Luận án Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm A / H1N1 / 09 đại dịch tại Việt Nam, 2009 - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG 
-------------------------- 
NGUYỄN THỊ KIM PHƢƠNG 
MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC 
CỦA VI RÚT CÚM A/H1N1/09 ĐẠI DỊCH 
TẠI VIỆT NAM, 2009 - 2013 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC 
HÀ NỘI – 2015 
i 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG 
-------------------------- 
NGUYỄN THỊ KIM PHƢƠNG 
MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC 
CỦA VI RÚT CÚM A/H1N1/09 ĐẠI DỊCH 
TẠI VIỆT NAM, 2009 - 2013 
Chuyên ngành: Vi sinh Y học 
Mã số: 62.72.01.15 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC 
 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 
1. PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai 
2. PGS.TS. Trần Hải Anh 
HÀ NỘI – 2015
ii 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan bản luận án này là công trình nghiên cứu nghiêm túc, 
trung thực. Tất cả số liệu và kết quả trong luận án chƣa từng đƣợc ai công bố 
trong bất kỳ công trình nào khác. 
 Nghiên cứu sinh 
 Nguyễn Thị Kim Phương 
iii 
LỜI CẢM ƠN 
Để hoàn thành luận án này, tôi xin trân trọng cảm ơn: 
- Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng 
- Ban Giám đốc, Trung tâm cúm Quốc gia, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng 
- Ban Giám đốc Bệnh viện, Khoa Vi sinh vật – Bệnh viện TWQĐ 108 
Đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới nhà khoa học 
PGS.TS.Lê Thị Quỳnh Mai ngƣời Thầy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt 
kinh nghiệm quý báu cho tôi từ những bƣớc đi đầu tiên trong lĩnh vực vi rút học và 
luôn khuyến khích tôi tích cực nghiên cứu tiếp cận những kiến thức nâng cao để tôi 
hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới Thầy PGS.TS.Trần Hải 
Anh đã sửa chữa chi tiết, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình 
nghiên cứu. 
Tôi xin trân trọng cảm ơn Chủ nhiệm và các thành viên nghiên cứu trong đề 
tài cấp nhà nƣớc về Cúm A/H1N1/09 đại dịch (Mã số ĐTĐL2009G/55), Phòng Thí 
nghiệm Cúm Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng đã giúp đỡ tôi trong 
suốt quá trình nghiên cứu. 
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ của TS. Tsutomu Kageyama Trung tâm 
Cúm thuộc Viện Quốc gia các bệnh Truyền nhiễm Nhật Bản (NIID) hỗ trợ kỹ thuật 
ban đầu của nghiên cứu. 
Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, TS. Hoàng Vũ Mai 
Phương, ThS. Nguyễn Cơ Thạch, ThS. Lê Thị Thanh cùng các bạn đồng nghiệp 
công tác tại Phòng Thí nghiệm cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung 
ƣơng đã nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận án. 
Tôi xin gửi đến mọi thành viên trong gia đình, những người thân yêu, những 
bạn bè đồng nghiệp đã luôn động viên chia sẻ về mọi mặt để tôi vƣợt qua mọi khó 
khăn trong quá trình nghiên cứu đạt đƣợc thành quả ngày hôm nay. 
