Luận án Nghiên cứu giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể thai bằng dna thai tự do trong máu mẹ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO	 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
‘
HOÀNG HẢI YẾN
NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ CỦA 
 PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THAI BẰNG DNA 
THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC 
HÀ NỘI - 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO	 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
HOÀNG HẢI YẾN
NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ CỦA 
PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THAI BẰNG DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ 
Chuyên ngành	: Hóa sinh 
Mã số	: 62720112
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC 
Người hướng dẫn khoa học: 
GS.TS. Tạ Thành Văn 
PGS.TS. Nguyễn Duy Ánh
HÀ NỘI - 2020
LỜI CẢM ƠN
Với tất cả lòng kính trọng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy: 
GS.TS. Tạ Thành Văn - Hiệu trưởng, Trưởng Bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy đã luôn tận tình chỉ bảo, truyền đạt những kiến thức và ý kiến quý báu, hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án. 
PSG.TS. Nguyễn Duy Ánh - Giám đốc Bệnh viện Phụ sản Hà Nội, Phó trưởng Bộ môn Phụ Sản Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy đã hết lòng hướng dẫn, chỉ dạy, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án. 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới:
Thầy, Cô Chủ tịch Hội đồng, các Thầy, các Cô trong Hội đồng chấm luận án đã có nhiều ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thiện Luận án. 
	Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi để tôi hoàn thành luận án. 
	Đảng ủy, Ban Giám đốc, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Trung tâm Đào tạo, Trung tâm Sàng lọc, Chẩn đoán trước sinh và sơ sinh Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. 
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:
Các Thầy, các Cô, các anh, các chị tại Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu.
Các anh, các chị, các bạn đồng nghiệp tại Trung tâm Sàng lọc, Chẩn đoán trước sinh và sơ sinh, Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội đã luôn hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp đã luôn ủng hộ, động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. 
Ban Giám đốc, các anh, các chị, các bạn Công ty CP Thiết bị SISC Việt Nam đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện và hỗ trợ một phần kinh phí trong quá trình thực hiện nghiên cứu.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới tất cả các thai phụ đã tham gia trong nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án và tiếp thêm động lực cho tôi để tiếp tục phấn đấu trong chuyên môn cũng như trong nghiên cứu khoa học. 
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ tôi, người đã sinh thành, nuôi dưỡng, yêu thương và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập; chồng và hai con gái và những người thân trong gia đình đã luôn động viên, giúp đỡ và ở bên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành được luận án. 
 Hà Nội, ngày 10 tháng 4 năm 2020
Hoàng Hải Yến
LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Hoàng Hải Yến, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh Y học, xin cam đoan:
Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của Thầy: GS.TS. Tạ Thành Văn và PGS.TS. Nguyễn Duy Ánh. 
Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. 
Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu. 
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. 
Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2020
Người viết cam đoan
Hoàng Hải Yến
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
ACMG 
The American College of Medical Genetics and Genomics
Hiệp hội gen và di truyền y học của Hoa Kỳ
ACOG
American College of Obstetricians and Gynecologists
Hội Thai phụ khoa Hoa Kỳ
AF
Amniotic fluid
Dịch ối
AMA
Advanced Maternal Age
Tuổi thai phụ cao (≥ 35 tuổi)
AQ
Aligment Quality
