Luận án Nghiên cứu đột biến gen CDH1 (e - Cadherin) trên bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI 
NGUYỄN THỊ THANH HƢƠNG 
 NGHIªN CøU §éT BIÕN GEN CDH1 (E - cadherin) 
TR£N BÖNH NH¢N UNG TH¦ D¹ DµY LAN TáA DI TRUYÒN 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC 
HÀ NỘI – 2020 
 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI 
----***---- 
NGUYỄN THỊ THANH HƢƠNG 
NGHIªN CøU §éT BIÕN GEN CDH1 (E - cadherin) 
TR£N BÖNH NH¢N UNG TH¦ D¹ DµY LAN TáA DI TRUYÒN 
Chuyên ngành : Hóa sinh y học 
Mã số : 62720112 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC 
Người hướng dẫn khoa học: 
 PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung 
HÀ NỘI - 2020 
 LỜI CẢM ƠN 
Trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án này tôi đã nhận được 
rất nhiều sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của các cơ quan, đơn vị, Thầy cô, đồng 
nghiệp, bạn bè, bệnh nhân và gia đình thân yêu của mình. 
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cô PGS. 
TS Đặng Thị Ngọc Dung, người thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho 
tôi những kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô cùng quý báu, là 
người luôn giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá 
trình thực hiện luận án. 
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: 
- Ban Giám hiệu, phòng Quản lý và Đào tạo Sau đại học – Trường Đại 
học Y Hà Nội, Ban Giám đốc BV Phụ sản TW đã tạo điều kiện, giúp đỡ để tôi 
học tập và hoàn thành luận án. 
- GS. TS Tạ Thành Văn, Hiệu trưởng, Trưởng bộ môn Hóa sinh – 
Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và 
thực hiện luận án. 
- TS Nguyễn Thúy Hương, Bộ môn Giải phẫu bệnh – Trường Đại học Y 
Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận án. 
- Tập thể cán bộ nhân viên khoa Sinh hóa – BV Phụ sản TW đã chia sẻ, 
động viên và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình công tác và học tập. 
- Tập thể cán bộ nhân viên Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng – Xét 
nghiệm Y học, các thầy cô bộ môn Hóa sinh trường Đại học Y Hà Nội đã giúp 
đỡ tôi trong suốt quá trình làm nghiên cứu. 
- Các em học viên bác sĩ nội trú Hóa sinh: Trần Đức Anh, Ngô Diệu 
Hoa, Đặng Thị Nga, Lê Thị Yến, Hàn Thị Thanh Thủy đã giúp đỡ, đồng hành 
với tôi trong quá trình nghiên cứu. 
 - Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến các bệnh nhân cùng gia đình họ đã tin 
tưởng, giúp đỡ và hợp tác với tôi trong quá trình làm nghiên cứu để tôi có thể 
hoàn thành luận án. 
- Xin cảm ơn các bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong quá trình học 
tập, công tác và nghiên cứu. 
- Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, tình cảm yêu quý đến bố mẹ 
tôi, bố mẹ chồng, anh chị em trong gia đình đã luôn yêu thương, động viên và 
chia sẽ với tôi trong thời gian qua. Cảm ơn chồng và 2 con yêu quý, những 
người đã hi sinh rất nhiều cho sự nghiệp của tôi, là chỗ dựa vững chắc và 
cũng là động lực vô cùng to lớn để tôi hoàn thành nhiệm vụ. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2020 
Nguyễn Thị Thanh Hƣơng 
 LỜI CAM ĐOAN 
Tôi là Nguyễn Thị Thanh Hương, nghiên cứu sinh khóa 35, Trường Đại 
học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh Y học, xin cam đoan: 
1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của 
cô PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung. 
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được 
công bố tại Việt Nam. 
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực 
và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu. 
