Luận án Nghiên cứu b ào chế và đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá đu đủ rừng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG 
HỌC VIỆN QUÂN Y 
LÊ THỊ THANH THẢO 
NGHIÊN CỨU B ÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ 
TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA 
CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 
(Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis., 
họ Nhân sâm Araliaceae) 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC 
HÀ NỘI – 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG 
HỌC VIỆN QUÂN Y 
LÊ THỊ THANH THẢO 
NGHIÊN CỨU B ÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ 
TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA 
CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 
(Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis., 
họ Nhân sâm Araliaceae) 
Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc 
Mã số: 9720202 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC 
 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 
1. GS.TS. Võ Xuân Minh 
2. PGS.TS. Đỗ Quyên 
HÀ NỘI – 2020 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi với sự 
hướng dẫn khoa học của tập thể cán bộ hướng dẫn. 
Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và được công bố một 
phần trong các bài báo khoa học. Luận án chưa từng được công bố trong bất 
kỳ công trình nào khác. Nếu có điều gì sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. 
Tác giả 
Lê Thị Thanh Thảo 
LỜI CẢM ƠN 
Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận 
được sự giúp đỡ tận tình của các Thầy cô, các anh chị, các bạn đồng nghiệp 
và những người thân trong gia đình. 
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng đặc biệt và biết ơn sâu sắc tới: 
GS.TS. Võ Xuân Minh và PGS.TS. Đỗ Quyên, những người Thầy đã tận tâm 
hướng dẫn khoa học, đã luôn động viên, khích lệ, tạo mọi điều kiện thuận lợi 
nhất cho tôi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, lời cảm ơn chân thành tới các Thầy 
Cô trong: Ban Giám đốc, Viện Đào tạo Dược, Trung tâm Nghiên cứu Ứng 
dụng Sản xuất thuốc, Bộ môn Dược lý - Học viện Quân Y, phòng Sau đại học 
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. 
Tôi cũng xin cảm ơn Ban Giám hiệu cùng các Thầy, Cô Bộ môn Thực 
vật, Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội, Ban Giám hiệu cùng các 
Thầy, Cô Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Hóa Sinh biển, 
Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm 
Khoa học & Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, 
thực phẩm Hà Nội đã tạo điều k iện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án. 
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Trường Cao đẳng Y tế Hà 
Đông, Ủy ban nhân dân Thành phố Hà Nội, các anh/chị đồng nghiệp, người 
thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ và tạo điều kiện để 
tôi hoàn thành luận án. 
Ngày tháng năm 2020 
 Lê Thị Thanh Thảo
MỤC LỤC 
Trang phụ bìa 
Lời cam đoan 
Lời cảm ơn 
Mục lục 
Danh mục các chữ, ký hiệu viết tắt trong luận án 
Danh mục các hình 
Danh mục các bảng 
ĐẶT VẤN ĐỀ 1 
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐU ĐỦ RỪNG 3 
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố 3 
1.1.2. Thành phần hóa học 4 
1.1.3. Tác dụng sinh học và dược lý 6 
1.1.4. Công dụng 7 
1. 2. CAO THUỐC 8 
1.2.1. Định nghĩa, phân loạ i 8 
1.2.2. Kỹ thuật điều chế cao thuốc 10 
1.3. TỔNG QUAN VỀ TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH 23 
1.3.1. Khái niệm về tăng cường miễn dịch và chất tăng cường miễn 
dịch 23 
1.3.2. Mô hình nghiên cứu đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch 
của một số chế phẩm thảo mộc 24 
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠN G PHÁP NGHIÊN CỨU 30 
2.1. ĐỐI TƯỢN G NGHIÊN CỨ U 30 
2.1.1. Nguyên liệu 30 
2.1.2. Động vật thí nghiệm 30 
2.1.3. Thuốc thử, hóa chất và dung môi 31 
2.1.4. Máy móc, trang thiết b ị nghiên cứu 32 
2.1.5. Địa điểm nghiên cứu 33 
2.2. PHƯƠN G PHÁP NGHIÊN CỨU 33 
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu xây dựng qui trình bào chế cao khô 
lá Đu đủ rừng qui mô phòng thí nghiệm 33 
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đánh 
giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng 46 
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch và 
độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng trên động vật thực nghiệm 48 
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH BÀO CHẾ 
CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 53 
3.1.1. Kết quả xác định một số hợp chất chính sử dụng làm chất 
đánh dấu 53 
3.1.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Đu đủ rừng 
làm nguyên liệu chiết xuất 56 
3.1.3. Kết quả xây dựng qui tr ình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng 72 
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT 
LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU 
ĐỦ RỪNG 88 
3.2.1. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của cao khô lá Đu đủ 
rừng 88 
3.2.2. Kết quả đánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng 95 
3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN 
DỊCH VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG TRÊN 
ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM 100 
3.3.1. Kết quả đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô 
lá Đu đủ rừng 100 
3.3.2. Đánh giá độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng 108 
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 119 
4.1. VỀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH BÀO CHẾ CAO KHÔ LÁ ĐU 
ĐỦ RỪNG 119 
4.1.1. Về xác định nhóm hợp chất chính sử dụng làm chất đánh dấu 
trong xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng 119 
4.1.2. Về lựa chọn 2 phương pháp định lượng 120 
4.1.3. Về tiêu chuẩn cơ sở lá Đu đủ rừng 121 
4.1.4. Về qui trình bào chế cao lá Đu đủ rừng 122 
4.1.5. Về thiết b ị chiết xuất, cô đặc và kết quả bào chế cao 3:1 128 
4.1.6. Bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng phương pháp phun sấy 129 
4.2. VỀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VÀ ĐỘ ỔN 
ĐỊNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 135 
4.2.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở 135 
4.2.2. Về đánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng 136 
4.3. VỀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH VÀ ĐỘC TÍNH 
CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 136 
4.3.1. Tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá Đu đủ rừng 136 
4.3.2. Độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng 143 
KẾT LUẬN 145 
KIẾN NGHỊ 147 
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN 
CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
PHỤ LỤC 
DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT 
STT Viết tắt Phần viết đầy đủ 
1. A Độ hấp thụ quang 
2. Aer Aerosil 
3. AO Acid oleanolic 
4. BC Bạch cầu 
5. C Nồng độ 
6. 