Chất lượng khớp
bp
Base Pair
Cặp base
cffDNA
Cell Free Fetal DNA
DNA thai tự do
CFTS
Combined First Trimester Screening
Sàng lọc kết hợp thai kỳ 1
CNV
Copy Number Variation
Biến thể số lượng bản sao
CSS
Chromosome Selective Sequencing
Giải trình tự nhiễm sắc thể chọn lọc (mục tiêu)
CPM
Confined Placental Mosaicism
Khảm giới hạn rau thai
CV
Coefficient of Variation
Điểm biến thiên
CVS
Chorionic Villus Sampling
Lấy mẫu gai rau
DANSR
Digital Analysis of Selected Regions
Phân tích số các vùng chọn lọ	
DN
Data Noise
Dữ liệu nhiễu
DNA
Deoxyribo Nucleic Acid
Acid nucleic
DTBS
Dị tật bẩm sinh
GC
Guanine Cytosine
GRCh37 
Genome Reference Consortium human
HG
Human Genome
Hệ gen người
ISP
Ion Sphere Particle
ISPD
International Society for Prenatal Diagnosis
Hiệp hội Chẩn đoán trước sinh quốc tế
ISUOG
The International Society of Ultrasound in Obstetrics & Gynecology
Hội Siêu âm thai phụ khoa Thế giới
MPSS
Massively Parallel Shotgun Sequencing
Giải trình tự đồng thời số lượng lớn ngẫu nhiên	
NGS
Next Generation Sequencing
Giải trình tự gen thế hệ mới
NIPS
Noninvasive Prenatal Screening	
Sàng lọc trước sinh không xâm lấn
NSGC
National Society of Genetic Counselors 
Hội quốc gia về tư vấn di truyền
NST
Chromosome
Nhiễm sắc thể
NT
Nuchal Translucency
Độ mờ da gáy
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng chuỗi trùng hợp
PPR
Posteriori Risk
Nguy cơ sau xét nghiệm
SCA
Sex Chromosome Aneuploidy
Lệch bội NST giới tính
SMFM
Society for Maternal-Fetal Medicine
Hội Y học thai phụ và thai
SNPs
Single Nucleotide Polymorphisms
Đa hình đơn nucleotide
TFM
True Fetal Mosaicism
Khảm thai thực sự 
TMAP 
Torrent Mapping Alignment Program
Thuật toán TMAP
URs
Unique Reads
Trình tự duy nhất 	
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. 	Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả xét nghiệm sàng lọc huyết thanh thai phụ phát hiện trisomy 21	13
Bảng 1.2. 	Kết quả phát hiện trisomy 21 theo tuổi thai phụ và nguy cơ*	31
Bảng 1.3. 	Kết quả phát hiện trisomy 18, 13*	32
Bảng 1.4. 	So sánh các phương pháp sàng lọc	33
Bảng 1.5. 	Kết quả sàng lọc trisomy 21, 18, 13	34
Bảng 2.1. 	Đánh giá kết quả xét nghiệm NIPS	54
Bảng 3.1. 	Đặc điểm tuổi thai phụ trong nghiên cứu	56
Bảng 3.2. 	Đặc điểm cân nặng nhóm thai phụ làm xét nghiệm NIPS	57
Bảng 3.3. 	Tuổi thai tại thời điểm làm xét nghiệm NIPS	58
Bảng 3.4. 	Yếu tố nguy cơ của thai phụ làm xét nghiệm NIPS	58
Bảng 3.5. 	Nồng độ DNA tự do và nồng độ DNA thư viện	59
Bảng 3.6. 	Kết quả chất lượng ISP trên chíp giải trình tự	61
Bảng 3.7. 	Chất lượng khớp của đoạn đọc với trình tự hg19	63
Bảng 3.8. 	Tỷ lệ thành công của xét nghiệm NIPS	63
Bảng 3.9. 	Tỷ lệ thất bại của của xét nghiệm NIPS	64
Bảng 3.10. 	Kết quả giải trình tự	64
Bảng 3.11. 	Kết quả điểm z-score NST 21, 18, 13, X	66
Bảng 3.12. 	Tỷ lệ lệch bội NST trong xét nghiệm NIPS	66
Bảng 3.13. 	Phân loại lệch bội NST với xét nghiệm NIPS dương tính	67
Bảng 3.14. 	Nồng độ cffDNA và tuổi thai	68
Bảng 3.15. 	Nồng độ cffDNA và cân nặng thai phụ	69
Bảng 3.16. 	Kết quả xét nghiệm karyotype từ dịch ối	74
Bảng 3.17. 	Các trường hợp kết quả xét nghiệm NIPS không phù hợp với kết quả xét nghiệm karyotype	79
Bảng 3.18.	 Xét nghiệm NIPS dương tính với trisomy 21, 18, 13	80
Bảng 3.19. 	Xét nghiệm NIPS dương tính với lệch bội NST giới tính	81
Bảng 3.20. 	Giá trị xét nghiệm NIPS	83
Bảng 3.21. 	Giá trị tiên đoán dương dựa vào yếu tố nguy cơ	85
Bảng 3.22. 	Kết quả xét nghiệm NIPS liên quan đến tuổi thai phụ	86
Bảng 3.23. 	Kết quả xét nghiệm NIPS liên quan đến sàng lọc huyết thanh thai phụ nguy cơ cao trisomy 21	87
Bảng 3.24. 	Kết quả xét nghiệm NIPS liên quan đến siêu âm bất thường	87
Bảng 3.25. 	Kết quả xét nghiệm NIPS liên quan đến độ mờ da gáy	88
Bảng 3.26. 	Kết quả xét nghiệm NIPS liên quan đến các yếu tố nguy cơ	89
Bảng 4.1. 	Nồng độ cffDNA qua các nghiên cứu trên thế giới	103
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. 	Phân bố theo nghề nghiệp và địa dư	57
Biểu đồ 3.2. 	Phân bố z-score NST 21	65
Biểu đồ 3.3. 	Phân bố z-score NST 18	65
Biểu đồ 3.4. 	Phân bố z-score NST 13	65
Biểu đồ 3.5. 	Phân bố z-score NST X	65