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2020 
Ngƣời viết cam đoan 
 Nguyễn Thị Thanh Hƣơng 
 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 
Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt 
AJCC 
APC 
CDH1 
EC 
EGFR 
EMT 
GAPPS 
GSK-3 
GTT 
HMMD 
H.Pylori 
IGCLC 
MLPA 
NST 
Nu 
PCR 
SHPT 
SIFT 
SNP 
TNM 
UICC 
UTBM 
UTDD 
WHO 
American joint committee on cancer 
Adenomatous polyposis coli 
Cadherin-1 
Extracellular Cadherin 
Epidermal growth factor receptor 
Epithelial – mesenchymal transitions 
Glycogen synthase kinase 3 
International Gastric Cancer Linkage 
Consortium 
Multiplex ligation-dependent probe 
amplification 
Nucleotide 
Polymerase Chain Reaction 
Sorting Intolerant from Tolerant 
Single Nucleotide Polymorphisms 
Tumor – Nodes – Metastasis 
Union for international cancer 
control 
World Health Organization 
Ủy ban ung thư Hoa Kỳ 
Tiểu phần ngoại bào 
Thụ thể yếu tố tăng trưởng 
biểu bì 
Chuyển đổi biểu mô-trung mô 
Ung thư tuyến dạ dày và hội 
chứng polyp đại tràng dạ dày 
Giải trình tự 
Hóa mô miễn dịch 
Vi khuẩn Helicobacter Pylori 
Hiệp hội liên kết ung thư dạ 
dày thế giới 
Nhiễm sắc thể 
Phản ứng chuỗi polymerase 
Sinh học phân tử 
Thuật toán sắp xếp không 
dung nạp từ dung nạp sai 
Đa hình đơn nucleotide 
Khối u nguyên phát - Hạch 
bạch huyết - Di căn 
Hiệp hội kiểm soát ung thư 
quốc tế 
Ung thư biểu mô 
Ung thư dạ dày 
Tổ chức y tế thế giới 
 MỤC LỤC 
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 3 
1.1. Ung thư dạ dày lan tỏa di truyền ............................................................ 3 
1.1.1. Lịch sử phát hiện và dịch tễ học ..................................................... 3 
1.1.2. Các yếu tố nguy cơ .......................................................................... 4 
1.1.3. Đặc điểm lâm sàng ........................................................................ 12 
1.1.4. Giải phẫu bệnh .............................................................................. 13 
1.1.5. Chẩn đoán ung thư dạ dày lan tỏa di truyền ................................. 17 
1.1.6. Chẩn đoán giai đoạn ung thư dạ dày ............................................. 18 
1.1.7. Điều trị và tiên lượng .................................................................... 20 
1.2. Vai trò của gen CDH1 trong ung thư dạ dày lan tỏa di truyền ............ 22 
1.2.1. Cấu trúc và chức năng của gen CDH1 .......................................... 22 
1.2.2. Cơ chế gây bệnh của gen CDH1 trong ung thư dạ dày lan tỏa di truyền .. 25 
1.2.3. Đặc điểm di truyền của ung thư dạ dày lan tỏa di truyền ............. 28 
1.2.4. Tình hình nghiên cứu về ung thư dạ dày lan tỏa di truyền và đột 
biến gen CDH1 ở trên thế giới và Việt Nam. ............................... 30 
1.2.5. Quản lý bệnh ung thư dạ dày lan tỏa di truyền do đột biến gen CDH1 ... 32 
1.3. Các phương pháp phát hiện đột biến gen CDH1 ................................. 36 
1.3.1. Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR .............................................. 37 
1.3.2. Kỹ thuật giải trình tự gen theo phương pháp Sanger .................... 37 
1.3.3. Dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến gen CDH1 bằng phần 
mềm phân tích tin sinh học ........................................................... 38 
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 40 
2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 40 
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu........................................................ 41 
 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 41 
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: ..................................................................... 41 
2.3.2. Cỡ mẫu nghiên cứu ....................................................................... 41 
2.3.3. Phương pháp thu thập mẫu ........................................................... 42 
2.3.4. Các biến số nghiên cứu ................................................................. 43 
2.3.5. Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................... 45 
2.3.6. Phương tiện nghiên cứu ................................................................ 46 
2.3.7. Quy trình kỹ thuật phân tích đột biến gen CDH1 ......................... 48 
2.3.8. Thử nghiệm Clo-Test trong chẩn đoán nhiễm H. Pylori .............. 51 
2.3.9. Quy trình kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch ............................... 52 
2.4. Xử lý và phân tích số liệu .................................................................... 53 
2.5. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu ........................................................ 53 
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 55 