13
C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy 
(Phổ cộng hưởng từ carbon 13) 
7. CI Carr's compressibility index (Chỉ số nén Carr) 
8. CR/DP là tỷ lệ % (khối lượng/khối lượng) của chất rắn trên tổng 
khối lượng dịch phun sấy 
9. cs. Cộng sự 
10. Cyc Cyclophosphamid 
11. DĐVN Dược điển Việt Nam 
12. DM/DL Dung môi/dược liệu (ml/g) 
13. ĐĐR Đu đủ rừng 
14. EtOH Ethanol 
15. HMBC Heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy 
(Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết) 
16. HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng 
hiệu năng cao) 
17. HS chiết Hiệu suất chiết 
18. HSPL Hệ số pha loãng 
19. HSPS Hiệu suất phun sấy 
20. HR-ESI-MS High resolution - electrospray ionization - mass 
spectroscopy (Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù 
điện tử) 
21. IL Interleukin 
22. INF Interferon 
23. KLCT Khối lượng cơ thể 
24. KTTP Kích thước tiểu phân 
25. KLRbk Khối lượng riêng biểu kiến 
26. LD50 Lethal Dose 50 (Liều gây chết 50% số con vật thử) 
27. LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) 
28. LOQ Limit of Quantification (Giới hạn định lượng) 
29. M Khối lượng 
30. Mal Maltodextrin 
31. MeOH Methanol 
32. m/z Mass to charge ratio (tỉ lệ khối lượng/điện tích) 
33. OA Ovalbumin + Al(OH)3 
34. RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) 
35. SPN Saponin toàn phần 
36. SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) 
37. SE Standard error (Sai số chuẩn) 
38. STT Số thứ tự 
39. TCCS Tiêu chuẩn cơ sở 
40. TCMD Tăng cường miễn dịch 
41. TD/CR Tá dược/Chất rắn 
42. TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) 
43. KLLTĐ Khối lượng lách tương đối 
44. KLTƯTĐ Khối lượng tuyến ức tương đối 
45. TB Trung bình 
46. TNF Tumor necrosis factor (Yếu tố hoại tử khối u) 
47. UV – VIS Ultraviolet-vis ible (Tử ngoại - khả kiến) 
DANH MỤC CÁC HÌNH 
Hình Tên hình Trang 
1.1. Cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis .,) 4 
1.2. Cấu trúc saponin phân lập từ Đu đủ rừng 5 
1.3. Sơ đồ thiết bị bể ch iết siêu âm và que siêu âm 15 
1.4. Cấu tạo hệ thống phun sấy 22 
2.1. Sơ đồ nghiên cứu trên mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng 
Cyclophosphamid 49 
3.1. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ lá Đu đủ rừng 53 
3.2. Phổ UV-Vis của mẫu t rắng và mẫu chuẩn 56 
3.3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang theo thời gian phản ứng 
tạo màu 57 
3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào lượng acid 
oleanolic chuẩn 58 
3.5. Sắc ký đồ của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng 61 
3.6. Đồ th ị mô tả sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ acid oleanolic 62 
3.7. Hình ảnh vi phẫu lá Đu đủ rừng 65 
3.8. Hình ảnh soi bột lá Đu đủ rừng 66 
3.9. Hình ảnh sắc ký đồ TLC dược liệu lá Đu đủ rừng 68 
3.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/dược liệu và số lần chiết đến chiết xuất 
saponin toàn phần 75 
3.11. Ảnh hưởng của thời g ian đến chiết xuất saponin toàn phần 77 
3.12. Sơ đồ tóm tắt các gia i đoạn điều chế cao lá Đu đủ rừng 3:1 87 
3.13. Sơ đồ tóm tắt g iai đoạn bào chế cao khô lá Đu đủ rừng 88 
3.14. Kết quả chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) của bột cao khô lá 
Đu đủ rừng 89 
3.15. Hình ảnh TLC của cao khô lá Đu đủ rừng 92 
Hình Tên hình Trang 
3.16. Hình ảnh TLC trong theo dõi độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng 99 
3.17. Hình ảnh vi thể lách chuột ở các lô (HE × 100) 104 
3.18. Hình ảnh vi thể tuyến ức chuột ở các lô (HE × 100) 104 
3.19. Tương quan giữa liều dùng theo tỷ lệ chuột chết 109 
3.20. Ảnh đại thể gan, lách và thận chuột ở các lô khác nhau (HE x 25) 116 
3.21. Hình ảnh mô bệnh học gan chuột sau 90 ngày uống thuốc (HE x 400) 117 
3.22. Hình ảnh mô bệnh học lách chuột sau 90 ngày uống thuốc (HE x 400) 117 
3.23. Hình ảnh mô bệnh học thận chuột sau 90 ng ày uống thuốc (HE x 400) 118 
DANH MỤC CÁC BẢNG 
Bảng Tên bảng Trang 
3.1. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang theo thời gian phản ứng tạo màu 57 
3.2. Kết quả xác định độ lặp lại và độ đúng của phương pháp UV- Vis 59 
3.3. Kết quả xác định t ính tương thích hệ thống HPLC 60 
3.4. Diện t ích pic và thời gian lưu của các dung d ịch chuẩn ở các nồng độ 61 
3.5. Kết quả đánh giá độ lặp lại và độ đúng t rong ngày và khác ngày 62 
3.6. Độ nhiễu nền của sắc ký đồ mẫu chuẩn acid oleanolic 63 
3.7. Kết quả xác định tỷ lệ mất khối lượng do làm khô của bột lá Đu đủ rừng 67 
