Luận án Nghiên cứu điều chế cao từ cỏ sữa lá lớn (euphorbia hirta l.), ứng dụng chế biến thực phẩm dinh dưỡng kiểm soát glucose máu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
VIỆN DINH DƯỠNG QUỐC GIA
NGUYỄN MẠNH THẮNG
NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO TỪ CỎ SỮA
LÁ LỚN (EUPHORBIA HIRTA L.) VÀ ỨNG DỤNG CHẾ BIẾN THỰC PHẨM DINH DƯỠNG
KIỂM SOÁT GLUCOSE MÁU
Chuyên ngành: Dinh dưỡng
Mã số: 9720401
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DINH DƯỠNG
Hà Nội – 2020
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
VIỆN DINH DƯỠNG
Người hướng dẫn khoa học :
GS. TS. Nguyễn Công Khẩn 
PGS. TS. Trương Tuyết Mai 
Phản biện 1: 	
Phản biện 2: 	
Phản biện 3: 	 
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Viện tại Viện Dinh dưỡng
Vào hồi .giờ, ngày tháng năm.. 
Có thể tìm hiểu luận án tại :
Thư viện Quốc gia
Thư viện Viện Dinh dưỡng
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tính cấp thiết của luận án	
	Trong những thập kỷ gần đây, các nghiên cứu về cây cỏ thực vật có khả năng hỗ trợ trong phòng và điều trị bệnh đái tháo đường và biến chứng đái tháo đường đang ngày càng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Cây cỏ sữa lá lớn có tên khoa học là Euphorbia hirta L., họ thầu dầu (Euphorbiaceae), một loại cây mọc hoang dại nơi vùng đất ẩm ở các nước nhiệt đới, trong đó có các tỉnh phía nam Việt Nam. Khảo sát thực tế cho thấy, Bình Dương là một tỉnh có điều kiện thời tiết, thổ nhưỡng rất phù hợp cho sự phát triển của các cây thuộc họ thầu dầu. Nhiều nghiên cứu trên Thế giới như Ấn Độ, Malaysia, Nhật Bản đã cho thấy tác dụng của cây cỏ sữa đối với bệnh đái tháo đường thông qua cơ chế kiểm soát glucose máu, ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase bởi hợp chất flavonoid có trong loài thảo dược này. Ở nước ta cho đến nay, còn thiếu những nghiên cứu một cách bài bản, có hệ thống về cây cỏ sữa lá lớn để đưa nguồn dược liệu này ứng dụng sản xuất thực phẩm giàu dinh dưỡng đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Xuất phát từ thực tế trên, đề tài luận án “Nghiên cứu điều chế cao từ cỏ sữa lá lớn (Euphobia hirta L.) và ứng dụng chế biến thực phẩm dinh dưỡng kiểm soát glucose máu” đã được thực hiện.
Mục tiêu nghiên cứu
Mô tả được đặc điểm thực vật và xác định một số thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn.
Điều chế và đánh giá được tính an toàn, hiệu quả của cao cỏ sữa lá lớn trong kiểm soát glucose máu.
Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất đồ uống dinh dưỡng từ cao cỏ sữa lá lớn dùng trong kiểm soát glucose máu.
Nội dung nghiên cứu
1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật và phân tích một số thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn.
2. Nghiên cứu quy trình điều chế cao từ cỏ sữa lá lớn, đánh giá tính an toàn và hiệu quả của cao cỏ sữa lá lớn trong kiểm soát glucose máu.
3. Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất đồ uống dinh dưỡng từ cao cỏ sữa lá lớn dùng trong kiểm soát glucose máu.
Giả thuyết nghiên cứu
1. Hiện nay các bằng chứng khoa học đầy đủ, có hệ thống về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cỏ sữa lá lớn ở các vùng khác nhau của Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu đề cập đến.
2. Cao chiết từ cỏ sữa lá lớn được nghiên cứu trong điều kiện tối ưu đạt hàm lượng flavonoid phù hợp sẽ có khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase trên ống nghiệm, kiểm soát glucose máu trên chuột đái tháo đường.
3. Sản phẩm cao chiết từ cỏ sữa lá lớn có thể làm nguyên liệu để tạo ra các sản phẩm khác nhau, trong đó có sản phẩm đồ uống dinh dưỡng đạt chất lượng và đảm bảo an toàn thực phẩm, giúp cộng đồng có thể tiếp cận, sử dụng dễ dàng và thuận tiện. 
Đóng góp mới của luận án:
- Cung cấp bằng chứng khoa học về đặc điểm thực vật và một số thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn phát triển tự nhiên tại Bình Dương, chứng minh được cơ chế làm giảm đường huyết của cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) là do khả năng ức chế các enzyme thủy phân carbohydrate như α-amylase và α-glucosidase. Đây là cơ sở khoa học chứng minh tác dụng của cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) trong việc làm giảm chỉ số đường huyết ở chuột bị gây đái tháo đường ở qui mô thực nghiệm. 