 Hà Nội, tháng 01 năm 2015 
 NGUYỄN THỊ KIM PHƢƠNG 
iv 
MỤC LỤC 
Trang phụ bìa i 
Lời cam đoan ii 
Lời cảm ơn iii 
Mục lục iv 
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vii 
Danh mục các bảng ix 
Danh mục các hình vẽ, biểu đồ, sơ đồ x 
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 
CHƢƠNG I – TỔNG QUAN ......................................................................... 3 
1.1. Vi rút cúm................................................................................................... 3 
1.1.1. Đặc điểm vi rút học ............................................................................. 3 
1.1.2. Quá trình nhân lên của vi rút cúm A ................................................. 10 
1.2. Đại dịch cúm A/H1N1/09 ........................................................................ 13 
1.2.1. Tình hình cúm A(H1N1)pdm09 trên thế giới ................................... 13 
1.2.2. Phản ứng của TCYTTG trƣớc diễn biến của đại dịch A/H1N1/09. . 19 
1.2.3. Tình hình đại dịch cúm A/H1N1/09 tại Việt Nam ............................ 20 
1.2.4. Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 ............................................................. 21 
1.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán vi rút cúm A(H1N1)pdm09 PTN .............. 24 
1.3.1. Phân lập vi rút. .................................................................................. 24 
1.3.2. Phƣơng pháp phát hiện vật liệu di truyền ......................................... 26 
1.3.3. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể ..................................................... 30 
1.4. Vắc xin ..................................................................................................... 32 
1.4.1. Các loại vắc xin cúm ......................................................................... 33 
1.4.2. Đáp ứng miễn dịch của vắc xin cúm ................................................. 37 
1.4.3. Phản ứng phụ của vắc xin cúm mùa và cúm đại dịch ....................... 38 
Trang 
v 
1.4.4. Lựa chọn chủng vi rút dự tuyển vắc xin ........................................... 38 
CHƢƠNG II – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 41 
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 41 
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ....................................................................... 41 
2.1.2 . Tiêu chuẩn lựa chọn chủng cúm A(H1N1)pdm09 ........................... 41 
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu: ........................................................................ 41 
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu:.......................................................................... 41 
2.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: .................................................... 41 
2.2.3. Cỡ mẫu trong nghiên cứu .................................................................. 42 
2.2.4. Các biến số nghiên cứu ..................................................................... 42 
2.2.5. Vật liệu và kĩ thuật xét nghiệm ......................................................... 43 
2.2.6. Trang thiết bị và dụng cụ tiêu hao. ................................................... 60 
2.3. Vấn đề Y đức trong nghiên cứu ............................................................... 60 
CHƢƠNG III – KẾT QUẢ .......................................................................... 61 
3.1. Lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu. ............. 61 
3.2. Kết quả PCR phân tách và khuếch đại 6 phân đoạn gen. ....................... 62 
3.2.1. Đặc điểm di truyền gen HA(Haemagglutinin) .................................. 63 
3.2.2. Đặc điểm di truyền gen NA(Neuraminidase). .................................. 69 
3.2.3. Đặc điểm di truyền các gen M, NS, PB1 và PB2. ............................ 74 
3.3. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 ........................ 84 
3.3.1. Kết quả thử nghiệm HI trên các vi rút phân lập trong nghiên cứu. .. 84 
3.3.2. Phân bố sự thay đổi đặc tính kháng nguyên theo thời gian và các thay 
đổi axit amin trong protein HA liên quan. .................................................. 85 
3.4. Các đột biến liên quan đến thay đổi đặc điểm kháng nguyên hoặc giảm độ 
nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir. ................................ 86 
3.4.1. Phát hiện đột biến bằng phân tích trình tự nucleotide. ..................... 87 
vi 
3.4.2. Kết quả thử nghiệm sinh học đánh giá ảnh hƣởng của đột biến đến 
biểu hiện kiểu hình của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. ................................. 89 
3.5. Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin ........................ 90 
3.6. Thử nghiệm ngƣng kết hồng cầu (Haemagglutinin Assay –HA) ............ 93 
CHƢƠNG IV – BÀN LUẬN. ....................................................................... 95 
4.1. Sự lƣu hành của cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, 2009 -2013. ......... 95 
4.2. Lựa chọn vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu. .......... 96 
4.3. Kết quả phân tách, khuếch đại và giải trình tự 6 phân đoạn gen ............. 97 
4.4. Kết quả phân tích cây gia hệ HA, NA, M, NS, PB1 và PB2 ................... 98 
4.5. Kết quả phân tích protein HA, NA, M1, M2 , NS1, NS2, PB1, PB2 .. 101 
4.5.1 . Protein HA ..................................................................................... 101 
4.5.2 . Protein NA. .................................................................................... 106 
4.5.3 . Các protein M1, M2 , NS1, NS2, PB1 và PB2. ............................. 108 
4.6. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 ...................... 109 
4.7. Kết quả thử nghiệm ức chế neuraminidase (NAI). ................................ 112 
4.8. Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin ...................... 113 
KẾT LUẬN .................................................................................................. 118 
KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 120 
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
PHỤ LỤC 
vii 
