâm huyết chỉ bảo, dạy dỗ em trong suốt quá trình làm việc và thực hiện luận án.
Xin được trân trọng được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô Bộ môn Huyết học - Truyền máu, các thầy cô Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, các thầy cô Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ em hoàn thành luận án này.
Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới BSCKII. Võ Thị Thanh Bình, TS. Trần Ngọc Quế cùng các bác sĩ, cử nhân, điều dưỡng, kỹ thuật viên Khoa Ghép Tế bào gốc và Trung tâm Tế bào gốc đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Các anh chị và các bạn đã góp phần không nhỏ vào sự thành công của luận án.
Xin được gửi lời cảm ơn tới tập thể Phòng Kế hoạch tổng hợp đã chung tay chia sẻ công việc để tôi yên tâm thực hiện và hoàn thành luận án.
Xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong hội đồng chấm luận án cấp cơ sở, cấp nhà trường đã cho em những đóng góp quý báu để luận án được hoàn thiện hơn.
Xin được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể các cán bộ, nhân viên Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đã quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong những năm tháng vừa qua.
Xin được gửi lời cảm ơn tới các anh chị, các bạn đồng nghiệp trong cả nước luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thiện luận án.
Xin được gửi lời cảm ơn đến các bệnh nhân cùng gia đình bệnh nhân đã đồng ý tham gia vào nghiên cứu, để cho tôi có cơ hội được thực hiện và hoàn thành luận án này.
Con xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Bố Mẹ đã đã sinh ra con, nuôi dạy con nên người, đặc biệt xin tỏ lòng thành kính đến linh hồn người Cha đã khuất khi tôi chưa dời mái trường Đại học Y Hà Nội. Xin được cảm ơn các thành viên trong gia đình nội, ngoại đã luôn bên tôi trong những lúc khó khăn nhất. Tôi cũng xin bày tỏ lời biết ơn chân thành nhất đến vợ và 2 con yêu quý của tôi, là động lực trong cuộc sống của tôi, những người đã hy sinh rất nhiều cho sự nghiệp của tôi, đã luôn luôn ở bên cạnh tôi, động viên và giúp đỡ tôi đi đến ngày hôm nay.
Xin được cảm ơn tới quê hương nghèo khó nơi tôi được sinh ra và lớn lên, với những con người chân thật, hiền hậu đã nuôi dưỡng, cho tôi chí hướng phấn đấu.
Hà Nội, ngày tháng năm 2017
Nguyễn Hữu Chiến
MỤC LỤC
PHỤ LỤC
DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. NST bệnh nhân Nguyễn Phương A.	2
Hình 3.2. NST bệnh nhân Bùi Mạnh P.	2
Hình 3.3. NST bệnh nhân Nguyễn Đình Nam Tr.	2
Hình 3.4. NST bệnh nhân Đoàn Thị Thanh Th.	2
Hình 3.5. Gen NPM1: bệnh nhân Nguyễn Quang H.	2
Hình 3.6. Gen ETO-AML1: bệnh nhân Trịnh Huỳnh H.	2
Hình 3.7. Gen FLT3-ITD: bệnh nhân Nguyễn Thị Thanh H.	2
Hình 3.8. Gen BCR/ABL p210: bệnh nhân Đoàn Thị Thanh Th.	2
Hình 3.9. Tác nhân nhiễm trùng của bệnh nhân Nguyễn Quang H.	2
Hình 3.10. Tác nhân nhiễm trùng của bệnh nhân Trương Văn Th.	2
Hình 3.11. Tác nhân nhiễm trùng của bệnh nhân Hà Thị H.	2
Hình 3.12. Tác nhân nhiễm trùng của bệnh nhân Vũ Duy H.	2
Hình 3.13. Tác nhân nhiễm trùng của bệnh nhân Lê Huyền Tr.	2
Hình 3.14. Tác nhân nhiễm trùng của bệnh nhân Nguyễn Hoàng H.	2
Hình 3.15. Tác nhân nhiễm trùng của bệnh nhân Hoàng Thị Thùy L.	2
Hình 3.16. Tác nhân nhiễm trùng của bệnh nhân Lê Thị H.	2
Hình 3.17. FISH X/Y: bệnh nhân Vũ Duy H.	2
Hình 3.18. FISH X/Y: bệnh nhân Nguyễn Hoàng H.	2
Hình 3.19. FISH X/Y: bệnh nhân Trần Thị Th.	2
Hình 3.20. FISH X/Y: bệnh nhân Hoàng Thị Thùy L.	2
Hình 3.21. GVHD cấp: bệnh nhân Nguyễn Duy Tr.	2
Hình 3.22. GVHD cấp: bệnh nhân Nguyễn Hoàng H.	2
Hình 3.23. GVHD mạn: bệnh nhân Đoàn Thị Thanh Th.	2
