Luận án Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
HUỲNH VĂN CHƢƠNG 
KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ 
CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ 
VÀ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC 
SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ 
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
HUỲNH VĂN CHƢƠNG 
KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ 
CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ VÀ NGHIÊN CỨU 
CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC 
SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ 
Chuyên ngành : Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi 
Mã số : 62 64 01 02 
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 
1. PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân 
2. PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam 
HÀ NỘI, 2017
i 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên 
cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng để bảo vệ 
lấy bất kỳ học vị nào. 
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn, 
các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. 
Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017 
Tác giả luận án 
Huỳnh Văn Chƣơng 
ii 
LỜI CẢM ƠN 
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận đƣợc sự 
hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng 
nghiệp và gia đình. 
Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn 
sâu sắc tới thầy cô PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân, PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam đã tận tình 
hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình 
học tập và thực hiện đề tài. 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ 
môn Bệnh lý, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Miễn dịch học 
và vắc xin, Viện Công nghệ sinh học- Đại học Huế đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá 
trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. 
Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều 
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án. 
Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017 
Nghiên cứu sinh 
Huỳnh Văn Chƣơng 
iii 
MỤC LỤC 
Lời cam đoan i 
Lời cảm ơn ii 
Mục lục iii 
Danh mục chữ viết tắt vii 
Danh mục bảng viii 
Danh mục hình ix 
Danh mục biểu đồ xi 
Danh mục đồ thị xi 
Trích yếu luận án xii 
Thesis abstract xiv 
PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1 
1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1 
1.2 Mục tiêu của đề tài 3 
1.3 Phạm vi nghiên cứu 3 
1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3 
1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 
2.1 Giới thiệu về bệnh cầu trùng gà 4 
2.1.1 Căn bệnh cầu trùng 4 
2.1.2 Đặc điểm dịch tễ 13 
2.1.3 Sinh bệnh học 14 
2.1.4 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của gà bị bệnh cầu trùng 15 
2.1.5 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cầu trùng gà 16 
2.1.6 Điều trị bệnh cầu trùng gà 18 
2.1.7 Miễn dịch chống cầu trùng ở gà 18 
2.1.8 Vắc xin phòng bệnh cầu trùng gà 20 
2.2 Tổng quan về công nghệ ADN tái tổ hợp 21 
2.2.1 Giới thiệu chung về công nghệ ADN tái tổ hợp 21 
2.2.2 Đặc điểm của hệ thống vector pET, pGEM-T Easy, tạo dòng và biểu hiện 
gene trong E. coli 21 
iv 
2.3 Công nghệ chế tạo kháng thể lòng đỏ trứng bằng phƣơng pháp gây miễn 
dịch cho gà mái 24 
2.3.1 Trọng lƣợng phân tử và tính chất lý hóa của IgY (Yolk Immunoglobulin) 24 
2.3.2 Cấu trúc của IgY 24 
2.3.3 Độ bền của IgY 25 
2.3.4 Lợi thế của công nghệ sản xuất IgY 26 
2.3.5 Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng gà 27 
2.3.6 Những ứng dụng của IgY 28 
PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 
3.1 Địa điểm nghiên cứu 31 
3.2 Thời gian nghiên cứu 31 
3.3 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 31 
3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 31 
3.3.2 Thiết bị và hóa chất dùng cho nghiên cứu 31 
3.4 Nội dung nghiên cứu 33 
3.4.1 Khảo sát các đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà 33 
3.4.2 Nghiên cứu tách dòng gene mã hóa kháng nguyên, tạo plasmid mang 
gene kháng nguyên, biến nạp vào tế bào E. coli 33 
3.4.3 Nghiên cứu biểu hiện gene kháng nguyên, tách chiết, tinh khiết và định 
lƣợng kháng nguyên tái tổ hợp 33 