Biểu đồ 3.6. 	Phân bố nồng độ cffDNA	68
Biểu đồ 3.7. 	Nồng độ cffDNA và tuổi thai	69
Biểu đồ 3.8 - 3.9. 	Nồng độ cffDNA và cân nặng, BMI	70
Biểu đồ 3.10. 	Nồng độ cffDNA và tuổi thai phụ	70
Biểu đồ 3.11. 	Nồng độ cffDNA và z-score NST 21	71
Biểu đồ 3.12. 	Nồng độ cffDNA và z-score NST 18	71
Biểu đồ 3.13. 	Nồng độ cffDNA và z-score NST 13	72
Biểu đồ 3.14. 	Nồng độ cffDNA và z-score NST X	72
Biểu đồ 3.15. 	Nồng độ cffDNA và trisomy 18, 21	73
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ nghiên cứu	53
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ kết quả nghiên cứu	84
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. 	Tỉ lệ bất thường các NST được chẩn đoán khi trẻ < 1 tuổi	4
Hình 1.2. 	Trẻ mắc hội chứng Down (Trisomy 21)	5
Hình 1.3. 	Trẻ mắc hội chứng Edwards	6
Hình 1.4. 	Trẻ mắc hội chứng Patau	7
Hình 1.5. 	Trẻ mắc hội chứng Turner	8
Hình 1.6. 	Kỹ thuật hút dịch ối và lấy mẫu gai rai	14
Hình 1.7. 	Cơ chế giải phóng DNA tự do	17
Hình 1.8. 	DNA thai tự do trong máu thai phụ	18
Hình 1.9. 	Các cách tiếp cận để xác định nồng độ cffDNA	21
Hình 1.10. 	Giải trình tự tổng hợp	25
Hình 1.11. 	Giải trình tự bán dẫn	26
Hình 1.12. 	Các phương pháp sử dụng trong sàng lọc DNA thai tự do	28
Hình 1.13. 	Biểu đồ khảm NST	35
Hình 1.14. 	Các trường hợp dương tính giả của xét nghiệm NIPS	36
Hình 2.1. 	Biểu đồ phân bố chuẩn của điểm z-score	48
Hình 2.2. 	Quy trình tạo DNA thư viện	50
Hình 2.3. 	Các bước chính chuẩn bị mẫu DNA thư viện trên Ion Chef	51
Hình 2.4. 	Giải trình tự trên máy Proton	51
Hình 3.1. 	Kết quả kiểm tra chất lượng DNA thư viện	60
Hình 3.2. 	Hiệu quả nạp mẫu vào chip giải trình tự	61
Hình 3.3. 	Chất lượng khớp của đoạn đọc với trình tự hg19	62
Hình 3.4. 	Kết quả phân tích NST từ dịch ối thai phụ L.T.T.T.	76
Hình 3.5. 	Kết quả phân tích NST từ dịch ối thai phụ N.T.N.L.	77
Hình 3.6. 	Kết quả phân tích NST từ dịch ối thai phụ N.T.T.	78
Hình 4.1. 	Giải trình tự thất bại	95
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bất thường nhiễm sắc thể (NST) thai xảy ra khoảng 1/150 trẻ sinh sống, là một trong số những nguyên nhân hàng đầu gây nên tử vong và bệnh tật cho trẻ sơ sinh trên toàn thế giới [1],[2]. Chiếm khoảng 83,0% của những bất thường này là do trisomy 21, 18, 13 và lệch bội NST giới tính gây ra hội chứng Down, Edwards, Patau, Turner... [3].
Các phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống phát hiện lệch bội NST bao gồm siêu âm hình thái và phân tích huyết thanh thai phụ trong thai kỳ 1 và thai kỳ 2. Tỷ lệ phát hiện trisomy 21 với ngưỡng lớn hơn 1/250 dao động từ 50% đến 95% với tỷ lệ dương tính giả khoảng 5,0% tùy thuộc vào phương pháp sàng lọc được sử dụng [4]. Để chẩn đoán xác định thì các thai phụ có nguy cơ cao bất thường NST sẽ được thực hiện các thủ thuật xâm lấn như lấy mẫu gai rau hoặc hút dịch ối để khảo sát số lượng NST bằng các kỹ thuật Karyotype, QF-PCR, FISH, Prenatal BoBs, MLPA. Các thủ thuật xâm lấn này có thể gây mất thai với tỷ lệ là 0,11 - 0,22% [5]. Do đó, rất cần có những phương pháp sàng lọc với tỷ lệ dương tính giả thấp đồng thời tỷ lệ phát hiện cao hơn, thai phụ không cần chịu thủ thuật xâm lấn, tránh được nguy cơ ảnh hưởng đến thai phụ và thai nhi [6].
Gần đây, xét nghiệm phân tích DNA thai tự do (cell free fetal DNA - cffDNA) sàng lọc lệch bội NST sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS) đã được chứng minh là phương pháp sàng lọc trước sinh hiệu quả so với các phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống với tỷ lệ phát hiện trisomy 21 là 99,2% và tỷ lệ dương tính giả là 0,09%, tỷ lệ phát hiện trisomy 18 là 96,3% và tỷ lệ dương tính giả là 0,13%, tỷ lệ phát hiện trisomy 13 là 91,0% và tỷ lệ dương tính giả là 0,13% [7],[8],[9]. Với mong muốn tìm hiểu rõ hơn về giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới, giúp thầy thuốc lâm sàng có thêm một phương pháp sàng lọc lệch bội NST thai, đề tài “Nghiên cứu giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể thai bằng DNA thai tự do trong máu mẹ” được tiến hành với 2 mục tiêu: 
Ứng dụng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y bằng DNA thai tự do trong máu mẹ.
