Luận án Nghiên cứu phát hiện và xây dựng quy trình phân lập tetrodotoxin và một số độc tố thần kinh khác từ cá nóc

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
VIỆN DƯỢC LIỆU 
===o0o=== 
PHÙNG MINH DŨNG 
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ 
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN LẬP 
TETRODOTOXIN VÀ MỘT SỐ ĐỘC TỐ 
THẦN KINH KHÁC TỪ CÁ NÓC 
LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC 
HÀ NỘI, 2017 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
VIỆN DƯỢC LIỆU 
===o0o=== 
PHÙNG MINH DŨNG 
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ 
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN LẬP 
TETRODOTOXIN VÀ MỘT SỐ ĐỘC TỐ 
THẦN KINH KHÁC TỪ CÁ NÓC 
LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC 
CHUYÊN NGÀNH : Dược học cổ truyền 
MÃ SỐ : 62720406 
Người hướng dẫn khoa học : PGS. TS. Trần Việt Hùng 
PGS. TS. Nguyễn Tiến Vững 
HÀ NỘI, 2017 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng 
dẫn của PGS. TS. Trần Việt Hùng và PGS. TS. Nguyễn Tiến Vững. 
Các số liệu và kết quả được trình bày trong Luận án là trung thực và chưa từng 
được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. 
Người cam đoan 
Phùng Minh Dũng 
LỜI CẢM ƠN 
Trong quá trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận 
được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các tập thể, thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc 
nhiều lĩnh vực, cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. 
Trước hết, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn 
chân thành tới: PGS. TS. Trần Việt Hùng, PGS. TS. Nguyễn Tiến Vững những người 
thày đã tận tình hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt 
quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. 
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo, Phòng Quản lý Khoa học và Đào tạo 
– Viện Dược liệu đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và 
nghiên cứu 
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: 
PGS. TS. Nguyễn Tiến Đạt - Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam 
TS. Trần Minh Ngọc – Phó Viện trưởng, Viện Dược liệu 
ThS. Dương Minh Tân – Khoa Nghiên cứu phát triển, Viện Kiểm nghiệm thuốc 
Trung ương 
TS. Nguyễn Hoài Nam – Phó Viện trưởng, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm 
KHCN Việt Nam 
PGS. TS. Đỗ Thị Hà – Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu 
TS. Trịnh Thị Điệp – Khoa Hóa học, Trường Đại học Đà Lạt 
 đã tạo mọi điều kiện phối hợp, giúp đỡ và đóng góp ý kiến quý báu cho tôi hoàn 
thiện luận án này. 
Cuối cùng, tôi xin cám ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn bên tôi, động 
viên, khích lệ tôi giúp tôi học tập, làm việc và hoàn thành luận văn này. 
Xin chân thành cảm ơn! 
 NCS. Phùng Minh Dũng 
MỤC LỤC 
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................................ 0 
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... 0 
MỤC LỤC ........................................................................................................................... 0 
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ....................................................... 0 
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................................. 0 
DANH MỤC CÁC HÌNH................................................................................................... 0 
MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1 
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ............................................................................................... 3 
1.1. CÁ NÓC ..................................................................................................................... 3 
1.1.1. Phân loại .............................................................................................................. 3 
1.1.2. Phân bố ................................................................................................................ 3 
1.1.3. Đặc điểm nhận dạng ............................................................................................ 2 
1.2. TETRODOTOXIN ...................................................................................................... 4 
1.2.1. Cấu trúc tetrodotoxin và các độc tố tương tự tetrodotoxin .................................. 4 
1.2.2. Phân bố và nguồn gốc của tetrodotoxin trong tự nhiên ....................................... 7 
1.2.3. Hàm lượng của tetrodotoxin và các dẫn chất trong cá nóc ............................... 13 
1.2.4. Độc tính của tetrodotoxin và các dẫn chất ........................................................ 15 
1.2.5. Tác dụng sinh học và cơ chế ............................................................................. 17 
1.2.6. Khả năng ứng dụng của tetrodotoxin trong y học ............................................. 20 
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ TETRODOTOXIN ................................... 27 
1.3.1. Một số phương pháp chiết xuất, phân lập tetrodotoxin từ tự nhiên .................. 27 
1.3.2. Một số phương pháp điều chế khác ................................................................... 30 
1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG TETRODOTOXIN VÀ 