Hình 3.24. GVHD mạn: bệnh nhân Vũ Duy H.	2
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Yếu tố tiên lượng bệnh LXM cấp dòng tủy	2
Bảng 3.1. Tình trạng bệnh trước ghép	2
Bảng 3.2. Nhóm tiên lượng bệnh nhân được ghép	2
Bảng 3.3. Bất đồng giới giữa bệnh nhân và người hiến	2
Bảng 3.4. Bất đồng nhóm máu giữa bệnh nhân và người hiến	2
Bảng 3.5. Đặc điểm về nguồn TBG	2
Bảng 3.6. Mức độ phù hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến	2
Bảng 3.7. Đặc điểm khối TBG truyền cho bệnh nhân	2
Bảng 3.8. Đặc điểm của phác đồ điều kiện hóa trước ghép	2
Bảng 3.9. Đặc điểm phác đồ điều trị dự phòng bệnh ghép chống chủ	2
Bảng 3.10. Thời gian tế bào máu trở về giá trị bình thường	2
Bảng 3.11. So sánh thời gian phục hồi các dòng tế bào máu ngoại vi ở bệnh nhân ghép từ máu dây rốn và máu ngoại vi	2
Bảng 3.12. Đặc điểm sự thay đổi xét nghiệm di truyền	2
Bảng 3.13. Đặc điểm sự thay đổi xét nghiệm sinh học phân tử (gen LXM)	2
Bảng 3.14. Đặc điểm nôn sau điều kiện hóa	2
Bảng 3.15. Biểu hiện viêm loét miệng	2
Bảng 3.16. Biểu hiện về tiêu chảy	2
Bảng 3.17. Đặc điểm tổn thương gan	2
Bảng 3.18. Đặc điểm về vị trí nhiễm trùng	2
Bảng 3.19. Đặc điểm về tác nhân nhiễm trùng	2
Bảng 3.20. Tác dụng phụ do điều trị thuốc dự phòng GVHD	2
Bảng 3.21. Biến chứng muộn trong quá trình theo dõi bệnh nhân sau ghép	2
Bảng 3.22. Đặc điểm hội chứng mọc mảnh ghép	2
Bảng 3.23. Đánh giá mọc mảnh ghép bằng sự phục hồi tế bào máu	2
Bảng 3.24. So sánh phục hồi tế bào máu giữa trường hợp được ghép từ TBG máu ngoại vi và máu dây rốn	2
Bảng 3.25. Mọc mảnh ghép đánh giá bằng xét nghiệm chimerism	2
Bảng 3.26. Đặc điểm truyền KHC ở những bệnh nhân ghép bất đồng nhóm máu	2
Bảng 3.27. Đặc điểm chung bệnh ghép chống chủ	2
Bảng 3.28. Thời điểm xuất hiện bệnh ghép chống chủ	2
Bảng 3.29. Bệnh ghép chống chủ và mức độ phù hợp HLA	2
Bảng 3.30. Bệnh ghép chống chủ và nguồn TBG	2
Bảng 3.31. Bệnh ghép chống chủ và liều TBG máu ngoại vi	2
Bảng 3.32. Bệnh ghép chống chủ và bất đồng giới	2
Bảng 3.33. Bệnh ghép chống chủ và phác đồ điều kiện hóa	2
Bảng 3.34. Đặc điểm về thải ghép	2
Bảng 3.35. Kết quả chung của ghép TBG tạo máu đồng loài điều trị LXM cấp dòng tủy	2
Bảng 3.36. Đặc điểm về tái phát sau ghép ở bệnh nhân LXM cấp dòng tủy	2
Bảng 3.37. Đặc điểm tử vong của bệnh nhân ghép	2
Bảng 3.38. Tỷ lệ tái phát và tình trạng bệnh tại thời điểm ghép	2
Bảng 3.39. Tỷ lệ tử vong và tình trạng bệnh tại thời điểm ghép	2
Bảng 3.40. Tỷ lệ tái phát và yếu tố tiên lượng trước ghép	2
Bảng 3.41. Tỷ lệ tử vong và yếu tố tiên lượng trước ghép	2
Bảng 3.42. Tỷ lệ tái phát và nguồn TBG ghép cho bệnh nhân	2
Bảng 3.43. Tỷ lệ tử vong và nguồn TBG ghép cho bệnh nhân	2
Bảng 3.44. Tỷ lệ tái phát và sự phù hợp HLA bệnh nhân/người hiến	2
Bảng 3.45. Tỷ lệ tử vong và sự phù hợp HLA bệnh nhân/người hiến	2
Bảng 3.46. Bất đồng giới và tỷ lệ tái phát	2
Bảng 3.47. Bất đồng giới và tỷ lệ tử vong	2
Bảng 3.48. Bệnh ghép chống chủ và tỷ lệ tái phát	2
Bảng 3.49. Bệnh ghép chống chủ và tỷ lệ tử vong	2
DANH MỤC BIỂU
Biểu đồ 1.1. So sánh tỷ lệ tử vong liên quan đến điều trị, tái phát ở 2 nhóm bệnh nhân được ghép TBG đồng loài và tự thân	2
Biểu đồ 1.2. So sánh thời gian sống không LXM, sống thêm toàn bộ ở 2 nhóm bệnh nhân được ghép TBG đồng loài và tự thân	2
Biểu đồ 3.1. Phân bố thể bệnh theo xếp loại FAB 1986	2
Biểu đồ 3.2. Đặc điểm sự thay đổi bạch cầu và bạch cầu hạt trung tính	2
Biểu đồ 3.3. Đặc điểm sự thay đổi huyết sắc tố	2
Biểu đồ 3.4. Đặc điểm sự thay đổi hồng cầu lưới (HCL)	2
Biểu đồ 3.5. Đặc điểm sự thay đổi tiểu cầu	2