Xác định tỷ lệ lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y và bước đầu đánh giá giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới sử dụng DNA thai tự do trong máu mẹ.
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Bất thường nhiễm sắc thể thai 
1.1.1. Tần suất xuất hiện 
Các nhiễm sắc thể (NST) có thể bị bất thường về số lượng hoặc cấu trúc. Các biến đổi này có thể thấy ngay khi sinh hoặc mắc phải trong quá trình ác tính hoá của các tế bào khối u và là kết quả của các biến cố xảy ra trong phân bào giảm nhiễm hoặc phân bào nguyên nhiễm. Sự bất thường này có thể xảy ra trên một hoặc nhiều NST. Bất thường NST phổ biến nhất là trisomy 21, 18, 13 và lệch bội NST giới tính [10]. Nghiên cứu trên 34.910 trẻ sinh sống đến 13 tuổi tại Đan Mạch cho thấy bất thường NST chiếm khoảng 15,0% các dị tật bẩm sinh được chẩn đoán trước 1 tuổi và 25,0% tử vong chu sinh do dị tật bẩm sinh, tần suất bất thường NST là 1/118 hay 8,45/10.000 trẻ sinh sống [11]. Nghiên cứu tại cộng đồng các nước ở Châu Âu năm 2004 cũng cho thấy khoảng 1/4 trường hợp tử vong sớm ở trẻ sơ sinh là do dị tật bẩm sinh, trong đó 18,0% do bất thường NST. Trong nghiên cứu trên 10.323 trường hợp bất thường NST bao gồm các trường hợp sinh con sống trước 1 tuổi, thai chết khi tuổi thai trên 20 tuần hoặc đình chỉ thai nghén vì dị tật bẩm sinh từ năm 2000 - 2006. Kết quả phát hiện 7.335 trường hợp trisomy 21, 18 hoặc 13, trong đó trisomy 21 chiếm tỷ lệ 53,0% với tần suất xuất hiện là 23/10.000, trisomy 18 chiếm tỷ lệ 13,0% với tần suất 5,9/10.000, trisomy 13 chiếm tỷ lệ 5% với tần suất 2,3/10.000, trisomy NST giới tính là 473 ca chiếm tỷ lệ 5% với tần suất 2/10.000 và 778 ca monosomy X chiếm tỷ lệ 8,0% với tần suất 3,3/10.000. Chỉ có 1.737 ca bất thường NST hiếm gặp chiếm tỷ lệ 17,0% với tần suất là 7,4/10.000 bao gồm thể tam bội, trisomy các NST khác, chuyển đoạn NST không cân bằng, mất đoạn và nhân đoạn (Hình 1.1) [3].
Hình 1.1. Tỉ lệ bất thường các NST được chẩn đoán khi trẻ < 1 tuổi
(Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3330224)
Tại Trung Quốc, mỗi năm có khoảng 16 triệu trẻ mới sinh, trong đó dị tật bẩm sinh chiếm khoảng 4,0 - 6,0%. Bất thường NST chiếm tỷ lệ 1/160 trẻ sinh sống tại Mỹ và 1/60 tại Trung Quốc [10],[12]. Thống kê của Tổng cục dân số cho thấy, mỗi năm Việt Nam có khoảng gần 1,5 triệu trẻ em mới được sinh ra, trong đó tỷ lệ dị tật bẩm sinh chiếm khoảng 1,5 - 2,0% trẻ sinh sống. Đáng lưu ý là mỗi năm có khoảng 1.400 - 1.800 trẻ mắc trisomy 21, khoảng 200 - 250 trẻ mắc trisomy 18. Theo báo cáo của Phùng Như Toàn (2003) từ kết quả nuôi cấy từ dịch ối phát hiện 24/213 ca bất thường NST chiếm 11,2% [13]. Hoàng Thị Ngọc Lan và cộng sự (2004) phát hiện 7/4 ... f sex chromosomal aneuploidies by sequencing circulating cell-free DNA from maternal plasma. Prenatal Diagnosis, 33, 591-597.
Warren MP, Chua A (2006). Appropriate use of estrogen replacement therapy in adolescents and young adults with turner syndrome and hypopituitarism in light of the Women’s health initiative. Growth Horm IGF Res, 16, 98-102.
Hong Yao, Lei Zhang, Hongyun Zhang et al (2012). Noninvasive prenatal genetic testing for fetal aneuploidy detects maternal trisomy X. Prenatal Diagnosis, 32, 1-3.
Abramsky L, Hall S, Levitan J et al (2001). What parents are told after prenatal diagnosis of a sex chromosome abnormality: interview and questionnaire study. BMJ, 322(7284), 463-6.
Committee on Practice Bulletins-Obstetrics, Committee on Genetics, and the Society for Maternal-Fetal Medicine. Practice Bulletin No. 163, Screening for Fetal Aneuploidy. J. Obstetrics & Gynecology. 127 (2016)
Gregg AR et al (2016). Noninvasive prenatal screening for fetal aneuploidy, 2016 update: a position statement of the American College of Medical Genetics and Genomics. J. Genetics in Medicine, 18(10), 1056-1065.