3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu ......................................... 55 
3.1.1. Đặc điểm về tuổi, giới, tiền sử bệnh và yếu tố nguy cơ ............... 55 
3.1.2. Đặc điểm lâm sàng ........................................................................ 58 
3.1.3. Đặc điểm tổn thương dạ dày qua nội soi ...................................... 60 
3.1.4. Phân loại giai đoạn bệnh theo TNM ............................................. 61 
3.2. Kết quả phân tích gen CDH1 của đối tượng nghiên cứu ..................... 61 
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA và phản ứng PCR khuếch đại các exon 
của gen CDH1 ............................................................................... 61 
3.2.2. Kết quả phát hiện đột biến và SNP của gen CDH1 ...................... 62 
3.2.3. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của đối tượng nghiên cứu 
mang đột biến và SNP trên gen CDH1 ......................................... 72 
 3.3. Xác định đột biến gen CDH1 ở các thành viên trong gia đình bệnh 
nhân mang đột biến gen CDH1. ............................................................. 79 
3.3.1. Phả hệ và kết quả phát hiện đột biến gen CDH1 ở các thành viên 
trong gia đình. ............................................................................... 79 
3.3.2. Đặc điểm về phả hệ và các thành viên gia đình mang đột biến 
gen CDH1. .................................................................................... 87 
Chƣơng 4: BÀN LUẬN ................................................................................. 91 
4.1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu ................................................ 91 
4.2. Đột biến gen CDH1 trên bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền. ............... 101 
4.3. Đột biến gen CDH1 ở các thành viên trong gia đình bệnh nhân mang 
đột biến gen CDH1. .............................................................................. 120 
KẾT LUẬN .................................................................................................. 134 
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN 
ĐẾN LUẬN ÁN 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
PHỤ LỤC 
 DANH MỤC BẢNG 
Bảng 1.1. Phân loại mô bệnh học ung thư biểu mô dạ dày của Tổ chức Y tế 
Thế giới năm 2010 và so sánh với phân loại Lauren . ............. 15 
Bảng 1.2. Phân loại TNM trong ung thư dạ dày theo AJCC 8th 2017 ........ 19 
Bảng 1.3. Phân loại giai đoạn bệnh UTDD theo TNM ............................... 20 
Bảng 1.4. Ý nghĩa của các phương pháp đánh giá đột biến gen CDH1 ...... 37 
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR.......................................................... 49 
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR ................................................. 49 
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự ............................... 50 
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR cho giải trình tự ......................... 50 
Bảng 2.5. Quy trình xử lý tiêu bản hóa mô miễn dịch ................................. 52 
Bảng 3.1. Phân loại đối tượng nghiên cứu theo tiêu chuẩn IGCLC 2015 ... 55 
Bảng 3.2. Phân bố tuổi và giới của bệnh nhân tham gia nghiên cứu ........... 56 
Bảng 3.3. Mối liên quan giữa tuổi phát hiện bệnh với giới tính .................. 56 
Bảng 3.4. Tiền sử cá nhân, gia đình và một số yếu tố nguy cơ ................... 57 
Bảng 3.5. Lý do vào viện của đối tượng nghiên cứu ................................... 58 
Bảng 3.6. Thời gian xuất hiện triệu chứng đầu tiên đến khi vào viện ......... 59 
Bảng 3.7. Đặc điểm tổn thương dạ dày qua nội soi ..................................... 60 
Bảng 3.8. Phân loại giai đoạn bệnh theo TNM ............................................ 61 
Bảng 3.9. Các SNP được tìm thấy trong nghiên cứu ................................... 63 
Bảng 3.10. Đột biến và SNP của gen CDH1 tìm được ở 4 bệnh nhân UTDD 
lan tỏa di truyền ........................................................................ 64 
Bảng 3.11. Dự đoán khả năng gây bệnh của các đột biến sai nghĩa .............. 70 
Bảng 3.12. Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến gen CDH1 .... 73 
Bảng 3.13. Đặc điểm nội soi và mô bệnh học của bệnh nhân mang đột biến 74 
Bảng 3.14. Phân bố SNP trên các bệnh nhân tham gia nghiên cứu ............... 77 
 Bảng 3.15. Đặc điểm lâm sàng và một số yếu tố nguy cơ ............................. 77 
Bảng 3.16. Đặc điểm của phả hệ mang đột biến gen trong nghiên cứu ........ 87 
Bảng 3.17. Tỷ lệ mang đột biến gen CDH1 trong phả hệ gia đình ............... 88 
Bảng 3.18. Đặc điểm nội soi và mô bệnh học của các thành viên gia đình 