Biểu đồ 3.6. Phản ứng không mong muốn trong quá trình truyền TBG	2
Biểu đồ 3.7. Đặc điểm sự thay đổi của xét nghiệm chimerism sau ghép	2
Biểu đồ 3.8. Thời gian sống toàn bộ	2
Biểu đồ 3.9. Thời gian sống không bệnh	2
Biểu đồ 3.10. Thời gian sống thêm toàn bộ theo CR1, CR2	2
Biểu đồ 3.11. Thời gian sống không bệnh theo CR1, CR2	2
Biểu đồ 3.12. Thời gian sống thêm toàn bộ theo yếu tố tiên lượng	2
Biểu đồ 3.13. Thời gian sống thêm không bệnh theo yếu tố tiên lượng	2
Biểu đồ 3.14. Thời gian sống thêm toàn bộ theo nguồn TBG	2
Biểu đồ 3.15. Thời gian sống không bệnh theo nguồn TBG	2
Biểu đồ 3.16. Thời gian sống thêm toàn bộ theo sự phù hợp HLA	2
Biểu đồ 3.17. Thời gian sống không bệnh theo sự phù hợp HLA	2
Biểu đồ 3.18. Thời gian sống thêm toàn bộ theo bất đồng giới	2
Biểu đồ 3.19. Thời gian sống không bệnh theo bất đồng giới	2
Biểu đồ 3.20. Thời gian sống thêm toàn bộ theo bệnh ghép chống chủ	2
Biểu đồ 3.21. Thời gian sống không bệnh theo bệnh ghép chống chủ	2
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Cơ chế ghép chống chủ cấp	2
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ nghiên cứu	2
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
Allo-HSCT (allogeneic hematopoietic stem cell transplantation)
: ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài
AML (acute myeloid leukemia)
: lơ xê mi cấp dòng tủy
Auto-HSCT (autologous hematopoietic stem cell transplantation)
: ghép tế bào gốc tạo máu tự thân
Bu
: busulfan
CMV
: cytomegalovirus
CSA
: cyclosporin A
Cy
: cyclophosphamid
EFS (event free survival)
: thời gian sống thêm không biến cố
Flu
: fludarabin
GVHD (graft versus host disease)
: bệnh ghép chống chủ
GVL (graft versus leukemia)
: ghép chống lơ xê mi
HLA (human leukocyte antigen)
: kháng nguyên bạch cầu người
IBMTR (International Blood and Marrow Transplant Registry)
: hiệp hội đăng ký ghép tuỷ và máu quốc tế 
LFS (leukemia free survival)
: thời gian sống thêm không lơ xê mi
LXM
: lơ xê mi
MRC (medical research council)
: hội đồng nghiên cứu y khoa
MTX
: methotrexate
NIH (National Institute of Health)
: Viện sức khỏe quốc gia Hoa Kỳ 
NRM (non relapse mortality)
: tỷ lệ tử vong không do tái phát
OS (overal survival)
: thời gian sống thêm toàn bộ
PFS (progression free survival)
: thời gian sống thêm không tiến triển bệnh
RFS (relapse free survival)
: thời gian sống thêm không tái phát bệnh
TBG
: tế bào gốc
TBI (total body irradiation)
: tia xạ toàn thân
VOD (veno occlusive disease)
: viêm tắc tĩnh mạch trên gan 
ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 2012, theo đánh giá của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế (International Agency for Research on Cancer: IARC), mỗi năm trên toàn thế giới có khoảng 14,1 triệu người mắc ung thư mới và có 8,2 triệu người chết vì căn bệnh này. Ở Việt Nam, theo báo cáo của Bộ Y tế mỗi năm có khoảng 150.000 người mới mắc bệnh ung thư và trên 75.000 trường hợp tử vong do ung thư. Theo các số liệu thống kê tại Mĩ năm 2013: tỷ lệ mắc lơ xê mi cấp dòng tủy (Acute Myeloid Leukemia: AML) khoảng 3,5 người mắc bệnh/100.000 dân và có xu hướng tăng theo tuổi (1/100.000 dân ở lứa tuổi 25 và 25/100.000 dân ở lứa tuổi 80); hàng năm có khoảng 15.000 trường hợp mắc lơ xê mi mới, chiếm 35% các trường hợp mắc mới về lơ xê mi cấp dòng tủy và chiếm 20% các bệnh máu ác tính, có khoảng 9.000 bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy tử vong [1]. Theo nghiên cứu tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương giai đoạn 2010-2014, lơ xê mi cấp dòng tủy chiếm 14,1% tổng số bệnh máu và chiếm 30,3% các bệnh máu ác tính [2].