Lyn S. Chitty, Louanne Hudgins, Mary E. Norton (2018). Current controversies in prenatal diagnosis 2: Cell‐free DNA prenatal screening should be used to identify all chromosome abnormalities. Prenatal Diagnosis, 38, 160-165.
Nicola Persico, Simona Boito, Benedetta Ischia et al (2016). Cell-free DNA testing in the maternal blood in high-risk pregnancies after first-trimester combined screening. Prenatal Diagnosis, 36, 232-236.
Syngelaki A, Pergament E, Homfray T et al (2014). Replacing the combined test by cell-free DNA testing in screening for trisomies 21, 18 and 13: impact on the diagnosis of other chromosomal abnormalities. Fetal Diagn Ther, 35, 174-84. 
Salomon LJ, Alfirevic Z, Audibert F et al (2014). ISUOG consensus statement on the impact of non-invasive prenatal testing (NIPT) on prenatal ultrasound practice. Ultrasound Obstet Gynecol, 44, 122-123.
A.Benachi, A.Letourneau, P.Kleinfinger et al (2015). Cell-Free DNA Analysis in Maternal Plasmain Cases of Fetal Abnormalities Detected on Ultrasound Examination. Obstet Gynecol, 125(6), 1330-7.
Petersen OB, Vogel I, Ekelund C et al (2014). Potential diagnostic consequences of applying non-invasive prenatal testing: population-based study from a country with existing first-trimester screening. Ultrasound Obstet Gynecol, 43, 265-271.
L. Beulen, B. H. W Fass, I. Feenstra et al (2017). Clinical utility of non-invasive prenatal testing in pregnancies with ultrasound anomalies. Ultrasound Obstet Gynecol, 49, 721-728.
Nicolaides KH, Syngelaki A, del Mar Gil M et al (2014). Prenatal detection of fetal triploidy from cell-free DNA testing in maternal blood. Fetal Diagn Ther, 35, 212-7.
Phụ lục 1
KỸ THUẬT LẤY MẪU
Thực hiện theo hướng dẫn 05 (PL.04.STKH), Bệnh viện Phụ sản Hà Nội
Vật tư tiêu hao: 
- Ống Cell-Free DNA BCT (Streck BCTs) chứa chất bảo quản K3EDTA.
- Kim số 18 (kim lấy thuốc)
- Bơm tiêm 10mL
Thực hiện:
- Lấy 10mL máu toàn phần vào ống Streck BCTs, lắc trộn đều máu trong ống 8 - 10 lần sau khi lấy máu. 
- Mẫu máu sau khi lấy để ở nhiệt độ phòng (mẫu máu sử dụng phân tích DNA tự do ổn định trong 14 ngày khi được bảo quản từ 6o - 37oC).
Phụ lục 2
GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI
Thực hiện theo QTKT-TS.NIPS-01, Bệnh viện Phụ sản Hà Nội
Tách huyết tương
- Ly tâm 1.600 vòng/phút/4oC/10 phút. Sau đó hút lớp huyết tương.
- Ly tâm tiếp lần 2 với tốc độ 16.000rpm/10 phút/4oC. Hút dịch nổi vào 3 ống eppendorf 1,5mL, mỗi ống chứa 1mL huyết tương. Lưu mẫu ở -80oC.
Tách DNA tự do (DNA tự do)
DNA tự do tổng số được tách thông qua hệ thống máy tách chiết tự động Prepito-D, sử dụng kit Free circulating NA từ Chemagen/Perkin Elmer. Quy trình thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Đo nồng độ DNA tự do sau tách
DNA tự do sau tách được đo nồng độ bằng máy quang phổ Qubit 3.0 sử dụng bộ kít Qubit dsDNA HS, thực hiện như sau:
- Pha hóa chất Qubit dsDNA HS/ buffer theo tỉ lệ 1:200
- Chuẩn bị dung dịch mẫu (2µL mẫu + 198µL Qubit đã pha) và dung dịch chuẩn (10 uL chuẩn + 190µL Qubit đã pha) vào 2 ống Qubit/mẫu, vortex.
- Ủ các ống xét nghiệm tại nhiệt độ phòng/2 phút (tránh ánh sáng trực tiếp)
- Chuẩn máy đo Qubit bằng 2 ống dung dịch chuẩn, đo nồng độ DNA tự do của từng ống mẫu.
- Bảo quản DNA tự do đã tách tại -80oC.
2.4. Quy trình tạo thư viện
2.4.1. Sửa đuôi và tinh sạch DNA tự do 
- Sử dụng kit Ion Plus Fragment Library để sửa đuôi DNA tự do, chuẩn bị hỗn hợp sau cho mỗi mẫu:
Thành phần
Thể tích
DNA mẫu sau khi tách chiết
8,5µL
5× End-Repair Buffer
10µL
End Repair Enzymes
0,5µL
Nuclease-free water
31µL
Tổng
50µL
- Ủ phản ứng trong 30 phút tại nhiệt độ phòng
- Tinh sạch DNA tự do đã sửa với 90μL AMPure XP/mẫu.