3.8. Kết quả xác định hàm lượng tro toàn phần của bột lá Đu đủ rừng 67 
3.9. Hàm lượng saponin toàn phần t rong lá Đu đủ rừng 69 
3.10. Hàm lượng acid oleanol ic trong lá Đu đủ rừng 70 
3.11. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lư ợng t rong tiêu chuẩn cơ sở lá Đu đủ rừng 71 
3.12. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến chiết xuất saponin toàn phần 72 
3.13. Ảnh hưởng của kích th ước tiểu phân dược liệu đến chiết xuất saponin 
toàn phần 73 
3.14. Ảnh hưởng của dung môi đến chiết xuất saponin toàn phần 74 
3.15. Ả nh hưởng của tỷ lệ dung môi/dược liệu và số lần chiết đến chiết xuất 
saponin toàn phần 74 
3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến ch iết xuất saponin toàn phần 76 
3.17. Ảnh hưởng của thời g ian đến chiết xuất saponin toàn phần 76 
3.18. Thông số qui trình chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ rừng bằng phương 
pháp chiết s iêu âm 77 
3.19. Kết quả chiết xuất lá Đu đủ rừng qui mô 2 kg/ mẻ bằng phương pháp 
chiết siêu âm 78 
3.20. Kết quả chiết xuất, cô đặc và loại tạp cao lá Đu đủ rừng 3:1 78 
3.21. Công th ức và điều kiện phun sấy khảo sát ảnh hưởng của tá dược 79 
Bảng Tên bảng Trang 
3.22. Ảnh hưởng của loại tá dược đến hiệu suất phun s ấy 80 
3.23. Công thức và điều kiện phun sấy khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá 
dược/chất rắn 81 
3.24. Ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược/chất rắn đến phun sấy cao Đu đủ rừng 82 
3.25. Công thức và điều kiện khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và 
tốc độ cấp dịch 83 
3.26. Ả nh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch đến phun sấy cao 
Đu đủ rừng 84 
3.27. Công thức và điều kiện khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/dịch 
phun 85 
3.28. Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/d ịch phun đến phun sấy cao Đu đủ rừng 85 
3.29. Công thức và thông số qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng 
phun sấy 86 
3.30. Kết quả xác định mất khối lượng do làm khô của cao khô lá Đu đủ 
rừng 90 
3.31. Kết quả xác định hàm lượng t ro toàn phần của cao khô lá Đu đủ rừng 90 
3.32: Kết quả thử độ nhiễm khuẩn của cao khô lá đu đủ rừng 91 
3.33. Hàm lượng saponin toàn phần trong cao khô lá Đu đủ rừng 93 
3.34. Hàm lượng acid oleanol ic trong cao khô lá Đu đủ rừng 94 
3.35. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lượng trong tiêu chuẩn cơ sở cao lá Đu đủ 
rừng 95 
3.36. Sự thay đổi độ ẩm, độ nhiễm khuẩn, hàm lượng saponin toàn phần và 
hàm lượng acid o leanolic của 3 lô theo thời gian bảo quản 96 
3.37. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên khối lượng lách tương đối 101 
3.38. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên khối lượng tuyến ức tương 
đối 101 
Bảng Tên bảng Trang 
3.39. Ảnh hưởng của thuốc th ử lên số lượng bạch cầu 102 
3.40. Ảnh hưởng của thuốc lên một số loại bạch cầu ở máu ngoại vi 103 
3.41 . Kết quả nhận xét giải phẫu bệnh của lách và tuyến ức 105 
3.42 . Ảnh hưởng của thuốc thử lên nồng độ IgG máu ngoạ i vi 106 
3.43. Ảnh hưởng của thuốc th ử đến phản ứng bì với kháng nguyên OA 106 
3.44. Ảnh hưởng của thuốc th ử đến nồng độ IL–2 107 
3.45. Ảnh hưởng của thuốc th ử đến nồng độ TNF-α 108 
3.46. Mối tương quan liều lượng và tỷ lệ phần trăm chuột chết sau uống cao 
khô lá Đu đủ rừng 109 
3.47. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng đối với khối lượng cơ thể 
chuột 110 
3.48. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng đến số lượng hồng cầu và 
lượng huyết sắc tố trong máu chuột 111 
3.49. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên hematocrit và thể tích trung 
bình hồng cầu trong máu chuột 112 
3.50. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên số lượng bạch cầu và tiểu 
cầu trong máu chuột 113 
3.51. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng đối với hoạt độ AST và ALT 114 
3.52. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên các chỉ số albumin và 
cholesterol toàn phần trong máu 115 
3.53. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên nồng độ creatinin máu 
chuột 115 
1 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Các bệnh suy giảm miễn dịch là một nhóm các tình trạng khác nhau 
gây nên do một hay nhiều khiếm khuyết của hệ miễn dịch và biểu hiện trên 
lâm sàng bởi gia tăng tình trạng dễ mắc nhiều bệnh nhiễm trùng. Ngày nay, 
các bệnh suy giảm miễn dịch có xu hướng ngày càng gia tăng với hậu quả cấp 
tính, tái diễn hay mạn tính thường là nặng nề [1]. 