Có nhiều phương pháp điều trị lơ xê mi cấp dòng tủy như hóa chất, tia xạ, ghép tế bào gốc tạo máu tự thân hoặc đồng loài, Với hóa chất hoặc tia xạ chỉ có thể giúp bệnh nhân đạt lui bệnh. Trong khi đó, ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài là một phương pháp hiện đại và có hiệu quả cao. Thành công của ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài có thể mang lại cho bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy cơ hội khỏi bệnh và có cuộc sống như người bình thường. Hiện nay, ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài được sử dụng rộng rãi cho những bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy trẻ tuổi, nhưng trở ngại lớn nhất khi áp dụng phương pháp này ở bệnh nhân trẻ tuổi là tỷ lệ chết liên quan đến điều trị. Một số khó khăn để có thể mở rộng điều trị bằng phương pháp điều trị này cho bệnh nhân lớn tuổi là: khả năng tìm được người hiến tế bào gốc ngay tại thời điểm cần ghép thấp, bệnh ghép chống chủ, khả năng khôi phục lại hệ miễn dịch chậm, gặp tỷ lệ cao kháng điều trị và tái phát bệnh. Tại nước ta đã có một số cơ sở thực hiện ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài để điều trị bệnh máu: Viện Huyết Học - Truyền máu Trung ương, Bệnh viện Nhi Trung ương, Bệnh viện Truyền máu - Huyết học Thành phố Hồ Chí Minh, Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Trung ương quân đội 108. Tuy nhiên, chỉ có 3 cơ sở áp dụng phương pháp điều trị này cho bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy là Bệnh viện Truyền máu - Huyết học Thành phố Hồ Chí Minh, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương và Bệnh viện Bạch Mai. Tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng tủy đã được thực hiện thành công từ năm 2008, cho đến nay nhiều bệnh nhân sau ghép đã hòa nhập được cuộc sống hoàn toàn bình thường. Nhằm tổng kết, đánh giá hiệu quả điều trị của phương pháp này và đẩy mạnh hơn nữa việc ứng dụng phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài trong điều trị bệnh lơ xê mi cấp dòng tủy, đề tài “Đánh giá kết quả điều trị lơ xê mi cấp dòng tủy bằng ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài giai đoạn 2012-2015” được tiến hành với 2 mục tiêu:
1. 	Nghiên cứu đặc điểm, diễn biến lâm sàng và xét nghiệm trước, sau ghép ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy được điều trị bằng ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài.
2. 	Đánh giá kết quả điều trị và một số yếu tố liên quan trong điều trị lơ xê mi cấp dòng tủy bằng ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài.
Chương 1  ... ra khỏi tủ âm và giữ trên đá cho đến khi sử dụng.
- Dùng pipet chuyển 120µl ADN và 7µl taq vào ống D-mix.
- Dùng máy votex để trộn đều hỗn hợp trên, sau đó ly tâm nhẹ để kéo toàn bộ hóa chất bám trên nắp ống xuống đáy.
- Chia vào từng giếng của phiến 10µl hỗn hợp trên.
- Dùng miếng giấy dán dán kín toàn bộ phiến.
- Đặt phiến vào máy PCR.
- Chọn chương trình chạy PCR cho xét nghiệm HLA.
- Lấy phiến ra khỏi máy PCR sau khi chương trình chạy kết thúc.
- Điện di toàn bộ sản phẩm sau PCR trên thạch agarrose 2%.
- Điện di 10 phút ở hiệu điện thế 100v.
- Sau khi điện di, nhuộm bản gel với ethidium boromide. 
- Rửa lại bản gel và xem kết quả điện di trên máy soi gel.
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Chụp lại ảnh và phân tích kết quả bằng phần mềm onelambda.
- Đánh dấu vị trí của những băng đặc hiệu.
- Nhập lại những vị trí đó vào phần mềm phân tích kết quả.
- Sau khi phần mềm phân tích kết quả xong, in kết quả đã phân tích.
ĐỊNH NHÓM HLA ĐỘ PHÂN GIẢI CAO 
BẰNG KỸ THUẬT SSO-LUMINEX
(Performing high-resolution HLA typing by SSO Luminex Technique)
I. NGUYÊN LÝ
Dựa trên nguyên lý lai giữa đầu dò DNA với sản phẩm DNA của mẫu xét nghiệm đánh dấu bằng huỳnh quang, trong đó các đầu dò DNA được thiết kế đặc hiệu cho từng alen HLA ở độ phân giải cao (High resolution). Tùy theo mật độ huỳnh quang tương ứng, hệ thống Luminex đọc và xác định được tên đầu dò đã gắn với chuỗi DNA của mẫu và kiểu gen HLA tương ứng.