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 
A(H1N1)pdm09 (Danh pháp chuẩn quốc tế) – A/H1N1/09 đại dịch 
(The novel influenza A(H1N1)vi rút which is causing of human influenza pandemic in 2009) 
ADN Axit Deoxyribonucleic 
ARN Axit Ribonucleic 
CDC Centers for Disease Control 
(Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng Mỹ) 
CPE Cytopathogenic effect (Gây hủy hoại tế bào) 
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assays 
(Phản ứng hấp thụ miễn dịch gắn enzyme) 
FAO Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lâm thế giới) 
GISRS Global Influenza Surveillance and Response System 
(Hệ thống giám sát cúm toàn cầu) 
HA Haemaglutinin 
HI Hemagglutinin Inhibition Assay (Phản ứng ức chế ngƣng kết hồng cầu) 
IC50 Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%) 
IFA Immunofluorescent Assay (Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang) 
ILI Influenza Like Illness (Bệnh giống cúm) 
IQR Interquartile Range (Khoảng tứ phân vị) 
ISIRV International Society for Influenza and other Respiratory Virus Diseases 
(Hiệp hội quốc tế về bệnh cúm và các bệnh vi rút gây viêm đƣờng hô hấp 
khác) 
IVAC Institute of Vaccines And Medical Biological 
(Viện vắc xin và sinh phẩm Y tế, Nha trang) 
MDCK Mardin Darby Canin Kidney cell (Tế bào thận chó thƣờng trực) 
MN Microneutralization Assay (Phản ứng trung hoà vi lƣợng) 
NA Neuramindase 
NAI Neuraminidase Inhibition Assay 
( Thử nghiệm ức chế enzyme Neuraminidase) 
NIBSC Nationnal Institute for Biological Standards and Control 
(Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và Kiểm soát sinh học Vƣơng quốc Anh) 
viii 
NLS Nuclear Localization Signal (Tín hiệu định vị nhân) 
NP Nucleoprotein 
NS Non-structural 
OIE World Organisation for Animal Health (Tổ chức thú y thế giới) 
PA Polymerase acid 
PB Polymerase basic 
PCR Polymerase Chain Reaction (Phƣơng pháp khuếch đại gen) 
Polivac Viện nghiên cứu sản xuất vắc xin, Hà Nội 
RNP Ribonucleoprotein 
RT- PCR Reserve Transcriptase - Polymerase Chain Reaction 
(Phƣơng pháp khuếch đại gen phiên mã ngƣợc) 
RT-LAMP Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification 
(Phƣơng pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngƣợc) 
SARS Severe Acute Respiratory Syndrome 
(Hội chứng hô hấp cấp tính nặng) 
Sequence Phƣơng pháp xác định trình tự gen 
VABIOTECH Company for vaccine and biologycal production No1 
(Công ty TNHH một thành viên vắc xin và sinh phẩm số 1) 
WHO 
TCYTTG 
World Health Organization 
Tổ chức Y tế Thế giới 
PTN Phòng thí nghiệm 
ix 
DANH MỤC BẢNG 
Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN và chức năng của vi rút cúm............................ 8 
Bảng 1.2 Diễn biến dịch liên quan đến phát hiện, kiểm soát hoạt động của 
trƣờng học trong giai đoạn A(H1N1)pdm09 tại Mexico ............................... 14 
Bảng 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................... 42 
Bảng 2.2 Bảng nhận định kết quả IC50 của vi rút cúm .................................... 56 
Bảng 3.1 Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu. 61 
Bảng 3.2 Kết quả tổng hợp 6 phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 
bằng phản ứng PCR......................................................................................... 63 
Bảng 3.3 Sự thay đổi (đột biến) axit amin trên protein HA ........................... 67 
Bảng 3.4 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein HA .................................. 68 
Bảng 3.5 Sự thay đổi (đột biến ) axit amin trên protein NA .......................... 72 
Bảng 3.6 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein NA .................................. 73 
Bảng 3.7 So sánh sự tƣơng đồng về axit amin trong các protein M1,M2, NS1, 
NS2, PB1 và PB2 của vi rút trong nghiên cứu................................................ 82 
Bảng 3.8 Tần suất thay đổi axit amin thƣờng gặp trong protein ................... 83 
Bảng 3.9 Kết quả hiệu giá HI của các vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt 
Nam, 2009-2013. ............................................................................................. 84 
Bảng 3.10 Thay đổi hiệu giá HI của vi rút nghiên cứu theo thời gian. ........... 85 
Bảng 3.11 Hiệu giá HI của các vi rút mang đột biến G155E và N156K. ....... 89 
Bảng 3.12 Kết quả thử nghiệm NAI với vi rút mang đột biến H275Y........... 90 
Bảng 3.13 Kết quả lựa chọn vi rút dự tuyển vắc xin bằng đánh giá độ tƣơng 
đồng về di truyền học trên gen HA và NA. .................................................... 91 
Bảng 3.14 Độ tƣơng đồng nucleotide trong gen HA của vi rút cúm 
A(H1N1)pdm09 nhóm 6C ..............................................................................92 
Bảng 3.15 Kết quả HA và HI của các vi rút trong nhóm lựa chọn ................. 93 
Trang 
x 
DANH MỤC HÌNH 
Hình 1.1 Cấu trúc của vi rút cúm ...................................................................... 5 
Hình 1.2 Cấu trúc phức hợp RNP của vi rút cúm. ............................................ 6 
Hình 1.3 Quá trình phiên mã của Polymerase .................................................. 9 
Hình 1.4 Chu trình nhân lên của vi rút cúm. ................................................... 13 
Hình 1.5 Diễn biến dịch tại khu vực các bang thuộc Bắc, Trung và Tây nam 
Mexico từ 1/4/2009 – 31/12/2009 ................................................................... 15 
Hình 1.6 Phân bố dịch cúm A(H1N1)pdm09 tại Mỹ (7/5/2009) ................... 16 
Hình 1.7 Các quốc gia chịu ảnh hƣởng của đại dịch và sự phân bố các trƣờng 
hợp tử vong ..................................................................................................... 18 
Hình 1.8 Biểu đồ dịch tễ học cúm A(H1N1)pdm09 trên toàn cầu .................. 19 
Hình 1.9 Cấu trúc bộ gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. ............................ 22 
Hình 1.10 Nguyên lý giải trình tự gen ............................................................ 29 
Hình 2.1 Quy trình giải trình tự gen ................................................................ 47 
Hình 2.2 Thang trọng lƣợng phân tử chuẩn 1 kb- Invitrogen ......................... 52 
Hình 2.3 Kết quả HI ... MID 10580204. 