DẪN CHẤT ..................................................................................................................... 33 
1.4.1. Phương pháp sinh hóa ....................................................................................... 33 
1.4.2. Phương pháp quang phổ .................................................................................... 34
1.4.3. Phương pháp sắc ký ........................................................................................... 35 
1.4.4. Phương pháp phổ khối ....................................................................................... 38 
1.4.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ................................................................. 41 
1.5. CHẤT CHUẨN VÀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ................................................ 43 
1.5.1. Chất chuẩn đối chiếu hóa học ............................................................................ 43 
1.5.2. Phương pháp thiết lập chất chuẩn ...................................................................... 43 
1.5.3. Đánh giá liên phòng thí nghiệm ........................................................................ 43 
1.5.4. Chất chuẩn tetrodotoxin .................................................................................... 44 
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 
CỨU ................................................................................................................................... 46 
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................................. 46 
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ............................................................................. 46 
2.2.1. Hóa chất thuốc thử ............................................................................................. 46 
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................................ 46 
2.2.3. Đôṇg vâṭ thí nghiêṃ .......................................................................................... 48 
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................... 49 
2.3.1. Thu mẫu, định danh, xử lý mẫu, bảo quản, vận chuyển cá nóc từ nơi thu mẫu 
đến phòng thí nghiệm .................................................................................................. 49 
2.3.2. Nghiên cứu phát hiện, định tính, định lượng tetrodotoxin ................................ 51 
2.3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học, phân lập tetrodotoxin và dẫn chất từ một số 
loài cá nóc .................................................................................................................... 55 
2.3.4. Chiết xuất và tinh chế tetrodotoxin làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn ........ 56 
2.3.5. Thiết lập chất chuẩn tetrodotoxin ...................................................................... 57 
2.3.6. Bào chế và tiêu chuẩn hóa bột đông khô tetrodotoxin 0,1 % ............................ 59 
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 63 
3.1. XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU VỀ NGUỒN CÁ NÓC TETRADONTIDAE CÓ 
CHỨA TETRODOTOXIN ............................................................................................... 63 
3.2. NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ THẦN KINH Ở MỘT SỐ LOÀI CÁ NÓC 
(TETRAODONTIDAE) .................................................................................................... 64
3.2.1. Xác định nhanh độc tố của phủ tạng một số loài cá nóc ................................... 64 
3.2.2. Xử lý mẫu, làm sạch qua cột chiết pha rắn ........................................................ 64 
3.2.3. Định tính tetrodotoxin bằng sắc ký lớp mỏng ................................................... 67 
3.2.4. Nghiên cứu phát hiện tetrodotoxin và một số độc tố thần kinh khác từ một số 
loài cá nóc bằng các phương pháp hiện đại ................................................................. 69 
3.2.5. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng tetrodotoxin bằng sắc ký lỏng 
khối phổ (LC/MS) ....................................................................................................... 72 
3.2.6. Khảo sát hàm lượng tetrodotoxin trong một số bộ phận của một số loài cá nóc
 ..................................................................................................................................... 75 
3.3. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, PHÂN LẬP TETRODOTOXIN VÀ 
CÁC DẪN CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI CÁ NÓC .......................................................... 80 
3.3.1. Phát hiện tetrodotoxin và nhóm chất tương tự tetrodotoxin (TTXs) từ một số 
loài cá nóc độc ............................................................................................................. 80 
3.3.2. Xây dựng quy trình phân lập tetrodotoxin và một số độc tố thần kinh từ một số 
loài cá nóc .................................................................................................................... 84 
3.3.3. Phân tích xác định cấu trúc các độc tố phân lập được từ 5 loài cá nóc ............. 84 
3.4. NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ TETRODOTOXIN Ở QUY MÔ 
PHÒNG THÍ NGHIỆM ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ...... 92 