Nguồn gốc quy trình: theo quy trình kỹ thuật của Hiệp hội Ngân hàng máu Mỹ AABB và của hãng (1,2,3)
II. CHỈ ĐỊNH
- Người bệnh ghép tế bào gốc tạo máu đồng loại, ghép cơ quan từ người cho;
- Mẫu máu của người hiến mô và các cơ quan;
- Các sản phẩm thu được từ người hiến tế bào gốc: máu ngoại vi, dịch tủy xương, máu dây rốn.
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Người bệnh ghép tế bào gốc tự thân.
IV. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện:
Cán bộ được đào tạo để thực hiện kỹ thuật.
2. Phương tiện – Hóa chất
2.1. Phương tiện:
- Máy PCR, máy ủ nhiệt;
- Hệ thống Luminex;
- Máy ly tâm lạnh;
- Máy trộn mẫu vortex;
- Máy tính và phần mềm phân tích kết quả (LABScan);
- Micro Pipet, đầu côn lọc, ống nghiệm 1,5 ml, hốt vô trùng;
- Găng tay, mũ, khẩu trang.
2.2. Hóa chất:
- Kít PCR gồm khay 96 giếng hoặc ống nghiệm chạy PCR, mồi DNA (primer) đặc hiệu HLA, đệm D-mix;
- Kít lai DNA chứa hạt nhựa gắn đầu dò (probe) đặc hiệu DNA đối với từng alen HLA, dung dịch streptavidin gắn huỳnh quang (SAPE), dung dịch đệm lai, đệm hồi tính, đệm biến tính, đệm rửa;
- Taq polymerase;
- Dung dịch sheath chạy máy;
- Cồn 96o - 100oC;
- Nước khử ion.
3. Mẫu bệnh phẩm:
Mẫu DNA (nồng độ 20-200 ng/µl) đã tách từ bệnh phẩm máu ngoại vi, máu dây rốn, dịch tủy xương.
V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Khuếch đại mẫu DNA sau tách:
- Hút 2 µl DNA vào mỗi ống nghiệm hoặc giếng; 
- Trộn mồi DNA, dung dịch đệm D-mix và Taq polymerase theo tỷ lệ phù hợp, trộn đều;
- Thêm 18µl hỗn hợp trên vào mỗi giếng hoặc ống nghiệm đã có DNA, đạt thể tích cuối cùng 20µl;
- Đậy kín phiến hoặc ống nghiệm, chuyển vào máy và chạy PCR.
2. Lai sản phẩm DNA đã khuếch đại với hạt SSO:
- Biến tính và hồi tính:
+ Chuyển 5µl sản phẩm DNA khuếch đại vào mỗi giếng của phiến 96 giếng mới (số lượng giếng cần dùng tùy thuộc vào số locus cần xét nghiệm);
+ Thêm 2,5µl đệm biến tính vào mỗi giếng, trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút;
+ Thêm 5µl đệm hồi tính, trộn đều;
+ Giữ phiến trong bể đá trước khi lai.
- Lai với đầu dò DNA:
+ Trộn hạt nhựa gắn đầu dò DNA và đệm lai theo tỷ lệ phù hợp vào mỗi giếng của phiến đã xử lý, đậy chặt phiến, votex nhẹ;
+ Ủ phiến trong máy ủ nhiệt ở 60oC, trong 15 phút;
+ Thêm 100µl đệm rửa vào mỗi giếng, đậy kín, ly tâm 1.000-1.300g trong 5 phút, hút bỏ dịch nổi, lặp lại bước rửa 2 lần.
- Đánh dấu và phân tích:
+ Hút 50 µl dung dịch SAPE 1X vào mỗi giếng, đậy phiến, trộn nhẹ;
+ Chuyển phiến vào máy ủ nhiệt, ủ phiến ở 60oC trong 5 phút;
+ Rửa phiến, chuyển vào hệ thống máy Luminex để đọc;
+ Chạy máy theo chương trình và phân tích kết quả dựa theo phần mềm đi kèm với kít.
3. Trả kết quả:
- Ghi kết quả vào phiếu và sổ xét nghiệm;
- Ký duyệt và kết quả cho bộ phận chỉ định.
4. Thu dọn dụng cụ, vệ sinh máy.
XÉT NGHIỆM FISH (Fluorescence in situ hybridization) 
XÁC ĐỊNH NHIỄM SẮC THỂ X, Y
DETECTION OF X,Y CHROMOSOMES BY FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION
I. NGUYÊN LÝ
Nguyên lý chung: xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH xác định nhiễm sắc thể X, Y sử dụng các probe là các đoạn ADN có gắn huỳnh quang và có trình tự nucleotide bổ sung đặc hiệu cho các đoạn ADN trên nhiễm sắc thể X, Y để lai ghép với các đoạn ADN tương đồng trên nhiễm sắc thể X hoặc Y. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện các nhiễm sắc thể này một cách chính xác.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được chỉ định khi cần xác định giới tính hoặc xác định mọc mảnh ghép sau khi ghép khác giới tính.