3.4.4 Kiểm tra độ tinh khiết và tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp 33 
3.4.5 Nghiên cứu sản xuất bột lòng đỏ trứng gà có kháng thể phòng trị bệnh 33 
3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 
3.5.1 Phƣơng pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng và xác định bệnh tích đại thể, 
vi thể của gà mắc cầu trùng 34 
3.5.2 Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng 34 
3.5.3 Phƣơng pháp tách chiết ADN để xác định loài cầu trùng gây bệnh ở gà 35 
3.5.4 Phƣơng pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E 35 
3.5.5 Nghiên cứu tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên trong vector tạo dòng 
và biến nạp vào tế bào vật chủ E. coli TOP10. 37 
3.5.6 Nghiên cứu tạo dòng gene 3-1E trong vector pET200/D-TOPO và biểu 
hiện gene kháng nguyên 3-1E 39 
3.5.7 Phƣơng pháp tách chiết tinh khiết, xác định tính đặc hiệu và định lƣợng 
của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp 40 
v 
3.5.8 Phƣơng pháp chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh 
cầu trùng gà 41 
3.5.9 Phƣơng pháp đánh giá hiệu quả phòng và điều trị bệnh cầu trùng của chế 
phẩm 42 
3.5.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 43 
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 
4.1 Tỷ lệ nhiễm, cƣờng độ nhiễm, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể, 
vi thể ở gà mắc cầu trùng 44 
4.1.1 Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm cầu trùng gà nuôi tại huyện Phú Vang, Thừa 
Thiên Huế 44 
4.1.2 Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi ở gà từ 1 đến 42 ngày tuổi 44 
4.1.3 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng 46 
4.1.4 Bệnh tích đại thể chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng 47 
4.1.5 Bệnh tích vi thể chủ yếu ở một số cơ quan của gà mắc bệnh cầu trùng 50 
4.2 Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng 54 
4.2.1 Một số chỉ tiêu hồng cầu ở gà từ 1-42 ngày tuổi mắc bệnh cầu trùng 55 
4.2.2 Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu hệ bạch cầu ở gà mắc bệnh cầu trùng 
(35-42 ngày tuổi) 56 
4.2.3 Kết quả nghiên cứu hàm lƣợng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu 
trùng (35 - 42 ngày tuổi) 58 
4.3 Kết quả phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E 59 
4.3.1 Thu và tinh sạch Oocyst cầu trùng gà 59 
4.3.2 Xác định loài cầu trùng bằng phƣơng pháp PCR 59 
4.3.3 Kết quả tách chiết ARN tổng số 60 
4.3.4 Kết quả thực hiện PCR 61 
4.3.5 Tinh sạch sản phẩm PCR 62 
4.4 Kết quả nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene 3-1E 63 
4.4.1 Kết quả tạo dòng gene kháng nguyên 3-1E vào vector tách dòng 63 
4.4.2 Phân tích trình tự gene 3-1E 64 
4.4.3 Kết quả tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên 3-1E vào vector biểu hiện 
pET200/D-TOPO 66 
4.4.4 Kết quả về tinh khiết và khả năng liên kết của kháng nguyên 3-1E cùng 
đuôi dung hợp 6His với cột Ni2+ 68 
4.5 Tối ƣu điều kiện biểu hiện của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp 70 
vi 
4.5.1 Kết quả sinh trƣởng của E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp mang gene mã 
hóa kháng nguyên 3-1E 70 
4.5.2 Kết quả về khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng 71 
4.5.3 Kết quả về tỷ lệ tiếp giống tối ƣu 72 
4.5.4 Kết quả tốc độ lắc tối ƣu lên khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn E. coli 
chủng BL21 (DE3) 73 
4.5.5 Kết quả về môi trƣờng biểu hiện tối ƣu 74 
4.5.6 Nồng độ tối ƣu của chất cảm ứng IPTG 74 
4.5.7 Thời gian cảm ứng của chất cảm ứng tối ƣu 75 
4.5.8 Nhiệt độ cảm ứng tối ƣu 76 
4.5.9 Mật độ tế bào tối ƣu 77 
4.6 Tách chiết, tinh sạch, định lƣợng và xác định tính đặc hiệu của kháng 
nguyên 3-1E tái tổ hợp 78 
4.6.1 Tách chiết, tinh sạch và định lƣợng kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E 78 
4.6.2 Tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp 78 
4.7 Chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh cầu trùng gà 79 
4.7.1 Xác định liều lƣợng kháng nguyên thích hợp để gây miễn dịch cho gà 79 
4.7.2 Nghiên cứu lựa chọn tá chất gây miễn dịch cho gà 80 
4.7.3 Định lƣợng kháng thể IgY 81 
4.7.4 Xác định hiệu giá kháng thể trong chế phẩm lòng đỏ 82 
4.7.5 Đánh giá hiệu quả phòng bệnh của chế phẩm 83 
4.7.6 Đánh giá hiệu quả điều trị của chế phẩm 86 
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 89 