mang đột biến gen CDH1 ......................................................... 89 
 DANH MỤC HÌNH 
Hình 1.1. (A) Ung thư biểu mô tế bào nhẫn tại chỗ: tuyến với màng nền còn 
nguyên vẹn được lót bởi các tế bào hình nhẫn. (B) Sự xâm nhập 
của các tế bào hình nhẫn bên dưới biểu mô (đầu mũi tên). (C) Ung 
thư biểu mô tế bào nhẫn xâm lấn giai đoạn T1a .......................... 16 
Hình 1.2. Hình ảnh gen CDH1 nằm trên nhánh dài NST 16, gồm 16 exon mã 
hóa cho các vùng protein tương ứng ........................................... 23 
Hình 1.3. Vị trí của E-cadherin và vai trò trong kết dính tế bào ............... 24 
Hình 1.4. Các con đường sinh ung thư liên quan đến E-cadherin ............ 25 
Hình 1.5. Phức hợp cadherin-catenin và protein APC. ............................. 26 
Hình 1.6. Con đường Rho-GTPase ........................................................... 27 
Hình 1.7. Sơ đồ phả hệ .............................................................................. 29 
Hình 1.8. Vị trí và phân loại các dạng đột biến gen CDH1 trong UTDD lan 
tỏa di truyền đã được công bố ................................................... 30 
Hình 3.1. Kết quả PCR exon 9 (A) và exon 13 (B) của gen CDH1, (-): 
chứng âm, (+): chứng dương, M: ladder thang chuẩn 100 bp... 62 
Hình 3.2. Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến. .......................... 65 
Hình 3.3. Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến. .......................... 66 
Hình 3.4. Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến ........................... 67 
Hình 3.5. Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến. .......................... 68 
Hình 3.6. Phân bố đột biến và SNP trên gen CDH1 ................................. 69 
Hình 3.7. Hình ảnh minh họa sử dụng công cụ Polyphen 2 trong dự đoán 
khả năng gây bệnh của đột biến sai nghĩa. ................................ 71 
Hình 3.8. Hình ảnh minh họa sử dụng công cụ Mutation Taster xác định 
khả năng gây bệnh của đột biến ................... ... áu 
Vàng da, vàng mắt 
 Bụng chướng 
Ấn thượng vị đau 
Hạch thượng đòn 
Thời gian xuất hiện triệu chứng 
< 6 tháng 
6 – 12 tháng 
>12 tháng 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
9 
1 
2 
3 
L HÌNH ẢNH NỘI SOI DẠ DÀY: Ngày nội soi: . 
L1 Hình ảnh nội soi của bệnh nhân? 
Bình thường 
Có tổn thương 
1 M1 
2 
L2 
Vị trí tổn thương? 
Tâm vị 
 Hang - môn vị 
Thân vị 
Khác 
1
2 
3 
4 
L3 Kích thước tổn thương? 
<1cm 
 1 – 2cm 
 2,1 – 3cm 
>3cm 
Khác 
1 
2 
3 
4 
L4 Các loại tổn thương 
Loét 
Sùi 
Thâm nhiễm 
Loét thâm nhiễm 
Khác 
1 
2 
3 
4 
M KẾT QUẢ MÔ BỆNH HỌC 
 Mã tiêu bản.. 
Bác sĩ đọc 
Nơi đọc 
M1 Phân loại theo Lauren? 
Thể ruột 
Thể lan tỏa 
1 
2 
M2 Phân loại theo WHO? 
 Ung thư biểu mô tuyến thể nhú 
 Ung thư biểu mô tuyến thể ống nhỏ 
 Ung thư biểu mô tuyến thể nhầy 
 Ung thư biểu mô tế bào nhẫn 
 Ung thư biểu mô tuyến vảy 
 Ung thư biểu mô tế bào vảy 
 Ung thư biểu mô thể tế bào nhỏ 
 Ung thư biểu mô thể không biệt hóa 
 Các ung thư biểu mô khác ) 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
. 
M3 Mức độ biệt hóa? 
Cao 
Vừa 
Kém 
1 
2 
3 
M4 Kết luận: K dạ dày thể  
 Có tính chất gia đình 
 Không có tính chất gia đình 
Giai đoạn bệnh theo TNM: 
1 
2
 Kết quả cận lâm sàng: 
Xét nghiệm Kết quả (vào viện) 
Test HP 
Nhóm máu 
Kết quả chẩn đoán hình ảnh: 
1. Siêu âm: 
2. Cắt lớp: 
3. Khác: 
Kết quả giải trình tự gen: 
PHỤ LỤC 3 
TRÌNH TỰ MỒI CỦA GEN CDH1 
Exon Kích thƣớc 
Exon 
Kích thƣớc sản 
phẩm PCR 
Tm 
(
o 
C) 
Trình tự (5’ – 3’) 
E1 171 287 58 F: CAGGTGAACCCTCAGCCAATC 
R: AATGCGTCCCTCGCAAGT 
E2 114 242 59 F:CACTCTTTACATGGTGGTGATG 
R:CAGAGAACTCCTATCTTGGGCA 
E3 223 358 57 F: GTCTTCCCACAAGTTCGCTC 
R: AGCGCACTAAAACAACAGCG 
E4I4E5 143 – 155 645 61 F: GACGCTGTCTGGCTAGGTTG 
R: GCAACAGGTCAAGAGGTGTC 
E6 144 476 55 F: AGAGTTTTTCAGGCCCGCATCT 
R:TTACACAACCTTTGGGCTTGGA 
E7 175 307 62 F: GCAGTATTGACCCAGTCCCAA 
R: CTTTGTCCACGGGATTGAGC 
I7E8 128 736 61 F: CCATCGCTTACACCATCCTC 
R: CAACTTCACAATCTTGCACC 
E9 182 302 57 F: AATCCTTTAGCCCCCTGAGA 
R: AGGGGACAAGGGTATGAACA 
E10 244 502 57 F: CCCTAGAATAGCCCCAGCTTT 
R:GCTGCAAGTCAGTTGAAAAATC 
E11 145 287 53 F: AGCGCTTAAGCCGTTTTCA 
R: AGGGAGGGGCAAGGAACT 
E12 224 687 53 F: GGAAACAACAGGCAGGCAATA 
R: CAATGGAAGGGGTGACATCTA 
E13 227 664 55 F: TACCGAACCCAGCGACATC 
R: GGCTGGCATAACTTGGGAGT 
E14 130 523 57 F: CCGACTTCAGGGATGTGAGTG 
R: GCTCAGGCAAGCTGAAAACAT 
E15 143 662 55 F: TCACACAACAAAGCCCCAGAT 
R: GCTCAGGCAAGCTGAAAACAT 
E16-1 840 57 F: TGGTTGGTGCTTGCATCTCTC 
R: GTAGCTGACTTCTCCCCTTCTT 
NGUYÊN TẮC TRONG THIẾT KẾ MỒI 
1. Chiều dài của mồi: mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại PCR và cho 
phản ứng giải trình tự từ 18-24bp, đủ để gắn đặc hiệu và gắn vào với khuôn ở 
nhiệt độ gắn mồi. 
2. Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm): tối ưu trong khoảng 52-58
o
C, Tm > 
65
oC thường dễ xảy ra các sản phẩm phụ thứ cấp. 
 Tm nên được tính toán cẩn trọng, nếu Tm giữa hai mồi chênh nhau quá 5
o
C 
phản ứng khuếch đại rất khó xảy ra. 
3. Nhiệt độ gắn mồi (Ta) quyết định tính đặc hiệu quan trọng của phản ứng 
khuếch đại PCR. Ta quá cao dẫn đến việc gắn không hiệu quả giữa mồi và DNA 
gốc dẫn tới hiệu suất sản phẩm PCR thấp. Ta quá thấp có thể dẫn tới việc gắn 
không đặc hiệu gây ra bởi việc bắt cặp nhầm với sản phẩm phụ khác. 
4. Tỉ lệ G, C trong mồi: hàm lượng base G, C trong tổng số base trong mỗi 
mồi nên trong khoảng 40-60%. 
5. Kẹp GC: sự hiện diện của base G, C ở 5 base cuối cùng tại đầu 3’ của 
mỗi mồi vô cùng quan trọng quyết định khả năng liên kết do liên kết G và C 
thường mạnh hơn. Tuy nhiên để tránh việc gắn không đặc hiệu, lượng base G,C 
không nên lớn hơn 3 trong 5 base cuối đầu 3’. 
6. Cấu trúc bậc 2: Sự hiện diện của các cấu trúc thứ cấp của mồi được tạo ra 
bởi các tương tác giữa các phân tử mồi hoặc nội phân tử mồi có thể dẫn đến kém 
hoặc không có năng suất của sản phẩm. Chúng ảnh hưởng xấu đến quá trình ủ 
mẫu mồi và cả quá trình khuếch đại, do đó làm giảm đáng kể “số lượng thực” 
sẵn có của mồi cho phản ứng. 
Cấu trúc kẹp tóc (Hairpins): là cấu trúc thứ phát được tạo ra do sự tương 
tác liên kết giữa chính các base trong mồi đó. Nên hạn chế cấu trúc kẹp tóc này. 
Điều kiện tối ưu ΔG kẹp tóc tại vị trí 3’ nên lớn hơn -2 kcal/mol, ΔG kẹp tóc bên 
trong (ngoại trừ 5 base đầu 3’) nên lớn hơn -3 kcal/mol. 
Liên kết tự thân của mồi (Self-dimer): cấu trúc này hình thành do sự liên 
kết giữa 2 mồi đơn cùng loại (ví dụ 2 mồi xuôi tự liên kết với nhau trong chính 
ống stock ban đầu). Khi các mồi hình thành các liên kết self-dimer sẽ giảm hiệu 
quả bắt cặp với DNA đích, chúng làm giảm năng suất sản phẩm. Điều kiện tối 
ưu ΔG của liên kết tự thân tại vị trí 3’ nên lớn hơn -5 kcal/mol, ΔG liên kết tự 
thân bên trong mồi (trừ 5 base đầu 3’) nên lớn hơn -6 kcal/mol. 
Liên kết chéo giữa 2 mồi (Cross-dimer): liên kết hình thành giữa mồi xuôi 
và mồi ngược. Điều kiện tối ưu ΔG của liên kết giữa 2 mồi tại vị trí 3’ nên lớn 
hơn -5 kcal/mol, ΔG liên kết giữa 2 mồi bên trong mồi (trừ 5 base đầu 3’) nên 
lớn hơn -6 kcal/mol. 