Hiện nay, cơ quan quản lý Thực phẩm và Thuốc Hoa Kỳ (US FDA) đã 
cấp phép cho nhiều thuốc có tác dụng điều trị cho bệnh nhân suy giảm miễn 
dịch được dùng trên lâm sàng. Các thuốc tăng cường miễn dịch (TCMD) có 
nguồn gốc phong phú, các chất có nguồn gốc từ các chế phẩm sinh học 
(Immunoglobulin, Interferon,) là sản phẩm công nghệ cao, giá thành còn 
khá cao. Các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược thường có nhiều tác 
dụng không mong muốn [2]. ... sắc ký đồ. Tính toán hàm 
lượng acid oleanolic của mẫu thử theo đường chuẩn xây dựng được. 
Tính kết quả: 
Hàm lượng acid oleanolic (mg) trong 1g cao khô lá Đu đủ rừng tính theo công 
thức sau: 
AO (mg/g) = 
C × n × V × 100 
M × (100-h) × 1000 
 C- nồng độ acid oleanolic trong dịch chiết tính từ đường chuẩn xây dựng được 
(µg/ml); V- Thể tích dịch chiết (ml), M- Khối lượng cao khô lá Đu đủ rừng (g); n- 
Hệ số pha loãng; h- Độ ẩm cao khô (%). 
3. ĐÓNG GÓI, GHI NHÃN VÀ BẢO QUẢN 
- Đóng gói: Sản phẩm được đóng trong lọ nút mài nhám, nắp kín. 
- Ghi nhãn: Nhãn trình bày rõ ràng, đúng quy chế. 
- Bảo quản: Nơi khô ráo, thoáng mát, tránh ánh sáng trực tiếp. 
 1 
PHỤ LỤC 4. QUI TRÌNH BÀO CHẾ CAO KHÔ 
LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 
I. ĐẶC ĐIỂM THÀNH PHẨM 
1.1. Tên thành phẩm: Cao khô lá Đu đủ rừng 
1.2. Chất lượng thành phẩm: 
1.2.1. Tính chất: Khối bột khô tơi, màu vàng nâu nhạt, đồng nhất, vị đắng, mùi 
đặc trưng. 
1.2.2. M ất khối lượng do làm khô: Không quá 5%. 
1.2.3. Tro toàn phần: Không quá 15,0%. 
1.2.4. Giới hạn kim loại nặng: As ≤ 1,0 mg/kg; Cd ≤ 1,0 mg/kg; Hg ≤ 0,1 
mg/kg; Pb ≤ 3,0 mg/kg. 
1.2.5. Giới hạn nhiễm khuẩn: Đạt mức 4, DĐVN V - Phụ lục 13.6 - “Thử giới 
hạn nhiễm khuẩn” phương pháp đĩa thạch. 
1.2.6. Định tính: bằng sắc ký lớp mỏng, trên sắc ký đồ của mẫu thử phải xuất 
hiện vết màu có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với vết của acid oleanolic. 
1.2.7. Định lượng: 
Hàm lượng saponin toàn phần không thấp hơn 100 mg/g và không cao 
hơn 200 mg/g tính theo acid oleanolic trong chế phẩm khô kiệt. 
Hàm lượng acid oleanolic không thấp hơn 7,5 mg/g và không cao hơn 
12,5 mg/g trong chế phẩm khô kiệt. 
II. ĐẶC ĐIỂM NGUYÊN PHỤ LIỆU 
Bảng PL 1. Đặc điểm nguyên phụ liệu 
Mục Tên nguyên liệu Tiêu chuẩn 
1 
Lá đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex 
Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliaceae) 
TCCS 
2 Ethanol 96° DĐVN V 
3 Nước tinh khiết DĐVN V 
5 Aerosil BP2014 
HỌC VIỆN QUÂN Y 
TTNC ỨNG DỤNG SX THUỐC TN 
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM 
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc 
------*** ------ 
 2 
III. THIẾT BỊ 
- Cân điện tử Mettler Toledo 3000 (Thụy sỹ). 