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
IV. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện: 
Kỹ thuật viên xét nghiệm Di truyền - Sinh học phân tử đã được đào tạo.
2. Phương tiện, hóa chất
2.1. Phương tiện:
- Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly tâm, máy trộn mẫu, và kính hiển vi huỳnh quang;
- Dụng cụ: kẹp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22, pipetman 100µl, 10µl, xi măng cao su, ống đong, giấy thấm.
2.2. Hóa chất:
- X/Y ADN Probe Kit Probe , DAPI/antifade;
- Dung dịch 10% formamide:5 ml formamide + 30 ml H2O + 15 ml 20X SSC;
- Dung dịch 2X SSC;
- Dung dịch rửa 0,1% NP40: 2X SSC + 0,1% NP40;
- Dung dịch rửa 0,3% NP-40: 0,4X SSC + 0,3% NP40;
- Cồn 70o, 85o, 100o.
3. Bệnh phẩm
2ml máu ngoại vi hoặc dịch hút tủy xương được đựng trong bơm tiêm có tráng chất chống đông heparin 5.000 đơn vị/ml.
V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Xem bài “Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, với kỹ thuật dual colour FISH, chúng ta sẽ thấy 3 màu:
+ Màu xanh da trời đậm: màu nhân tế bào;
+ Màu xanh lá cây: màu của probe gắn trên nhiễm sắc thể X;
+ Màu đỏ: màu của probe gắn trên nhiễm sắc thể Y.
Nhận định kết quả:
+ Một tín hiệu đỏ, một tín hiệu xanh: XY;
+ Hai tín hiệu đỏ: XX.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
ĐỊNH LƯỢNG VIRUS CYTOMEGALO (CMV) 
BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR
I. NGUYÊN LÝ
Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản một đoạn gen đặc trưng của virus CMV kết hợp với việc bổ sung taqman probe - là một chất phát huỳnh quang vào phản ứng PCR. Dựa vào sự kiểm soát số lượng huỳnh quang tiêu tốn trong phản ứng cùng với các chuẩn AND-CMV đã biết trước nồng độ, phần mềm của hệ thống sẽ tính toán và đếm được số lượng bản sao virus CMV ban đầu có trong mẫu bệnh phẩm.
Chỉ định: 
- Xét nghiệm này dùng để phát hiện/định lượng CMV trong các mẫu máu người bị nghi ngờ nhiễm CMV.
- Chỉ định để chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh (với BN sau ghép cơ quan).
- Chỉ định để sàng lọc nguy cơ mang mầm bệnh trên người cho cơ quan trong ghép tạng.
II. CHUẨN BỊ
2.1. Hóa chất sinh phẩm
- Kít tách ADN của hãng Qiagen gồm: buffer AL, Wash I, Wash II, proteinase K, cột lọc.
- Kít định lượng CMV của Nam Khoa gồm: 3 standar 103, 104,105, CMV mix, HBG mix, IC control, chứng trắng.
2.2. Vật tư - trang thiết bị
- Máy ly tâm eppendoft.
- Máy ủ nhiệt.
- Máy vortex.
- Box vô trùng.
- Đầu côn 1ml, 200µl, 20 µl vô trùng , free-nuclease.
- Ống eppendoft 1,5 ml, 0,2ml vô trùng , free-nuclease.
- Pipetman 1ml, 200µl, 20 µl.
2.3 Bệnh phẩm
- 2ml máu toàn phần đựng trong ống chống đông EDTA.
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Tách ADN 
- Quan sát, đối chiếu cẩn thận tên trên ống máu và giấy xét nghiệm.
- Dùng pipet hút 200µl máu vào một eppendoft vô trùng.
- Bổ sung 20µl proteinase K, trộn nhẹ nhàng bằng hút đẩy.
- Thêm 200 µl dung dịch AL, vortex 10 giây.
- Ủ 56oC trong 10 phút .
- Thêm 200 µl cồn 96o, lắc ngược nhẹ nhàng, không được vortex.
- Chuyển hết dịch trong eppendoft sang cột lọc.
- Ly tâm cột ở 10.000v/p trong 1 phút.
- Đổ bỏ hoàn toàn dịch ly tâm ở typ 2ml dưới cột lọc.
- Thêm 500 µl dung dịch rửa AW1 vào cột lọc.
- Ly tâm cột ở 10.000v/p trong 1 phút.
- Đổ bỏ hoàn toàn dịch ly tâm ở typ 2ml dưới cột lọc.
- Thêm 500 µl dung dịch rửa AW2 vào cột lọc.
- Ly tâm cột ở 10.000v/p trong 1 phút.
- Đổ bỏ hoàn toàn dịch ly tâm ở typ 2ml dưới cột lọc.
- Đăt cột lọc lên trên ống 2ml mới.
- Ly tâm cột lọc ở 14.000v/p trong 1 phút.