 7. Lặp cặp: nên tránh các đoạn di-nucleotid lặp đi lặp lại nhiều lần trong 
các mồi có thể gây bắt cặp nhầm. VD: ATATATATAT. Số lượng cặp di-
nucleotid có thể chấp nhận trong mồi nên dưới 4 cặp. 
 8. Lặp nucleotid: hạn chế các nucleotid lặp lại liền kề quá nhiều lần cũng 
dễ dẫn tới sự bắt cặp nhầm. VD: AGCGGGGGATGGGG số nucleotid lặp lần 
lượt là 5 và 4 trong 1 mồi. Số lượng nu đơn lặp liên tục tối đa cho phép nên 
không quá 4. 
Trình tự gen CDH1 được lấy trực tiếp từ trình tự FASTA trên kho dữ liệu 
NCBI thông qua phiên bản giới hạn phần mềm CLC Main Workbench 8.1.2. của 
hãng QIAGEN [120] . Trên phần mềm hiển thị rõ các vùng exon, các vùng mã 
hóa protein (coding DNA sequence), intron 
Nhóm nghiên cứu tiến hành thiết kế các cặp mồi bao trùm cả exon và một 
phần intron liền kề để đảm bảo các yêu cầu về chiều dài đoạn DNA đích: 
(1) Có thể kiểm tra các đột biến ghép nối splicing cận kề nếu có 
(2) Đảm bảo khi giải trình tự bằng phương pháp Sanger có thể hạn chế 
những vùng tín hiệu nhiễu ban đầu có thế ảnh hưởng tới đoạn exon và rìa intron 
mong muốn. 
(3) Thực hiện GTT trên hệ thống 3730 có thể giải được đoạn 1000bp, do 
đó đoạn đích mong muốn chiều dài dưới 1000bp. 
PHỤ LỤC 4 
DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA 
ĐÌNH BỆNH NHÂN B4 
STT Ký hiệu Họ và tên Tuổi Quan hệ với bệnh nhân 
1 III-1 Phạm Thanh T. 64 Bác họ 
2 III-2 Phạm Hồng P. 62 Bác họ 
3 III-3 Phạm Thị K. 55 Bác họ 
4 III-4 Phạm Văn Đ. 65 Bác ruột 
5 III-5 Phạm Văn X. 61 Bác ruột 
6 III-6 Phạm Văn T. 59 Bố đẻ 
7 III-7 Hồ Thị H. 57 Mẹ đẻ 
8 IV-1 Phạm Văn Q. 37 Anh họ 
9 IV-6 Phạm Thị H. 31 Chị họ 
10 IV-7 Phạm Thị H. 34 Chị ruột 
11 IV-11 Phạm Ngọc T. 17 Em ruột 
DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA 
ĐÌNH BỆNH NHÂN B151 
STT Ký hiệu Họ và tên Tuổi Quan hệ với bệnh nhân 
1 II-1 Ngô Thị X. 68 Mẹ đẻ 
2 III-1 Nguyễn Bá T. 46 Anh trai 
3 III-2 Nguyễn Bá S. 44 Anh trai 
4 III-4 Nguyễn Thị Đ. 33 Em gái 
5 III-6 Nguyễn Viết T. 44 Em họ 
6 III-7 Nguyễn Thị H. 33 Em họ 
7 IV-2 Nguyễn Bá C. 17 Cháu trai 
8 IV-3 Nguyễn Thị Q. 23 Cháu gái 
9 IV-4 Nguyễn Bá Q. 16 Cháu trai 
10 IV-5 Mai Xuân A. 15 Con trai 
DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA 
ĐÌNH BỆNH NHÂN B532 
STT Ký hiệu Họ và tên Tuổi Quan hệ với bệnh nhân 
1 II-2 Trần Văn Đ. 71 Bố đẻ 
2 II-6 Trần Thị T. 54 Cô ruột 
3 III-1 Trần Thị L. 48 Chị gái 1 
4 III-2 Trần Thị L. 43 Chị gái 2 
5 III-4 Trần Thị H. 37 Chị gái 3 
6 III-8 Bùi Văn H. 27 Em họ 
7 IV-5 Nguyễn Văn B. 16 Cháu trai 
8 IV-6 Nguyễn Văn D. 15 Cháu trai 
9 IV-7 Nguyễn Thị H. 13 Cháu gái 
10 IV-8 Nguyễn Văn T. 15 Cháu trai 
11 IV-9 Nguyễn Thị Minh T. 12 Cháu gái 
DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA 
ĐÌNH BỆNH NHÂN B732 
STT Ký hiệu Họ và tên Tuổi Quan hệ với bệnh nhân 
1 Lê Thị C. 74 Mẹ đẻ 
2 Phạm Thị Lê T. 37 Chị gái 
3 Nguyễn Khánh L. 13 Cháu gái 
4 Nguyễn Hoàng Gia B. 10 Cháu trai 
PHỤ LỤC 5 
Hình ảnh của một số SNP trên gen CDH1 đƣợc tìm thấy trong nghiên cứu 
1. Hình ảnh giải trình tự SNP rs 61747632 – c.1020G>A (p.T340T) nằm trên 
Exon 8. 