5.1 Kết luận 89 
5.2 Kiến nghị 89 
Danh mục các công trình đã công bố 91 
Tài liệu tham khảo 92 
Phụ lục 106 
vii 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 
Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt 
Bp Base pair Cặp ba zơ 
BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò 
cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid Sợi ADN bổ sung 
DNA Deoxyribonucleic acid A xít Deoxyribonucleic 
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ 
gắn enzyme 
HI Hemagglutination inhibition Ức chế ngƣng kết hồng cầu 
IgY Yolk Immunoglobulin Kháng thể long đỏ trứng 
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside 
kDa Kilo dalton Kilo dalton 
NC Negative control Đối chứng âm 
OD Optical density Mật độ quang học 
PBS Phosphate buffer saline Dung dịch muối đệm phốt phát 
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp 
RIA Radioimmunoassay Phƣơng pháp miễn dịch phóng 
xạ 
RT – PCR Reverse transcription polymerase chain 
reaction 
Phản ứng chuỗi trùng hợp 
phiên mã ngƣợc 
SARS Severe acute respiratory syndrome Hội chứng viêm phổi cấp tính 
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide 
gel electrophoresis 
Điện di trên gel polyacrylamide 
WSF Water soluble fraction Phần hòa tan trong nƣớc 
viii 
DANH MỤC BẢNG 
STT Tên bảng Trang 
4.1 Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm cầu trùng trên đàn gà tại một số xã của huyện Phú 
Vang 44 
4.2 Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi của gà 45 
4.3 Triệu chứng lâm sàng ở gà mắc bệnh cầu trùng 46 
4.4 Kết quả mổ khám gà bị mắc bệnh cầu trùng 48 
4.5 Tần suất xuất hiện các giai đoạn phát triển của cầu trùng gà trên tiêu bản vi thể 
các cơ quan gà bệnh 50 
4.6 Chỉ tiêu hồng cầu ở gà mắc bệnh cầu trùng 55 
4.7 Chỉ tiêu hệ bạch cầu của gà mắc bệnh cầu trùng 57 
4.8 Hàm lƣợng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu trùng 58 
4.9 Tỷ lệ nhiễm các loài cầu trùng gây bệnh ở gà 60 
4.10 Sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên 
3-1E ở các môi trƣờng khác nhau 70 
4.11 Sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên 
3-1E ở các tỷ lệ tiếp giống khác nhau 73 
4.12 Sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên 
3-1E ở các tốc độ lắc khác nhau 73 
4.13 Kết quả kiểm tra lƣợng kháng thể trong long đỏ trứng của gà đƣợc gây miễn 
dịch với kháng nguyên có bổ sung tá chất 80 
4.14 So sánh tỷ lệ mắc bệnh cầu trùng ở gà đƣợc và không đƣợc phòng bệnh bằng 
kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E 84 
4.15 So sánh tỷ lệ chết ở gà đƣợc và không đƣợc phòng bệnh bằng kháng thể 
kháng kháng nguyên 3-1E 85 
4.16 So sánh sinh trƣởng của gà đƣợc không đƣợc phòng bệnh bằng kháng thể 
kháng kháng nguyên 3-1E 85 
4.17 Lƣợng Oocyst trong phân gà trƣớc và sau điều trị 86 
4.18 Tỷ lệ khỏi bệnh của gà sau điều trị 86 
4.19 Ảnh hƣởng của kháng thể kháng sinh lên sinh trƣởng của gà 87 
ix 
DANH MỤC HÌNH 
STT Tên hình Trang 
2.1 So sánh cấu trúc phân tử của IgY gà và IgG thỏ 25 
4.1 Gà mắc bệnh cầu trùng, phân lẫn máu, đứng co cụm, mào yếm nhợt nhạt 47 
4.2 Gà chết khi bị mắc bệnh cầu trùng 47 
4.3 Manh tràng căng phồng đỏ sẫm bên trong có máu 49 
4.4 Manh tràng bên trong xuất huyết màu đỏ sẫm 50 
4.5 Oocyst cầu trùng, 20x 52 
4.6 Chất chứa lẫn máu trong ruột gà mắc cầu trùng, màu đỏ tƣơi, HE 10x 52 
4.8 Giai đoạn tiền Schizont của cầu trùng trong ruột gà, HE.40x 53 
4.7 Hồng cầu tràn ngập trong ruột gà mắc cầu trùng, HE. 40x 53 
4.9 Megatozit và Schizont 2 (liệt tử) trong ruột gà, HE. 40x 54 
4.10 Thâm nhiễm bạch cầu ái toan ở hạ niêm mạc ruột của gà mắc cầu 
trùng, HE. 40x. 54 
4.11 Oocyst thu đƣợc bằng phƣơng pháp phù nổi 59 
4.12 Sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho một số loài Eimeria 59 
4.13 Ảnh điện di ARN tổng số trên agarose gel 1% có sử dụng 
formaldehyde để biến tính. 61 
4.14 Ảnh điện di sản phẩm PCR trên agarose gel 1 62 
4.15 Ảnh điện di sản phẩm sau tinh sạch trên agarose gel1% 62 
4.16 Ảnh nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng chọn lọc 63 
4.17 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm plasmid pGEM T-easy-3-1E trong 
chủng E. coli TOP10 trên agarose gel1% 64 
4.18 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi M13 trên agarose 
gel 1% 64 
4.19 Mức độ tƣơng đồng giữa gene 3-1E đƣợc phân lập với gene 3-1Eđã 