- Tủ sấy tĩnh (Trung Quốc). 
- Máy nghiền, rây dược liệu (Việt Nam). 
- Hệ thống cô thu hồi dung môi 40 lít (Việt Nam). 
- Cân xác định hàm ẩm A dam (Anh). 
 - Thiết bị chiết siêu âm SONY MEDI SM30-CEP (Hàn Quốc): dung tích 
30 lít, công suất tạo sóng siêu âm 400W, gồm 8 đầu phát ở đáy bình, tần số siêu 
âm 60kHz. Kích thước máy: 1020 × 1500 × 750 cm. 
 - Thiết bị phun sấy LPG-5 (Trung Quốc) qui mô pilot: Kiểu phun ly tâm 
tốc độ cao, đĩa phun gồm 24 lỗ hình tròn, đường kính mỗi lỗ là 3mm. Phun dịch 
cùng chiều với dòng khí nóng, lưu lượng khí 240m
3
/giờ, tốc độ bốc hơi 5 kg/giờ. 
Công suất tiêu thụ điện 12kW. Kích thước máy: 2300 × 1280 × 2180 cm. Đường 
kính buồng sấy: 1000 cm. 
IV. THÔNG SỐ QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHUN SẤY 
Bảng PL 2. Thông số qui trình chiết xuất, cô cao lá đu đủ rừng qui mô 2 kg 
dược liệu/mẻ, lô 4 kg (2 mẻ). 
STT Tên phương pháp/ thông số Thiết bị/ thông số 
I Giai đoạn chiết xuất 
1.1 Chiết siêu âm Thiết bị SM30-CEP 
1.2 Bột lá khô ĐĐR Kích thước 0,5 - 1mm (qua rây 710) 
1.3 Dung môi chiết Ethanol 50o 
1.4 Nhiệt độ chiết 70 ± 2ºC
1.5 Tỷ lệ DM/ DL  số lần chiết 15 ml /1 g/lần x 2 lần 
1.6 Thời gian chiết 90 phút/ lần x 2 lần 
II Cô cao 
2.1 Cô thu hồi dung môi 70 - 80 ºC 
2.2 Cô đặc cách thủy 60 - 65 mmHg 
 3 
Bảng PL 3. Thông số qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng phương 
pháp phun sấy lô 1,2 kg 
STT Tên thông số Thông số 
1 Dịch phun sấy Cao lá đu đủ rừng (3:1) 
2 Tá dược phun sấy Aerosil 
3 Tỷ lệ tá dược/ chất rắn 30% 
4 Nhiệt độ đầu vào 130 ± 2ºC 
5 Tốc độ cấp dịch 30 ml / phút 
6 Tỷ lệ chất rắn trong dịch phun 14% 
7 Áp suất khí nén đầu phun 2 Bar 
 4 
V. SƠ ĐỒ CÁC GIAI ĐOẠN BÀO CHẾ 
Hình PL1. Sơ đồ các giai đoạn điều chế cao lá đu đủ rừng 3:1 
Dịch chiết ĐĐR 1+2 
Chiết siêu âm lần 1 
Dịch chiết ĐĐR 1 
Dịch chiết ĐĐR Bã ĐĐR 2 
Bã ĐĐR 1 
Chiết siêu âm lần 2 
DM/DL = 15ml/1g 
70
0
C, 90 phút 
Cô thu hồi dung 
DM/DL = 15ml/1g 
700C, 90 phút 
EtOH thu hồi 
Cao ĐĐR 3:1 
Phần dịch lỏng 1 Phần cắn 1 EtOH 96º 
Phần dịch lỏng 2 Phần cắn 2 
Để lắng, gạn 
Để lắng, gạn 
Cao ĐĐR 3:1 
Cô thu hồi dung 
EtOH 50º 
Gạn, lọc 
Gạn, lọc 
Kiểm nghiệm: 
- Hàm lượng SPN: 165 - 
245 mg/g 
- Tỷ lệ chất rắn: 20 - 30% 
Bột lá ĐĐR 
Đạt TCCS 
 5 
Hình PL 2. Sơ đồ tóm tắt giai đoạn bào chế cao khô lá đu đủ rừng 
 bằng phương pháp phun sấy 
VI. NỘI DUNG QUI TRÌNH 
6.1. Quy trình bào chế cao chiết lá Đu đủ rừng 3:1 
6.1.1. C huẩn bị nguyên liệu và thiết bị 
- Chuẩn bị nguyên liệu: Lá đu đủ rừng được sấy ở 40ºC đến khi có độ ẩm 
nhỏ hơn 12%. Nghiền nguyên liệu trên máy nghiền búa, rây qua rây 710. Sấy 
tiếp bột nguyên liệu ở 40ºC trong 1 giờ. Bột dược liệu sau khi sấy được đóng 
trong túi PE kín, 2 lớp. Bảo quản nguyên liệu ở điều kiện khô, mát (30
o
C ± 2
o
C; 
độ ẩm ≤ 75%) đến khi sử dụng. 