3.4.1. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập tetrodotoxin thô ............................................. 92 
3.4.2. Tinh chế tetrodotoxin bằng sắc ký lỏng điều chế .............................................. 95 
3.5. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA NGUYÊN LIỆU TETRODOTOXIN .. 98 
3.6. NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN TETRODOTOXIN .......................... 98 
3.6.1. Nghiên cứu độ ổn định của tetrodotoxin trong một số dung môi ...................... 98 
3.6.2. Nghiên cứu quy trình đóng ống chuẩn, 100 µg chất/lọ 1 ml, sử dụng dung môi 
thích hợp ...................................................................................................................... 99 
3.6.3. Kiểm tra đánh giá chất lượng ống chuẩn ......................................................... 100 
3.7. BÀO CHẾ BỘT ĐÔNG KHÔ TETRODOTOXIN 0,1 % ...................................... 102 
3.7.1. Bào chế bột đông khô ...................................................................................... 102 
3.7.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm nghiệm sản phẩm ................................... 103 
3.7.3. Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của bột đông khô 0,1% ................. 103
CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN ....................................................................................... 114 
4.1. VỀ CƠ SỞ DỮ LIỆU NGUỒN CÁ NÓC VÀ ĐỘC TỐ CÁ NÓC ...................... 114 
4.2. VỀ NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN, ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH 
LƯỢNG ĐỘC TÍNH, ĐỘC TỐ THẦN KINH TETRODOTOXIN VÀ CÁC CHẤT 
TƯƠNG TỰ TETRODOTOXIN ................................................................................... 115 
4.2.1. Sàng lọc, phát hiện độc tính bằng phương pháp sinh hóa chuột ..................... 115 
4.2.2. Các phương pháp định tính tetrodotoxin và dẫn chất ..................................... 115 
4.2.3. Các phương pháp định lượng tetrodotoxin ...................................................... 116 
4.3. PHÂN LẬP TETRODOTOXIN VÀ NHÓM CHẤT TƯƠNG TỰ TETRODOTOXIN 
TỪ MỘT SỐ LOÀI CÁ NÓC THU ĐƯỢC TỪ VÙNG BIỂN VIỆT NAM ............... 117 
4.4. VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ TETRODOTOXIN ĐẠT ĐỘ 
TINH KHIẾT LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN .......................... 119 
4.4.1. Chiết xuất ......................................................................................................... 119 
4.4.2. Tinh chế ........................................................................................................... 121 
4.5. THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN TETRODOTOXIN .................................................. 122 
4.6. BỘT ĐÔNG KHÔ TETRODOTOXIN 0,1 % ........................................................ 122 
4.7. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ...................................................................... 123 
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................................................ 125 
KẾT LUẬN ................................................................................................................... 125 
ĐỀ XUẤT ..................................................................................................................... 126 
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .................................................... 127 
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU 
ATCC : Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Mỹ (American Type Culture Collection) 
CI : Kỹ thuật ion hoá hoá học (Chemical ionization) 
COSY : Correlation Spectroscopy 
cs. : Cộng sự 
DEPT : Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer 
ĐVTN : Động vật thử nghiệm 
EI : Kỹ thuật ion hoá điện tử (Electron Ionization) 
ELISA : Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme Linked 
Immunosorbent Assay) 
ESI : Kỹ thuật ion hoá phun sương điện tử (Electric spray ionic) 
ED50 Liều của chất phơi nhiễm, trong cùng một thời điểm, gây ra ảnh hưởng sinh học 
khác nhau cho 50% (một nửa) của một nhóm động vật thử nghiệm (Effective 
Dose 50) 
FAB : Kỹ thuật bắn phá nguyên tử nhanh (Fast Atom Bombardment) 
FLD : Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector) 
FT ICR : Phổ cộng hưởng từ gia tốc ion chuyển dạng Fourier (Fourier transform ion 
cyclotron resonance) 
GC-MS : Sắc ký khí khối phổ (Gas chromatography - Mass spectrum) 
HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation 
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) 
HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence 
LC MS : Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography Mass spectrum) 
LC MS/MS : Sắc ký lỏng khối phổ ghép nối khối phổ (Liquid Chromatography tandem Mass 
spectrum) 
LD100 : Liều tối thiểu c ... 2 – 21 cm, nhưng nhóm chiều dài 12 – 16 
cm có tỷ lệ cao hơn cả. Chiều dài thành thục của loài khoảng 17– 19 cm. 
Chúng có xuất hiện cả ở vùng biển sâu và cả ở các cửa sông hay ở các vùng nước 
lợ ven bờ. 
Đây là loài thường sống thành đàn ở đáy và ăn tạp. 
 PL-12 
1.6.3. Hình ảnh tiêu bản 
Cá Nóc Vàng 
Lagocephalus spadiceus 
(J. Richardson, 1845) 
 Địa điểm thu mẫu: Nha 
Trang, Khánh Hoà 
 Thời gian thu mẫu: 
08/2012 
 Người thu mẫu: TS. 