- Nghiên cứu đã xây dựng được qui trình công nghệ điều chế cao chiết cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) trên cơ sở xác định các điều kiện công nghệ phù hợp, từ chế phẩm này có thể dễ dàng điều chế các dạng sản phẩm khác nhau trong phòng chống bệnh đái tháo đường (dạng viên nang, bột hoặc đồ uống). Trong đó, tác giả đã thử nghiệm sản xuất thành công sản phẩm đồ uống dinh dưỡng giàu flavonoid từ cỏ sữa lá lớn có nguồn gốc tự nhiên. Đây là lĩnh vực ở Việt Nam chưa phát triển nhiều, cần được đẩy mạnh trong thời gian tới, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng.
Bố cục của luận án
Luận án gồm 148 trang (không kể tài liệu tham khảo và phụ lục), trong đó: Đặt vấn đề: 2 trang; Mục tiêu nghiên cứu và Nội dung nghiên cứu: 1 trang; Giả thuyết nghiên cứu: 1 trang; Tổng quan: 48 trang. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu: 26 trang; Kết quả nghiên cứu: 41 trang; Bàn luận: 25 trang. Kết luận: 2 trang; Khuyến nghị: 1 trang. Luận án có 26 bảng, 33 hình và 167 tài liệu tham khảo (58 tài liệu tiếng Việt, 107 tài liệu tiếng Anh, 2 trang thông tin điện tử)
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Khái luận về mô hình bệnh tật: Thực trạng và giải pháp can thiệp hỗ trợ phòng, điều trị đái tháo đường và rối loạn glucose máu
1.1.1. Thực trạng đái tháo đường
Hiện nay, mô hình bệnh tật ở Việt Nam đã có nhiều thay đổi so với một thập kỷ trước đây. Đó là sự gia tăng nhanh chóng của các bệnh mạn tính không lây về tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong. Điều này là kết quả của sự chuyển dịch về mô hình dân số, với tỷ lệ người cao tuổi tiệm cận 11%, cơ cấu được cho là dân số già và do những thay đổi về kinh tế-xã hội, chế độ ăn và lối sống. Do đó, chúng ta đang đứng trước thách thức to lớn của gánh nặng kép về bệnh tật. Một trong số những bệnh mạn tính không lây phổ biến là đái tháo đường.
	Năm 2019, Hiệp hội ĐTĐ Hoa Kỳ đưa ra tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ dựa vào nồng độ glucose máu (mao mạch hoặc tĩnh mạch) và HbA1c. 
Chẩn đoán 
Tiêu chuẩn chẩn đoán 
Đái tháo đường
Nồng độ Glucose máu lúc đói (không ăn trước khi lấy máu ít nhất 8 giờ) 7,0(mmol/L).
Hoặc nồng độ Glucose máu ở thời điểm sau hai giờ thực hiện thử nghiệm dung nạp glucose (uống 75g glucose hòa tan trong nước) 11,1 (mmol/L).
Hoặc HbA1c 6,5%
Tiền đái tháo đường
Nồng độ Glucose máu lúc đói (không ăn trước khi lấy máu ít nhất 8 giờ) từ 5,6 đến 6,9 (mmol/L).
Hoặc nồng độ Glucose máu ở thời điểm sau hai giờ thực hiện thử nghiệm dung nạp glucose (uống 75g glucose hòa tan trong nước) từ 7,8 đến 11,0 (mmol/L).
 Hoặc HbA1c từ 5,7% đến 6,4%
Báo cáo mới nhất năm 2017 của IDF, khoảng 425 triệu người trong độ tuổi 20-79 mắc bệnh ĐTĐ, tương đương cứ 11 người có 1 người bị ĐTĐ, đến năm 2045 con số này sẽ là 629 triệu người (tăng 48%), tương đương cứ 10 người có 1 người bị ĐTĐ. Tại Việt Nam, Bộ Y tế thống kê năm 2017 có 3,5 triệu người trưởng thành mắc đái tháo đường, tương đương 6% dân số và dự kiến đến năm 2040 sẽ có 6,1 triệu người trưởng thành có thể mắc đái tháo đường. Điều này ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng và sự phát triển kinh tế - xã hội của đất nước. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp hỗ trợ phòng và điều trị bệnh đái tháo đường thông qua việc kiểm soát glucose máu ở cộng đồng là hết sức quan trọng, bao gồm sự kết hợp của nhiều giải pháp, từ giải pháp dinh dưỡng, tăng cường hoạt động thể lực, chế độ ăn uống hợp lý, thay đổi lối sống tới việc sử dụng các sản phẩm hỗ trợ có nguồn gốc từ thực vật, đặc biệt là các thực vật giàu polyphenols đang là xu thế nghiên cứu và triển khai áp dụng hiện nay.
1.1.2. Giải pháp can thiệp hỗ trợ phòng, điều trị đái tháo đường và rối loạn glucose máu
	Các biện pháp chính trong phòng và điều trị đái tháo đường và rối loạn glucose máu là thay đổi lối sống, thực hiện chế độ ăn hợp lý và tăng cường vận động, bên cạnh đó là sử dụng các sản phẩm, thuốc có tác dụng kiểm soát glucose máu. Trong những thập kỷ gần đây, các nghiên cứu về các loài thực vật có khả năng hỗ trợ phòng bệnh đái tháo đường đang ngày càng được quan tâm. Nhiều loại thực vật đã được khuyến cáo sử dụng với mục đích hỗ trợ hoặc bổ sung thay thế thuốc điều trị cho bệnh nhân đái tháo đường, chủ yếu dựa vào các hợp chất polyphenol và flavonoid có sẵn trong thực vật.	