đƣợc công bố (AF13613) 65 
x 
4.20 Mức độ tƣơng đồng của trình tự amino a xít của kháng nguyên 3-
1E đã phân lập và kháng nguyên 3-1E đã đƣợc công bố 
(AAD39362) 65 
4.21 Tế bào E. coli BL21 (DE3) mang gene 3-1E 67 
4.22 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm plasmid TOPO-3-1E sau khi tách từ 
chủng E. coli BL21 (DE3) 67 
4.23 Biểu hiện của protein 3-1E trong E. coli BL21 tái tổ hợp trên gel 
SDS-PAGE 15%. 68 
4.24 Ảnh tinh sạch và khả năng liên kết giữa đuôi 6xHis với phối tử Ni2+ 69 
4.25 Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene 
mã hóa kháng nguyên 3-1E 72 
4.26 Ảnh hƣởng của môi trƣờng lên mức độ biểu hiện kháng nguyên tái 
tổ hợp 3-1E 74 
4.27 Kết quả biểu hiện kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp ở các nồng độ 
IPTG khác nhau 75 
4.28 Ảnh hƣởng thời gian cảm ứng của IPTG lên sản xuất kháng nguyên 
tái tổ hợp 3-1E 76 
4.29 Ảnh hƣởng của nhiệt độ cảm ứng lên sản xuất kháng nguyên 3-E 76 
4.30 Ảnh hƣởng của mật độ tế bào trƣớc khi bổ sung chất cảm ứng 77 
4.31 Lƣợng kháng nguyên 3-1E thu đƣợc sau khi tinh sạch bằng gel 
ProBond
TM
 Nickel-Chelating Resin 78 
4.32 Kết quả Western blot kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên 3-1E 79 
4.33 Ảnh điện di định lƣợng kháng thể IgY trên gel SDS-PAGE 12% 82 
4.34 Bột lòng đỏ trứng sau khi đông khô 83 
4.35 Ảnh kết quả ELISA một số mẫu kháng thể IgY3-1E 83 
4.36 Oocyst phát triển thành dạng gây nhiễm 84 
xi 
DANH MỤC BIỂU ĐỒ 
STT Tên biểu đồ Trang 
4.1. Kết quả kiểm tra lƣợng kháng thể trong trứng của gà đƣợc gây miễn dịch với 
các tá chất khác nhau 81 
 DANH MỤC ĐỒ THỊ 
STT Tên đồ thị Trang 
4.1. Kết quả ELISA khảo sát lƣợng kháng thể kháng 3-1E 80 
xii 
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN 
Họ và tên nghiên cứu sinh: Huỳnh Văn Chƣơng 
Tên luận án: Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu 
chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị 
Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi; Mã số: 62 64 01 02 
Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam 
Mục đích nghiên cứu 
 Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của gà mắc bệnh cầu trùng tại Thừa 
Thiên Huế và tạo ra chế phẩm sinh học chứa kháng thể IgY đặc hiệu kháng kháng 
nguyên 3-1E của cầu trùng gà, sử dụng cho đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh cầu 
trùng gà. 
Phƣơng pháp nghiên cứu 
 Luận án sử dụng các phƣơng pháp: Các biểu hiện lâm sàng đƣợc xác định bằng 
phƣơng pháp thƣờng quy, thu Oocyst cầu trùng bằng phƣơng pháp phù nổi và kiểm tra trên 
kính hiển vi. Tất cả những gà chết do cầu trùng đƣợc mổ khám thu mẫu bệnh phẩm để xác 
định bệnh lý đại thể và vi thể, mẫu bệnh phẩm đƣợc cố định trong dung dịch formon 10 , 
tiêu bản vi thể đƣợc làm theo quy trình tẩm đúc parafin và nhuộm bằng Haematoxylin- 
Eosin. Một số chỉ tiêu huyết học đƣợc xác định bằng máy tự động Cell Dyn 3700. 
 ARN tổng số của cầu trùng gà đƣợc phân lập bằng Kit “SV Total RNA Isolation 
System  ... . R. and M. C. Dougald (1991). Coccidiosis deseases of Poultry. 
Nineth Iowa State University Press, Ames, USA: p. 38 - 40. 
134. Wills F. K. and L. E. Luginbuhl (1963). The use of egg yolk for passive immunization 
of chickens against Newcastle disease. Avian Dis. Vol 7 (1). pp. 5-12. 
135. Woods W. G., K. G. Whithear, D. G. Richards, G. R. Anderson, W. K. Jorgensen 
and R. B. Gasser (2000). Single-strand restriction fragment length polymorphism 
analysis of the second internal transcribed spacer (ribosomal DNA) for six species 
of Eimeria from chickens in Australia. Int J Parasitol. Vol 30 (9). pp. 1019-1023. 
136. Xiao Y., X. Gao, O. Taratula, S. Treado, A. Urbas, R. D. Holbrook, R. E. Cavicchi, C. 
T. Avedisian, S. Mitra, R. Savla, P. D. Wagner, S. Srivastava and H. He (2009). Anti-
HER2 IgY antibody functionalized single-walled carbon nanotubes for detection and 
selective destruction of breast cancer cells. BMC Cancer. 
137. Xu J., Y. Zhang and J. Tao (2013a). Efficacy of a DNA Vaccine Carrying Eimeria 
maxima Gam56 Antigen Gene against Coccidiosis in Chickens. Korean J 
Parasitol. Vol 51 (2). pp. 147-154. 
138. Xu J., C. Z. Ren, S. Wang, D. Liu, L. Cao and J. Tao (2013b). Protection Efficacy 
of Multivalent Egg Yolk Immunoglobulin against Eimeria tenella Infection in 
Chickens. Iran J Parasitol. Vol 8 (13). pp. 449-458. 