104. Valli MB, Selleri M, Meschi S, et al, (2011), "Hemagglutinin 222 variants in 
pandemic (H1N1) 2009 virus", Emerg Infect Dis, 17(4), pp. 749-51. 
105. Vazquez-Perez JA, Isa P, Kobasa D, et al, (2013), "A (H1N1) pdm09 HA 
D222 variants associated with severity and mortality in patients during a 
second wave in Mexico", Virol J, 10, pp. 41. 
106. Watanabe Y, Ibrahim MS, Ellakany HF3, et al, (2011), "Acquisition of 
Human-Type Receptor Binding Specificity by New H5N1 Influenza Virus 
Sublineages during Their Emergence in Birds in Egypt", PLoS Pathog, 7(5), 
pp. 19. 
107. WHO, (2009), "Availability of a candidate reassortant vaccine virus for the 
novel influenza A (H1N1) vaccine development: IDCDC-RG15", Available 
from www.who.int/csr/resources/.../swineflu/2009_05_27IDCDCRG15a.pdf. 
108. WHO, (2009), "CDC protocol of Realtime RT PCR for swine influenzae 
A(H1N1)", CDC, Atlanta, US. 
109. WHO, (2009), "Evolution of a pandemic A(H1N1) 2009", Available from 
=1 
110. WHO, (2009), "Influenza A(H1N1)", WHO, April 29, 2009, Available from 
dex.html. 
111. WHO, (2009), "Influenza A(H1N1) - update 18", WHO, 
112. WHO, (2009), "Swine influenza", WHO, April 27, 2009, Available from 
dex.html. 
 113. WHO, (2009), "Update. Influenza A (H1N1) Regional Report (31 May 2009)" 
n. 
114. WHO, (2009), "World now at the start of 2009 influenza pandemic" WHO, 
Available from 
6_20090611/en/index.htm 
115. WHO, (2010), "Clinical Aspects of Pandemic 2009 Influenza A (H1N1) Virus 
Infection", N Engl J Med, 362(18), pp. 1708-1900. 
116. WHO, (2010), "Influenza", WHO, June 30, 2010, Available from 
117. WHO, (2014), "Influenza vaccine viruses and reagents", WHO, 
118. WHO, (2014), "Recommended composition of influenza virus vaccines for 
use in the 2014-2015 northern hemisphere influenza season", Wkly Epidemiol 
Rec, 89(10), pp. 93-104. 
119. WHO (2010), "H1N1 in post-pandemic period", WHO, Available from 
n/index.html. 
120. WHO (2010), "Pandemic (H1N1)2009 - Update 112", WHO, Available from 
121. WHO (2010), "Pandemic (H1N1)2009 - update 115", WHO, Available from 
122. Wilschut J.C, McElhaney J.E, and Palache A.M, (2006), "Influenza", 2nd 
Edition, Mosby Elsevier, Philadelphia, PA, USA 
123. Wright P.V.F, Neumann G, and Kawaoka Y, (2007), "Orthomyxoviruses. In: 
Fields Virology, 5th Edition, (Eds. Knipe D.M., and Howley P.M.), Lippincott 
Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA, pp. 1691- 1740 
 124. Xie H, J.X, Li X, et al (2011), "Immunogenicity and cross-reactivity of 2009-
2010 inactivated seasonal influenza vaccine in US adults and elderly", PLoS 
One, 6(1), pp. 16650 DOI: 10.1371/journal.pone.0016650. 