2.4.2. Nối các đoạn adapters và tinh sạch DNA tự do
- Chuẩn bị hỗn hợp Ion P1 Adapter và Ion Xpress Barcode với tỉ lệ pha loãng 1:8 với nước Nuclease-Free.
- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng với các thư viện được gắn đầu mã vạch sử dụng dung dịch đã được pha loãng: 
Thành phần
Thể tích
DNA tự do
20µL
Ion P1 Adapters 
0,25µL
Ion Xpress Barcode X 
0,25µL
10 x Ligase Buffer
5µL
DNA ligase 
1µL
Nước nuclease-free 
23,5µL
Tổng
50µL
- PCR với chu trình nhiệt 25℃/15 phút, và giữ ở 4oC
- Tinh sạch DNA tự do đã được nối adapters sử dụng 90μL AMPure/mẫu. 
2.4.3. Nhân bản và tinh sạch DNA thư viện tự do
- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng với DNA thư viện tự do như sau:
Thành phần
Thể tích
Platinum HiFi
48µL
Library Amplification Primers
2,5µL
DNA tự do
9,5µL
Tổng
60µL
- Đưa vào máy PCR và chạy theo chu trình nhiệt: 72℃/20 phút; 95℃/5 phút; 10 chu kỳ 95℃/15 giây, 62℃/15 giây, 70℃/1 phút; sau đó 70℃/5 phút và giữ ở 4℃.
- Tinh sạch sản phẩm bằng 108µL AMPure.
- Đo nồng độ DNA thư viện tự do sau tinh sạch. Bảo quản DNA tự do thư viện ở nhiệt độ từ -30 oC đến -10oC.
2.4.4. Kiểm tra chất lượng DNA thư viện
Thực hiện theo quy trình của máy LabChip GX Touch 24 cho phép kiểm tra kích thước thư viện (DNA tự do đã được gắn barcode và adaptor) và nồng độ thư viện (có thể phát hiện ở nồng độ thấp) trước khi tiến hành các bước khuếch đại và làm giàu trong hệ thống Ion Chef. Các bước tiến hành theo quy trình của nhà sản xuất. Kết quả điện di được phân tích bằng phần mềm Labchip.
Kích thước DNA tự do trong huyết tương phân bố trong khoảng 140-180bp, kích thước đoạn adaptor P1 và barcode khoảng 80bp, do đó kích thước thư viện sẽ có đỉnh đơn tại 220 - 260bp và nồng độ thường trong khoảng 1.000 - 10.000pM. 
Thư viện đã được gắn mã vạch được pha loãng xuống 55pM. Mỗi chip giải trình tự tối đa được 14 mẫu/lần, tổ hợp hỗn hợp thư viện đồng đều của 14 mẫu để có hỗn hợp thư viện ≥ 25µL. 
2.5. Chuẩn bị mẫu giải trình tự và giải trình tự
2.5.1. Chuẩn bị mẫu giải trình tự (Ion Chef)
Mẫu DNA thư viện tự do sau khi được pha loãng đạt nồng độ 55pM sẽ được làm giàu một lần nữa trong hệ thống tự động Ion Chef sử dụng bộ kít Ion PI Hi-Q Chef. Mẫu DNA thư viện tự do được làm giàu sẽ được nạp tự động vào Ion PI Chip V3. Các bước thao tác tự động trong hệ thống Ion Chef. Phản ứng emulsion PCR (ePCR) trong đó có hạt Ion Sphere Particle (ISP). Trong điều kiện tối ưu, trong 1 giọt dầu môi trường ePCR chỉ chứa 1 hạt ISP và 1 đoạn DNA tự do thư viện và các thành phần phản ứng PCR. Hạt ISP sau khi được làm giàu sẽ được tinh sạch bằng hạt từ đặc hiệu với Biotin có gắn trên đầu gắn barcode. Bước kế tiếp là nạp dung dịch chứa các hạt ISP đã được làm giàu vào trong Ion PI Chip V3. Các bước chuẩn bị máy Ion chef được thực hiện như sau:
- 40 phút trước khi chạy, mở hóa chất Ion PI Hi-Q Chef và để ấm tới nhiệt độ phòng.
- Tạo lịch trình chạy trên trình duyệt web Ion Torrent.
- Bổ sung 25µL thư viện vào các ống mẫu trên giá hóa chất Hi-Q Chef Cartridge.
- Lắp các đồ nhựa tiêu hao vào máy Ion Chef.
- Đưa Ion PI Chip V3 vào máy.
- Đảm bảo các thông tin truy cập trên Ion Chef là chính xác.
- Chọn thời gian để quy trình hoàn thành và bắt đầu chu trình chạy.
2.5.2. Giải trình tự trên máy Proton
- Trước khi khởi động thiết bị 40 phút, đưa các hóa chất sử dụng tới nhiệt độ phòng. Đảm bảo trong máy có sẵn 1 con chip đã qua sử dụng để khởi động máy. Khởi động máy.
- Rửa máy bằng dung dịch Chlorite và nước. Khởi động máy Proton với NaOH và Wash 2. Khi nồng độ pH của Wash 2 đã đạt, chuẩn bị các ống dung dịch dNTPs (Deoxyribonucleoside triphosphates). Khởi động chu trình rửa đường chất lỏng với chip đã sử dụng.
- Khi các bước đã hoàn thành, đưa chip từ Ion Chef đã hoàn thành vào máy Ion Torrent. Khi hệ thống đã xác nhận chip và thông tin của quy trình chạy, tiến hành chu trình giải trình tự. Bảo quản chip còn lại trong hộp kín tại 4oC. 20 phút trước khi thực hiện chu trình chạy thứ 2, để chip ở nhiệt độ phòng.
- Dữ liệu giải trình tự được chuyển trực tiếp vào thư mục DNA trong máy chủ của hệ thống Ion Torrent (Ion Torrent Server). Dữ liệu được phân tích tự động trong máy chủ trong 8 - 12 giờ.
2.5.3. Phân tích kết quả giải trình tự.
Sau quá trình giải trình tự, dữ liệu sẽ được chuyển sang hệ thống Ion Torrent Server. Dữ liệu thô ban đầu gồm các đoạn đọc có kích thước khác nhau. Dữ liệu của mỗi mẫu được nhận biết thông qua trình tự barcode. Tiếp theo, các đoạn đọc được cắt (trimming) dần từ đầu 3’ (nhằm loại bỏ trình tự barcode), sau đó lọc (filtering) giữ lại đoạn đọc có kích thước < 167 bp. Toàn bộ trình tự đoạn đọc còn lại được gióng hàng và so sánh với trình tự chuẩn bộ gen người (hg19) sử dụng TMAP (Torrent Mapping Alignment Program). Tiếp theo, những đoạn đọc được giữ lại là những đoạn đọc chỉ xuất hiện tại 1 vị trí duy nhất trên bộ gen được gọi là các unique reads (URs). Các đoạn đọc không tương đồng hoặc tương đồng nhiều hơn 1 vị trí trên bộ gen sẽ được lọc bỏ. 
Phụ lục 3
QUY TRÌNH LẤY MẪU ỐI
Thực hiện theo QTKT-CĐTS, Bệnh viện Phụ sản Hà Nội
CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Bác sỹ chuyên khoa và điều dưỡng (y tá).
2. Phương tiện
- Máy siêu âm với các đầu dò chuyên dụng.
- Dung dịch sát khuẩn da (cồn povidine 10%), bơm tiêm 5mL, dây nối có khóa 3 chạc, bông, băng dính phẫu thuật.
- Găng tay, áo, mũ, khẩu trang phẫu thuật.
- Bộ dụng cụ can thiệp vô trùng: kẹp, cốc kim loại, khay quả đậu, xe đẩy có mặt bàn đựng dụng cụ.
- Kim chọc hút chuyên dụng (BBrawn G27).
3. Người bệnh
- Người bệnh được giải thích kỹ về thủ thuật để phối hợp với thầy thuốc.
- Người bệnh được khám tiền mê trước khi thực hiện thủ thuật.
- Hướng dẫn đi tiểu không để bàng quang căng.
- Cho người bệnh nằm, sát trùng da, sau đó phủ khăn phủ vô khuẩn có lỗ.
4. Phiếu xét nghiệm
- Hồ sơ bệnh án điều trị nội trú.
- Có biên bản hội chẩn chỉ định thực hiện thủ thuật đã được thông qua.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
- Giải thích cho người bệnh.
- Xem xét chỉ định, chống chỉ định.
- Tiến hành trong phòng thủ thuật: 3 lần kiểm tra thông tin người bệnh: đối khớp bệnh nhân nằm trên giường với hồ sơ bệnh án và thông tin trên ống lấy mẫu. 
- Thủ thuật viên rửa tay, đeo khẩu trang, đeo găng, áo phẫu thuật vô khuẩn.
- Y tá (điều dưỡng) sát khuẩn rộng vị trí chọc kim.
- Bác sĩ xuyên kim vào buồng ối dưới hướng dẫn của siêu âm.
- Y tá (điều dưỡng) nối dây nối có khóa 3 chạc với đốc kim rồi dùng bơm tiêm rút ra khoảng 10mL dịch ối. Mẫu dịch này được bảo quản và chuyển đến phòng xét nghiệm.
- Kết thúc thủ thuật, băng ép nhẹ vùng chọc.
- Người bệnh được theo dõi tại phòng lưu 1 - 2 giờ.
Phụ lục 4
QUY TRÌNH NUÔI CẤY DỊCH ỐI LÀM NST ĐỒ
Thực hiện theo QTKT-DTTB-02, Bệnh viện Phụ sản Hà Nội
Nuôi cấy tế bào ối:
10mL dịch ối vào 2 ống Falcon vô trùng (quy trình lấy mẫu ối).
Ly tâm 800vòng/phút x 10 phút.
Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần lắng cặn khoảng 0,5mL trong có chứa các tế bào ối.
Bổ sung 4mL dung dịch Amniomax vào mỗi ống, trộn đều, chuyển vào chai nuôi cấy.