1.2. Khái luận về nhóm hợp chất Polyphenol thực vật
Trên thế giới có khoảng 1200 cây thực vật đã được ghi nhận có tác dụng trên bệnh nhân đái tháo đường. Mỗi cây thực vật có thể chứa một hoặc nhiều hoạt chất khác nhau tác dụng hạn chế tăng glucose máu như: polyphenol, flavonoid, alkanoids, terpenoid, anthocyanins và các hoạt chất khác đã được phân lập từ thực vật. Polyphenol là một hợp chất có trong thực vật tự nhiên mà nó có thể cho màu và mùi vị. Polyphenol cấu thành từ các vòng benzene với vị trí các gốc OH khác nhau chia thành nhiều nhóm khác nhau: non-flavonoid và flavonoid. 
Trong thực vật, flavonoid tồn tại ở 2 dạng: dạng tự do (aglycon) và dạng liên kết với đường (glycoside). Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, flavonoid có vai trò như chất kích thích insulin hay bắt chước chức năng của insulin, ảnh hưởng đến hoạt động của các enzyme trong quá trình chuyển hóa đường. Giúp làm chậm quá trình phân hủy và hấp thụ carbohydrate trong chế độ ăn uống bằng cách hạn chế thủy phân các oligosaccharide mạch thẳng hoặc mạch nhánh như dextrin, maltose và maltotriose để sản xuất glucose, do đó ngăn chặn sự hấp thụ glucose.
Hiện nay, các nhà khoa học Việt Nam tiếp tục nghiên cứu các loại thực vật đã được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian trong phòng chống bệnh đái tháo đường như mướp đắng, giảo cổ lam. Ở các tỉnh phía Nam, cây cỏ sữa lá lớn đã được dân gian sử dụng nhiều trong chữa trị một số bệnh như: lỵ, tiêu khát, đái tháo đường và có hàm lượng polyphenol khá cao. Do đó, việc nghiên cứu nhằm thúc đẩy tiềm năng ứng dụng cây cỏ sữa lá lớn phát triển tự nhiên trong hỗ trợ phòng ngừa và điều trị đái tháo đường là điều cần thiết. Đây là lý do tác giả chọn cỏ sữa lá lớn là nguyên liệu chính để tiến hành nghiên cứu và tính đến việc sản xuất nước uống giàu dinh dưỡng từ cây cỏ sữa lá lớn ở quy mô công nghiệp thành một dạng thực phẩm bảo vệ sức khỏe sau này, góp phần vào đa dạng hoá các sản phẩm đồ uống cũng như sản phẩm hỗ trợ phòng và hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường.
1.3. Cỏ sữa lá lớn
Cỏ sữa lá lớn có tên khoa học là Euphorbia hirta L. thuộc họ thầu dầu (Euphorbiaceae). Cây thảo, sống quanh năm, cao 30-60 cm, rễ cọc, đường kính 3-5 mm. Thân thường ít phân nhánh, phân nhánh từ giữa hoặc phía trên, màu đỏ nhạt, có nhựa mủ trắng và có nhiều lông che chở dài màu vàng nâu. Lá đơn, mọc đối, gốc cuống lá có hai lá kèm nhỏ hình tam giác hay hình lông cứng, kích thước 0,8-1,7 mm, rụng sớm. Cuống lá dài 13,5 mm, phiến lá hình mác-thuôn, elip dài, hoặc hình trứng-mác, kích thước 10-50 x 3-6 mm, thỉnh thoảng có các đốm màu đỏ tía dọc theo gân giữa, cả hai mặt đều có lông dày, gốc phiến lá tròn, hơi lệch. Mép lá nửa dưới toàn bộ hoặc một phần có răng cưa, nửa trên có răng cưa nhỏ hơn, ngọn lá nhọn, hoặc tù. Cụm hoa mọc ở nách lá, có cuống dài 25 mm, tất cả các bộ phận đều nhiều lông, hoa đơn tính. Một cụm hoa bao gồm 4-5 hoa đực, hoa cái có cuống ngắn, bầu cao, nhô ra khỏi tổng bao hình chuông, bầu 3 ngăn, có lông thưa thớt, vòi nhụy chia 2 thùy. 
Trong tài liệu Cây thuốc và động vật làm thuốc có đề cập cây cỏ sữa lá lớn giúp kiểm soát glucose máu trên động vật. Trên thực tế, cây cỏ sữa lá lớn đã được người dân Nam Bộ sử dụng theo phương pháp đông y để dùng chữa bệnh cho bệnh nhân đái tháo đường. Cỏ sữa lá lớn có thể được xem là nguồn nguyên liệu từ thiên nhiên có tiềm năng trong việc hỗ trợ phòng bệnh đái tháo đường, hữu ích cho ngành sản xuất thực phẩm nói chung và đồ uống giàu dinh dưỡng nói riêng.