125. Yen T. Nguyen , Samuel B. Graitcer, Tuan H. Nguyen, Duong N. Tran, Tho 
D. Pham, Mai T.Q. Le, et al (2013), "National surveillance for influenza 
and influenza-like illness in Vietnam, 2006 −2010", Vaccines, 31(40), pp. 
4368-4374. 
126. Yu-Chieh Liao, Hsin-Hung Lin, and Chieh-Hua Lin, (2013), "Monitoring the 
antigenic evolution of human influenza A viruses to understand how and when 
viruses escape from existing immunity", BioMed Centre, 6, pp. 227. 
127. Zambon, M. and C. W. Potter, (2009), Influenza, in Principles and Practice of 
Clinical Virology, Sixth Edition John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, UK, pp. 
373–408. 
 PHỤ LỤC 1 
1. Phƣơng pháp RT-PCR. 
+ Bệnh phẩm: Bệnh phẩm dịch họng hoặc dịch phế quản đƣợc lấy ở những 
bệnh nhân HCC theo định nghĩa ca bệnh của chƣơng trình giám sát cúm 
quốc gia, đƣợc bảo quản 2-80C trong khi vận chuyển tới phòng thí nghiệm 
theo quy định và cất giữ -800C cho đến khi sử dụng. 
+ Sinh phẩm : 
- Hệ thống mồi (Primer): sử dụng hệ thống mồi theo thiết kế của Viện 
nghiên cứu các bệnh truyền nhiễm quốc gia (NIID), Nhật bản. 
Týp/ 
Phân týp 
Mồi Trình tự ( 5’-3’ ) 
Sản phẩm 
khuyếch đại 
(bp) 
A 
M30F2/08 
(xuôi) 
ATG AGY CTT YTA ACC GAG GTC GAA ACG 
244 
M264R3/08 
(ngƣợc) 
TGG ACA AAN CGT CTA CGC TGC AG 
A/H1N1/09 
đại dịch 
H1 Conv-F1 
( xuôi) 
TGC ATT TGG GTA AAT GTA ACA TTG 
349 
H1 Conv-R1 
( ngƣợc) 
AAT GTA GGA TTT RCT GAK CTT TGG 
- Bộ sinh phẩm tách chiết ARN: QIAamp viral RNA Mini Kit, 250 preps, 
catalog 52904, Qiagen 
- Bộ sinh phẩm dụng cho phản ứng RT - PCR: Qiagen Onestep RT- PCR 
kit, catalog 210212. 
 Đệm Qiagen Onestep RT- PCR, 5 x 
 Dung dịch Q, 5 x 
 Hỗn hợp dNTP (bao gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 10mM cho mỗi 
thành phần). 
  Hỗn hợp enzyme Qiagen One-step RT-PCR (Omniscript TM, Sensiscript 
TM and HotStarTaq DNA polymeraza) 
 Nƣớc cất tinh khiết. 
 RNase inhibitor (40U/µ) – Invitrogen. 
 Chứng dƣơng: ARN virus cúm H1N1/09 đại dịch (do CDC cung cấp) 
 Chứng âm: 
Chứng âm tách chiết (Negative Extraction Control – NEC) 
Chứng âm (No Template Control - NTC) 
 Tiến hành 
 Tách chiết vật liệu di truyền ARN từ mẫu bệnh phẩm: thực hiện theo 
thƣờng quy của Bộ sinh phẩm tách chiết ARN: QIAamp viral RNA Mini 
Kit, 250 preps, catalog 52904, Qiagen. 
 Phản ứng RT-PCR (Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction ) 
ARN tổng số đƣợc tách từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng nghi nhiễm cúm 
A/H1N1 mới (Swine-like Influenza virus). Sau đó, ARN đƣợc cho vào hỗn 
hợp RT-PCR với mồi đặc hiệu cúm A/H1N1 mới đƣợc thiết kế trên gen 
M2 protein (Inf A) và cặp mồi đặc hiệu trên gene HA (Inf H1N1pdm09). 
Sinh phẩm Thể tích (l) Số lƣợng phản ứng (N) 
Đệm Q 5x 4 4xN 
Đệm PCR 5x 4 4xN 
dNTPs (kit) 0.8 0.8xN 
Mồi xuôi (5 M) 3.6 3.6xN 
Mồi ngƣợc (5 M) 3.6 3.6xN 
Enzyme mix (kit) 0.8 0.8xN 
RNase Inhibitor (40U/l) 0.1 0.1xN 
Nƣớc cất tinh sạch 0.1 0.1xN 
ARN mẫu 3 
Tổng số 20 
  Chu kỳ nhiệt. 