Đào Việt Hà, Viện Hải 
Dương học Nha Trang 
 Nơi lưu mẫu: Phòng 
nghiên cứu độc tố cá 
nóc, Khoa Nghiên cứu 
phát triển, Viện Kiểm 
nghiệm thuốc Trung 
ương 
 PL-13 
Phụ lục 1.7. Cá nóc răng mỏ chim 
1.7.1. Danh pháp 
Phân loại khoa học 
- Giới: Animalia 
- Ngành: Chordata 
- Lớp: Actinopterygii 
- Bộ: Tetraodontiformes 
- Họ: Tetraodontidae, họ phụ Tetraodontinae 
- Chi: Lagocephalus 
- Loài: L. inermis 
Tên khoa học: Lagocephalus inermis (Temminck & Schlegel, 1850) 
Tên địa phương: Cá nóc, Cá nóc vàng 
Tên tiếng anh: Smooth blaasop, Smooth puffer 
Tên khác: Buntal pisang, Buntal timah (Malaysia), Smooth-backed blowfish (Ấn độ) 
1.7.2. Đặc điểm sinh thái 
Thân hình quả đạn. 
Gai nhỏ không có ở mặt lưng, chỉ có ở mặt bụng và phân bố phía trước lỗ hậu môn. 
Vây đuôi lõm nhẹ. Mỗi bên thân có một đường gờ ngăn cách mặt bên và mặt bụng. 
Lỗ mang màu đen. 
Răng dạng bản, hình mỏ chim, cứng, sắc và có màu trắng. 
Bên lưng thân và đầu có màu nâu tro, không có chấm đen hay vằn vện. 
Vây ngực, hai bên đầu ngang với lỗ mang và lườn có màu vàng kim, mặt bụng màu 
trắng. Vây lưng, vây đuôi có màu vàng nhạt, đoạn cuối chuyển dần thành màu xám 
đen. 
Loài này có kích thước tối đa khá lớn, TL đạt tới 95 cm. Chiều dài khai thác được 
ở Việt nam dao động trong khoảng 19 – 30 cm, nhưng chiều dài 20 – 22 cm chiếm tỷ 
lệ cao. 
Loài cá này thường được tìm thấy ở các dốc thềm lục địa. 
Cá sống ở đáy, ăn tạp. 
 PL-14 
1.7.3. Hình ảnh tiêu bản 
Cá Nóc Răng Mỏ Chim 
Lagocephalus inermis 
(Temminck & Schlegel, 
1850) 
 Địa điểm thu mẫu: 
Nha Trang, Khánh 
Hoà 
 Thời gian thu mẫu: 
08/2012 
 Người thu mẫu: TS. 
Đào Việt Hà, Viện 
Hải Dương học Nha 
Trang 
 Nơi lưu mẫu: Phòng 
nghiên cứu độc tố cá 
nóc, Khoa Nghiên 
cứu phát triển, Viện 
Kiểm nghiệm thuốc 
Trung ương 
 PL-15 
Phụ lục 1.8. Cá Nóc chấm cam vằn mắt 
1.5.1. Danh pháp 
Phân loại khoa học: 
- Giới: Animalia 
- Ngành: Chordata 
- Lớp: Actinopterygii 
- Bộ: Tetraodontiformes 
- Họ: Tetraodontidae, họ phụ Tetraodontinae 
- Chi: Torquigener 
- Loài: Torquigener Brevipinnis 
Tên khoa học: Torquigener Brevipinnis (Regan, 1903) 
Tên địa phương: Cá nóc, Cá nóc vằn mắt, Cá nóc mít 
Tên tiếng Anh: Brown-spotted puffer 
Tên khác: Yellow-stripe toadfish (Indonesia) 
1.8.2. Đặc điểm sinh thái: 
Trên thân có gai nhỏ, tương đối ngắn, nằm sát vào da, và thưa. Gai ở mặt lưng và mặt 
bụng nối liền với nhau ở hai bên thân phía trước khe mang và phía sau vây ngực, nhưng 
không có ở khoảng giữa vây lưng và vây hậu môn. 
Đường gờ ngăn cách mặt bên và mặt bụng nổi thành cạnh rõ ràng. 
Mõm tù, cằm thẳng đứng và khe miệng cao hơn hoặc bằng rìa trên gốc vây ngực. 
Đầu và mặt lưng màu nâu vàng, trên đó có nhiều chấm trắng, lớn nhỏ không đều. 
