Luận án Nghiên cứu hiệu quả hai phương pháp đông phôi chậm và đông phôi thủy tinh hóa

ĐẶT VẤN ĐỀ
Thành công của một quy trình thụ tinh trong ống nghiệm được thể hiện qua tỉ lệ mang thai. Hiện nay, xu hướng giảm số lượng phôi chuyển nhưng không làm giảm tỉ lệ mang thai. Việc lựa chọn phôi có chất lượng tốt nhất để chuyển, kết hợp với chương trình trữ lạnh sẽ giúp người bệnh tiết kiệm chi phí đáng kể, đồng thời góp phần cải thiện tỉ lệ thai cộng dồn trên một chu kỳ có kích thích buồng trứng và tăng tính an toàn của kỹ thuật điều trị. Theo thống kê của Van Voorhis (1995), trữ lạnh phôi có khả năng làm tăng tỉ lệ mang thai lên khoảng 6,6%, tính trên mỗi noãn thu được sau chọc hút và chi phí điều trị sẽ giảm 25-45% so với chu kì chuyển phôi tươi, bên cạnh đó kết quả sản khoa lại cao hơn hẳn[1],[2],[3],[4].
Đã có 2 phương pháp trữ lạnh được áp dụng là: Hạ nhiệt độ chậm và thủy tinh hóa. Sự khác biệt chính của 2 phương pháp này là tốc độ hạ nhiệt và nồng độ chất bảo quản.
Hạ nhiệt độ chậm được Whittingham giới thiệu lần đầu tiên vào những năm đầu thập niên 70 trên mô hình phôi chuột. Em bé đầu tiên từ phôi người đông lạnh trên thế giới ra đời bằng phương pháp này được ghi nhận vào năm 1983 [5].
Trong phương pháp hạ nhiệt độ chậm, mẫu tế bào được làm lạnh với tốc độ hạ nhiệt chậm (1-30C/1 phút) từ nhiệt độ sinh lý xuống nhiệt độ rất thấp (khoảng - 800C) trước khi đưa mẫu vào lưu trữ trong ni - tơ lỏng. Ngoài ra, tốc độ rã đông cũng diễn ra chậm, quá trình xâm nhập và loại bỏ các chất bảo vệ đông lạnh (CPA) được diễn ra qua nhiều bước nhỏ. Do nồng độ các CPA sử dụng thấp và trải qua nhiều bước, tế bào tránh được sốc thẩm thấu gây ra bởi nồng độ CPA, đồng thời khả năng gây độc cho tế bào thấp. 
Vào năm 1985, Rall và Fahy đã chứng minh được phôi chuột có thể được đông lạnh thành công bằng một phương pháp mới, được gọi là thủy tinh hóa(non - equylibrium cryopreservation method) [6]. Em bé đầu tiên trên thế giới ra đời bằng kỹ thuật này được báo cáo vào năm 2002 (Liebermann và cs.,2002; Shaw và Jones,2003) [7], [8].
Trong kỹ thuật thủy tinh hóa, ba yếu tố quan trọng góp phần vào sự thành công của kỹ thuật là nồng độ của các CPA sử dụng, tốc độ hạ nhiệt/làm ấm và thể tích mẫu trữ lạnh (Vajta và Nagy, 2006), (Yahin và Arav, 2007) [9],[10]. Để có thể chuyển một lượng môi trường có chứa phôi từ dạng lỏng thành dạng "kính", các CPA cần phải được sử dụng ở nồng độ rất cao. 
 Trong một thời gian khá dài, dù có những hạn chế về mặt hiệu quả nhưng hạ nhiệt độ chậm đã được xem là một phương pháp trữ lạnh chuẩn mực trong ngành công nghiệp chăn nuôi cũng như trong IVF trên người.
Trái lại, một khoảng thời gian dài sau khi được giới thiệu, thủy tinh hóa vẫn được xem là một kỹ thuật mang tính thử nghiệm vì nhiều lý do. Trong đó, lo ngại về các độc tính có thể có của việc sử dụng chất bảo quản nồng độ cao trên phôi và khó khăn trong việc thiết lập một hệ thống làm lạnh với tốc độ cao là những trở ngại chính. Vì vậy, cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới vẫn liên tục thực hiện các nghiên cứu so sánh ưu nhược điểm của 2 phương pháp, cũng như theo dõi sức khỏe, bệnh tật của những trẻ sinh ra từ 2 phương pháp trữ lạnh để đưa ra lựa chọn tối ưu an toàn.
Tại trung tâm hỗ trợ sinh sản Quốc Gia, kỹ thuật đông lạnh chậm được thực hiện thành công năm 2002, thủy tinh hóa bắt đầu triển khai năm 2006, với phôi giai đoạn phân chia (phôi ngày 2 và phôi ngày 3). Tại thời điểm nghiên cứu (2012- 2013), hầu hết các trung tâm hỗ trợ sinh sản ở Việt Nam, đều đã thực hiện thủy tinh hóa phôi mới và tiếp tục rã đông những phôi đã đông lạnh chậm. Tuy nhiên, chưa có một nghiên cứu theo dõi dọc nào tại Việt Nam, đánh giá hiệu quả các quy trình trữ lạnh thông qua các tiêu chí:tỷ lệ phôi sống, tỷ lệ có thai, tỉ lệ sinh sống, cũng như các yếu tố liên quan, tiên lượng kết quả có thai, theo dõi sự hình thành phát triển chiều cao, cân nặng, thể chất, trí tuệ, tâm vận động, bệnh tật từ khi sinh ra cho đến khi 4 tuổi để đưa ra tiên lượng cho sự phát triển tiếp theo cho những trẻ sinh ra từ 2 phương pháp này.
Do đó chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hiệu quả hai phương pháp đông phôi chậm và đông phôi thủy tinh hóa" với 2 mục tiêu:
1. Đánh giá đặc điểm phôi sau rã đông của hai phương pháp đông phôi chậm và đông phôi thủy tinh hóa.
2. Đánh giá một số yếu tố liên quan và tiên lượng của hai 2 phương pháp đông phôi chậm và đông phôi thủy tinh hóa.
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Những thay đổi bên trong tế bào trong quá trình trữ lạnh.
Hình 1.1. Phản ứng của phôi khi cho vào môi trường có chứa CPA [9]
(CPA: chất bảo vệ lạnh)
A: Phôi 4 phôi bào
B: Các phôi bào bị mất nước làm cho kích thước phôi co nhỏ (khi vừa tiếp xúc môi trường trữ lạnh).
C: Khi CPA đi vào bên trong phôi bào và thay thế lượng nước tế bào đã mất đi, lúc này kích thước của phôi được phục hồi.
Nguyên lý của trữ lạnh là giảm nhiệt độ của môi trường chứa mẫu tế bào hay mẫu mô xuống nhiệt độ rất thấp, thường là 196ºC (nhiệt độ sôi của ni-tơ lỏng). Ở nhiệt độ thấp này, hầu hết các hoạt động sinh học bên trong tế bào bao gồm các phản ứng sinh hoá và các hoạt động trao đổi chất bị ngừng lại.
Nhờ đó, tế bào sống ở dạng tiềm sinh (hybernate) và có thể bảo quản trong một thời gian rất dài. Với điều kiện nhiệt độ thấp, các phân tử nước, các chất hoà tan trong môi trường xung quanh cũng như các vật chất bên trong tế bào tồn tại dưới dạng kết hợp (dạng tinh thể và dạng kính), do đó, không có bất kỳ yếu tố nào từ môi trường bên trong cũng như bên ngoài có thể tác động đến tế bào trong giai đoạn này. Tuy nhiên, nhiệt độ cơ thể của đa số các loài được kiểm soát chặt chẽ, nhất là ở các động vật có vú. Do đó, trong quá trình trữ lạnh, việc hạ nhiệt độ của tế bào về mức dưới 0ºC có thể đưa tế bào vào một môi trường không sinh lý. Hậu quả là các tổn thương có thể xảy ra trong tất cả các giai đoạn của quá trình hạ nhiệt độ.
Trong quá trình làm lạnh và rã đông, một số thay đổi trong môi trường chứa tế bào và cả trong bản thân tế bào có thể ảnh hưởng đến cấu trúc, chức năng, sự toàn vẹn và khả năng sống của tế bào sau khi rã đông.
Một chu kỳ trữ lạnh thường trải qua ba giai đoạn quan trọng là
Đông lạnh: Đưa tế bào từ nhiệt độ sinh lý 37ºC xuống nhiệt độ rất thấp -196ºC.
Lưu trữ: Mẫu tế bào được bảo quản trong ni-tơ lỏng.
Rã đông: Đưa tế bào từ nhiệt độ thấp của ni-tơ lỏng về nhiệt độ sinh lý khi cần để tế bào tiếp tục phát triển.
Trong quá trình làm lạnh, tuỳ theo từng giai đoạn hạ nhiệt mà các tổn thương trên tế bào có thể khác nhau. Trong giai đoạn hạ nhiệt từ 15ºC đến -5ºC, các hạt lipid, các màng giàu lipid và các sợi vi ống bên trong tế bào có thể bị tổn thương [10]. Đây là những tổn thương không thể phục hồi khi đông lạnh noãn. So với những loài khác, các giọt lipid chứa trong tế bào noãn ở người tương đối thấp hơn. Nhưng điều này cũng không loại trừ khả năng tổn thương ở tế bào noãn người trong quá trình đông lạnh. Mặt khác, khoảng nhiệt độ này có thể gây tổn thương màng và polymer hoá các vi ống, do đó sẽ làm rối loạn khả năng sắp xếp của các nhiễm sắc thể trên mặt phẳng xích đạo khi tế bào phân chia và kết quả là gây hiện tượng lệch bội trong quá trình phân chia của tế bào [12].
Một số ảnh hưởng khác mà khoảng nhiệt độ này gây ra cho tế bào thường được nhắc đến như việc giảm tốc độ hoạt động của các men (enzyme) sử dụng các quá trình chuyển hoá của tế bào. Nghiên cứu cho thấy khi nhiệt độ giảm từ 37ºC xuống 7ºC hoạt động của các men giảm 8 lần. Tuy nhiên, ảnh hưởng của việc giảm hoạt động các men lên khả năng phát triển của tế bào sau này vẫn chưa được làm sáng tỏ [13]. Bên cạnh các khí hoà tan, môi trường nuôi cấy tế bào thường dùng khí CO2 làm hệ đệm để cân bằng pH trong môi trường. Khi nhiệt độ hạ xuống thấp, các khí này không còn ở dạng hoà tan trong môi trường nữa mà tách ra tạo thành các bọt khí. Số lượng và kích thước của các bọt khí càng lớn thì việc chèn ép làm tổn thương đến cấu trúc trong tế bào càng nghiêm trọng [14].
Khi tế bào được làm lạnh từ -5ºC đến -15ºC hiện tượng hình thành tinh thể đá từ các phân tử nước tinh khiết trong môi trường sát bên ngoài tế bào (môi trường ngoại bào) và ngay bên trong tế bào (môi trường nội bào) sẽ xuất hiện. Sự hình thành các tinh thể đá có thể gây tổn thương cơ học lên màng tế bào và các bào quan bên trong. Đây là giai đoạn gây tổn thương lớn nhất và quan trọng nhất mà tế bào phải trải qua trong quá trình làm lạnh và rã đông [11]. Nước là thành phần chiếm thể tích lớn nhất bên trong tế bào cũng như ở môi trường bên ngoài tế bào. Khi nhiệt độ càng giảm, số lượng phân tử nước chuyển thành tinh thể đá càng tăng, lượng nước ở thể lỏng giảm dần, hậu quả là nồng độ chất tan trong môi trường ngoại bào tăng gây mất cân bằng về áp lực thẩm thấu giữa tế bào với môi trường. Hậu quả là nước từ bên trong tế bào chất bị rút ra ngoài và kích thước tế bào trở nên co nhỏ. Nếu tế bào bị co nhỏ quá mức, sự tổn thương màng lipoprotein của tế bào xảy ra không thể phục hồi [15].
Tăng nhiệt độ tiềm tàng cũng là một hậu quả của sự hình thành các tinh thể đá. Các phân tử nước khi chuyển sang thế rắn sẽ giải thoát ra một lượng nhiệt. Nếu cùng một lúc có nhiều phân tử nước chuyển sang thể rắn thì nhiệt lượng thoát ra đủ lớn để làm thay đổi nhiệt độ đang từ vài độ âm lên 0ºC. Sự thay đổi nhiệt độ đột ngột này có thể làm ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của tế bào sau khi rã đông hay thậm chí làm tế bào chết ngay trong quá trình làm lạnh. Do đó, trong quá trình hạ nhiệt độ chậm, việc hạn chế các phân tử nước chuyển trạng thái cùng lúc là tối quan trọng.
Từ -50ºC đến -150ºC, tổn thương trên màng trong suốt nhưng đứt gãy màng trong suốt này không giống như sự đứt gãy màng trong suốt xảy ra do hiện tượng sốc thẩm thấu.
Ở nhiệt độ lưu trữ mẫu (dưới -150ºC thường là nhiệt độ của ni-tơ lỏng -196ºC), tế bào ít bị ảnh hưởng bất lợi nhất trong toàn bộ quy trình trữ lạnh. Tuy nhiên, những phản ứng tạo thành các gốc tự do và những sản phẩm đứt gãy của các đại phân tử bởi các bức xạ ion hoá hay các sản phẩm không mong muốn này, cũng như sự tác động của bức xạ có khả năng gây đứt gãy hoặc gây ra những tổn thương khác cho ADN. Mặc dù vậy, cho đến nay, vẫn chưa có một bằng chứng nào rõ ràng về ảnh hưởng của bức xạ lên mẫu tế bào lưu trữ trong ni-tơ lỏng.
1.2. Các biện pháp hạn chế tổn thương tế bào trong trữ lạnh.
1.2.1. Sử dụng chất bảo quản lạnh (CPA)
Sự hình thành tinh thể đá trong quá trình hạ nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất đến khả năng sống của tế bào sau một chu trình làm lạnh - rã đông [14]. Tinh thể đá được hình thành ngẫu nhiên ở bất kỳ vị trí nào bên trong và bên ngoài tế bào. Do đó, việc hạn chế hình thành các tinh thể đá là điều kiện tiên quyết để một chương trình trữ lạnh đạt tỉ lệ thành công cao. Việc phát hiện ra vai trò của glycerol trong trữ lạnh được xem là một phát kiến quan trọng, góp phần thúc đẩy kỹ thuật trữ lạnh phát triển [16]. Nhiều thử nghiệm khác đã được thực hiện với mục đích tìm ra những chất mới với khả năng bảo vệ tế bào sống trong suốt quá trình đông lạnh và rã đông tương tự glycerol. Những chất này được gọi một tên chung là các chất bảo vệ đông lạnh (CPA).
CPA là những chất có khả năng giống nhau là hoà tan được trong nước và gây cản trở sự chuyển trạng thái giữa nước và đá. Chúng tương tác với những phân tử sinh học với vai trò “thay thế nước” trong tế bào, nhờ đó hạn chế được sự hình thành các tinh thể đá nội bào khi nhiệt độ hạ thấp [17]. Một vai trò khác của CPA cũng không kém phần quan trọng là tế bào bảo vệ khi ở nhiệt độ thấp [11]. Do không tạo thành tinh thể, các CPA hạn chế sự gia tăng nồng độ của các chất hoà tan. Nó còn gắn kết lên màng bào tương để bảo vệ tế bào khi các phân tử nước ngoại bào bắt đầu chuyễn sang dạng tinh thể. Tuy nhiên, những ghi nhận về hiệu quả của từng loại CPA lên các tế bào khác nhau chỉ dựa trên quan sát thực tế, chưa được chứng minh về cơ chế [12]. Hai dạng CPA thường được sử dụng trong đông lạnh là CPA có khả năng thẩm thấu và CPA không có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào. Hai loại CPA này có tính chất và cách thức hoạt động khác nhau, nhưng hỗ trợ cho nhau trong vai trò là tác nhân khử nước bên trong tế bào, giúp hạn chế sự tạo thành tinh thể đá nội bào. Một điểm cần lưu ý là bên cạnh những lợi điểm đã nêu, hầu hết các CPA đều có khả năng gây độc tính. Độc tính của CPA tỉ lệ thuận với nồng độ và thời gian tiếp xúc, nhất là khi ở nhiệt độ sinh lý [11].
CPA có khả năng thẩm thấu là những phức hợp oligohydoxy (như ethanol hoặc các phức hợp của ethanol), hoà tan được trong nước, khả năng gây độc cho tế bào thấp và có thể xâm nhập vào tế bào qua màng bào tương nhờ khối lương phân tử nhỏ. Với những tính chất này, CPA có thể xâm nhập vào bên trong và thế chỗ các phân tử nước, giúp giảm sự hình thành tinh thể đá nội bào và do đó giảm tổn thương của các tế bào. Ngoài ra, sự hiện diện của các CPA này trong môi trường đông lạnh, làm cho nồng độ chất hoà tan trong môi trường ngoại bào, tăng lên đáng kể so với môi trường trong tế bào. Điều này gây ra sự mất cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa bên trong và bên ngoài tế bào. Đồng thời, vai trò thay thế các phân tử nước bên trong tế bào của CPA, giúp cho kích thước của tế bào nhanh chóng hồi phục, sau khi được rút khỏi tế bào, nhờ đó giảm được hiện tượng tổn thương màng nếu tế bào ở trạng thái co bào tương quá lâu.
Các loại CPA có khả năng thẩm thấu thường được sử dụng trong IVF bao gồm 1,2-propanediol (PROH) (hay propylene glycol), dimethylsulfoxide (DMSO), glycerol, hay 1,2-ethanediol (hay ethylene glycol - EG). Các CPA này thường hoạt động ở pha đầu tiên của quá trình khử nước. Ở pha đầu tiên này, khi tế bào tiếp xúc với một dung dịch có chứa CPA có khả năng thẩm thấu, sự hiện diện của những chất này ở môi trường ngoại bào tạo ra một chênh lệch về áp suất thẩm thấu, giúp rút nước ra khỏi tế bào. Đồng thời, các CPA sẽ từ từ đi vào bên trong tế bào, thay thế các phân tử nước. Vì khả năng thẩm thấu của màng bào tương đối với nước lớn hơn đối với các CPA, do đó, quá trình mất nước trong tế bào diễn ra nhanh hơn so với lượng CPA từ bên ngoài đi vào bên trong tế bào, thay thế các phân tử nước. Hậu quả là thể tích tế bào giảm nhanh trong thời gian đầu tiếp xúc với môi trường trữ lạnh. Sau đó, khi CPA đã thay thế hoàn toàn lượng nước mất, tế bào sẽ khôi phục hình dạng về thể tích ban đầu.
Như đã trình bày, có bốn loại CPA thường được sử dụng là glycerol, DMSO, EG và PROH. Các loại CPA trên có thể được sử dụng đơn lẻ hay phối hợp. Nhìn chung việc lựa chọn loại CPA nào sẽ phụ thuộc vào tính thẩm thấu của màng tế bào và khả năng gây độc của loại CPA đó. Glycerol hay còn gọi là glycerine, là một hợp chất đường của rượu. Glycerol có mặt nhiều trong tế bào gan của những loài động vật có khả năng sống trong điều kiện nhiệt độ rất thấp (ở các vùng cực) giúp cho máu của những động vật này không bị đông, do đó nó tương thích với những vật chất sinh hoá trong tế bào sống. Chính vì thế, khả năng gây độc của glycerol đối với tế bào được xếp vào loại thấp nhấ ...  TK, et al. (2010). “Chromosomal abnormalities in spontaneous abortion after assisted reproductive treatment”. BMC Med Genet. 2010;11:153. 
Martínez MC, Méndez C, Ferro J, et al. (2010). “Cytogenetic analysis of early nonviable pregnancies after assisted reproduction treatment”. Fertil Steril. 2010;93(1):289–92.
Wang X, Zhang X, Qin Y, Hao D, Shi H. Outcomes of day 3 embryo transfer with vitrification using Cryoleaf: a 3-year follow-up study. J Assist Reprod Genet. 2012;29(9):883–9. doi: 10.1007/s10815-012-9814-y. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
	SPelkonen, Gissler M2, Koivurova S3, et al (2015): “Physical health of singleton children born after frozen embryo transfer using slow freezing: a 3-year follow-up study”.Hum Reprod. 2015 Oct;30(10):2411-8. doi: 10.1093/humrep/dev203. Epub 2015 Aug 20.
	Ulla-Britt Wennerholm (2013). “Perinatal out conmes of children born aftr frozen thawed embryo transfer: a Nordic cohort study from the CoNart as group”. Hum Repreduction, Volume 28, Issue, 1 September 2013, Pages 2545-2553.
	F Belva, Bonduelle M, Roelants M, et al (2016): “ Neonatal health including congenital malformation risk of 1072 children born after vitrified embryo transfer”. Hum Reprod. 2016;31(7):1610–1620. 
	Osamu Kato, Kawasaki N, Bodri D, et al (2012): “Neonatal outcome and birth defects in 6623 singletons born following minimal ovarian stimulation and vitrified versus fresh single embryo transfer”. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2012;161(1):46–50. 
Shi W, Xue X, Zhang S, Zhao W, Liu S, Zhou H, et al. Perinatal and neonatal outcomes of 494 babies delivered from 972 vitrified embryo transfers. Fertil Steril. 2012;97(6):1338–42. 
	Antonina Sazonova; Karin (2012). “Obstetric outcome in singletons after invitro fertilization with cryopreser thawed embryos”. Human Reproduction: Volume 27, Issue5, 1 May 2012, pages 1343-1350.
	Belva F1, Henriet S, Van den Abbeel E, et al (2008). “Neonatal outcome of 937 children born after transfer of cryopreserved embryos obtained by ICSI and IVF and comparison with outcome data of fresh ICSI and IVF cycles”. Human Reproduction2008 Oct;23(10):2227-38.
Maheshwari A, Pandey S, Amalraj Raja E et al (2018), “Is frozen embryo transfer better for mothers and babies? Can cumulative meta-analysis provide a definitive answer?”Hum Reprod Update. 2018 Jan 1;24(1):35-58.
Gurleen Sharland (2018), “Bệnh học tim thai giản yếu (sổ tay thực hành)/ Đặng Ngọc Tuyên (Biên dịch)”, Nhà xuất bản Y học. 2018, tr 49-55.
Zhao Y, Abuhamad A, Fleenor J et al (2016), “Prenatal and Postnatal Survival of Fetal Tetralogy of Fallot: A Meta-analysis of Prenatal outcomes and associated genetic disorders”, J Ultrasound Med, 35(5), 905-915.
Bùi Hải Nam, Trần Danh Cường, Nguyễn Thị Hiệp Tuyết (2019), “Chẩn đoán trước sinh bất thường nhiễm sắc thể ở thai có tứ chứng Fallot”, Tạp chí Phụ sản, tập 16 (04), 06-2019, tr 06-10.
Dai W, Jiang Y, Gulinazi M el al (2015), “Application for prenatal diagnosis using both chromosomal karyotype analysis and BACs-on-Beads assay’, Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi, 35 (3), pp 357-360.
MỤC LỤC
CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: 	Một số dụng cụ được sử dụng phổ biến tại các trung tâm TTON trên thế giới	22
Bảng 2.1: 	Thời điểm quan sát phôi, và giai đoạn phát triển tương ứng ở từng thời điểm	50
Bảng 2.2. 	Đồng thuận đánh giá phôi ở giai đoạn phân chia	51
Bảng 2.3. 	Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi ngày 4	52
Bảng 3.1.	Đặc điểm mẫu phôi nghiên cứu.	57
Bảng 3.2. 	Số lượng phôi trước đông, sau rã, trước chuyển theo phân độ phôi.	59
Bảng 3.3. 	Mối tương quan giữa số lượng phôi tốt (độ 3) trước đông và số lượng phôi tốt (độ 3) sau rã của 2 phương pháp.	60
Bảng 3.4. 	Mối tương quan giữa số lượng phôi trung bình (độ 2) trước đông và số lượng phôi trung bình (độ 2) sau rã của 2 phương pháp.	60
Bảng 3.5. 	Mối tương quan giữa số lượng phôi xấu (độ 1) trước đông và số lượng phôi xấu (độ 1) sau rã của 2 phương pháp.	61
Bảng 3.6. 	Mối tương quan giữa số lượng phôi tốt (độ 3) sau rã và số lượng phôi tốt (độ 3) trước chuyển của 2 phương pháp.	61
Bảng 3.7. 	Mối tương quan giữa số lượng phôi trung bình (độ 2) sau rã và số lượng phôi trung bình (độ 2) trước chuyển của 2 phương pháp.	62
Bảng 3.8: 	Mối tương quan giữa số lượng phôi xấu (độ 1) sau rã và số lượng phôi xấu (độ 1) trước chuyển của 2 phương pháp.	62
Bảng 3.9: 	Mối tương quan giữa số lượng phôi tốt (độ 3) trước đông và số lượng phôi tốt (độ 3) trước chuyển của 2 phương pháp.	63
Bảng 3.10: 	Bảng giá trị ước lượng tính theo phương trình tương quan giữa số lượng phôi tốt trước đông và số lượng phôi tốt trước chuyển.	63
Bảng 3.11. 	Trung bình số phôi trước đông/ chu kỳ FET theo phân độ phôi.	65
Bảng 3.12. 	Trung bình số phôi sau rã/chu kỳ FET theo phân độ phôi.	66
Bảng 3.13. 	Trung bình số phôi trước chuyển/chu kỳ FET theo phân độ phôi	67
Bảng 3.14. 	Chất lượng phôi sau rã và trước chuyển tính theo tỷ lệ.	67
Bảng 3.15. 	Nhóm tuổi	68
Bảng 3.16. 	Điểm chuyển phôi	68
Bảng 3.17. 	Số phôi chuyển/ chu kỳ FET.	69
Bảng 3.18. 	Một số đặc điểm của 2 nhóm BN đông phôi ngày 2 và BN đông phôi ngày 3 của 2 phương pháp.	69
Bảng 3.19. 	Mối liên quan giữa tuổi vợ và kết quả có thai.	70
Bảng 3.20. 	Bảng giá trị tiên lượng kết quả có thai tại các điểm cắt của độ dày niêm mạc tử cung.	72
Bảng 3.21. 	Tỷ suất chênh về kết quả có thai giữa các nhóm độ dày niêm mạc tử cung.	73
Bảng 3.22. 	Bảng giá trị tiên lượng kết quả có thai tại các điểm cắt của số lượng phôi chuyển.	74
Bảng 3.23. 	Mối liên quan giữa có ≥1 phôi tốt trước đông và kết quả có thai.	74
Bảng 3.24. 	Mối liên quan giữa có ≥1 phôi trung bình (độ 2) trước đông và kết quả có thai.	75
Bảng 3.25. 	Mối liên quan giữa có ≥1 phôi xấu trước đông và kết quả có thai.	75
Bảng 3.26. 	Mối liên quan giữa có ≥1 phôi tốt sau rã và kết quả có thai.	76
Bảng 3.27. 	Mối liên quan giữa có ≥1 phôi trung bình (độ 2) sau rã và kết quả có thai.	77
Bảng 3.28. 	Mối liên quan giữa có ≥1 phôi xấu sau rã và kết quả có thai.	77
Bảng 3.29: 	Mối liên quan giữa có ≥1 phôi tốt trước chuyển và kết quả có thai.	78
Bảng 3.30. 	Mối liên quan giữa có ≥1 phôi trung bình (độ 2) trước chuyển và kết quả có thai.	78
Bảng 3.31. 	Mối liên quan giữa có ≥1 phôi xấu trước chuyển và kết quả có thai.	79
Bảng 3.32. 	Bảng giá trị tiên lượng kết quả có thai tại các điểm cắt của điểm chuyển phôi.	80
Bảng 3.33. 	Bảng giá trị tiên lượng kết quả có thai tại các điểm cắt của số lượng phôi tốt ngày 2 trước đông chậm.	81
Bảng 3.34. 	Bảng giá trị tiên lượng kết quả có thai tại các điểm cắt của số lượng phôi tốt ngày 2 trước đông thủy tinh hóa.	84
Bảng 3.35. 	Bảng giá trị tiên lượng kết quả có thai tại các điểm cắt của số lượng phôi tốt ngày 3 trước đông thủy tinh hóa.	86
Bảng 3.36. 	Bảng giá trị tiên lượng kết quả có thai tại các điểm cắt của số lượng phôi tốt ngày 2 sau rã đông chậm.	88
Bảng 3.37. 	Bảng giá trị tiên lượng kết quả có thai tại các điểm cắt của số lượng phôi tốt ngày 2 sau rã thủy tinh hóa	90
Bảng 3.38. 	Bảng giá trị tiên lượng kết quả có thai tại các điểm cắt của số lượng phôi tốt ngày 3 sau rã thủy tinh hóa.	92
Bảng 3.39. 	Bảng giá trị tiên lượng kết quả có thai tại các điểm cắt của số lượng phôi tốt ngày 2- đông chậm trước chuyển.	94
Bảng 3.40. 	Bảng giá trị tiên lượng kết quả có thai tại các điểm cắt của số lượng phôi tốt ngày 2- thủy tinh hóa trước chuyển.	96
Bảng 3.41. 	Bảng giá trị tiên lượng kết quả có thai tại các điểm cắt của số lượng phôi tốt ngày 3- thủy tinh hóa trước chuyển	98
Bảng 3.42. 	Phân tích hồi quy đa biến các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả có thai ở phương pháp thủy tinh hóa.	99
Bảng 3.43. 	Kết quả có thai và diễn biến thai kỳ sau chuyển phôi đông chậm.	100
Bảng 3.44. 	Kết quả có thai và diễn biến thai kỳ sau chuyển phôi thủy tinh hóa	101
Bảng 3.45. 	Tỷ lệ có thai và diễn tiến thai kỳ của 2 phương pháp.	102
Bảng 3.46. 	Cân nặng trung bình thô của trẻ sơ sinh trai, gái tương ứng với tuổi thai 28-42 tuần.	103
Bảng 3.47. 	Cân nặng, chiều cao trung bình thô của trẻ sơ trai, gái tương ứng từ 3 tháng đến 4 tuổi.	104
Bảng 3.48. 	Phát triển trí tuệ, tâm vận động, bệnh lý ở trẻ sinh ra sau chuyển phôi trữ lạnh.	105
Bảng 4.1. 	Giá trị của số lượng phôi tốt trước đông trong tiên lượng kết quả có thai	127
Bảng 4.2. 	Giá trị của số lượng phôi tốt sau rã trong tiên lượng kết quả có thai	129
Bảng 4.3. 	Giá trị của số lượng phôi tốt trước chuyển trong tiên lượng kết quả có thai	131
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: 	Diễn biến chất lượng phôi theo các thời điểm: trước đông, sau rã, trước chuyển.	64
Biểu đồ 3.2. 	Mối liên quan giữa độ dày niêm mạc tử cung và kết quả có thai.	71
Biểu đồ 3.3. 	Mối liên quan giữa số lượng phôi chuyển và kết quả có thai.	73
Biểu đồ 3.4. 	Mối liên quan giữa điểm chuyển phôi và kết quả có thai.	79
Biểu đồ 3.5. 	Đường biểu thị độ nhạy, độ đặc hiệu (ROC) của số lượng phôi tốt ngày 2 trước đông chậm trong tiên lượng kết quả có thai.	80
Biểu đồ 3.6. 	Đường biểu thị độ nhạy, độ đặc hiệu (ROC) của số lượng phôi tốt ngày 3 trước đông chậm trong tiên lượng kết quả có thai.	82
Biểu đồ 3.7. 	Đường biểu thị độ nhạy, độ đặc hiệu (ROC) của số lượng phôi tốt ngày 2 trước đông thủy tinh hóa trong tiên lượng kết quả có thai.	83
Biểu đồ 3.8. 	Đường biểu thị độ nhạy, độ đặc hiệu (ROC) của số lượng phôi tốt ngày 3 trước đông thủy tinh hóa trong tiên lượng kết quả có thai.	85
Biểu đồ 3.9. 	Đường biểu thị độ nhạy, độ đặc hiệu (ROC) của số lượng phôi tốt ngày 2 sau rã đông chậm trong tiên lượng kết quả có thai.	87
Biểu đồ 3.10. 	Đường biểu thị độ nhạy, độ đặc hiệu (ROC) của số lượng phôi tốt ngày 3 sau rã đông chậm trong tiên lượng kết quả có thai.	89
Biểu đồ 3.11. 	Đường biểu thị độ nhạy, độ đặc hiệu (ROC) của số lượng phôi tốt ngày 2 sau rã thủy tinh hóa trong tiên lượng kết quả có thai.	89
Biểu đồ 3.12. 	Đường biểu thị độ nhạy, độ đặc hiệu (ROC) của số lượng phôi tốt ngày 3 sau rã thủy tinh hóa trong tiên lượng kết quả có thai.	91
Biểu đồ 3.13. 	Đường biểu thị độ nhạy, độ đặc hiệu (ROC) của số lượng phôi tốt ngày 2- đông chậm trước chuyển trong tiên lượng kết quả có thai.	93
Biểu đồ 3.14. 	Đường biểu thị độ nhạy, độ đặc hiệu (ROC) của số lượng phôi tốt ngày 3- đông chậm trước chuyển trong tiên lượng kết quả có thai.	95
Biểu đồ 3.15. 	Ðường biểu thị độ nhạy, độ đặc hiệu (ROC) của số lượng phôi tốt ngày 2- thủy tinh hóa trước chuyển trong tiên lượng kết quả có thai.	95
Biểu đồ 3.16. 	Đường biểu thị độ nhạy, độ đặc hiệu (ROC) của số lượng phôi tốt ngày 3- thủy tinh hóa trước chuyển trong tiên lượng kết quả có thai.	97
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. 	Phản ứng của phôi khi cho vào môi trường có chứa CPA	3
Hình 1.2. 	Bình chứa ni tơ lỏng trữ phôi	12
Hình 1.3. 	Máy Cryologic	13
Hình 1.4. 	Máy Planner	13
Hình 1.5. 	Sơ đồ hạ nhiệt độ trong hạ nhiệt độ chậm	17
Hình 1.6. 	Cryoloop	24
Hình 1.7. 	Cryotop	25
Hình 1.8. 	Cryotec	26
Hình 1.9. 	Cryotip	27
Hình 1.10. 	HSV straw	27
Hình 1.11. 	Rapid-I	28
Hình 2.1.	Sơ đồ nghiên cứu nhóm phôi đông chậm	47
Hình 2.2.	Sơ đồ nghiên cứu nhóm phôi thủy tinh hóa	48
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO	 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
PHAN THỊ THANH LAN
nghiªn cøu hiÖu qu¶ hai ph­¬ng ph¸p
§«ng ph«i chËm vµ ®«ng ph«i thñy tinh hãa
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
HÀ NỘI - 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO	 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
PHAN THỊ THANH LAN
nghiªn cøu hiÖu qu¶ hai ph­¬ng ph¸p
§«ng ph«i chËm vµ ®«ng ph«i thñy tinh hãa
Chuyên ngành : Sản phụ khoa 
 Mã số : 62720131
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học: 
GS.TS. NGUYỄN VIẾT TIẾN
HÀ NỘI - 2020
LỜI CẢM ƠN
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS.TS. Nguyễn Viết Tiến, người thầy đã truyền đạt những kiến thức sâu rộng, cũng như tạo điều kiện tốt nhất, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận án. Thầy là tấm gương sáng để em suốt đời học tập và noi theo.
Em luôn luôn ghi nhớ và biết ơn các Thầy Cô trong Bộ môn Phụ sản, Bộ môn Nghiên cứu khoa học, Bộ môn Mô phôi, Bộ môn Nhi, các Thầy Cô trong Hội đồng chấm đề cương, các học phần, cũng như chuyên đề, tiểu luận tổng quan, Hội đồng chấm luận án cơ sở đã luôn chỉ bảo, cho em các ý kiến quý báu để hoàn chỉnh luận án.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau Đại học, các phòng ban chức năng của Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin gửi tới lãnh đạo và toàn thể đồng nghiệp trong Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốc gia - Bệnh viện Phụ sản Trung ương, Bệnh viện Phụ sản Hải Phòng, lời cảm ơn chân thành vì đã luôn giúp đỡ về mọi mặt trong công việc, cũng như trong học tập để tôi có thể yên tâm học tập và nghiên cứu.
Tôi xin đặc biệt cảm ơn những bệnh nhân đã đồng ý tham gia nghiên cứu này. Những người đã rất tin tưởng, hợp tác, cung cấp những thông tin cá nhân, giúp tôi có được những dữ liệu quý báu để hoàn thành luận án này.
Tôi xin mãi ghi lòng tạc dạ những tình cảm và công ơn này.
Ngày tháng năm 2020
Phan Thị Thanh Lan
LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Phan Thị Thanh Lan nghiên cứu sinh khóa 31 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Sản phụ khoa xin cam đoan:
Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Nguyễn Viết Tiến.
Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam.
Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Tác giả
Phan Thị Thanh Lan
CHỮ VIẾT TẮT
BG 	: butylene glycol
BN	: Bệnh nhân
CPA 	: Cryoprotective agents (Các chất bảo vệ đông lạnh)
Dex 	: dextran.
DMSO 	: Dimethyl sulfoxide 
EG 	: ethylene glycol. 
FET 	: Frozen Embryo Transfer (Chuyển phôi đông lạnh)
Fic 	: Ficoll
Gly 	: Glycerol.
HPC 	: hydroxypropyl cellulose
IVF 	: Thụ tinh trong ống nghiệm
Me2SO 	: dimethylsulfoxide 
Met 	: methanol
NMTC 	: Niêm mạc tử cung
PEG 	: polyethylene glycol
PG 	: propylene glycol.
PR 	: Pregnance rate (tỷ lệ có thai)
PROH 	: 1,2 – propanediol hay propylene glycol
PVP 	: polyvilylpyrrolidone
SR 	: Survial rate (tỷ lệ sống)
TB 	: Tế bào
3,12,13,24-28,64,69,71-74,79-98,103,104,180
1-2,4-11,14-23,29-63,65-68,70,75-78,99-102,105-178,181-