Chu kỳ nhiệt 
Nhiệt độ 
Thời gian 
50
0
C 
30:00 
95
0
C 
15:00 
94
0
C 
0:30 
50
0
C 
0:30 
72
0
C 
0:40 
72
0
C 
7:00 
4
0
C 
∞ 
x40chu kỳ 
 Điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose 
 Chuẩn bị gel 2%: 
o Đổ khuôn gel bằng khay điện di có cài sẵn răng lƣợc. 
o Cho 2 g Agarose bột và 100 ml TBE vào cốc đong thuỷ tinh. Hoà tan 
Agarose bằng lò vi sóng trong khoảng 3-4 phút, cho Agarose tan hoàn toàn. 
o Để nguội xuống khoảng 500C rồi cho 10 μl Ethidium bromide lắc đều, đổ 
dung dịch Agarose này vào khay điện di có cài sẵn răng lƣợc. Sau khoảng 
60 phút ở nhiệt độ phòng, khi gel đã đông, gỡ nhẹ nhàng răng lƣợc ra. Bảo 
quản gel ở 40C. 
 Tra mẫu vào gel: 
- Đặt gel vào bể điện di theo đúng chiều dòng điện từ âm sang dƣơng rồi cho 
TBE 1X ngập bản gel sao cho dung dich đệm cách mặt gel từ 1-2 mm. 
- Cho 2 µl đệm đặt mẫu X 6 ( Loading Dye X 6) vào từng giếng của đĩa 
microtitre hoặc trên giấy parafilm với số lƣợng tƣơng ứng với số mẫu cần 
phân tích. Đệm Loading chứa 50% Glycerol vì vậy có tác dụng kéo ADN 
xuống dƣới đáy của giếng điện di và còn chứa Bromophenol Blue có tác 
dụng đánh dấu ADN trong quá trình chạy. 
- Trộn 10 µl mỗi sản phẩm PCR với 2 µl đệm đặt mẫu X 6. 
- Trộn 1 µl thang chuẩn ADN 100 bp hoặc 1000 bp với 9 µl TBE x1. 
- Chuyển dung dịch đã đƣợc trộn với nhau vào trong các giếng của bản gel. 
- Đóng nắp của bể điện di, chọn dòng điện 110V và thời gian 30 phút. 
- Tắt máy chạy gel, chuyển gel sang máy đọc 
 Soi và chụp ảnh gel: 
- Rửa gel dƣới vòi nƣớc chảy trong 30 giây. 
 - Cho bản gel ngay ngắn trên máy đọc gel, bật đèn tím để đọc gel. 
- Chụp ảnh 
 Nhận định kết quả 
 Kết quả đƣợc chấp nhận đƣợc khi: 
o Chứng dƣơng có band tƣơng đƣơng với kích thƣớc theo thiết kế của cặp 
mồi ( 244bp với cún A và 349 bp cho A/H1N1/09 đại dịch). 
o Chứng âm phản ứng (NTC), chứng âm tách chiết (NEC) đều không xuất 
hiện band 
- Kết quả âm tính: sự xuất hiện sản phẩm PCR ở các vị trí không đặc hiệu 
hoặc không có sự hiện diện của sản phẩm PCR. 
- Dƣơng tính: sản phẩm PCR đặc hiệu có độ dài bằng độ dài chứng dƣơng. 
2. Phƣơng pháp real time RT-PCR. 
 Hệ thống mồi và probes: theo thiết kế của CDC- Mỹ. 
Mồi và probe Trình tự 5’-3’ Nồng độ 
Flu A xuôi GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C 40uM 
Flu A ngƣợc AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA 40uM 
Flu A probe TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG 10uM 
SW Inf A xuôi GCA CGG TCA GCA CTT ATY CTR AG 40uM 
SW Inf A ngƣợc GTG RGC TGG GTT TTC ATT TGG TC 40uM 
SW Inf A probe CYA CTG CAA GCC CA”T” ACA CAC AAG CAG GCA 10uM 
SW H1 xuôi GTG CTA TAA ACA CCA GCC TYC CA 40uM 
SW H1 ngược CGG GAT ATT CCT TAA TCC TGT RGC 40uM 
SW H1 probe CA GAA TAT ACA “T”CC RGT CAC AAT TGG ARA A 10uM 
RNP xuôi AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 40uM 
RNP ngƣợc GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT 40uM 
RNP probe TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG 10uM 
 Bộ sinh phẩm SuperScrip III Platium One-Step Quantitative RT-PCR 
System (Invitrogen) catalog 11732-088. 