Cây cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.)
1.4. Khái luận về tách chiết và điều chế cao chiết xuất từ thực vật
Chiết xuất là một quá trình công nghệ liên quan đến việc tách các phần có dược tính từ mô thực vật khỏi các thành phần không có hoạt tính bằng cách sử dụng dung môi. Các sản phẩm thu được thường không tinh khiết, dạng dịch chiết hoặc bán rắn (cao đặc), hoặc bột (cao khô). Đây là bước đầu tiên để tách sản phẩm mong muốn từ nguyên liệu tự nhiên. Phương pháp chiết xuất gồm: chiết dung môi, chưng cất, ép và thăng hoa theo nguyên lý tương ứng. Trong đó, chiết dung môi là phương pháp được sử dụng rộng rãi. Trong công nghiệp, các phương pháp được sử dụng phổ biến gồm: chiết ngâm, chiết ngấm kiệt hay chiết hồi lưu. Các phương pháp còn lại như hỗ trợ vi sóng, siêu âm, enzyme hay chất lỏng siêu tới hạn có giới hạn áp dụng cho những mục đích đặc thù hoặc nhóm hoạt chất dễ bị phân hủy bởi nhiệt. 
Với flavonoid, được cho là khá bền bởi nhiệt và có độ tan tốt trong nước, các phương pháp chiết xuất có thể được sử dụng gồm chiết ngâm, chiết ngấm kiệt, chiết soxhlet hay chiết hồi lưu. Trong cỏ sữa lá lớn, các hợp chất flavonoid, các polyphenolic và tannin đều thuộc nhóm khá phân cực và dễ tan trong nước. Do vậy, có thể sử dụng phương pháp chiết hồi lưu với nước hoặc hệ dung môi cồn nước. Tuy nhiên, chiết hồi lưu với nước thường cho hiệu suất chiết cao, kinh tế hơn và sản phẩm cao chiết thu được dễ dàng đưa vào pha chế đồ uống. 
1.5. Công nghệ sản xuất đồ uống từ thảo dược ứng dụng hỗ trợ phòng và kiểm soát glucose máu.
Xu hướng sử dụng các loại đồ uống có thành phần là các loại nguyên liệu tự nhiên ngày càng tăng, đặc biệt là các loại đồ uống được chiết xuất từ thảo dược, trái cây. Loại đồ uống này vừa có công dụng giải khát, vừa cung cấp cho cơ thể những chất dinh dưỡng và đang là xu hướng chung của thị trường, sẽ dần thay thế các loại đồ uống có gas. Sơ đồ dây chuyền sản xuất đồ uống pha chế từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên hay tổng hợp được chỉ ra ở hình dưới đây. 
Nước
Nguyên liệu, 
hương liệu, phụ gia
Xử lý nước
Phối chế
Lọc
Gia nhiệt
Rót hộp
Ghép nắp
Thanh trùng
Làm mát
Sản phẩm
Siro
Chai/lon
Rửa
Nắp
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu chính
Phần trên mặt đất cây cỏ sữa lá lớn được thu hái tại tỉnh Bình Dương, được phơi khô đến độ ẩm ≤ 11%, cắt thành các đoạn dài 4-6 cm và được bảo quản trong túi nilon, để nơi khô ráo, thoáng mát. Thời gian từ khi thu hái đến khi đưa vào thí nghiệm tối thiểu là 30 ngày. Từ nguyên liệu này, tác giả đã tiến hành điều chế cao cỏ sữa lá lớn. Trong nghiên cứu, tác giả sử dụng một số nguyên liệu khác như: Mật ong; Cao sâm; Chất tạo ngọt; Quế; Gừng; Nước và bao bì dạng lon nhôm.
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ
- Trong nghiên cứu này, các hóa chất chủ yếu được sử dụng gồm: ethanol tuyệt đối, methanol, Quercetin chuẩn, Cơ chất L-aspartat và L-alanin, Cơ chất Blocked p-nitrophenyl maltoheptaoside (BPNPG7), Cơ chất p-nitrophenyl- α-D-glucopyranoside (PNPG), quercitrin; các thuốc thử dùng trong các phản ứng định tính và thuốc thử hiện màu sắc ký (Mayer, Dragendorff, Bouchardat, dd FeCl3 5%, dd gelatin 1%, dd chì acetat 10%, Lugol, Fehling A, Fehling B, vanillin-acid sulfuric)
Dụng cụ: Kít định lượng glucose, HbA1c (Wako Pure Chemicals, Nhật Bản), bơm kim tiêm và các dụng cụ thí nghiệm cơ bản.
2.1.3. Động vật thí nghiệm
Trong nghiên cứu, động vật thí nghiệm được sử dụng là chuột nhắt trắng chủng Swiss albino dùng trong đánh gi ... 