- Kiểm tra hệ thống chiết xuất: Hoạt động của hệ thống chiết xuất phải 
được kiểm tra và đánh giá tình trạng hoạt động trước khi tiến hành. Hệ thống 
chiết xuất, cô cao phải sạch và đảm bảo không còn dư phẩm của lần chiết trước. 
Các van dẫn, van xả và van an toàn phải hoạt động bình thường. 
Dịch phun sấy 
Cao khô lá ĐĐR 
Đóng gói 
Cao ĐĐR 3:1 
Phun sấy 
Nhiệt độ đầu vào 130 ± 2
0
C 
Áp suất khí nén đầu phun 2 
- Thêm Aer, nước: tỷ lệ Aer 30% so 
với chất rắn, tỷ lệ CR/ DP: 14%; 
- Khuấy đều đồng nhất 
Cấp dịch phun (30ml/phút) 
Kiểm nghiệm theo 
TCCS 
 6 
- Pha ethanol 500: Cân 25,5 kg ethanol 960 có độ cồn thực 940 (tương ứng 
với 31,9 lít), thêm nước vừa đủ 55,2 kg; trộn đều, thu được 60 lít ethanol 50
0
6.1.2. Điều chế dịch chiết 
Chiết xuất lá ĐĐR bằng phương pháp chiết siêu âm trên thiết bị SM30 với 
các thông số qui trình ghi trong bảng PL 2; các bước như sau: 
- Cân, đong nguyên liệu và dung môi theo công thức theo mẻ chiết: 2,0 kg 
bột khô lá ĐĐR, 60 lít ethanol 50º chia làm 2 lần, mỗi lần 30 lít. 
- Làm ẩm nguyên liệu với khoảng 3 lít dung môi, sau đó cho vào túi vải 
buộc kín, ủ ẩm trong 15 phút. Cho dung môi còn lại vào bình chiết, đậy nắp kín. 
- Bật công tắc nguồn của thiết bị chiết siêu âm. Trên màn hình hiển thị lựa 
chọn chế độ chiết nóng có tác động của sóng siêu âm, cài đặt các thông số qui 
trình gồm nhiệt độ (70ºC), thời gian chiết (90 phút/ lần), mức công xuất chiết 
100%. Khi nhiệt độ đạt mức cài đặt thì cho nguyên liệu trong túi vải vào dung 
môi trong bình chiết, điều chỉnh để túi và dược liệu phân bố đều trong thiết diện 
của bình chiết. Bật nút “Run” trên màn hình để bắt đầu quá trình chiết xuất. 
- Khi hết thời gian chiết xuất đã cài đặt, máy sẽ tự động tắt chế độ siêu âm và 
gia nhiệt. Sau đó bật bơm để bơm dịch chiết từ bình chiết ra bình chứa. Mở nắp 
bình chiết, lấy túi vải ra, ép kiệt bã để thu lấy phần dịch ép. Gộp phần dịch chiết 
và dịch ép thu được dịch chiết thứ nhất. 
- Chiết xuất lần thứ hai: Phần bã sau khi chiết lần thứ nhất tiếp tục cho vào 
bình chiết, cân dung môi theo công thức rồi cho vào bình chiết. Cài đặt lại các 
thông số chiết siêu âm rồi tiến hành chiết xuất tương tự lần chiết thứ nhất. Khi 
hết thời gian chiết xuất đã cài đặt, bơm dịch chiết ra bình chứa, ép kiệt bã thu 
dịch chiết lần hai. 
- Kết thúc chiết xuất: Rửa bình chiết với nước bằng cách bấm nút “Water 
Supply”, khi đó nước sẽ được bơm cấp vào bình chiết từ đường ống dẫn nước 
tinh khiết nối với máy, khi lượng nước bơm vào bình được khoảng 15 lít thì bấm 
nút “Stop” để dừng cấp nước. Dùng khăn hoặc vải mềm vệ sinh sạch bình chiết. 
Sau đó bấm nút “Auto cleaning” để bơm nước rửa từ bình ra ngoài thùng chứa. 
 7 
Làm vệ sinh lặp lại hai lần như trên. Cuối cùng, bơm hết nước trong bình chiết. 
Đạy nắp bình chiết. Tắt máy bằng cách bấm công tắc nguồn về chế độ “Off”. Bã 
dược liệu được chuyển ra ngoài khu vực chiết. 
- Lọc dịch chiết: Gộp dịch chiết từ hai lần chiết xuất. Lọc dịch chiết qua vải 
thô thu lấy phần dịch trong. 
6.1.3. C ô cao và loại tạp 
- Trộn đều dịch chiết ở các mẻ chiết. Chia dịch chiết thành 4 mẻ cô cao, mỗi 
mẻ khoảng 30 lít. Cô thu hồi dung môi ở nhiệt độ 70 - 80
0
C đến khi còn 1/3 so 
với lượng dịch chiết ban đầu thì dừng. Gộp các dịch cô rồi tiếp tục cô đến tỷ lệ 
cao khoảng 3:1 (ba phần dược liệu được một phần cao). 