139. Xu S. Z., T. Chen and M. Wang (2006a). Protective immunity enhanced by 
chimeric DNA prime-protein booster strategy against Eimeria tenella challenge. 
Avian diseases. Vol 50 (4). pp. 579-585. 
105 
140. Xu Z., Z. Zhong, L. Huang, L. Peng, F. Wang and P. Cen (2006b). High level 
production of bioactive human beta-defens in-4 in Escherichia coli by soluble fusion 
expression. Applied microbiology and biotechnology. Vol 72 (3). pp. 471-479. 
141. Ye J., H. Shao and D. R. Perez (2012). Passive immune neutralization strategies 
for prevention and control of influenza A infections. Immunotherapy. Vol 4 (2). 
pp. 175-186. 
142. Ying Z., L. Wang, P. Yao, J. Zhang and J. An (2013). Expression and purification 
of 3-1E gene from Eimeria acervulina in Pichia pastoris. Journal of Chemical and 
Pharmaceutical Research. Vol 5 (11). pp. 659-665. 
143. Yokoyama H., R. C. Peralta, R. Diaz, S. Sendo, Y. Ikemori and Y. Kodama 
(1992). Passive protective effect of chicken eggyolk immunoglobulins against 
experimental enterotoxigenic Escherichia coli infection in neonatal piglets. 
InfectImmun. Vol 60 (3). pp. 998-1007. 
144. Yokoyama K., N. Sugano, A. K. Rahman, M. Oshikawa and K. Ito (2007). 
Activity of anti–Porphyromonas gingivalis egg yolk antibody against gingipains in 
vitro. Oral Microbiol. Immunol. Vol 22 (5). pp. 352-355. 
145. Yousif A. A., W. A. Mohammad, M. H. deir and A. A. el-Sanousi (2006). Oral 
administration of hyperimmune IgY: an immunoecological approach to curbing acute 
infectious bursal disease virus infection. Egypt. J. Immunol. Vol 13 (2). pp. 85-94. 
146. Zander D and E. Mallinson (1991). Principles of disease prevention: diagnosic and 
control. In Desaese of Poutry. Ames. Iowa State Univ. pp. 3-44. 
147. Zhao Y., C. Wang, Y. Lu, S. Amer, P. Xu, J. Wang, J. Lu, Y. Bao, B. Deng, H. He 
and J. Qin (2011). Prokaryotic expression and identification of 3-1E gene of 
merozoite surface antigen of Eimeria acervulina. Parasitol Res. Vol 109 (5). pp. 
1361-1365. 
148. Zhen Y. H., L. J.Jin, J. Guo, X. Y. Li, Y. N. Lu and J. Chen (2008). Characterization 
of specific egg yolk immunoglobulin (IgY) against mastitis-causing Escherischia coli. 
Vet Microbiol. Vol 130 (1-2). pp. 126-133. 
106 
PHỤ LỤC 1 
MỘT SỐ TRANG THIẾT BỊ DÙNG CHO NGHIÊN CỨU 
 Máy luân nhiệt PCR Bộ thiết bị điện di protein 
 Máy ly tâm lạnh Máy siêu âm mẫu 
 Tủ nuôi lắc, ổn nhiệt Máy cảm ứng (water barth) 
107 
PHỤ LỤC 2 
MỘT SỐ HÌNH ẢNH HOẠT ĐỘNG THÍ NGHIỆM 
Đƣờng tiêu hóa của gà mắc bệnh cầu trùng Kiểm tra Oocyst cầu trùng gà 
Giải phẩu manh tràng gà mắc bệnh cầu trùng để thu Oocyst 
108 
 Cắt gel agarose có chứa 
gene 3-1E để tinh sạch 
Kết tủa háng thể 
Kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng 
ELISA 
Thu trứng gà chứa kháng thể kháng 
kháng nguyên 3-1E 
109 
PHỤ LỤC 3 
KIỂM ĐỊNH SỰ SAI KHÁC CÁC TỶ LỆ 
(Sử dụng phần mềm Minitab 14.0) 
1. Tỷ lệ nhiễm cầu trùng tại 3 xã 
Rows: Xã Columns: ketqua 
 - + All 
PH 158 150 308 
 51.30 48.70 100.00 
 160.0 148.0 308.0 
PL 165 155 320 
 51.56 48.44 100.00 
 166.2 153.8 320.0 
PT 157 139 296 
 53.04 46.96 100.00 
 153.8 142.2 296.0 
All 480 444 924 
 51.95 48.05 100.00 
 480.0 444.0 924.0 
Pearson Chi-Square = 29.213, DF = 3, P-Value = 0.025 
2. Tỷ lệ nhiễm theo tuổi 
Rows: TUOI Columns: KETQUA 
 - _ + All 
T1 150 0 36 186 