- Đặt cột lên ống eppendoft mới đã ghi tên người bệnh. 
- Nhỏ 100 µl nước vô trùng vào chính giữa cột lọc.
- Ly tâm cột ở 14.000v/p trong 1 phút.
- Thu dịch ADN trong ống eppendoft.
- Bảo quản -200 nếu chưa sử dụng ngay.
2. Thực hiện phản ứng Real-time PCR
- Đưa các thành phần của kit định lượng ra nhiệt độ phòng 10 phút để rã đông hoàn toàn.
- Trộn kỹ bằng vortex các ống standar 103, 104,105, IC control.
- Trộn nhẹ nhàng bằng lắc ngược các ống CMV-mix, HBG mix.
- Lấy 7 ống eppendoft 0,2 ml đánh số thứ tự S1, S2, S3, Nev-HBG, Ne-CMV, BN-HBG, BN- CMV
- Nhỏ 5µl standar các nồng độ 103, 104,105 tương ứng vào các ống S1, S2, S3.
- Nhỏ 5µl IC control vào các ống Nev-HBG, Ne-CMV, BN-HBG, BN- CMV.
- Nhỏ 5µl chứng trắng vào các ống Nev-HBG, Ne-CMV.
- Nhỏ 5µl AND của người bệnh cần xét nghiệm vào các ống BN-HBG, BN- CMV.
- Nhỏ 20µl HBG-mix vào các ống Nev-HBG, BN-HBG.
- Nhỏ 20µl CMV-mix vào các ống S1, S2, S3, Ne-CMV, BN- CMV.
- Trộn nhẹ nhàng tất cả các ống trên bằng tay.
- Spin down 10 giây.
- Đặt các ống vào máy Real-time PCR CFX 96 và cài đạt sơ đồ giếng theo đúng thứ tự đặt trên máy.
- Chọn chương trình nhiệt CMV protocol.
- Chọn nơi lưu kết quả trong CMV result.
- Bấm start để máy chạy.
Chương trình chạy sẽ kết thúc sau 1h 40 phút.
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Kết quả của phản ứng Real-time PCR sẽ hiển thị lên màn hình khi kết thúc chương trình chạy:
- Nếu mẫu âm tính, thì trả kết quả là âm tính kèm với hình ảnh chạy và ghi chú ở dưới là “Ngưỡng phát hiện 102 copies/ml máu”.
- Nếu mẫu dương tính thì lấy số lượng virus trong ô kết quả ở màn hình máy tính nhân với 50 (độ pha loãng) và trả kết quả bằng hình ảnh chạy kèm theo số lượng virus tính được sau khi đã nhân với độ pha loãng.
BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU
Ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài điều trị bệnh Lơ xê mi cấp dòng tủy
I. Phần hành chính:
1.1. Người nhận: 
- Họ tên: - Tuổi: Giới:.
- Địa chỉ:..
- Điện thoại liên hệ: 
1.2. Người hiến tế bào gốc:
- Họ tên:- Tuổi:. Giới:.
- Mã hồ sơ:..
- Địa chỉ:..
- Điện thoại liên hệ:. ...
1.3. Đơn vị máu dây rốn:
- Mã số: ...
1.4. Ngày vào viện:.Ngày ghép:..
1.5. Ngày ra viện:........Mã hồ sơ:..
II. Các đặc điểm nghiên cứu:
2.1. Đặc điểm của người hiến là anh chị em ruột: 
- Số lượng người cho (để tìm 1 người phù hợp nhất):. ..
- Virus viêm gan:.
- Nhóm máu:
- Bệnh lý kèm theo:.
- Diễn biến huy động tế bào gốc:
Thông số
D0
D1
D2
D3
D4
D5
D6
Số lượng BC
BC đa nhân
Uric/LDH
XN khác
Lâm sàng
- CD34+ trước ghép:.....sau gạn:.sau bảo quản:..
- Số lần gạn:.....- Thể tích mỗi lần gạn:...
- Điều kiện bảo quản tế bào gốc:.
- Tỷ lệ tế bào sống/chết sau bảo quản:....
Tác dụng phụ do tiêm G-CSF
Có
Không
- Đau xương/cơ
- Đau đầu
- Tăng LDH
- Lách to
- Tăng huyết áp
- Tăng acid uric
Tác dụng phụ trong quá trình gạn TBG
Có
Không
- Đau đầu
- Rét run
- Tê vùng môi
- Chuột rút
2.2. Đặc điểm đơn vị tế bào gốc máu dây rốn:
- Virus viêm gan:.
- Nhóm máu:
- Tổng phân tích tế bào máu: ..................
- Điện di huyết sắc tố: .
- HLA: 
- Tế bào CD34(+): ..
- Thể tích: ...
2.3. Đặc điểm người nhận:
2.3.1. Đặc điểm chung trước ghép:
- Chẩn đoán:........................................................Nhóm tiên lượng	 
- Đợt lui bệnh:..............................................................................	