Hai bên đầu có 4 – 5 đường vằn ngang màu nâu. 
Chạy dọc 2 bên thân, từ gốc vây ngực đến gốc vây đuôi là hai hàng các chấm màu 
cam, đường trên dày và đậm màu hơn đường dưới. 
Khác với cá Nóc chấm cam (Torquigener gloerfelti), cá Nóc chấm cam có đầu và 
mặt lưng có các chấm nâu nhỏ phân bố dày đặc, chúng sắp xếp tạo ra một số hoa tròn, 
màu trắng, có kích thước lớn hơn chúng. Các hoa đó phân bố rải rác và khá đều trên 
mặt lưng. Dọc hai bên thân có một số chấm nâu lớn, phân bố rải rác và không xếp thẳng 
hàng trên nền xám nâu. 
Trên các tia vây đuôi có các vằn ngang màu nâu còn cá Nóc chấm cam có rìa sau vây 
đuôi màu đen. 
 PL-16 
Trong số mẫu thu được, chiều dài tối đa TL là 16,8 cm và nhóm chiều dài thường 
gặp nằm trong khoảng 9 – 12 cm. 
Đây là loài sống đáy và ăn tạp, chúng thường sống ở vùng biển tương đối sâu (34 – 
100 m), thuộc vùng cận nhiệt đới. 
1.8.3. Hình ảnh tiêu bản 
Cá Nóc Vằn Mắt 
Torquigener Brevipinnis (Regan, 
1903) 
 Địa điểm thu mẫu: Nha 
Trang, Khánh Hoà 
 Thời gian thu mẫu: 08/2012 
 Người thu mẫu: TS. Đào 
Việt Hà, Viện Hải Dương 
học Nha Trang 
 Nơi lưu mẫu: Phòng nghiên 
cứu độc tố cá nóc, Khoa 
Nghiên cứu phát triển, Viện 
Kiểm nghiệm thuốc Trung 
ương 
 PL-17 
Phụ lục 1.9. Cá nóc chấm cam 
1.9.1. Danh pháp 
Phân loại khoa học 
- Giới: Animalia 
- Ngành: Chordata 
- Lớp: Actinopterygii 
- Bộ: Tetraodontiformes 
- Họ: Tetraodontidae, họ phụ Tetraodontinae 
- Chi: Torquigener 
- Loài: T. gloerfelti 
Tên khoa học: Torquigener gloerfelti (Hardy, 1984) 
Tên địa phương: Cá nóc, Cá nóc chấm cam, Cá nóc mít 
Tên tiếng Anh: Rusty spotted toadfish 
Tên khác: 南海窄額魨 (Trung quốc) 
1.9.2. Đặc điểm sinh thái 
Gai trên thân nhỏ, tương đối ngắn, nằm sát vào da, và thưa. Gai ở mặt lưng và mặt bụng 
nối liền với nhau ở hai bên thân phía trước khe mang và phía sau vây ngực, nhưng không 
có ở khoảng giữa vây lưng và vây hậu môn. 
Đường gờ ngăn cách mặt bên và mặt bụng nổi thành cạnh rõ ràng. 
Mõm tù, cằm thẳng đứng và khe miệng cao hơn hoặc bằng rìa trên gốc vây ngực. 
Đầu và mặt lưng có các chấm nâu nhỏ phân bố dày đặc, chúng sắp xếp tạo ra một số hoa 
tròn, màu trắng, có kích thước lớn hơn chúng. Các hoa đó phân bố rải rác và khá đều 
trên mặt lưng. Dọc hai bên thân có một số chấm nâu lớn, phân bố rải rác và không xếp 
thẳng hàng trên nền xám nâu. Rìa sau vây đuôi màu đen. 
Chiều dài tối đa TL của cá là 22 cm và thường bắt gặp được các cá thể có chiều dài nằm 
trong khoảng 13 – 18 cm. Chiều dài thành thục của loài nằm trong khoảng 18 – 20 cm. 
Loài này sống ở đáy, ven bờ và là loài ăn tạp. 
 PL-18 
1.9.3. Hình ảnh tiêu bản 
Cá Nóc chấm cam 
Torquigener gloerfelti 
(Hardy, 1984) 
 Địa điểm thu mẫu: Nha 
Trang, Khánh Hoà 
 Thời gian thu mẫu: 
08/2012 
 Người thu mẫu: TS. 
Đào Việt Hà, Viện Hải 
Dương học Nha Trang 
 Nơi lưu mẫu: Phòng 
nghiên cứu độc tố cá 
nóc, Khoa Nghiên cứu 
phát triển, Viện Kiểm 
nghiệm thuốc Trung 
ương 
 PL-19 
Phụ lục 1.10. Cá nóc vằn 
1.10.1. Danh pháp 
Phân loại khoa học 
- Giới: Animalia 
- Ngành: Chordata 
- Lớp: Actinopterygii 
- Bộ: Tetraodontiformes 
- Họ: Tetraodontidae, họ phụ Tetraodontinae 
- Chi: Takifugu 
- Loài: T. Oblongus 
Tên khoa học: Takifugu Oblongus (Bloch, 1786) 
Tên Việt Nam: Cá nóc vằn, cá Nóc hổ 
Tên địa phương: Cá nóc, Cá nóc hổ, Cá nóc trần, Cá nóc bông 
Tên gọi ở một số nước: Oblong blow fish (Anh), Lattice blaasop (India), Bebo (India), 
Ikan Buntal (Malaysia), Pita-pita (Indonesia), Ruitjies-blaasop (South Africa), 
Honfugu (Nhật Bản) 
1.10.2. Đặc điểm sinh thái 
Gai nhỏ phân bố ở mặt lưng, mặt bụng nối liền với hai bên thân ở phía trước khe mang 
và phía sau vây ngực. Gai không có ở hai bên bắp đuôi. 
Trên cơ thể có đường bên và đường gờ ngăn cách mặt bên và mặt bụng. 
Khe miệng thấp hơn rìa trên gốc vây ngực. 
Trên đầu và lưng màu nâu với các chấm vàng nhạt lớn nhỏ không đều. 
Hai bên đầu, lưng có nhiều vân màu nâu và màu vàng nhạt xen kẽ như da hổ. Phía cuối 
lưng và trên bắp đuôi, các vân này có dạng hình chữ V nằm vắt ngang qua. 
Vây ngực, vây đuôi có màu vàng tươi. Vây lưng và vây hậu môn hình tam giác. Vây 
lưng mềm (12-14), vây hậu môn (10-12) 
Mặt bụng màu trắng. 
Đây là loại cá có hàm răng mạnh mẽ mà có thể phát triển quá dài nếu cá không thể tiêu 
thụ thực phẩm thô. 
Loài này có kích thước tương đối lớn, chiều dài TL tối đa khoảng 40 cm. Nhóm chiều 
dài thường bắt gặp nằm trong khoảng 15 – 25 cm. 
 PL-20 
Loài này thường sống đáy ở cả vùng nước mặn và lợ, ở các vùng nước ven bờ, cửa sông 
và bãi triều, đồng thời, người ta cũng bắt gặp chúng ở các khu rừng ngập mặn. 
Là loài ăn tạp. Thức ăn chủ yếu của chúng là tảo, động vật thân mềm, động vật không 
xương sống, hoặc động vật giáp xác nhỏ. 
1.10.3. Hình ảnh tiêu bản 
Cá Nóc Vằn 
(Takifugu oblongus B. 1786) 
 Địa điểm thu mẫu: Nha 
Trang, Khánh Hoà 
 Thời gian thu mẫu: 
08/2012 
 Người thu mẫu: TS. Đào 
Việt Hà, Viện Hải Dương 
học Nha Trang 
 Nơi lưu mẫu: Phòng 
nghiên cứu độc tố cá nóc, 
Khoa Nghiên cứu phát 
triển, Viện Kiểm nghiệm 
thuốc Trung ương 
 PL-21 
PHỤ LỤC 2. BỘ DỮ LIỆU CHUẨN NHẬN DẠNG TTX VÀ CÁC CHẤT 
TƯƠNG TỰ TTX 
2.1. Bộ dữ liệu nhận dạng TTX 
Phổ khối lượng ESI MS 
Phổ ESI MS fullscan của TTX 
Phổ ESI MS/MS mảnh mẹ m/z = 320 
 PL-22 
Phổ khối phân giải cao HR ESI FT ICR MS 
Phổ khối phân giải cao HR ESI FT ICR MS 
Phỏng đoán công thức phân tử dựa trên phổ khối lượng phân giải cao 
 PL-23 
Phổ khối phân giải cao ESI Orbitrap MS 
Phổ ESI Orbitrap MS fullscan của TTX 
 PL-24 
Phổ ESI Orbitrap MS2 mảnh mẹ m/z=320 với mức năng lượng bắn phá CE = 25eV 
 PL-25 
Phổ ESI Orbitrap MS3 mảnh m/z=320 =>302 với mức năng lượng bắn phá CE1 = 
25eV, CE2 = 25eV 
 PL-26 
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 
Phổ NMR 1H của TTX 
 PL-27 
Phổ NMR 13C của TTX 
 PL-28 
Phổ NMR COSY của TTX 
 PL-29 
Phổ NMR DEPT của TTX 
 PL-30 
Phổ NMR HMBC của TTX 
 PL-31 
Phổ NMR HSQC của TTX 
 PL-32 
Phổ NMR ROESY của TTX 
 PL-33 
2.2. Bộ dữ liệu nhận dạng 6-epitetrodotoxin 
Phổ khối lượng phân giải cao HR ESI FTICR MS 
Phổ khối lượng phân giải cao HR ESI FTICR MS 
 PL-34 
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 
Phổ NMR 1H của 6-epiTTX 
 PL-35 
Phổ NMR 13C của 6-epiTTX 
 PL-36 
Phổ NMR HMBC của 6-epiTTX 
 PL-37 
Phổ NMR HSQC của 6-epiTTX 
 PL-38 
2.3. Bộ dữ liệu nhận dạng 5-deoxytetrodotoxin 
Phổ khối phân giải cao HR ESI FTICR MS 
Phổ khối phân giải cao FTICR MS 
 PL-39 
Phổ NMR của 5-deoxyTTX 
Phổ NMR 1H của 5-deoxyTTX 
 PL-40 
Phổ NMR 13C của 5-deoxyTTX 
 PL-41 
Phổ NMR HMBC của 5-deoxyTTX 
 PL-42 
Phổ NMR HSQC của 5-deoxyTTX 
 PL-43 
2.4. Bộ dữ liệu nhận dạng 6-deoxytetrodotoxin 
Phổ khối phân giải cao ESI FTICR MS
Phổ khối phân giải cao ESI FTICR MS của 6-deoxyTTX 
 PL-44 
Phổ NMR của 6-deoxyTTX 
Phổ NMR 1H của 6-deoxyTTX 
 PL-45 
Phổ NMR 13C của 6-deoxyTTX 
 PL-46 
Phổ NMR HMBC của 6-deoxyTTX 
 PL-47 
Phổ NMR HSQC của 6-deoxyTTX 
 PL-48 
2.5. Bộ dữ liệu nhận dạng 11-deoxyTetrodotoxin 
Phổ khối phân giải cao ESI FTICR MS 
Phổ ESI FTICR của 11-deoxyTTX 
 PL-49 
Phổ NMR của 11-deoxyTetrodotoxin 
Phổ NMR 1H của 11-deoxyTTX 
 PL-50 
Phổ NMR 13C của 11-deoxyTTX 
 PL-51 
Phổ NMR HMBC của 11-deoxyTTX 
 PL-52 
Phổ NMR HSQC của 11-deoxyTTX 
 PL-53 
2.6. Bộ dữ liệu nhận dạng 6,11-dideoxyTetrodotoxin 
Phổ khối phân giải cao ESI FTICR MS 
Phổ ESI FTICR MS của 6,11-dideoxyTTX 
 PL-54 
Phổ NMR 
Phổ NMR 1H của 6,11-dideoxxyTTX 
 PL-55 
Phổ NMR 13C của 6,11-dideoxxyTTX 
 PL-56 
Phổ NMR HMBC của 6,11-dideoxyTTX 
 PL-57 
Phổ NMR HSQC của 6,11-dideoxxyTTX 
 PL-58 
PHỤ LỤC 3. CHẤT CHUẨN TETRODOTOXIN 
Phụ lục 3.1. Tetrodotoxin tinh khiết 
3.1.1. Ảnh chụp lọ tetrodotoxin tinh khiết 
Tetrodotoxin tinh khiết 
Lô sản xuất: TTX-NC01.13 
Hàm lượng: 98,27% C11H17N3O8 tính theo dạng khan 
 PL-59 
3.1.2. Phiếu kiểm nghiệm tetrodotoxin tinh khiết 
 PL-60 
Phụ lục 3.2. Chất chuẩn đối chiếu hoá học phòng thử nghiệm tetrodotoxin 
3.2.1. Ảnh chụp một số lọ chuẩn tetrodotoxin 0,1mg/ml 
LỌ CHUẨN TETRODOTOXIN 0,1MG/LỌ 