2. Hình ảnh giải trình tự SNP rs1801552 – c.2076T>C (p.A692A) nằm trên 
Exon 13, kiểu gen đồng hợp CC. 
3. Hình ảnh giải trình tự SNP rs33964119 - c.2253C>T (p.N751N) nằm trên 
exon 14. 
4. Hình ảnh giải trình tự SNP rs552874184 – c.2165-15C>A nằm trên intron 13. 
5. Hình ảnh giải trình tự SNP rs3743674 – c.48+6C>T nằm trên intron 1. 
6. Hình ảnh giải trình tự gen SNP rs35667437 - c.1711+47G>A nằm trên intron 11. 
7. Hình ảnh giải trình tự SNP rs1801026 – c.2649+54C>T nằm trên intron 16. 
(a) c.2164+17A (b) c.2164+17dupA 
8. Hình ảnh giải trình tự SNP rs34939176 – c.2164+17dupA nằm trên intron 
13. Hình (a) là hình ảnh giải trình tự bình thường. Hình (b) là hình ảnh 
giải trình tự SNP c.2164+17dupA 
 (a) c.1008+131G 
 (b) c.1008+131delGinsATC (c) c.1008+131delGinsATC 
 Mồi E7F Mồi E7R 
9. Hình ảnh giải trình tự SNP c.1008+131delGinsATC nằm trên intron 7, 
đây là SNP mới được phát hiện trong nghiên cứu. Hình (a) là hình ảnh 
GTT bình thường. Hình (b) là hình ảnh GTT SNP 
c.1008+131delGinsATC mồi xuôi (F). Hình (c) là hình ảnh GTT SNP 
c.1008+131delGinsATC mồi ngược (R). 
 (a) c.1712-54T (b) c.1712-54dupT 
10. Hình ảnh giải trình tự SNP c.1712-54dupT nằm trên intron 11, đây là SNP mới 
được phát hiện trong nghiên cứu. Hình (a) là hình ảnh GTT bình thường. Hình (b) là 
hình ảnh GTT SNP c.1712-54dupT. 
11. Hình ảnh giải trình tự SNP rs730881656 - c.2103C>T (V701V) mồi ngược (R). 
Phụ lục 6 
BỘ CÂU HỎI AUDIT-C 
STT Nội dung câu hỏi Nội dung câu trả lời Điểm 
1
1 
Tần suất uống rượu trong 
thời gian gần đây 
-Chưa bao giờ 
-≤ 1 lần/tháng 
-2 – 4 lần/tháng 
-2 – 3 lần/tuần 
-≥ 4 lần/tuần 
0 
1 
2 
3 
4 
2
2 
Số chén rượu uống trong một 
ngày 
-Không uống 
-1 – 2 chén* 
-3 – 4 chén 
-5 – 6 chén 
-7 – 9 chén 
-≥ 10 chén 
0 
0 
1 
2 
3 
4 
3
3 
Bao nhiêu lâu uống từ 6 chén 
trở lên trong một lần uống 
-Không bao giờ 
-Vài tháng một lần 
-Hàng tháng 
-Hàng tuần 
-Hàng ngày 
0 
1 
2 
3 
4 
 *: 1 chén rượu trong bộ câu hỏi tương đương với 1 đơn vị rượu tiêu chuẩn 
PHỤ LỤC 7 
Hình ảnh điện di các exon của gen CDH1 
Hình ảnh điện di Exon 1 (287bp) 
Hình ảnh điện di Exon 2 (242bp) 
Hình ảnh điện di Exon 3 (358bp) 
Hình ảnh điện di E4E5 (645bp) 
Hình ảnh điện di Exon 6 (476bp) 
Hình ảnh điện di Exon 7 (307bp) 
Hình ảnh điện di Exon 8 (736bp) 
Hình ảnh điện di Exon 9 (302bp) 
Hình ảnh điện di Exon 10 (502bp) 
Hình ảnh điện di Exon 11 (287bp) 
Hình ảnh điện di Exon 12 (687bp) 
Hình ảnh điện di Exon 13 (664bp) 
Hình ảnh điện di Exon 14 (523bp) 
Hình ảnh điện di Exon 15 (662bp) 
Hình ảnh điện di Exon 16 (840bp) 
PHỤ LỤC 8 
Bảng tổng hợp các đột biến và SNP của gen CDH1 được tìm thấy trong nghiên 
cứu 
Mã BN 
Exon/ 
Intron 
Đột biến/SNP n 
Thể đột 
biến 
Chú 
thích 
Ý nghĩa 
B04 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 
1 
Đồng hợp SNP Lành tính 
E5 c.639 G>A (p.W213*) Dị hợp Mới Gây bệnh 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính 
B151 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 
1 
Đồng hợp SNP Lành tính 
E13 c.1990A>C (p. K664Q) Dị hợp Mới Chƣa rõ 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính 
B532 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 
1 
Đồng hợp SNP Lành tính 
I7 c.1008+131 delGinsATC - - Chưa rõ 
E9 c.1298 A>G (D433G) Dị hợp Mới Chƣa rõ 
I11 c.1711+47G>A (rs35667437) Dị hợp SNP Lành tính 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính 
B732 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 
1 
Đồng hợp SNP Lành tính 
I7 c.1008+131 delGinsATC - Mới Chưa rõ 
I12 c.1937-13T>C Dị hợp DV Gây bệnh 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính 