 80.65 0.00 19.35 100.00 
 63.52 14.52 107.96 186.00 
T2 39 0 161 200 
 19.50 0.00 80.50 100.00 
 68.30 15.62 116.08 200.00 
T3 42 0 88 130 
 32.31 0.00 67.69 100.00 
 44.39 10.15 75.45 130.00 
T4 0 67 135 202 
 0.00 33.17 66.83 100.00 
 68.98 15.77 117.24 202.00 
T5 62 0 78 140 
 44.29 0.00 55.71 100.00 
 47.81 10.93 81.26 140.00 
All 293 67 498 858 
 34.15 7.81 58.04 100.00 
 293.00 67.00 498.00 858.00 
Pearson Chi-Square = 491.473, DF = 8, P-Value = 0.000 
110 
3. Bệnh tích gà bị nhiễm cầu trùng 
Rows: benhtichTT Columns: ketqua 
 - + All 
MT 62 180 242 
 25.62 74.38 100.00 
 181.5 60.5 242.0 
MT-RN 218 24 242 
 90.08 9.92 100.00 
 181.5 60.5 242.0 
RN 219 23 242 
 90.50 9.50 100.00 
 181.5 60.5 242.0 
TT 227 15 242 
 93.80 6.20 100.00 
 181.5 60.5 242.0 
All 726 242 968 
 75.00 25.00 100.00 
 726.0 242.0 968.0 
Pearson Chi-Square = 420.694, DF = 3, P-Value = 0.000 
4. Tỷ lệ nhiễm các loài cầu trùng 
Chi-Square Test: số không nhiễm. số nhiễm 
Rows: loaicautrung Columns: ketqua 
 Sk nhiễm số nhiễm All 
EA 305 193 498 
 61.24 38.76 100.00 
 359 139 498 
EM 360 138 498 
 72.29 27.71 100.00 
 359 139 498 
EMi 452 46 498 
 90.76 9.24 100.00 
 359 139 498 
EN 396 102 498 
 79.52 20.48 100.00 
 359 139 498 
EP 420 78 498 
 84.34 15.66 100.00 
 359 139 498 
ET 221 277 498 
 44.38 55.62 100.00 
 359 139 498 
All 2154 834 2988 
 72.09 27.91 100.00 
 2154 834 2988 
Pearson Chi-Square = 356.277, DF = 5, P-Value = 0.000 
111 
5. Tỷ lệ mắc bệnh cầu trùng gà đƣợc và không đƣợc phòng bệnh bằng kháng 
thể kháng kháng nguyên 3-1E 
Rows: loga Columns: KETQUA 
 - + All 
DC 6 44 50 
 12 88 100 
 25.50 24.50 50.00 
TN 45 5 50 
 90 10 100 
 25.50 24.50 50.00 
All 51 49 100 
 51 49 100 
 51.00 49.00 100.00 
Pearson Chi-Square = 60.864, DF = 1, P-Value = 0.000 
6. So sánh tỷ lệ chết của gà đƣợc và không đƣợc phòng bệnh bằng kháng thể 
kháng kháng nguyên 3-1E 
Rows: loga Columns: KETQUA 
 số gà k chết gà chết All 
DC 9 41 50 
 18 82 100 
 28.50 21.50 50.00 
TN 48 2 50 
 96 4 100 
 28.50 21.50 50.00 
All 57 43 100 
 57 43 100 
 57.00 43.00 100.00 
Chi-Square = 62.056, DF = 1, P-Value = 0.000 
7. Tỷ lệ khỏi bệnh của gà sau khi điều trị 
Chi-Square Test: Số gà không khỏ bệnh; số gà khỏi bệnh 
Rows: logathnghiem Columns: ketqua 
 kkhỏibệnh khỏi bệnh All 
LO1 2 48 50 
 4.00 96.00 100.00 
 1.25 48.75 50.00 
LO2 0 50 50 
 0.00 100.00 100.00 
 1.25 48.75 50.00 
LO3 0 50 50 
 0.00 100.00 100.00 
 1.25 48.75 50.00 
112 
LO4 3 47 50 
 6.00 94.00 100.00 
 1.25 48.75 50.00 
All 5 195 200 
 2.50 97.50 100.00 
 5.00 195.00 200.00 
Chi-Square = 5.538, DF = 3, P-Value = 0.036 
8. One-way ANOVA: Gà khỏe HC, Gà bệnh HC 
Source DF SS MS F P 
hc 1 5.6927 5.6927 127.63 0.000 
Error 38 1.6949 0.044 
Total 39 7.3876 
S = 0.2112 R-Sq = 77.06% R-Sq(adj) = 76.45% 
 Individual 95% CIs For Mean Based on 
 Pooled StDev 
Level N Mean StDev -----+---------+---------+---------+---- 
gà bệnh 20 1.754 0.2029 (---*---) 
gà khoẻ 20 2.553 0.2192 (---*---) 
 -----+---------+---------+---------+---- 
 1.75 2.00 2.25 2.50 
Pooled StDev = 0.2112 
9. One-way ANOVA: Gà khỏe Hb, Gà bệnh Hb 
Source DF SS MS F P 
Hb 1 25.28 25.28 16.36 0.000 
Error 38 58.74 1.55 
Total 39 84.02 
S = 1.243 R-Sq = 30.09% R-Sq(adj) = 28.25% 
 Individual 95% CIs For Mean Based on 
 Pooled StDev 
Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+-------- 