- Thời gian từ lúc chẩn đoán bệnh đến khi ghép (tháng):...................	
- Thời gian ghép đến kết thúc nghiên cứu (tháng ..../20...):.............................	
- Viêm gan: Không:	 Có: 
- Bệnh lý khác:...................................................................................	
- Mức độ phù hợp HLA:........................................................................	
- Bất đồng nhóm máu hệ ABO:..................................................................	
- Phác đồ điều kiện hoá:..................................................................................	
- Liều tế bào gốc được truyền/kg.............................................................	
- Dự phòng aGVHD (CSA+MTX): Không:	 Có: 
2.3.2. Biến chứng sau ghép: 
2.3.2.1. Biến chứng ghép chống chủ:
Thời gian
Vị trí
Mức độ
Điều trị
Đáp ứng
aGVHD
cGVHD
2.3.2.2. Các biến chứng khác:
Biến chứng
Có
Không
- Viêm bàng quang chảy máu
- Nhiễm trùng
- Xuất huyết
- VOD
- Hội chứng mọc mảnh ghép
- CMV tái hoạt động
- Tái phát (D+)
2.3.2.3. Biến chứng do CSA
Biến chứng do cyclosporin A
Có
Không
- Tăng huyết áp
- Phì đại lợi
- Tăng Bilirubin máu
- Giảm magie
- Rối loạn chuyển hóa lipid máu
- Đau tay chân, co giật
- Tổn thương thận
2.3.2.4. Biến chứng muộn 
Biến chứng
Có
Không
- CMV tái hoạt động
- Nhiễm trùng muộn
- Tái phát
- cGVHD
- Rối loạn nội tiết
- Ung thư thứ phát
2.3.3. Kết quả ghép:
- Thời gian tế bào hồi phục (ngày):
TB hồi phục 
D1
D5
D8
D12
D15
D30
D60
D90
ANC tăng > 0,5G/l
Tiểu cầu >20*
* không truyền tiểu cầu trong 3 ngày liên tiếp
- Kết quả thời điểm D+30, 90, 180:
+ Tổng phân tích tế bào máu:	
+ Chimerism: Máu toàn phần..T cell	
+ Tủy đồ:	
+ Sinh thiết tủy xương:	
+ Di truyền: Công thức NST FISH X/Y	
+ Sinh học phân tử (gen lơ xê mi): 	
- Kết quả sinh hóa:
Kết quả sinh hóa
D1
D3
D7
D10
D15
D18...
Bilirubin máu
LDH
Creatinin
Magie
Lipid máu
Acid uric
Nồng độ CSA
DANH SÁCH BỆNH NHÂN
STT
Họ tên bệnh nhân
Giới
Năm sinh
Địa chỉ
Ngày ghép
Giang Thị Thanh H
Nữ
1987
Hà Nội
09/09/2012
Lê Thị Ph
Nữ
1968
Hà Nội
25/9/2012
Nguyễn Quang H
Nam
1976
Nam Định
16/11/2012
Nguyễn Thị Ngọc Đ
Nữ
1989
Hà Nội
11/01/2013
Nguyễn Thị Thanh H
Nữ
1989
Bắc Giang
08/3/2013
Vũ Thị Nh
Nữ
1982
Nam Định
13/3/2013
Trần Thị Bích Ng
Nữ
1977
Hà Nội
29/5/2013
Nguyễn Khắc L
Nam
1992
Nghệ An
03/6/2013
Nguyễn Thị Phương A
Nữ
1995
Ninh Bình
01/11/2013
Nguyễn Đình Nam Tr
Nam
2003
Hà Nội
21/11/2013
Đoàn Thị Thanh Th
Nữ
1984
Hà Nội
18/2/2013
Bùi Mạnh Ph
Nam
1972
Hải Dương
12/6/2014
Trương Văn Th
Nam
1965
Hà Nam
22/7/2014
Trịnh Huỳnh H
Nam
1977
Hà Nội
01/8/2014
Lê Minh Ng
Nam
1977
Hà Nội
17/10/2014
Nguyễn Duy Tr
Nam
1975
Hải Phòng
21/10/2014
Trần Thị Th
Nữ
1985
Tuyên Quang
11/11/2014
Vũ Duy H
Nam
1965
Hà Nội
02/12/2014
Hoàng Thị Thùy L
Nữ
1986
Quảng Bình
30/12/2014
Hà Thị H
Nữ
1979
Bình Phước
08/01/2015
Nguyễn Văn Đ
Nam
1976
Bắc Giang
09/3/2015
Lê Huyền Tr
Nữ
1989
Hà Nội
15/4/2015
Nguyễn Hoàng H
Nam
1989
Hà Nội
29/5/2015
Huỳnh Trần Bảo Tr
Nữ
1998
Đà Nẵng
25/9/2015
Lê Thị H
Nữ
1985
Hà Nội
12/10/2015
Xác nhận
của Giáo viên hướng dẫn
GS.TS. Nguyễn Anh Trí
Xác nhận
của Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương