Tóm tắt Luận án Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm

 1 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
 Da là cơ quan lớn nhất của cơ thể có chức năng bảo vệ. Mặc dù chỉ 
gồm 2 lớp mô chuyên biệt với hai loại tế bào chủ yếu là nguyên bào sợi và 
tế bào sừng nhƣng việc tái tạo khi da bị tổn thƣơng vẫn còn là một thách 
thức. Các tấm tế bào da nuôi cấy hoặc vật liệu tƣơng đƣơng da chế tạo từ 
tế bào da nuôi cấy đã đƣợc ứng dụng trong điều trị bỏng, vết thƣơng mạn 
tính . Việc khắc phục các hạn chế đang đƣợc kỳ vọng vào vai trò tác 
dụng của các tế bào gốc bởi chúng là những tế bào chƣa có chức năng 
chuyên biệt, chúng có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác 
nhau và có khả năng tự thay mới. 
Tế bào gốc trung mô tồn tại trong tủy xƣơng, máu cuống rốn, dây rốn, 
mô liên kết của cơ thể và ở các khoảng kẽ của nhiều cơ quan. Các tế bào 
này có thể đƣợc nuôi cấy và nhân lên in vitro và dƣới các điều kiện thích 
hợp chúng có thể cảm ứng biệt hóa thành các tế bào xƣơng, sụn, cơ và mỡ. 
Hiện nay, tế bào gốc trung mô đƣợc coi là dạng tế bào quan trọng cho 
công nghệ mô. 
Trong liền vết thƣơng, tế bào gốc trung mô đƣợc xác định là chúng 
biệt hóa thành các dạng tế bào da khác nhau. Tủy xƣơng là nguồn chính 
của tế bào gốc trung mô nhƣng vấn đề thu tủy xƣơng gặp khó khăn và số 
lƣợng ngƣới cho tủy xƣơng cũng hạn chế. Những vấn đề cần cân nhắc này 
đã hạn chế các ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc trung mô tủy xƣong. 
 Việc tìm kiếm các tế bào gốc trung mô từ nguồn mô khác đã đƣợc 
quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây. Dây rốn là mô mềm có 
chiều dài lớn và là cầu nối giữa thai và bánh nhau để trao đổi oxy, dinh 
dƣỡngcho thai. Các nghiên cứu phôi thai học và kháng nguyên bạch cầu 
ngƣời (Human Leukocyte Antigen – HLA) của các tế bào từ dây rốn cho 
thấy chúng có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ ngƣời mẹ. 
Mô dây rốn là sản phẩm thải sau khi sinh và là một nguồn tƣơng đối 
dƣ thừa. Sự thu hồi mô cũng dễ dàng và không bị ảnh hƣởng cúa các vấn 
 2 
đề về đạo đức và luật pháp. Năm 2004, tế bào gốc trung mô phân lập đƣợc 
từ màng dây rốn. Các tế bào này sau khi phân lập và nuôi cấy duy trì, cấy 
chuyền 3 đến 5 lần trong môi trƣờng nuôi cấy đặc trƣng chƣa hề bị biệt 
hoá, vẫn giữ đƣợc đầy đủ đặc tính của TBG ban đầu mới phân lập. 
Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, đề tài “Nghiên cứu biệt hóa 
tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng 
nhiệt thực nghiệm” đƣợc tiến hành nhằm mục tiêu: 
1. Đánh giá một số đặc điểm phân lập nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc 
trung mô màng dây rốn. 
2. Đánh giá hiệu quả ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong 
điều trị vết thƣơng bỏng nhiệt thực nghiệm 
Những đóng góp mới của luận án: 
- Luận án có đóng góp mới cho nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu thực 
nghiệm, đã phân lập đƣợc tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn ngƣời, các 
đặc tính tế bào gốc trung mô và ảnh hƣởng của chúng trên vết thƣơng bỏng 
dị loại là thỏ thực nghiệm. 
- Mở ra hƣớng nghiên cứu mới trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào để điều trị 
vết thƣơng bỏng, vết thƣơng mạn tính. 
- Một số điểm mới thu đƣợc trong kết quả nghiên cứu của luận án là tế bào 
gốc trung mô phân lập từ màng dây rốn ngƣời mọc đơn lớp trong điều kiện 
nuôi cấy in vitro và có khả năng tạo cụm, cụm của tế bào gốc trung mô ở 
dạng CFU-F (Collony Forming Unit – Fibroblast). 
- Tế bào gốc trung mô màng dây rốn ngƣời có đặc tính sinh miễn dịch thấp. 
Các tế bào có bộc lộ các phân tử HLA-G và HLA-E nhƣng bộc lộ HLA-
DR, với mức độ thấp. Kháng thể đặc hiệu kháng tế bào gốc trung mô trên 
thỏ xuất hiện với hiệu giá thấp. 
- Tế bào gốc trung mô màng dây rốn có thể cảm ứng để biệt hóa thành 
nguyên bào sợi trong môi trƣờng định hƣớng in vitro. 
Bố cục luận án: 
Luận án gồm 119 trang với 29 hình ảnh, 9 biểu đồ và 22 bảng, trong 
 3 
đó: đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan tài liệu (30 trang); Đối tƣợng và 
phƣơng pháp nghiên cứu (23 trang); Kết quả nghiên cứu (36); Bàn luận (25 
trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1 trang). Tài liệu tham khảo: 145 tài 
liệu (tiếng Việt 29, tiếng Anh 116). 
CHƢƠNG 1 
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 
1.1. QUÁ TRÌNH LIỀN VẾT THƢƠNG 
1.1.1. Diễn biến lâm sàng vết thƣơng, vết bỏng sâu 
Thông thƣờng, các vết thƣơng liền trong vòng 4 – 6 tuần. Các vết 
thƣơng khuyết da hoặc bỏng sâu toàn bộ lớp da thì quá trình liền vết 
thƣơng đều phải trải qua quá trình hình thành mô hạt. Tùy thuộc vào diện 
tích, độ sâu của vết bỏng, sức đề kháng của cơ thể, vết bỏng cơ bản tiến 
triển theo ba giai đoạn đan xen và kế tiếp nhau là: Giai đoạn cấp tính, giai 
đoạn tái tạo và giai đoạn hình thành sẹo. 
1.1.2. Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thƣơng 
Quá trình liền vết thƣơng có nhiều cơ chế phức tạp nhƣng kết quả 
cuối cùng là tái lập lại các mô tế bào đã bị tổn thƣơng. Do đó quan niệm 
mới trong điều trị các tổn thƣơng ở bất cứ cơ quan nào trong cơ thể là các 
tế bào tổn thƣơng phải đƣợc thay thế bằng các tế bào khoẻ mạnh. Để duy 
trì chức năng bảo vệ cơ thể, con ngƣời cần có da. Thành phần tế bào da 
ngƣời chủ yếu gồm 2 loại là nguyên bào sợi và tế bào sừng. 
1.1.2.1. Nguyên bào sợi 
1.1.2.2. Tế bào sừng 
1.2. GHÉP TẾ BÀO ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG 
Do có vai trò quan trọng quyết định trực tiếp tới quá trinh liền vết 
thƣơng nên nguyên bào sợi và tế bào sừng cũng là những tế bào đƣợc nuôi 
cấy để ghép trong điều trị vết thƣơng. 
1.2.1. Vật liệu tƣơng đƣơng trung bì có tế bào 
Vật liệu thay thế trung bì có tế bào là vật liệu dùng nguyên bào sợi để 
tạo một cấu trúc tái sinh trên giá đỡ làm từ một số nguyên liệu khác nhau. 
 4 
Cấu trúc này đƣợc cấy nguyên bào sợi để tổng hợp các protein và các thành 
phần khác của đệm gian bào mà có tác dụng kích thích những tế bào tại vết 
thƣơng của ngƣời bệnh tăng cƣờng hoạt động để làm nhanh liền vết thƣơng. 
* TransCyte. 
* Dermagraft. 
1.2.2. Vật liệu tƣơng đƣơng biểu bì có tế bào 
* Epicel. 
* Laserskin. 
1.2.3. Vật liệu tƣơng đƣơng da hai lớp có tế bào 
Vật liệu tƣơng đƣơng da hai lớp gồm biểu bì và trung bì là sản phẩm 
mới và phức tạp nhất hiện nay về cấu trúc. Vật liệu đƣợc tạo ra bởi nuôi 
cấy nguyên bào sợi và tế bào sừng trên nền là giá thể collagen và cơ chất 
lycosaminoglycan 
 Vật liệu tƣơng đƣơng da đồng loại là sản phẩm mới nhất và tiến bộ 
nhất gần đây, chúng đang đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng. Hai sản phẩm 
nguyên mẫu của dạng này là Apligraf và Orcel. 
1.3. TẾ BÀO GỐC, TIỀM NĂNG VÀ ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC 
1.3.1. Tế bào gốc, đặc tính và phân loại tế bào gốc 
Tế bào gốc là những tế bào chƣa có chức năng chuyên biệt, chúng có 
tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự 
thay mới. 
Dựa theo nguồn gốc hoặc thời điểm phân lập, có thể phân loại các tế 
bào gốc thành các nhóm sau: 
- Tế bào gốc phôi 
- Tế bào gốc thai 
- Tế bào gốc nhũ nhi 
- Tế bào gốc trƣởng thành 
- Tế bào vạn tiềm năng do cảm ứng 
1.3.2. Ứng dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh 
1.3.3. Các tiềm năng ứng dụng tế bào gốc 
 5 
1.3.4. Biệt hóa tế bào gốc thành các tế bào da dùng trong điều trị vết thƣơng 
1.3.4.1. Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành nguyên bào sợi 
1.3.4.2. Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào sừng 
1.4. DÂY RỐN VÀ TẾ BÀO GỐC PHÂN LẬP TỪ MÀNG DÂY RỐN 
Năm 2004, nhóm nghiên cứu tại Đại học Quốc gia Singapore đã 
thành công trong việc xác định và phân lập đƣợc các TBG biểu mô và TBG 
trung mô từ màng dây rốn. Cả hai loại tế bào gốc biểu mô và trung mô 
màng dây rốn đều có 2 loại marker là: Oct 4 (Octamer 4) và Nanog 
(Pluripotency Sustaining ES Cell Factor). Điều này gợi ý cho thấy tính gốc 
của cả hai loại tế bào này cao hơn so với tính gốc của tế bào tuỷ xƣơng, 
máu cuống rốn hay các tế bào gốc trƣởng thành khác. 
CHƢƠNG 2 
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 
Thỏ thí nghiệm bao gồm 02 lô: 
Lô 1, gồm 15 thỏ dùng để đánh giá tính sinh miễn dịch của tế bào 
gốc trung mô màng dây rốn ngƣời khi ghép dị loại. 
Lô 2, gồm 30 thỏ dùng để đánh giá hiệu quả ghép tấm tế bào gốc 
trung mô điều trị vết bỏng nhiệt thực nghiệm. 
Thỏ thí nghiệm đều đã trƣởng thành từ 10-12 tháng tuổi, do Ban chăn 
nuôi động vật thí nghiệm, Học viện Quân y, Bộ Quốc Phòng cung cấp. 
Nuôi đảm bảo tiêu chuẩn thực nghiệm. 
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 
2.2.1. Mẫu mô dây rốn 
 Mô dây rốn thu từ sản phụ ngay sau khi sinh với các tiêu chuẩn 
nguồn mô nhƣ sau: 
- Tiêu chuẩn y đức về nguồn cung cấp mô: 
- Tiêu chuẩn sàng lọc 
- Ngƣời hiến dây rốn thử máu âm tính với các bệnh truyền nhiễm 
 6 
- Tính pháp lý của nguồn mô nghiên cứu 
2.2.2. Hóa chất chủ yếu dùng trong nghiên cứu 
Các hoá chất và vật tƣ nuôi cấy do hãng Invitrogen và PAAcung 
cấp, đều đạt tiêu chuẩn quốc tế an toàn về độc tính, vi khuẩn, 
mycoplasma và vi rút. 
Môi trƣờng nuôi cấy tế bào trung mô do Ngân hàng tế bào gốc 
Mekostem (Việt Nam) cung cấp theo bản quyền chuyển nhƣợng của công 
ty CRC (Singapore). 
2.2.3. Các vật tƣ tiêu hao chủ yếu 
Màng Tegaderm, 
Các vật tƣ tiêu hao do hãng Corning, 3M, Baxter cung cấp đạt tiêu 
chuẩn quốc tế về vô trùng và phục vụ mục đích nuôi cấy tế bào. 
2.2.4. Các thiết bị và dụng cụ chủ yếu 
 - Phòng sạch nuôi cấy tế bào 
 - Kính hiển vi đảo ngƣợc 
 - Máy ly tâm lạnh 
 - Tủ hood lọc không khí vô trùng 
 - Tủ ấm (incubator) 
 - Pipet Aid 
- Tủ lạnh gia dụng 
 - Tủ lạnh âm 86
0
C và âm 152
0
C 
- Tank Nitơ lỏng 
 - Thiết bị hạ nhiệt độ theo chƣơng trình hoặc hộp hạ nhiệt độ với cồn PIA. 
- Nỉa, kéo 
2.2.5 Các giá đỡ để tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì. 
 Màng Tegaderm chất liệu polyurethane do hãng 3M Health Care, 
USA cung cấp đƣợc dùng để làm giá đỡ tế bào. 
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.3.1. Các phƣơng pháp nghiên cứu trong phân lập, nuôi cấy và biệt 
hóa tế bào 
 7 
2.3.1.1. Phân lập tế bào gốc trung mô 
2.3.1.2. Cấy chuyển nhân rộng số lƣợng tế bào gốc trung mô dây rốn 
2.3.1.3. Đánh giá khả năng tạo colony của tế bào 
2.3.1.4. Xác định số lƣợng tế bào trong nuôi cấy 
Số lƣợng TB đƣợc tính theo công thức: C = n/v (n: số lƣợng TB đã 
đếm đƣợc trong buồng đếm, v: thể tích đếm (ml), C: mật độ TB (TB/ml). 
Trong buồng đếm Neubaeur có thể tích 0,1mm
3
 = 1.10
-4
 ml do đó công 
thức tính là: 
C = n x 10
4
/ml 
2.3.1.5. Đánh giá hình thái tế bào 
 - Đánh giá hình thái tế bào bằng phƣơng pháp nhuộm giemsa 
 - Đánh giá hình thái mô bằng phƣơng pháp nhuộm HE 
- Đánh giá hình thái siêu cấu trúc 
2.3.1.6 Phƣơng pháp khảo sát biểu hiện của các kháng nguyên HLA của 
tế bào gốc trung mô 
- Phân tích biểu hiện của HLA-G và HLA-E bằng kỹ thuật western blot 
- Phân tích HLA-DR bằng kỹ thuật flowcytometry 
2.3.1.7 Xác định tính sinh miễn dịch của tế bào gốc 
 Nguyên liệu và chuẩn bị 
- Tế bào gốc: là dòng tế bào cùng nguồn gốc và thế hệ tế bào đã sử 
dụng ghép cho thỏ trong quá trình nghiên cứu thực nghiệm. 
 - Huyết thanh thỏ: các mẫu máu thỏ đƣợc lấy ở 4 thời điểm: Bắt đầu 
nghiên cứu ghép tế bào gốc - D0 và các thời điểm sau đó là D15, D30, D60. 
 Phương pháp phân tích miễn dịch ELISA 
2.3.1.8. Biệt hóa tế bào gốc mô thành tế bào dạng nguyên bào sợi 
- Môi trƣờng cảm ứng biệt hóa 
- Các bƣớc biệt hóa 
 - Xác định khả năng tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì của tế bào 
2.3.1.9. Xét nghiệm ELISA collagen typ I trong dịch nổi tế bào biệt hóa 
 8 
2.3.2. Các phƣơng pháp đánh giá hiệu quả ghép tế bào điều trị vết 
thƣơng thực nghiệm 
2.3.2.1. Quy trình nghiên cứu thực nghiệm 
Sơ đồ 2.1. Thiết kế nghiên cứu vết thƣơng bỏng thực nghiệm 
Thỏ nghiên cứu 
(n = 30) 
Gây bỏng thực nghiệm 
2 bên lƣng thỏ 
Cắt lọc hoại tử 
ở vết thƣơng bỏng 
Vùng B (n = 30) 
Đắp tấm vật liệu 
Tegaderm không 
có tế bào 
Vùng A (n = 30) 
Đắp tấm vật liệu 
tƣơng đƣơng trung bì 
Theo dõi diễn biến vết 
thƣơng bỏng vào các 
thời điểm D0, D5, D10 
Theo dõi diễn biến vết 
thƣơng bỏng vào các 
thời điểm D0, D5, D10 
Kết luận 
 9 
2.3.2.2. Gây bỏng thực nghiệm 
- Phương pháp gây bỏng: Theo phƣơng pháp của Halovec và 
Pocicado 1961 (có cải tiến). 
2.3.2.3.Thay băng chăm sóc vết thƣơng 
2.3.2.4. Ghép tấm tế bào lên vết thƣơng 
Vùng A – vùng nghiên cứu ghép tấm tế bào (quy định vết thƣơng bên 
phải lƣng thỏ), vùng B – vùng đối chứng (chỉ ghép màng Tegaderm đơn thuần). 
2.3.2.5. Xét nghiệm hình thái cấu trúc mô vết thƣơng 
2.3.2.6. Xét nghiệm vi khuẩn vết bỏng 
- Xác định số lƣợng vi khuẩn có trong 1 cm
2 
vết bỏng theo công thức: 
SLVK/ cm
2
 = 
(5 N1 x 10
3
) + (5 N2 x 10
2
) 
2 
N1: Số lƣợng khuẩn lạc ở đĩa thạch cấy lúp 0,001. 
N2: Số lƣợng khuẩn lạc ở đĩa thạch cấy lúp 0,01. 
5: 5 ml nƣớc muối 0,9%. 
2.3.2.7. Các chỉ tiêu theo dõi toàn thân 
* Toàn thân 
* Cân nặng thỏ 
2.3.2.8. Các chỉ tiêu theo dõi tại chỗ vết thƣơng 
- Theo dõi hàng ngày diễn biến 
- Tính diện tích vết thƣơng 
2.3.2.9. Các xét nghiệm huyết học và sinh hoá máu 
- Xét nghiệm huyết học 
- Xét nghiệm sinh hoá 
2.3.2.10. Xác định hoạt độ enzym GOT trong huyết thanh 
 10 
2.3.2.11. Xác định hoạt độ enzym GPT trong huyết thanh 
2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU 
Các số liệu đựơc tính theo trị giá trung bình (X SD ) hoặc tỷ lệ % . 
Xử lý số liệu trên phần mềm SPSS 16.0 sự khác biệt có ý nghĩa thống kê 
khi P<0,05. 
CHƢƠNG 3 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
3.1. ĐẶC ĐIỂM PHÂN LẬP, NUÔI CẤY BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC 
TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN 
3.1.1. Đặc điểm phân lập tế bào gốc trung mô dây rốn 
3.1.1.1. Kết quả phân lập và hình thái tế bào gốc trung mô dây rốn 
Bảng 3.2. Thời gian tế bào tách ra khỏi mẫu mô và đạt 50% che phủ (n=17) 
Chỉ tiêu 
Trong 7 
ngày 
Trong 14 
ngày 
Trong 21 
ngày 
Trong 28 
ngày 
Số 
mẫu 
% 
Số 
mẫu 
% 
Số 
mẫu 
% 
Số 
mẫu 
% 
Mọc tế 
bào 
02 11,7 10 58,8 15 88,2 17 100,0 
Tế bào 
đạt 50% 
00 00 05 29,4 14 82,3 16 94,1 
Sau 4 tuần tất cả các mẫu mô đều mọc tế bào. 
 Theo dõi tế bào mọc ra khỏi mẫu mô nuôi cấy, thu tế bào bằng quy 
trình tripsin và cấy chuyển đến P3-P4. 
 11 
3.1.1.2. Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô dây rốn 
Bảng 3.3. Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô ở P2 
Nguồn tế bào 
Thời gian (ngày) Tỷ lệ % số 
colony/tế bào 
thí nghiệm 
Bắt đầu quan sát 
thấy colony 
Thấy rõ đa số 
colony 
Mẫu mô 01 04 7 73 
Mẫu mô 02 05 8 72 
Mẫu mô 03 05 10 77 
Mẫu mô 04 04 9 66 
Mẫu mô 05 05 7 71 
3.1.2. Biểu hiện kháng nguyên hòa hợp tổ chức và tính sinh miễn dịch 
của tế bào gốc trung mô dây rốn 
3.1.2.1. Đặc điểm biểu hiện HLA-G, HLA-E và HLA-DR của tế bào 
Ảnh 3.6. Kháng nguyên HLA-G và HLA-E có trong dịch nghiền tế bào 
gốc trung mô màng dây rốn được phát hiện bằng kỹ thuật western blot. 
Mức độ biểu hiện HLA-DR trên bề mặt TBGTM màng dây rốn đƣợc 
phân tích qua flowcytometry. 
 12 
Biểu đồ 3.2. Kết quả phân tích bằng flowcytometry mức độ biểu hiện HLA-DR 
của tế bào gốc trung mô màng dây rốn. 
3.1.2.2. Tính sinh miễn dịch của tế bào gốc trung mô dây rốn 
Biểu đồ 3.3. Phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng 
nguyên siêu nghiền bằng xét nghiệm ELISA 
 13 
Biểu đồ 3.4. Phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng 
nguyên là tế bào nguyên vẹn 
3.1.3. Khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành nguyên bào sợi 
3.1.3.1. Thay đổi về hình thái và dấu ấn tế bào trong quá trình biệt hóa 
Bảng 3.4. Tỷ lệ % hình dạng tế bào biệt hóa qua các thế hệ tế bào 
Thế hệ tế bào Hình sao Hình thoi Hình sợi 
Hình dạng 
khác 
P5 69,0 19,9 5,9 5,2 
P10 35,8 47,8 9,8 0,6 
P15 23,4 61,5 15,1 00 
 Tỷ lệ các tế bào hình thoi và sợi tăng dần theo các thế hệ tế bào khi 
nghiên cứu nuôi cấy trong môi trƣờng định hƣớng biệt hóa. 
 14 
Bảng 3.6. Tỷ lệ % hình dạng nhân tế bào biệt hóa 
Thế hệ tế bào 
Nhân tế bào biệt hóa 
Hình tròn Hình trứng 
Đang phân 
chia 
Nhân quái 
P5 70,7 26,2 3,1 00 
P10 38,8 58,0 3,4 00 
P15 17,4 80,9 1,7 00 
3.1.3.2. Khả năng chế tiết collagen và tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng 
trung bì của tế bào gốc trung mô 
Bảng 3.7. Hàm lượng collagen hòa tan (µg/ml) 
Mẫu xét nghiệm 
Nhóm tế bào 
Nhóm chứng 
(TBGTM) 
Nhóm nghiên cứu 
(NBS biệt hóa) 
P 
Môi trƣờng nuôi cấy 
(n=5) 
0,045 ± 0,002 0,046 ± 0,001 >0,05 
Dịch nổi nuôi cấy 
(n=5) 
0,069 ± 0,003 0,297 ± 0,011 <0,01 
P >0,05 <0,001 
3.2. HIỆU QUẢ GHÉP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN 
TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG BỎNG NHIỆT THỰC NGHIỆM 
3.2.1. Thay đổi một số chỉ số toàn thân và xét nghiệm của thỏ trong 
ghép tế bào gốc trung mô 
 15 
Bảng 3.8. Thay đổi các chỉ số huyết học thỏ nghiên cứu 
Chỉ số 
Thời điểm 
D0 D5 D10 
Số lƣợng hồng cầu 
(x10
12
/L) 
5,56 1,67 5,67 1,69 5,84 0,12 
Huyết tắc số 
(g/L) 
120,13 1,44 125,58 2,92 131,1 2,81 
Hematocrit (%) 34,41 1,81 37,25 1,56 38,10 2,10 
Số lƣợng bạch cầu 
(x10
9
/L) 
5,26 0,36 8,27 0,72 6,26 0,56 
Bạch cầu N (%) 23,05 2,41 19,90 1,67 20,69 2,42 
Bạch cầu L (%) 58,24 4,30 62,20 2,26 61,58 2,19 
Bảng 3.9. Thay đổi các chỉ số sinh hoá máu liên quan chức năng thận 
Chỉ số 
Thời điểm 
D0 D5 D10 
Glucose (mmol/L) 4,79 0,31 4,96 0,35 5,27 0,33 
Ure (mmol/L) 5,34 0,47 5,2 0,41 5,10 0,27 
Creatinin (mol/L) 93,8 4,86 94,6 5,48 96,04 5,63 
3.2.2. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô tới liền vết thƣơng 
3.2.2.1. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô tới diễn biến lâm 
sàng tại chỗ vết thƣơng 
 Bảng 3.12. Thay đổi diện tích vết thương bỏng 
Thời điểm 
Tỷ lệ % diện tích vết thƣơng đã liền 
P 
Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) 
D5 26,53 ± 12,04 25,84 ± 11,40 0,601 
D10 77,44 ± 12,24 68,76 ± 11,14 < 0,01 
D15 93,23 ± 3,74 87,36 ± 4,78 < 0,001 
Ngày thứ 10 và 15, diện tích vết bỏng của vùng A liền nhanh vùng B 
rệt hơn (p<0,001). 
 16 
Bảng 3.13. Tốc độ liền vết thương 
Thời điểm 
Diện tích vết thƣơng thu hẹp 
(cm
2
/ngày) P 
Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) 
Ngày thứ 1 - 5 0,93 ± 0,32 0,90 ± 0,29 0,488 
Ngày thứ 5 – 10 1,77 ± 0,74 1,25 ± 0,28 <0,01 
Ngày thứ 1 – 10 1,41 ± 0,33 1,28 ± 0,19 <0,01 
Ngày thứ 1 - 15 1,12 ± 0,16 1,04 ± 0,13 < 0,01 
Tốc độ thu hẹp vết thƣơng giữa vùng A và vùng B trong khoảng thời 
gian từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 10 thì sự khác nhau có ý nghĩa thống với 
p<0,01. 
3.2.2.2. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô đến thay đổi hình 
thái cấu trúc mô vết thƣơng 
Bảng 3.17. Thay đổi số lượng tế bào viêm tại mô vết thương 
Thời điểm 
Số lƣợng tế bào viêm/ĐVDT 
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P 
D0 30,16 7,41 31,46 5,98 0,375 
D5 18,86 4,46 18,01 5,08 0,475 
D10 08,96 1,80 12,50 3,01 0,001 
Số lƣợng tế bào viêm cả 2 vùng đều giảm theo tiến trình nghiên cứu. 
Tại thời điểm 10 ngày nghiên cứu (15 ngày sau gây bỏng), vùng A có số 
lƣợng tế bào viêm thấp hơn so với vùng B và sự khác biệt có ý nghĩa thống 
kê (P<0,001). 
 17 
Bảng 3.18. Thay đổi số lượng nguyên bào sợi tại mô vết thương 
Thời điểm 
Số lƣợng nguyên bào sợi/ĐVDT 
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P 
D0 13,86 5,40 13,53 03,13 0,714 
D5 37,20 8,26 36,56 9,35 0,76 
D10 67,10 9,09 52,73 10,38 <0,001 
 Ngày thứ 10 thấy số lƣợng nguyên bào sợi vùng A tăng hơn vùng B 
với p< 0,001. 
Bảng 3.19. Thay đổi số lượng tân mạch tại mô vết thương 
Thời điểm 
Số lƣợng tân mạch/ĐVDT 
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P 
D5 3,50 1,04 3,67 1,02 0,484 
D10 7,23 1,13 4,90 0,95 0,001 
Số lƣợng tân mạch ở vùng A tại thời điểm ngày nghiên cứu thứ 10 
(ngày thứ 15 sau khi gây bỏng) cao hơn có ý nghĩa thống kê so với vùng B 
với p <0,001. 
Bảng 3.20. Thay đổi chỉ số phân bào lớp mầm tại mô vết thương 
Thời điểm 
Chỉ số phân bào (có hiệu chỉnh MI x 100) 
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P 
D5 1,53 0,50 1,47 0,51 0,189 
D10 2,47 0,56 1,86 0,51 0,010 
Tại thời điểm ngày nghiên cứu thứ 10, chỉ số phân bào tăng hơn so 
với ngày thứ 5, đặc biệt vùng A tăng cao hơn so với vùng B có ý nghĩa 
thông kê (p<0,01). 
 18 
3.2.3. Vi khuẩn học vết thƣơng bỏng thực nghiệm 
 Bảng 3.22. Thay đổi mật độ Số lượng vi khuẩn vết thương 
Thời điểm 
Số lƣợng vi khuẩn ( 5 10
3
/cm
2
) 
Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) P 
D0 05,67 ± 31,07 9,02 ± 28,40 0,575 
D5 16,06 ± 37,15 22,87 ± 42,98 0,108 
D10 10,57 ± 27,96 7,22 ± 22,21 0,343 
Xét tại vùng A và vùng B thì số lƣợng vi khuẩn tăng cao ở lần 2 (thời 
điểm 5 ngày sau khi bắt đầu ghép tế bào) nhƣng sau đó giảm ở lần 3 (ngày 
thứ 10 sau khi ghép tế bào). 
CHƢƠNG 4 
BÀN LUẬN 
4.1. ĐẶC ĐIỂM PHÂN LẬP NUÔI CẤY, BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC 
TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN 
4.1.1. Phân lập tế bào gốc trung mô màng dây rốn 
 Tế bào gốc trung mô dây rốn có thể dễ dàng thu đƣợc. Do việc sử 
dụng chúng không bị các vƣớng mắc về vấn đề đạo đức, dây rốn là sự lựa 
chọn tối ƣu cho việc phân lập tế bào gốc trung mô. Hochedlinger và cộng sự 
đã xác định OCT-4 cũng có biểu hiện ở các tế bào gốc trung mô dây rốn. 
OCT-4 là một gene đặc biệt của tế bào gốc phôi, có vai trò quan trọng trong 
việc duy trì tình trạng không biệt hóa của tế bào gốc. 
Kết quả của chúng tôi có 15/17 mẫu mô nghiên cứu mọc tế bào ra 
khỏi mẩu mô trong 3 tuần sau nuôi cấy mô, đạt tỷ lệ 88,2% và cũng chỉ 
cần nuôi cấy trong hai tuần là đã có thể thu hoạch tế bào. Kết quả nghiên 
 19 
cứu các dấu ấn bề mặt tế bào cho thấy tế bào gốc trung mô có biểu hiện 
mạnh các dấu ấn CD44, CD29, CD105, và HLA-ABC, nhƣng không có 
CD34, HLA-DR, CD31 hoặc CD45 
4.1.2. Một số đặc tính của tế bào gốc trung mô dây rốn 
4.1.2.1. Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô dây rốn 
Tỷ lệ colony trong tập hợp số tế bào tách ra khỏi mẫu mô đạt cao, 
thấp nhất là 66% và cao nhất là 77%. Các mẫu nghiên cứu cho thấy, tế bào 
gốc trung mô phát triển tốt và tạo ra số lƣợng lớn các colony (gần 30 
colonies) và đƣờng kính của colony cũng đạt hơn 2mm.Nghiên cứu này 
chỉ ra rằng tế bào gốc trung mô phân lập đƣợc duy trì khả năng di truyền. 
Kích thƣớc colony lớn cũng gợi ý rằng chúng có khả năng tăng sinh và cả 
khả năng di cƣ. 
4.1.2.2. Tế bào gốc trung mô dây rốn có tính sinh miễn dịch thấp 
Đặc điểm kháng nguyên HLA ở tế bào gốc trung mô dây rốn 
Kết quả ở biểu đồ 3.2 cho thấy, trên 98% số tế bào thuộc quần thể 
TBGTM màng dây rốn thể dƣơng tính với CD90 là một dấu ấn đặc trƣng 
của TBGTM. Kết quả phân tích 15 mẫu TBGTM màng dây rốn cho mức 
độ biểu hiện của HLA-DR chỉ ở mức 1,95 ± 1,53%. 
TBGTM màng dây rốn trẻ sơ sinh bộc lộ các phân tử HLA-G và 
HLA-E nhƣng không bộ lộ HLA-DR. Đặc điểm biểu hiện này về HLA có 
thể là một phần nguyên nhân tạo nên tính sinh miễn dịch thấp của loại tế 
bào gốc này. 
Trong nghiên cứu này, tất cả các mẫu huyết thanh thỏ ở các thời điểm 
đƣợc khảo sát là D15, D30 và D60 đều có hoạt tính kháng thể kháng 
TBGTMMDRN đƣợc cấy ghép, chứng tỏ các tế bào này có tính sinh miễn dịch. 
 20 
4.1.3. Biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn thành dạng nguyên bào sợi 
 Trong nghiên cứu này, chúng tôi thu dây rốn trong điều kiện vô trùng 
sau đó phân lập tế bào gốc theo phƣơng pháp nuôi cấy bám dính của mô. 
Phƣơng pháp này đã đƣợc nhiều tác giả sử dụng để phân lập tế bào gốc 
trung mô dây rốn và xác định đặc tính của chúng. Kết quả nghiên cứu 
của chúng tôi tập trung vào quan sát các biến đổi hình thái của tế bào 
biệt hóa so với tế bào gốc trung mô cả trên kính hiển vi đảo ngƣợc và 
cả nhuộm tế bào. 
4.2. HIỆU QUẢ GHÉP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ ĐIỀU TRỊ VẾT 
BỎNG THỰC NGHIỆM 
4.2.1. Mô hình nghiên cứu ghép tế bào gốc trung mô dây rốn 
 Trị liệu tế bào đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các bệnh về máu và vết 
thƣơng. Kết quả ứng dụng lâm sàng trong nhiều thập kỷ đã khuyến khích 
các nhà khoa học tìm hiểu các trị liệu tế bào khác để thay thế các mô tế 
bào của hầu hết các cơ quan trong cơ thể. Trong mô hình nghiên cứu thực 
nghiệm của chúng tôi là ghép tấm tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn 
của ngƣời trên vết thƣơng của động vật là một dạng ghép dị loại. 
4.2.2. Tác động của ghép tế bào gốc trung mô trên quá trình liền vết 
thƣơng thực nghiệm 
Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng tế bào có tính gốc tách từ màng 
dây rốn có một số đặc tính của tế bào gốc trung mô để ghép trên những vết 
thƣơng thực nghiệm sau cắt hoại tử thấy diễn biến quá trình liền vết 
thƣơng có những dấu hiệu thuận lợi hơn. 
Ở vùng đƣợc ghép tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì thì tốc độ thu hẹp 
vết thƣơng diễn ra nhanh hơn trong 10 ngày đầu tiên sau ghép tế bào (bảng 
3.9, bảng 3.10). 
 21 
4.2.2.1. Ảnh hƣởng trên quá trình hình thành mô hạt 
 Ở vùng đƣợc ghép tế bào gốc trung mô, mô hạt cũng hình thành sớm 
nhƣng mỏng, vấn đề này thể hiện ở xét nghiệm mô học thấy nguyên bào 
sơi và tân mạch tăng dần ở các thời điểm nghiên cứu ngày thứ 5 ghép tế 
bào tuy nhiên chỉ tăng nhẹ so với vùng chứng mà không có ý nghĩa thống 
kê. Tuy nhiên vào ngày nghiên cứu thứ 10 (D10) thì số lƣợng NBS và tân 
mạch vùng nghiên cứu tăng cao hơn so với vùng đối chứng và có ý nghĩa 
thống kê với p<0,05 (bảng 3.15, bảng 3.16). 
4.2.2.2. Ảnh hƣởng đến quá trình viêm 
 Kết quả ở nhóm nghiên cứu cho thấy khi ghép tế bào thì phản ứng 
viêm ở vết thƣơng đều giảm dần và giảm nhiều hơn so với vùng đối 
chứng: ở ngày thứ 5 vết thƣơng tiết dịch ít và quanh vết thƣơng không 
viêm nề trong khi đó vùng chứng còn tiết dịch nhiều và bề mặt vết thƣơng 
vẫn có giả mạc (bảng 3.8). 
4.2.2.3. Ảnh hƣởng đến quá trình biểu mô hoá vết thƣơng 
 Nghiên cứu này chỉ ra rằng vết thƣơng ghép tấm vật liệu tƣơng 
đƣơng trung bỉ làm tăng chỉ số phân bào so với vùng chứng (bảng 3.17). 
Kết quả cả sự tăng phân bào tế bào lớp mầm là trên thực tế vết thƣơng 
quan sát thấy với vùng ghép tế bào thì vết thƣơng thu hẹp và đƣợc đóng kín 
chủ yếu do biểu mô hoá. Kích thƣớc của quầng biểu mô đƣợc tính từ bờ mép 
vết thƣơng ban đầu đến sát mép vết thƣơng ở thời điểm 10 ngày đều lớn hơn 
so với vết thƣơng vùng chứng. 
4.2.2.4. Ảnh hƣởng đến quá trình co rút vết thƣơng 
Kết quả nghiên cứu ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn của 
chúng tôi cho thấy tế bào gốc trung mô làm tăng nhanh quá trình biểu mô 
hoá mà cụ thể là kích thƣớc mép biểu mô lớn hơn và chỉ số phân bào cao 
 22 
hơn so với vùng chứng (bảng 3.17) trong khi đó ở vùng chứng không ghép 
tế bào thì hiện tƣợng co rút vết thƣơng diễn ra sớm và mạnh hơn vùng 
nghiên cứu. 
Tóm lại: Qua phân tích các số liệu nghiên cứu và bàn luận trên đây 
có thể đƣa ra nhận định những tác động chính làm liền vết thƣơng ở từng 
loại vết thƣơng theo thứ tự sắp xếp nhƣ sau: 
Vết thƣơng vùng đối chứng 
1. Co kéo mạnh làm hẹp vết thƣơng. 
2. Tổ chức hạt bình thƣờng 
3. Biểu mô hoá bình thƣờng. 
Vết thƣơng ghép tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì 
1. Biểu mô hoá tăng nhanh 
2. Tổ chức hạt bình thƣờng 
3. Co rút vết thƣơng nhẹ 
4.2.3. Những ảnh hƣởng bất lợi của ghép tấm vật liệu tƣơng đƣơng 
trung bì đến tình trạng toàn thân và nhiễm khuẩn vết thƣơng 
4.2.3.1. Ảnh hƣởng trạng thái toàn thân của thỏ nghiên cứu 
 Kết quả nghiên cứu ghép tấm tế bào gốc trung mô màng dây rốn trên 
vết thƣơng bỏng nhiệt thực nghiệm cho thấy diễn tiến của thỏ nghiên cứu 
ngày càng tốt lên qua các giai đoạn nghiên cứu. Chỉ riêng các xét nghiệm 
bạch cầu cho thấy có sự tăng tƣơng đối trong công thức bạch cầu ở ngày 
nghiên cứu thứ 5 và thứ 10 (bảng 3.6). Điều đó cho thấy có thế cơ thể đang 
bắt đầu phản ứng miễn dịch trƣớc kháng nguyên là các tế bào và các sản 
phẩm do tế bào đƣợc ghép giải phóng ra. 
 Các tế bào gốc trung mô màng dây rốn khi đƣợc ghép dị loài vào 
vết bỏng có kích thích thỏ sinh kháng thể kháng tế bào gốc trung mô 
màng dây rốn. Hoạt tính kháng thể không mạnh và giảm nhanh sau khi 
 23 
ngừng cấy ghép tế bào. 
4.2.3.2. Ảnh hƣởng đến nhiễm khuẩn vết thƣơng 
Nghiên cứu cho thấy: hầu hết các mẫu cấy khuẩn dƣơng tính đều ở 
mật độ thấp dƣới 10
5
/cm
2
 (bảng 3.19) nên theo chúng tôi việc ghép tế bào 
không làm tăng tình trạng nhiễm trùng vết thƣơng và tình trạng ô nhiễm 
vết thƣơng vùng cấy ghép tế bào cũng không gây bất lợi cho thỏ nghiên 
cứu đặc biệt là bất lợi cho diễn biến của quá trình liền vết thƣơng. Do đó 
theo chúng tôi, các kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của ghép tấm tế bào tới 
quá trình liền vết thƣơng chỉ do chính các tế bào đƣợc ghép lên vết thƣơng 
quyết định. 
KẾT LUẬN 
 Qua nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn để điều 
trị vết thƣơng bỏng thực nghiệm chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 
1. Một số đặc điểm phân lập nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc trung mô 
màng dây rốn. 
- Tế bào phân lập từ màng dây rốn mọc đơn lớp trong điều kiện nuôi 
cấy in vitro và có khả năng tạo cụm. Cụm của tế bào gốc trung mô ở dạng 
CFU-F (Collony Forming Unit – Fibroblast). 
- Tế bào gốc trung mô dây rốn có đặc tính sinh miễn dịch thấp. Các 
tế bào có bộc lộ các phân tử HLA-G và HLA-E nhƣng không bộ lộ rõ 
HLA-DR. 
- Kháng thể đặc hiệu kháng tế bào gốc trung mô màng dây rốn ở thỏ 
đƣợc ghép thấp và giảm dần từ ngày thứ 30 sau ghép. 
- Tế bào gốc trung mô dây rốn có thể cảm ứng để biệt hóa thành 
nguyên bào sợi trong môi trƣờng định hƣớng in vitro.. 
 24 
2. Ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trên mô hình vết thƣơng 
bỏng là an toàn và có tác dụng tích cực trong điều trị vết thƣơng 
- Quá trình biểu mô hóa tại vết thƣơng ghép tấm tế bào gốc trung mô 
màng dây rốn có tác dụng thúc đẩy nhanh quá trình liền vết thƣơng. 
- Mật độ nguyên bào sơn, tân mạch và chỉ số phân bào vùng nghiên 
cứu tăng cao hơn so với vùng đối chứng. 
- Tình trạng viêm ở vết thƣơng giảm nhẹ dần từ ngày nghiên cứu thứ 
5 đến ngày nghiên cứu thứ 10. 
 - Ghép tấm tế bào gốc trung mô màng dây rốn vật liệu tƣơng 
đƣơng trung bì không làm tăng tình trạng nhiễm khuẫn vết thƣơng tại 
các thời điểm nghiên cứu. 
KIẾN NGHỊ 
Tiếp tục nghiên cứu với vùng đối chứng đƣợc điều trị bằng phác đồ 
sinh học khác nhƣ: ghép da, ghép tế bào sừng, nguyên bào sợi để so sánh 
với hiệu quả ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn. 
Tiếp tục nghiên cứu hóa mô miễn dịch để làm rõ hơn cơ chế thúc 
đẩy quá trình liền vết thƣơng tại vùng nghiên cứu và vùng đối chứng.