 Chứng dƣơng: ARN virus cúm H1N1/09 đại dịch (do CDC cung cấp) 
 Chứng âm: 
Chứng âm tách chiết ( Negative Extraction Control – NEC) 
 Chứng âm (No Template Control - NTC) 
 Tiến hành 
- Chuẩn bị hỗn dịch phản ứng 
- Chia hỗn dịch phản ứng vào phiến nhựa 96 giếng theo sơ đồ: 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
B 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
C 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
D RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP 
E 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
Inf 
A 
F 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
Sw 
Inf 
A 
G 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
Sw 
H1 
H RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP 
STT Thành phần Thể tích (ul)/ 1 pƣ Số lƣợng phản ứng (N) 
1 2x PCR master mix 12.5 12.5xN 
3 
SuperScripIII 
RT/Platium Taq Mix 
0.5 0.5xN 
4 Mồi xuôi 0.5 0.5xN 
5 Mồi ngƣợc 0.5 0.5xN 
6 Probe 0.5 0.5xN 
7 Nƣớc tinh sạch 5.5 5.5xN 
 Tổng số 20 20xN 
 - Cho ARN mẫu bệnh phẩm (S1-Sn) theo sơ đồ sau: 
 Cài đặt chƣơng trình vào máy real time PCR 
Tăng nhiệt trƣớc phản ứng 60oC trong 5 phút 
RT Bƣớc 1 50oC trong 30 phút 
Ức chế hoạt hoá Taq Bƣớc 2 95oC trong 02 phút 
PCR 
44 chu kỳ 
Bƣớc 3 95oC trong 15 giây 
Bƣớc 4 55oC trong 30 giây 
Bƣớc 5 Thu nhận tín hiệu huỳnh quang 
Bƣớc 6 72oC trong 30 giây 
 Bƣớc 7 Giữ ở 20oC 
 Nhận định kết quả: 
- Chứng âm sẽ không có tín hiệu huỳnh quang. Nếu có tín hiệu huỳnh quang 
tại các giếng chứng âm chứng tỏ các phản ứng đã bị nhiễm. Khi đó nên làm 
lại từ đầu theo dúng hƣớng dẫn. 
- Dựa vào chứng RP để đánh giá chất lƣợng RNA (chỉ đánh giá đƣợc RNA 
tách chiết từ mẫu bệnh phẩm của ngƣời): tất cả các bệnh phẩm có tín hiệu 
huỳnh quang đƣợc thu nhận trƣớc hoặc tại chu kỳ thứ 37 của phản ứng 
đƣợc coi là đủ lƣợng RNA cho phản ứng. 
- Mẫu đƣợc coi là dƣơng tính khi tín hiệu huỳnh quang đƣợc thu nhận trƣớc 
hoặc tại chu kỳ thứ 40 của phản ứng. 
 LỰA CHỌN CHỦNG VI RÚT DỰ TUYỂN 
Bắc 
Bán Cầu 
Vi rút 
A/H1N1 
Vi rút A/H3N2 Vi rút Cúm B Nam Bán Cầu 
2003-2004 
A/New 
Caledonia/20/9
9-like virus 
A/Moscow/10/9
9-like virus 
B/Hong 
Kong/330/2001 
-like virus 
(dòng Victoria) 
A/Fujian/411/20
02 - like virus 
2004 
2004-2005 
B/Shanghai/361/2002 
-like virus 
(dòng Yamagata) 
A/Wellington/1/
2004-like virus 
2005 
 2005-2006 A/California/7/2
004-like virus 
 B/Malaysia/2506/2004 
-like virus 
(dòng Victoria) 
2006 
2006-2007 
A/Wisconsin/67
/2005-like virus 
2007 
2007-2008 A/Solomon 
Islands/3/2006
-like virus 
A/Brisbane/10/2
007-like virus 
B/Florida/4/2006 
-like virus 
(dòng Yamagata) 
2008 
2008-2009 A/Brisbane/59/
2007 -like 
virus 
2009 
2009-2010 
B/Brisbane/60/2008 
-like virus 
(dòng Victoria) 
A/California/7/
2009 -like 
virus 
A/Perth/16/2009
-like virus 
2010 
2010-2011 
2011 
2011-2012 
2012 
2012-2013 
A/Victoria/361/