Bảo ôn
Dán nhãn
Đồ uống CSLL
Nguyên liệu phụ
Lon nhôm
Rửa
Nhãn
0
Cặn 
Bao bì phế liệu
Gia nhiệt
(100oC)
3.3.4. Đánh giá chất lượng, an toàn thực phẩm 
Sản phẩm đồ uống dinh dưỡng cỏ sữa lá lớn trong nghiên cứu sản xuất thử nghiệm được kiểm nghiệm các chỉ tiêu chất lượng và các chỉ tiêu an toàn tại các phòng thử nghiệm đạt Tiêu chuẩn quốc gia TCVN ISO/IEC 17025 tại Viện Dinh dưỡng Quốc gia và Công ty TNHH Eurofins Sắc ký Hải Đăng. Sản phẩm đồ uống cỏ sữa lá lớn có hàm lượng flavonoid toàn phần cao (80,3 mg/100ml). Các chỉ tiêu hóa lý và an toàn thực phẩm đều đáp ứng mức giới hạn an toàn theo quy định tại QCVN 6-2:2010/BYT, QCVN 8-1:2011/BYT, QCVN 8-2:2011/BYT và QCVN 8-3:2012/BYT.
3.3.5. Đánh giá khả năng chấp nhận tại cộng đồng 
Có 85,7% người tiêu dùng thích màu của đồ uống cỏ sữa, 89,8% người tiêu dùng thích mùi hương và 87,7% người tiêu dùng thích vị của sản phẩm.
Mức độ
Màu
Mùi
Vị
Chung
%
n
%
n
%
n
%
n
Rất thích
9,2
9
18,4
18
15,3
15
14,3
14
Thích
76,5
75
71,4
70
72,4
71
73,5
72
Chấp nhận
14,3
14
10,2
10
14,3
14
12,2
12
Không thích và rất không thích
0
0
0
0
0
0
0
0
Cộng dồn từ thích đến rất thích
85,7
89,8
87,7
87,8
Như vậy, xét chung các tiêu chí về sự chấp nhận sản phẩm đồ uống cỏ sữa cho thấy không có người tiêu dùng đánh giá không thích sản phẩm, còn lại là chấp nhận sản phẩm với tỷ lệ cộng dồn từ thích đến rất thích là 87,8%.
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
4.1. Đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn
Nghiên cứu của tác giả là nghiên cứu đầu tiên về đặc điểm thực vật, mô tả hình thái của cỏ sữa lá lớn ở khu vực Miền Nam là tỉnh Bình Dương. Theo các tài liệu trên thế giới đã được công bố cho thấy cỏ sữa lá lớn chứa flavonoids nhiều hơn cỏ sữa lá nhỏ cũng như các thực vật cùng loài khác. Nhằm tìm hiểu và bổ sung thêm các thông tin khoa học về cây cỏ sữa lá lớn, tác giả đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.)” để tìm hiểu chi tiết, hệ thống về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của cỏ sữa lá lớn.Tại Việt Nam, chưa có nhiều các nghiên cứu về cây cỏ sữa lá lớn, chỉ có một vài nghiên cứu phản ánh từng góc độ nhỏ lẻ, chưa toàn diện của cây như đặc điểm hiển vi, thành phần hóa học. Nghiên cứu này của chúng tôi đã mô tả cỏ sữa lá lớn một cách hệ thống, toàn diện.
4.1.1. Đặc điểm thực vật
	Nghiên cứu của Nguyễn Thu Hằng so sánh về mặt vi phẫu giữa cỏ sữa lá lớn và cỏ sữa lá nhỏ cho phép phân biệt sự khác nhau rõ ràng giữa cỏ sữa lá lớn và cỏ sữa lá nhỏ dựa trên các đặc điểm vi phẫu và bột dược liệu. Tuy nhiên, nghiên cứu này không đề cập đến thành phần hóa học, cũng như định danh khoa học của hai loài cỏ sữa này. Bên cạnh việc xác định hình ảnh vi phẫu cho kết quả tương tự như nghiên cứu của Nguyễn Thu Hằng, tác giả còn xác định được tên khoa học của cỏ sữa lá lớn, thành phần hóa học của loài cây phát triển tự nhiên tại Bình Dương.	
4.1.2. Thành phần hóa học
	Tác giả đã tiến hành chiết xuất phân đoạn dịch chiết n-hexan, chloroform, ethyl acetat, định tính dịch chiết bằng bằng sắc ký lớp mỏng đã khẳng định quercitrin là một flavonoid chính trong cây. Đây là cơ sở khoa học để lựa chọn quercitrin làm chất chuẩn để định tính bằng sắc ký lớp mỏng và định lượng flavonoid toàn phần. Các kết quả nghiên cứu của tác giả không chỉ bổ sung thêm các thông tin khoa học cơ bản, quan trọng về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn phát triển tự nhiên ở Việt Nam mà còn mở ra hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. 