Nuôi cấy tế bào trong tủ ấm 37oC với 5% CO2 trong vòng 10 – 15 ngày.
Thu hoạch tế bào ối
Sau khi nuôi cấy 10 – 15 ngày, kiểm tra trên kính hiển vi soi ngược khi thấy hình ảnh nhiều tế bào phân chia: 
- Dừng quá trình phân bào ở kỳ giữa bằng 0,1mL Colcemid. Để tủ ấm 37o C với 5% CO2 trong vòng 3 giờ.
- Làm bong tế bào khỏi thành bình nuôi cấy bằng 3mL Trypsin 0,25% để tủ ấm 5 phút.
- Ly tâm 1800vòng/phút x 10 phút loại bỏ dịch nổi, lấy 0,5mL phần lắng cặn chứa tế bào. 
- Sốc nhược trương phá vỡ màng tế bào bằng dung dịch KCl 0,75M. Lúc này các NST được bung ra khỏi màng tế bào, ly tâm lấy phần lắng cặn.
- Cố định và làm sạch mẫu bằng dung dịch Carnoy (Acid acetic:Methanol = 1:3) 3 lần. 
- Ly tâm 1800 vòng/phút x 10 phút, lấy khoảng 0,5 - 1mL phần lắng cặn có chứa các cụm NST và nhân tế bào.
- Nhỏ dịch thu được lên lam kính.
- Nhuộm tiêu bản theo phương pháp nhuộm băng G.
3. Nhuộm tiêu bản
	Các tế bào ối sau khi thu hoạch được nhuộm bằng phương pháp nhuộm băng G để đánh giá các bất thường về số lượng và cấu trúc NST
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất:
Dụng cụ:	
5 cốc thủy tinh loại 100mL để đựng hóa chất và thuốc nhuộm.
2 cốc mỏ thủy tinh loại 500mL đựng nước rửa tiêu bản. 	
Hóa chất:	
Dung dịch Trypsin 0,01% (0,01g: 100mL nước muối 0,9%)
Các dung dịch đệm: KH2PO4 9,1g + nước cất vừa đủ 1000mL
Na2HPO4 11,9g + nước cất vừa đủ 1000mL
Dung dịch Giemsa 5%:	Dung dịch KH2PO4 (đã pha ở trên): 47,5 mL
Dung dịch Na2HPO4 (đã pha ở trên): 47,5 mL
Dung dịch Giemsa: 5 mL.
Các bước tiến hành (thực hiện trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm)
	Nhúng tiêu bản qua dung dịch NaCl 9‰ (100mL) khoảng 2 - 3 giây.
	Đặt tiêu bản vào cốc chứa dung dịch Trypsin (100mL) đã pha ở trên khoảng 7 - 10 phút.
	Rửa tiêu bản lặp lại 2 lần trong cốc đựng dung dịch NaCl 9‰ .
	Tiêu bản được nhuộm bằng thuốc nhuộm Giemsa 5% khoảng 10 - 15 phút.
Tất cả các tiêu bản nhuộm xong được rửa bằng cách nhúng qua 3 cốc nước sạch hoặc rửa dưới vòi nước chảy nhẹ để loại bỏ cặn thuốc nhuộm thừa.
Để tiêu bản khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
* Đánh giá
- Phân tích trên kính hiển vi với độ phóng đại x 1000 lần có chức năng chụp ảnh kết nối với hệ thống máy tính có phần mềm phân tích NST.
- Các cụm NST đủ tiêu chuẩn phân tích là những cụm có NST phân tán tốt, không chồng lên nhau, còn nền bào tương, kích thước NST không dài quá cũng không ngắn quá, băng rõ.
- Các cụm NST được phân tích về số lượng và cấu trúc:
+ Về số lượng: cụm 45, 46 hay 47 NST.
+ Về cấu trúc NST: bình thường và đột biến (chuyển đoạn, nhân đoạn, mất đoạn...).
- Mỗi mẫu được phân tích 30 cụm NST ở kỳ giữa, trường hợp khảm phân tích 100 cụm NST.
Phụ lục 5
PHIẾU THÔNG TIN BỆNH NHÂN
Thai phụ 	Mã số:
Họ và tên: 	Năm sinh:
Địa chỉ:	Điện thoại:
Nghề nghiệp:
Cân nặng (kg):	Chiều cao (cm):
Tiền sử nội khoa:	
Tiền sử mang thai bất thường: 	Loại bất thường:	
Ngày lấy mẫu:
Thai nhi	
Ngày siêu âm:	Tuổi thai:
CRL (chiều dài đầu mông):	NT (độ mờ da gáy): 
Kết quả xét nghiệm:	
Sàng lọc kết hợp thai kỳ 1 (CFTS):	
Triple test:	
Gia đình
- Gia đình bên chồng, bên vợ có ai bị sảy thai, thai chết lưu hoặc thai bất thường không?
- Gia đình bên chồng, bên vợ có ai mắc hoặc sinh con mắc các bệnh tật di truyền không? Đặc biệt các bệnh: Down, chậm phát triển trí tuệ.