B144 
B158 
B169 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 
3 
Đồng hợp SNP Lành tính 
I11 c.1711+47G>A (rs35667437) Dị hợp SNP Lành tính 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính 
B729 
B738 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 
2 
Đồng hợp SNP Lành tính 
I7 c.1008+131 delGinsATC - Mới Chưa rõ 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính 
E16 *54 C>T (rs1801026) Dị hợp SNP Lành tính 
B284 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 
1 
Dị hợp SNP Lành tính 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính 
E14 c.2253 C>T (rs33964119) Dị hợp SNP Lành tính 
E16 *54 C>T (rs1801026) Đồng hợp SNP Lành tính 
B725 
E8 c.1020 G>A (rs61747632) 
1 
Dị hợp SNP Lành tính 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính 
I13 c.2164+17dupA (rs34939176) SNP Lành tính 
E14 c.2253 C>T (rs33964119) Dị hợp SNP Lành tính 
B39 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 
1 
Đồng hợp SNP Lành tính 
I7 c.1008+131 delGinsATC - Mới Chưa rõ 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính 
B295 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 
1 
Dị hợp SNP Lành tính 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính 
E16 *54 C>T (rs1801026) Dị hợp SNP Lành tính 
B718 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) 
1 
Đồng hợp SNP Lành tính 
E14 c.2253 C>T (rs33964119) Dị hợp SNP Lành tính 
E16 *54 C>T (rs1801026) Dị hợp SNP Lành tính 
B730 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 
1 
Dị hợp SNP Lành tính 
I11 c.1712-54dupT - Mới Chưa rõ 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính 
B733 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 
1 
Đồng hợp SNP Lành tính 
I11 c.1711+47G>A (rs35667437) Dị hợp SNP Lành tính 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính 
B734 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 
1 
Đồng hợp SNP Lành tính 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính 
I13 c.2165-15C>A(rs552874184) Dị hợp SNP Lành tính 
B737 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 
1 
Đồng hợp SNP Lành tính 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính 
E16 *54 C>T (rs1801026) Đồng hợp SNP Lành tính 
B285,B308 
B717,B720 
B726,B731 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 6 Đồng hợp SNP Lành tính 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính 
B277,B341 
B519,B163 
B735 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 5 
Đồng hợp SNP Lành tính 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính 
B367,B486 
B719,B728 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 4 
Dị hợp SNP Lành tính 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính 
B445 I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 1 
Đồng hợp SNP Lành tính 
E14 c.2253 C>T (rs33964119) Dị hợp SNP Lành tính 
B668 E13 c.2076 T>C (rs1801552) 1 Dị hợp SNP Lành tính 
I11 c.1711+47G>A (rs35667437) Dị hợp SNP Lành tính 
B723 I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 1 Dị hợp SNP Lành tính 
I7 c.1008+131 delGinsATC - Mới Chưa rõ 
B193,B462 
B551,B736 
I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 4 Đồng hợp SNP Lành tính 
B38 
B724 
E13 c.2076 T>C (rs1801552) 2 Đồng hợp SNP Lành tính 
B279 I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 1 Dị hợp SNP Lành tính 
B22 E13 c.2076 T>C (rs1801552) 1 Dị hợp SNP Lành tính 
B722 I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 1 Đồng hợp SNP Lành tính 
E13 c.2103 C>T (rs730881656 Dị hợp SNP Lành tính 
Tổng 45