4.2. Điều chế cao cỏ sữa lá lớn, đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chế phẩm trong kiểm soát glucose máu 
4.2.1. Điều chế cao cỏ sữa lá lớn
Tác giả đã nghiên cứu các điều kiện chiết xuất để tìm được điều kiện phù hợp điều chế cao cỏ sữa lá lớn đạt hiệu suất cao, giảm giá thành, quá trình thao tác thuận tiện, an toàn, đầy đủ thông số kỹ thuật, quy trình ổn định. Để sản phẩm giữ được các thành phần hoạt tính sinh học trong quá trình sản xuất, việc tối ưu hóa quy trình điều chế cao là khâu then chốt. Trong nghiên cứu này, tác giả đã lựa chọn các thông số kỹ thuật thích hợp để tối ưu hóa quy trình điều chế cao như nhiệt độ chiết, thời gian chiết, tỷ lệ dung môi/dược liệu, số lần chiết. Điều này phù hợp với các nghiên cứu của nhiều tác giả ở Việt Nam đã sản xuất ra các sản phẩm ứng dụng trong bảo vệ và nâng cao sức khỏe, được tiêu thụ rộng rãi trên thị trường. Các nghiên cứu đã chỉ ra flavonoid là nhóm hoạt chất có tác dụng trong cây cỏ sữa lá lớn, khi chiết bằng nước nóng có thể chiết flavonoid với hàm lượng khá cao. Trong nghiên cứu này, tác giả đã sử dụng dung môi nước trong chiết xuất hoạt chất ra khỏi cỏ sữa lá lớn. Đây cũng là dung môi thân thiện với môi trường, an toàn, đầu tư thiết bị đơn giản phù hợp với hầu hết các đơn vị sản xuất tại Việt Nam, đặc biệt là giá thành sản xuất hợp lý. 
Quy trình chiết xuất cỏ sữa lá lớn xây dựng được ở quy mô nhỏ lặp lại và ổn định ở quy mô 1 kg/mẻ, cụ thể: hiệu suất chiết và hàm lượng flavonoid thu được ở qui mô 1 kg/mẻ đều đạt tương tự như ở qui mô nhỏ 10g/mẻ. Do vậy có triển vọng lớn khi áp dụng ở quy mô lớn hơn. Như vậy, sau khi khảo sát các yếu tố có ảnh hưởng đến hiệu suất, hàm lượng hợp chất flavonoid toàn phần, sự thuận tiện trong thao tác, hướng tới sản phẩm có giá thành hạ, quy trình ổn định và thân thiện với môi trường, tác giả đã xây dựng được quy trình điều chế cao cỏ sữa lá lớn ổn định với hiệu suất đạt trung bình là 21,8% so với nguyên liệu đầu vào, hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo quercitrin ổn định và đạt trung bình 22,4 mg/g.
4.2.2. Đánh giá tính an toàn của cao cỏ sữa lá lớn
4.2.2.1. Đánh giá độc tính cấp
	Tác giả đã xác định liều được liều LD0 là 16,54 g/kg, LD100 là 40,35 g/kg, liều LD50 là 28,6 g cao/kg. Ali Esmail Al-Snafi nghiên cứu trên chuột thực nghiệm để xác định tính an toàn của cỏ sữa lá lớn bằng việc cho chuột uống dịch chiết với các liều tương ứng 1, 10 and 50 mg/kg trong 50 ngày so với nhóm chứng.
4.2.2.2. Đánh giá độc tính bán trường diễn 
	Ưu điểm của nổi trội của nghiên cứu này là được làm trên chuột thực nghiệm tại Viện Dược liệu, Bộ Y tế, là cơ sở nghiên cứu có uy tín, đội ngũ nhà khoa học nhiều kinh nghiệm trong nghiên cứu, đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn trên mô hình động vật thực nghiệm đối với các diệu liệu của Việt Nam. Nghiên cứu được thực hiện theo đúng quy trình và các chỉ tiêu được theo dõi một cách chặt chẽ.
	Với phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn, kết quả nghiên cứu cho thấy, cao cỏ sữa lá lớn không ảnh hưởng đến tình trạng chung của chuột cống trắng, không ảnh hưởng đến các chỉ số huyết học như số lượng bạch cầu, hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng tiểu cầu, lympho bào; không ảnh hường đến các thông số hóa sinh máu như hoạt độ AST, ALT, creatinin, protein toàn phần, urê, bilirubin, glucose; không ảnh hưởng đến cấu trúc đại thể, vi thể cũng như tỷ khối gan, thận, lách, tim so với khối lượng cơ thể chuột. Từ nghiên cứu tính an toàn và hiệu quả trên mô hình động vật thực nghiệm là cơ sở để phát triển sản phẩm ứng dụng trong tương lai.