gà bệnh 20 7.110 1.274 (-------*-------) 
gà khỏe 20 9.400 1.212 (-------*-------) 
 -+---------+---------+---------+-------- 
 7.00 7.70 8.40 9.10 
Pooled StDev = 1.243 
10. One-way ANOVA: Gà khỏe Tỷ khối huyết cầu, Gà bệnh Tỷ khối huyết cầu 
Source DF SS MS F P 
tkhc 1 595.984 595.984 780.79 0.000 
Error 38 29.006 0.763 
Total 39 624.990 
S = 0.8737 R-Sq = 95.36% R-Sq(adj) = 95.24% 
113 
 Individual 95% CIs For Mean Based on 
 Pooled StDev 
Level N Mean StDev -----+---------+---------+---------+---- 
gà bệnh 20 21.851 0.742 (-*) 
gà khỏe 20 29.750 0.988 (-*) 
 -----+---------+---------+---------+---- 
 22.5 25.0 27.5 30.0 
Pooled StDev = 0.874 
11. One-way ANOVA: Gà khỏe Thể tích bình quân hồng cầu, Gà bệnh Thể tích 
bình quân hồng cầu 
Source DF SS MS F P 
bqhc 1 118.9 118.9 3.49 0.000 
Error 38 1294.8 34.1 
Total 39 1413.7 
S = 5.837 R-Sq = 8.41% R-Sq(adj) = 6.00% 
 Individual 95% CIs For Mean Based on 
 Pooled StDev 
Level N Mean StDev -------+---------+---------+---------+-- 
Gà khỏe 20 120.312 0.16 (---------*----------) 
gà bệnh 20 124.381 8.25 (----------*---------) 
 -------+---------+---------+---------+-- 
 120.0 122.5 125.0 127.5 
Pooled StDev = 5.84 
12. One-way ANOVA: Gà khỏe Nồng độ huyết sắt tố bình quân, Gà bệnh Nồng độ 
huyết sắt tố bình quân 
Source DF SS MS F P 
hstbq 1 0.2739 0.2739 3.11 0.086 
Error 38 3.3496 0.0881 
Total 39 3.6235 
S = 0.2969 R-Sq = 7.56% R-Sq(adj) = 5.13% 
 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled 
 StDev 
Level N Mean StDev +---------+---------+---------+--------- 
Gà bệnh 20 13.450 0.047 (-----------*----------) 
Gà khỏe 20 13.645 0.417 (----------*-----------) 
 +---------+---------+---------+--------- 
 13.32 13.44 13.56 13.68 
Pooled StDev = 0.297 
13. One-way ANOVA: Gà khỏe Lƣợng huyết sắt tố bình quân, Gà bệnh Lƣợng 
huyết sắt tố bình quân 
Source DF SS MS F P 
lhstbq 1 88.0902 88.0902 1147.89 0.000 
Error 38 2.9161 0.0767 
Total 39 91.0064 
S = 0.2770 R-Sq = 96.80% R-Sq(adj) = 96.71% 
114 
 Individual 95% CIs For Mean Based on 
 Pooled StDev 
Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+--- 
Gà bệnh 20 40.505 0.195 (*) 
Gà khỏe 20 37.527 0.340 (-*) 
 ------+---------+---------+---------+--- 
 38.0 39.0 40.0 41.0 
Pooled StDev = 0.277 
14. One-way ANOVA: Gà khỏe Bạch cầu, Gà bệnh Bạch cầu 
Source DF SS MS F P 
bc 1 364.39 364.39 229.01 0.000 
Error 38 60.46 1.59 
Total 39 424.86 
S = 1.261 R-Sq = 85.77% R-Sq(adj) = 85.39% 
 Individual 95% CIs For Mean Based on 
 Pooled StDev 
Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+-------- 
gà bệnh 20 32.353 0.702 (--*-) 
gà khỏe 20 26.406 1.640 (-*--) 
 -+---------+---------+---------+-------- 
 26.0 28.0 30.0 32.0 
Pooled StDev = 1.261 
15. One-way ANOVA: Gà khỏe Bạch cầu nhân trung tính, Gà bệnh Bạch cầu nhân 
trung tính 
Source DF SS MS F P 
dntt 1 2898.51 2898.51 2308.11 0.000 
Error 38 47.72 1.26 
Total 39 2946.23 
S = 1.121 R-Sq = 98.38% R-Sq(adj) = 98.34% 
 Individual 95% CIs For Mean Based on 
 Pooled StDev 
Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+-------- 
gà bệnh 20 51.820 1.298 (*) 
gà khỏe 20 35.251 0.910 (*) 
 -+---------+---------+---------+-------- 
 35.0 40.0 45.0 50.0 
Pooled StDev = 1.121 
16. One-way ANOVA: Gà khỏe tế bào lympho, Gà bệnh tế bào lympho 
Source DF SS MS F P 
lympho 1 2978.213 2978.213 10165.81 0.000 