2011-like virus 
B/Wisconsin/1/2010 
-like virus 
(dòng Yamagata) 
2013 
2013-2014 
A/Victoria/361/
2011-like virus* 
B/Massachusetts/2/201
2-like virus 
B/Brisbane/60/2008-
like virus 
(quidrivalent) 
 QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮC XIN 
Danh sách chủng cúm A/H1N1/09 pdm tại Việt Nam, 2009-2013 
STT 
Mã chủng Hiệu giá 
HA 
Năm 
1 A/Vietnam/HN-32043/2009 16 
Năm 2009 
2 A/Vietnam/HN-32067/2009 16 
3 A/Vietnam/KH-848/2009 16 
4 A/Vietnam/TN-255/2009 16 
5 A/Vietnam/TN-385/2009 32 
6 A/Vietnam/HN-32060/2009 16 
7 A/Vietnam/HU-730/2009 32 
8 A/Vietnam/DN-1029/2009 32 
9 A/Vietnam/HN-NN07/2009 32 
10 A/Vietnam/HN-31916/2009 16 
11 A/Vietnam/TN-374/2009 16 
12 A/Vietnam/HU-727/2009 16 
13 A/Vietnam/TN-364/2009 32 
14 A/Vietnam/HN-33419/2009 32 
15 A/Vietnam/HN-NN12/2010 32 
Năm 2010 
16 A/Vietnam/HN-NN44/2010 32 
17 A/Vietnam/HN-NN46/2010 64 
18 A/Vietnam/HN-NN100/2010 64 
19 A/Vietnam/HN-NN142/2010 32 
20 A/Vietnam/HN-NN125/2010 64 
21 A/Vietnam/HN-NN18/2010 64 
22 A/Vietnam/HN-NN23/2010 64 
23 A/Vietnam/HN-NN115/2010 64 
24 A/Vietnam/HN-NN116/2010 64 
25 A/Vietnam/HN-NN139/2010 64 
26 A/Vietnam/HN-NN144/2010 32 
27 A/Vietnam/HN-NN45/2010 16 
28 A/Vietnam/HN-NN17/2010 32 
29 A/Vietnam/HN-NN70/2010 32 
30 A/Vietnam/HN-NN133/2010 32 
31 A/Vietnam/HN-NN63/2010 64 
32 A/Vietnam/HN-NN56/2010 32 
33 A/Vietnam/HN-NN49/2010 32 
PHỤ LỤC 2 
Danh sách chủng cúm A/H1N1/09 pdm tại Việt Nam, 2009-2013 
34 A/Vietnam/HN-36484/2011 32 
Năm 2011 
35 A/Vietnam/ICD-44/2011 32 
36 A/Vietnam/IVP26/2011 16 
37 A/Vietnam/SS0611135/2011 32 
38 A/Vietnam/SS0611253/2011 32 
39 A/Vietnam/HN36530/2011 16 
40 A/Vietnam/2095/2011 16 
41 A/Vietnam/IS0612067/2012 32 
Năm 2012 
42 A/Vietnam/IS0212158/2012 32 
43 A/Vietnam/IS0212364/2012 16 
44 A/Vietnam/SS5512003/2012 32 
45 A/Vietnam/IS0213085/2013 64 
Năm 2013 
46 A/Vietnam/NH13049/2013 64 
47 A/Vietnam/DK13120/2013 64 
48 A/Vietnam/NH13284/2013 128 
49 A/Vietnam/36947/2013 128 
50 A/Vietnam/37043/2013 32 
51 A/Vietnam/NH13111/2013 128 
52 A/Vietnam/HN36944/2013 128 
53 A/Vietnam/HN36979/2013 64 
54 A/Vietnam/IS0913135/2013 128 
55 A/Vietnam/HN36942/2013 128 
56 A/Vietnam/HN36947/2013 128 
57 A/Vietnam/HN36945/2013 64 
58 A/Vietnam/HN36946/2013 128 
59 A/Vietnam/2013369/2013 32 
60 A/Vietnam/HN20216/2013 32 
61 A/Vietnam/36978/2013 128 
62 A/Vietnam/37047/2013 128 
63 A/Vietnam/NH13246/2013 32 
64 A/Vietnam/36955/2013 64 
65 A/Vietnam/IS0213167/2013 64 
66 A/Vietnam/36992/2013 32 
67 A/Vietnam/IS0713070/2013 34 
Danh sách chủng cúm A/H1N1/09 pdm tại Việt Nam, 2009-2013 
68 A/Vietnam/HN36983/2013 32 
Năm 2013 
69 A/Vietnam/HN36955/2013 32 
70 A/Vietnam/HN36954/2013 64 
71 A/Vietnam/37223/2013 128 
72 A/Vietnam/KX13037/3013 64 
73 A/Vietnam/IS0213089/2013 64 
74 A/Vietnam/0713035/2013 32 
75 A/Vietnam/TB05501/2013 32 
Xác nhận của cơ quan lấy mẫu nghiên cứu