4.2.3. Đánh giá tính hiệu quả của cao cỏ sữa lá lớn trong kiểm soát glucose máu
4.2.3.1. Khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của flavonoid
Sự ức chế enzyme thủy phân carbohydrate như α-amylase và α-glucosidase được biết đến như là quá trình làm trì hoãn sự tiêu hóa và sự hấp thụ carbohydrate từ hệ thống ruột non. Bởi có sự ức chế các enzyme này nên việc hấp thu glucose vào máu là thấp nhất. Khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của mẫu khảo sát được đánh giá thông qua giá trị IC50. IC50 được định nghĩa là nồng độ (µg/mL) của mẫu thử khảo sát có thể ức chế 50% hoạt tính của enzyme, mẫu có hoạt tính ức chế càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. Trong nghiên cứu này, dựa trên đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ mẫu thử và hoạt tính ức chế, giá trị IC50 được xác định lần lượt là 967 µg/mL (α-amylase), 53,96 µg/mL (α-glucosidase). Như vậy, kết quả nghiên cứu này phù hợp với các tài liệu tham khảo và phù hợp với các giả thuyết đặt ra. Trên cơ sở đó, tiến hành các nghiên cứu in vivo tiếp theo để khẳng định tác dụng giảm đường huyết của cao cỏ sữa lá lớn.
4.2.3.2. Hiệu quả kiểm soát glucose máu trên mô hình động vật thực nghiệm 
	Theo một số công trình nghiên cứu trên thế giới, liều dùng của cao chiết cồn cỏ sữa lá lớn dao động trong khoảng 100-800 mg cao/kg thể trọng chuột cống trắng. Hơn thế nữa, theo y học cổ truyền cỏ sữa lá lớn được dùng với liều 4-6 g dược liệu/ người/ngày, do vậy tác giả sử dụng cao chiết liều 250 mg/kg và cao chiết liều 500 mg/kg để thử tác dụng hạ glucose máu. Trong nghiên cứu này, sau khi điều trị 8 tuần liên tục bằng cao chiết cỏ sữa lá lớn với liều 500 mg/kg thể trọng, nồng độ glucose máu giảm đáng kể so với nhóm chứng bệnh lý với p < 0,05. Như vậy, cao chiết cỏ sữa lá lớn với liều 500 mg/kg thể trọng chuột nhắt trắng có tác dụng điều trị đái tháo đường trên mô hình động vật thực nghiệm thông qua tiêu chí làm giảm nồng độ glucose máu. 
4.3. Ứng dụng cao cỏ sữa lá lớn để thử nghiệm sản xuất thực phẩm dinh dưỡng trong kiểm soát glucose máu
	Lần đầu tiên, tác giả đã xây dựng thành công quy trình chiết xuất được dịch chiết ổn định từ bộ phận từ mặt đất trở lên của cây cỏ sữa lá lớn từ các công nghệ hiện đại thích hợp, các hóa chất thích hợp, thời gian chiết thích hợp. Tử đó, đã xây dựng công thức, tiến hành chọn lựa và đã sản xuất thành công nước uống dinh dưỡng kiểm soát glucose máu. Quá trình tiến hành từ thu hái nguyên liệu, làm sạch tạp chất và phơi khô, tách chiết để thu được cao cỏ sữa được tiến hành đúng nguyên tắc chiết tách dược liệu giúp đảm bảo hiệu suất và chất lượng của cao chiết. Cao chiết cỏ sữa lá lớn phối hợp với một số nguyên liệu để tạo ra sản phẩm nước đồ uống dinh dưỡng cỏ sữa lá lớn. 
	Nghiên cứu này đã đưa ra được quy trình sản xuất thử nghiệm đồ uống từ cao cỏ sữa lá lớn với công thức phù hợp. Kiểm tra chất lượng sản phẩm sau sản xuất thử nghiệm cho thấy, sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng về các chỉ tiêu hóa lý, vi sinh (đạt QCVN 6-2:2010/BYT) với hàm lượng flavonoid toàn phần là 506,7 mg/L nằm trong giới hạn cho phép và kỳ vọng của nghiên cứu. Sản phẩm đồ uống dinh dưỡng cỏ sữa lá lớn được đánh giá chấp nhận cộng đồng trên 98 đối tượng là người trưởng thành có độ tuổi từ 24 đến 65 tuổi, có 85,7% người thử thích màu nước cỏ sữa, 89,8% thích mùi hương và 87,7% thích vị của sản phẩm (Tỷ lệ cộng dồn từ người thích đến rất thích là 87,8%). Một nghiên cứu của tác giả trong nước cho thấy, việc bệnh nhân rối loạn đường huyết tiêu thụ 30 g trà cỏ sữa/ngày tương ứng 972mg flavonoid/ngày có hiệu quả kiểm soát glucose máu và giảm nồng độ HbA1c sau 12 tuần can thiệp. Dựa vào hàm lượng flavonoid toàn phần trong đồ uống dinh dưỡng cỏ sữa lá lớn trong nghiên cứu này, ước tính lượng đồ uống dinh dưỡng cỏ sữa lá lớn cần tiêu thụ là 1,21 (lít/ngày).
KẾT LUẬN
Đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn tại Bình Dương
 Về đặc điểm thực vật: Cỏ sữa lá lớn tại Bình Dương đã được nghiên cứu và xác định có tên khoa học là Euphorbia hirta L., họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Cây cao từ 20-50 cm, rễ cọc, màu vàng nâu, lá đơn, mọc đối.