Error 38 11.133 0.293 
Total 39 2989.346 
S = 0.5413 R-Sq = 99.63% R-Sq(adj) = 99.62% 
115 
 Individual 95% CIs For Mean Based on 
 Pooled StDev 
Level N Mean StDev -------+---------+---------+---------+-- 
gà bệnh 20 41.011 0.685 (* 
gà khỏe 20 59.208 0.342 *) 
 -------+---------+---------+---------+-- 
 45.0 50.0 55.0 60.0 
Pooled StDev = 0.541 
17. One-way ANOVA: Gà khỏe Bạch cầu đơn nhân lớn, Gà bệnh Bạch cầu đơn 
nhân lớn 
Source DF SS MS F P 
bcdnl 1 26.244 26.244 128.07 0.000 
Error 38 7.787 0.205 
Total 39 34.031 
S = 0.4527 R-Sq = 77.12% R-Sq(adj) = 76.52% 
 Individual 95% CIs For Mean Based on 
 Pooled StDev 
Level N Mean StDev +---------+---------+---------+--------- 
gà bệnh 20 2.8050 0.3953 (--*---) 
gà khỏe 20 4.2050 0.5035 (--*---) 
 +---------+---------+---------+--------- 
 2.40 3.00 3.60 4.20 
Pooled StDev = 0.4527 
18. One-way ANOVA: Gà khỏe Bạch cầu ái kiềm, gà bệnh Bạch cầu ái kiềm 
Source DF SS MS F P 
bcak 1 0.000084 0.000084 0.09 0.764 
Error 38 0.035062 0.000923 
Total 39 0.035146 
S = 0.03038 R-Sq = 0.24% R-Sq(adj) = 0.00% 
 Individual 95% CIs For Mean Based on 
 Pooled StDev 
Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+------- 
gà bệnh 20 0.12045 0.02451 (-----------------*----------------) 
gà khỏe 20 0.12135 0.03528 (----------------*----------------) 
 --+---------+---------+---------+------- 
 0.1120 0.1200 0.1280 0.1360 
Pooled StDev = 0.03038 
19. One-way ANOVA: Gà khỏe bạch cầu ái toan, gà bệnh Bạch cầu ái toan 
Source DF SS MS F P 
bcatoan 1 43.3472 43.3472 2700.54 0.000 
Error 38 0.6100 0.0161 
Total 39 43.9572 
S = 0.1267 R-Sq = 98.61% R-Sq(adj) = 98.58% 
 Individual 95% CIs For Mean Based on 
 Pooled StDev 
Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+-------- 
gà bệnh 20 3.3205 0.1572 (*) 
gà khỏe 20 1.2235 0.0859 (*) 
 -+---------+---------+---------+-------- 
 1.20 1.80 2.40 3.00 
Pooled StDev = 0.1267 
116 
20. One-way ANOVA: Gà khỏe Protein tổng số, gà bệnh Protein tổng số 
Source DF SS MS F P 
protein 1 3298.22 3298.22 2692.77 0.000 
Error 38 46.54 1.22 
Total 39 3344.76 
S = 1.107 R-Sq = 98.61% R-Sq(adj) = 98.57% 
 Individual 95% CIs For Mean Based on 
 Pooled StDev 
Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+--- 
gà bệnh 20 17.307 0.800 (*) 
gà khỏe 20 35.468 1.345 (*) 
 ------+---------+---------+---------+--- 
 20.0 25.0 30.0 35.0 
Pooled StDev = 1.107 
21. One-way ANOVA: Gà khỏe Albumin, gà bệnh Albumin 
Source DF SS MS F P 
albumin 1 1341.659 1341.659 1793.17 0.000 
Error 38 28.432 0.748 
Total 39 1370.091 
S = 0.8650 R-Sq = 97.92% R-Sq(adj) = 97.87% 
 Individual 95% CIs For Mean Based on 
 Pooled StDev 
Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+------ 
gà bệnh 20 6.151 0.719 (*) 
gà khỏe 20 17.924 0.989 (*) 
 ---+---------+---------+---------+------ 
 7.0 10.5 14.0 17.5 
Pooled StDev = 0.865 
22. One-way ANOVA: Gà khỏe globulin, gà bệnh globulin 
Source DF SS MS F P 
globulon 1 376.812 376.812 504.00 0.000 
Error 38 28.410 0.748 
Total 39 405.222 
S = 0.8647 R-Sq = 92.99% R-Sq(adj) = 92.80% 
 Individual 95% CIs For Mean Based on 
 Pooled StDev 
Level N Mean StDev -----+---------+---------+---------+---- 
gà bệnh 20 11.463 0.964 (-*-) 
gà khỏe 20 17.511 0.753 (-*-) 
 -----+---------+---------+---------+---- 
 12.0 14.0 16.0 18.0 
Pooled StDev = 0.865