- Loại tạp: Cao 3:1 được để lắng trong 24 giờ rồi tách riêng phần dịch chiết 1 
và phần cắn 1. Phần cắn 1 được thêm ethanol 96º với tỷ lệ gấp bốn lần, đun 
nóng cách thủy và khuấy đều. Để nguội, sau 24 giờ gạn lọc lấy phần dịch trong, 
bỏ phần tủa không tan. Cô đặc dịch lọc đến tỷ lệ cao 3:1 (phần 2). Gộp hai phần 
cao ở trên, trộn đều, cô đặc và điều chỉnh về tỷ lệ cao 3:1. 
- Kết thúc cô cao, loại tạp: Vệ sinh nồi cô sạch sẽ. Ethanol thu hồi ở bộ phận 
ngưng tụ được xác định độ cồn rồi đựng trong can riêng. Ethanol thu hồi được 
dùng để pha chế dung môi cho các mẻ chiết tiếp theo. 
6.1.4. Hoàn thiện và bảo quản cao 3:1 
- Cao đu đủ rừng 3:1 từ 2 mẻ chiết xuất, mỗi mẻ 2 kg dược liệu được gộp lại 
thành 1 lô (tương ứng với 4 kg dược liệu) 
- Bảo quản mẫu: Cao 3:1 được đựng trong bình thủy tinh, nắp kín, để trong 
tủ bảo quản mẫu ở nhiệt độ khoảng 4°C. 
6.1.5. K iểm nghiệm bán thành phẩm 
Cao 3:1 cần được kiểm tra hai chỉ tiêu là tỷ lệ chất rắn và hàm lượng 
saponin toàn phần. Yêu cầu: Tỷ lệ chất rắn trong khoảng 20 – 30% và hàm 
lượng saponin toàn phần tính không được nhỏ hơn 165 mg/g và không quá 245 
mg/g theo khô tuyệt đối. 
a. Xác định tỷ lệ chất rắn trong cao 3:1 
 8 
Bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi trên thiết bị ADAM 
AMB310, 2g mẫu, 105
0
C trong 3h hoặc đến khi khối lượng không đổi. Tỷ lệ 
chất rắn bằng hiệu số 100% trừ đi hàm ẩm đọc được trên máy. 
b. Xác định hàm lượng saponin toàn phần bằng phương pháp UV-Vis 
+ Chuẩn bị mẫu chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc acid oleanolic có nồng độ 
khoảng 1000 µg/ml trong MeOH. Từ dun g dịch chuẩn gốc, pha dãy các dung dịch 
chuẩn làm việc có nồng độ thay đổi từ 100 đến 300 µg/ml. 
+ Chuẩn bị mẫu thử: Cân khoảng 500 mg cao lỏng 3:1, cho vào bình định 
mức 50 ml, thêm 40ml MeOH, siêu âm ở nhiệt độ phòng 30 phút, để nguội, bổ 
sung MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 5ml cho vào bình định 
mức 20 ml, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc dung dịch qua màng lọc 
0,45µm (Dịch A). Mẫu trắng: MeOH. 
Làm phản ứng màu Rosenthaler: Hút chính xác 0,2ml dịch A hoặc dung 
dịch chuẩn hoặc mẫu trắng, cho vào ống nghiệm, thêm 0,2 ml dung dịch vanilin 
5%/ acid acetic băng và 1,2 ml acid percloric. Đậy kín ống nghiệm rồi ủ cách 
thủy ở 70oC±1oC trong 40 phút. Ngâm ống nghiệm trong nước đá rồi chuyển 
vào bình định mức 5ml, tráng ống nghiệm bằng ethyl acetat và bổ sung ethyl 
acetat vừa đủ 5ml, lắc đều. 
Đo quang ở bước sóng 550nm. Từ nồng độ và độ hấp thụ quang của chuẩn 
acid oleanolic, độ hấp thụ quang của mẫu thử để tính ra hàm lượng của saponin 
toàn phần trong cao 3:1 theo công thức sau: 
Saponin (mg/g) = 
C × n × V × 100 
M × (100-h) × 1000 
 C- nồng độ saponin toàn phần trong cao ĐĐR tính theo acid oleanolic 
từ đường chuẩn xây dựng được (µg/ml); V- Thể tích cao ĐĐR (ml), M- Khối 
lượng cao ĐĐR (g); n- Hệ số pha loãng; h- Độ ẩm cao ĐĐR (%). 
6.2. Quy trình bào chế cao khô lá đu đủ rừng bằng phương pháp phun sấy 
a. Chuẩn bị: 
 9 
- Chuẩn bị mẫu dịch phun: 
Lấy cao 3:1 trong tủ bảo quản ra, đun nóng cách thủy ở nhiệt độ 50 - 60°C 
trong 30 phút để cao chảy lỏng, khuấy đều đến đồng nhất rồi để nguội về nhiệt 
độ phòng. Dựa trên tỷ lệ chất rắn được xác định cho từng lô chiết để tính toán 
lượng tá dược và nước thêm vào theo đúng tỷ lệ công thức như trong Bảng PL 3. 
Sau khi thêm tá dược và nước vào cao 3:1, khuấy đều bằng máy khuấy cơ Ika 
trong 10 phút để thu được dịch phun sấy đồng nhất. 
- Chuẩn bị thiết bị phun sấy: M áy phun sấy được vệ sinh sạch sẽ. Đảm bảo 
không còn dư phẩm của lần phun trước. Lắp các thiết bị vào phần thân máy. 
- Chuẩn bị bao bì đóng gói: Túi PE, giấy nhôm, bình thủy tinh nút mài. 
b. Tiến hành phun sấy : 
- Bật cầu giao điện, bật công tắc nguồn trên máy phun sấy. Trên màn hình 
chính ở phần “Fan”, bật nút “ON” để khởi động quạt gió và kiểm tra hệ thống để 
đảm bảo không bị hở ở các đầu nối ống dẫn và cửa buồng phun. Khi đảm bảo 
chắc chắn không có dự dò khí thì cài đặt thông số về nhiệt độ phun sấy (120
0
C) 
bằng cách bật nút “ON” trên mục của “Heating”, khi nhiệt độ đầu vào đạt 
ngưỡng cài đặt thì khởi động đầu phun bằng cách bật nút “ON” trong mục 
“Spray gun”, điều chỉnh áp suất vòi phun về 2 Bar, sau 10 giây bật tiếp cấp dịch 
phun bằng cách bật nút “ON” trong mục “Peristalsis pump”, điều chỉnh tốc độ 
cấp dịch trên thiết bị cấp dịch là 10 vòng phút (tương ứng là 30 ml/phút). Tiến 
hành phun sấy đến khi hết dịch phun thì tiếp tục phun sấy với 200 ml nước. 
- Thu bột phun sấy: Bột phun sấy được lấy ở bình đựng mẫu, sau các 
khoảng thời gian cách nhau khoảng 30 phút thu sản phẩm một lần. Sản phẩm 
được đóng gói trong bình thủy tinh nút mài, nắp kín, bọc giấy nhôm và màng 
cho chống ẩm. 
- Kết thúc phun sấy: Khi phun sấy xong, tắt thiết bị theo thứ tự súng phun > 
cấp dịch > gia nhiệt bằng cách bấm vào nút “OFF” trong từng mục điều khiển, 
mỗi lần cách nhau 5 – 10 giây. Sau đó để quạt gió hoạt động để làm nguội 
 10 
buồng phun. Khi nhiệt độ đầu ra giảm xuống trong khoảng 60 - 700C thì tắt quạt 
gió để vệ sinh thiết bị. 
- Vệ sinh thiết bị phun sấy: Tháo các bộ phận của thiết bị ra khỏi phần thân 
máy, dùng máy bơm rửa bằng nước ở trong buồng phun đến khi sạch các bột 
bám ở thành buồng phun, rửa các ống dẫn, bình đựng mẫu để khô tự nhiên. 
VII. PHƯƠNG PHÁP KIỂM SOÁT, KIỂM NGHIỆM 
Bảng PL 4. Kiểm soát, kiểm nghiệm 
STT Giai đoạn bào chế Nội dung kiểm tra, kiểm soát Yêu cầu 
I Giai đoạn chiết xuất 
1.1 Dược liệu 
Kiểm nghiệm nguyên liệu theo TCCS 
đã xây dựng 
Đạt 
1.2 
Nghiền, rây nguyên liệu 
Cân nguyên phụ liệu 
Rây số 710 
Theo công thức 
Đúng 
1.3 
Chiết xuất trên máy chiết 
siêu âm 
Nhiệt độ chiết 70 ± 20C, thời gian 
chiết 90 phút/ lần, tỷ lệ dung môi/ 
dược liệu 15ml/1g/lần, chiết 2 lần. 
Đúng 
1.4 Cô đặc 
Nhiệt độ cô thu hồi dung môi 80 - 
850C; nhiệt độ cô cách thủy 85 - 900C 
Đúng 
1.5 Bào chế cao ĐĐR 3:1 
Hàm lượng saponin: 165 - 245 mg/g 
Tỷ lệ chất rắn trong cao: 20 - 30% 
Đạt 
Đạt 
II Giai đoạn phun sấy 
2.1 Chuẩn bị dịch phun 
Pha chế dịch phun theo công thức: 
Aerosil tỷ lệ 30% so với chất rắn trong 
cao, tỷ lệ chất rắn/ dịch phun 14% 
Đúng 
2.2 Phun sấy 
Nhiệt độ phun sấy 130 ± 20C, tốc độ 
cấp dịch 30 ml/phút, áp suất khí nén 
đầu phun 2 Bar. 
Đúng 
2.3 
Kiểm nghiệm cao khô lá 
ĐĐR 
Theo TCCS Đạt 
 11 
VIII. DƯ PHẨM, PHẾ PHẨM 
Dược liệu, cao khô lá đu đủ rừng không đạt, rơi vãi, bẩn phải huỷ. 
IX. CÁC HỒ SƠ LÀM VIỆC CẦN THIẾT 
1. DĐVN V 
2. Sổ pha chế 
3. Nội qui phòng bào chế. 
4. Qui trình vận hành thiết bị. 
5. Tiêu chuẩn cơ sở cao khô lá đu đủ rừng. 
6. Các hồ sơ và nội qui khác có liên quan.