 Về thành phần hóa học: Phần trên mặt đất cỏ sữa lá lớn có chứa: flavonoid, saponin, tanin, alcaloid, đường khử, polysaccharid, sterol. Nhóm flavonoid trong cỏ sữa lá lớn chứa chủ yếu là quercitrin. Hàm lượng flavonoid toàn phần trong phần trên mặt đất cỏ sữa lá lớn tính theo quercitrin là 0,375 ± 0,014 % trong dược liệu khô tuyệt đối.
2. Điều chế cao cỏ sữa lá lớn, đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chế phẩm trong kiểm soát glucose máu
2.1. Điều chế cao cỏ sữa lá lớn: Điều kiện thích hợp cho điều chế cao chiết cỏ sữa lá lớn là: Kích thước nguyên liệu 2-3cm; chiết xuất 3 lần với tỷ lệ dược liệu/dung môi 10/8/8 trong thời gian chiết xuất tương ứng 2,5h/2h/1,5h ở nhiệt độ chiết 950C, sau đó cô trên bếp cách thủy ở 700C. Hàm lượng flavonoid toàn phần đạt 20-21 mg/g cao khô (độ ẩm ≤ 5%).
2.2. Đánh giá tính an toàn của cao cỏ sữa lá lớn: Cao cỏ sữa lá lớn đã được xác định đảm bảo an toàn trên động vật thực nghiệm với LD50 là 26,8 g cao/kg thể trọng chuột nhắt trắng và sử dụng liều 0,3 g cao/kg và 3,0 g cao/kg bằng đường uống trong 30 ngày trên chuột cống trắng đã cho thấy không ảnh hưởng đến tình trạng toàn thân, sự phát triển khối lượng cơ thể, chức năng tạo máu, chức năng gan, thận, đại thể cơ quan và mô bệnh học. 
2.3. Đã đánh giá được hiệu quả của cao cỏ sữa lá lớn trong kiểm soát glucose máu
Khả năng ức chế hoạt động của enzyme α-amylase và α-glucosidase với giá trị IC50 tương ứng được xác định là 967 µg/mL và 53,96 µg/mL.
Sử dụng cao chiết cỏ sữa lá lớn liều 500 mg/kg thể trọng trong 8 tuần có tác dụng hỗ trợ giảm glucose máu trên chuột đái tháo đường thực nghiệm: nồng độ glucose máu ở nhóm chuột can thiệp thấp hơn đáng kể so với ở nhóm chuột đái tháo đường chứng (10,2 ± 1,3 mmol/L so với 14,3 ± 1,5 mmol/L, p<0,05).
3. Đã ứng dụng cao cỏ sữa lá lớn để sản xuất đồ uống dinh dưỡng dùng trong kiểm soát glucose máu: Quy trình sản xuất thử nghiệm đồ uống dinh dưỡng từ cao chiết cỏ sữa lá lớn đã được xây dựng: Công thức (cao Cỏ sữa lá lớn 25 g/L, mật ong 25 g/L; chất tạo ngọt 0,3 g/L; gừng 10 g/L); Đóng lon 200ml; Thanh trùng ở điều kiện 900C trong 10 phút đã tạo ra sản phẩm có hàm lượng flavonoid toàn phần là 80,3 mg/100ml, đạt chất lượng về mặt dinh dưỡng, cảm quan và đảm bảo yêu cầu theo QCVN 6-2:2010/BYT. Sản phẩm được đánh giá cao bởi người tiêu dùng (85,7% thích màu, 89,8% thích mùi hương và 87,7% thích vị). 
KHUYẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng và thử nghiệm trên cộng đồng về hiệu quả kiểm soát glucose máu, chống oxy hóa của đồ uống cỏ sữa lá lớn trong hỗ trợ phòng và điều trị bệnh đái tháo đường.
Tiếp tục hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất đồ uống cỏ sữa lá lớn và ứng dụng ở qui mô công nghiệp.
Đề nghị các cơ quan nghiên cứu và quản lý nhà nước quan tâm trong việc phát triển vùng trồng cây cỏ sữa lá lớn, nâng cao chất lượng nguồn thảo dược này ứng dụng trong chăm sóc và nâng cao sức khỏe của nhân dân.
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
Nguyễn Mạnh Thắng, Nguyễn Công Khẩn, Trương Tuyết Mai, Nguyễn Thu Hằng, Nguyễn Thị Thúy Quỳnh (2018). Nghiên cứu đặc điểm của cây cỏ sữa lá lớn tại tỉnh Bình Dương. Tạp chí Dược học. Số 511, tr. 77-81.
Nguyễn Mạnh Thắng, Nguyễn Công Khẩn, Trương Tuyết Mai, Trương Hoàng Kiên, Phạm Thị Nguyệt Hằng (2017). Nghiên cứu tác dụng chống đái tháo đường thực nghiệm và tính an toàn của cao chiết nước cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.). Tạp chí Dược học. Số 497, tr. 51-53.
Nguyễn Mạnh Thắng, Nguyễn Công Khẩn, Trương Tuyết Mai, Hoàng Liên Hương, Nguyễn Đức Hạnh (2019). Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất nước giải khát cỏ sữa từ cao chiết cỏ sữa lá lớn. Tạp chí Dinh dưỡng và An toàn thực phẩm. Số 15(4), tr. 73-82.