Số lượng: 100 lọ 
Lô sản xuất: TTX.DTDL.2015 
Hàm lượng: 99,9% C11H17N3O8 so với hàm lượng ghi trên nhãn 
 PL-61 
3.2.2. Chứng chỉ phân tích 
 PL-62 
 PL-63 
PHỤ LỤC 4. BỘT ĐÔNG KHÔ TTX NỒNG ĐỘ 0,1% 
Phụ lục 4.1. Tetrodotoxin thô 
HỢP CHẤT TTX THÔ 80% 
Lô sản xuất: NC02 
Khối lượng: 17,7 mg 
Hàm lượng 81,19% C11H17N3O8 tính theo nguyên trạng 
 PL-64 
Phụ lục 4.2. Bột đông khô TTX 0,1% 
4.2.1. Ảnh chụp lọ bột đông khô 
BỘT ĐÔNG KHÔ TETRODOTOXIN NỒNG ĐỘ 0,1% 
Lô sản xuất: TTX.BND.01 
Số lượng: 10 lọ 
Hàm lượng: 0,103% C11H17N3O8 theo dạng khan 
 PL-65 
4.2.2. Phiếu kiểm nghiệm 
 PL-66 
4.2.3. Tiêu chuẩn chất lượng bột đông khô 
BỘ Y TẾ TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG 
BỘT ĐÔNG KHÔ 
TETRODOTOXIN 
 NỒNG ĐỘ 0,1% 
Số tiêu chuẩn: 
VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC 
TRUNG ƯƠNG 
Có hiệu lực từ: 
I. Yêu cầu kỹ thuật 
1.1. Công thức bào chế 
Công thức bào chế cho 1 lọ 
TTX thô (hàm lượng TTX ≥ 80 %)tương ứng với. 1 mg TTX 
Dung dịch lactose 20% (kl/tt) .. 5 mL 
Đệm citrate vừa đủ10 mL 
1.2. Yêu cầu chất lượng 
TT Chỉ tiêu Yêu cầu 
1 Hình thức Bột xốp, màu trắng hoặc trắng ngà 
2 Định tính Phải thể hiện các phép thử định tính của tetrodotoxin. 
3 Hàm lượng nước Không quá 1,5 % 
4 Định lượng 
Hàm lượng tetrodotoxin trong chế phẩm phải đạt từ 
0,09 đến 0,11%, tính theo chế phẩm khan. 
II. Phương pháp thử 
2.1. Hình thức 
Thử bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt yêu cầu đã nêu. 
2.2. Định tính 
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 
Theo phần định lượng, sắc ký đồ của dung dịch chế phẩm phải cho pic chính có thời 
gian lưu và phổ khối 2 lần (MS2) giống với thời gian lưu và phổ khối 2 lần (MS2) của 
pic tetrodotoxin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. 
2.3. Hàm lượng nước 
Thử theo DĐVN IV, phụ lục 10.3. Cân khoảng 1 g chế phẩm. 
2.4. Định lượng 
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS 
* Dung môi, hóa chất 
- Methanol HPLC 
- Acid acetic băng PA 
 PL-67 
- Amoni acetat PA 
* Điều kiện sắc ký 
- Thiết bị: Máy sắc ký lỏng khối phổ Thermo Scientific TSQ quantum Ultra 
- Cột: Alltech Apollo C8; 5µm; 250 x 4,6mm hoặc cột tương đương 
- Pha động: Dung dịch đệm acetat - methanol (30 : 70) 
(Dung dịch đệm acetat: Dung dịch chứa 15 mM amoni acetat và 15mM acid 
acetic băng). 
- Tốc độ dòng: 450 µl/phút 
- Thể tích tiêm: 10 µl 
- Điều kiện khối phổ 
+ Nguồn: ESI với chế độ ion dương 
+ Khí: Sheath Gas (SG): 20, Khí bổ trợ Auxiliary Gas (AG): 10 
+ Thế ion hóa: 3200V 
+ Nhiệt hóa hơi: 200oC 
+ Nhiệt độ mao quản: 360oC 
+ Chế độ quét SRM: m/z = 320 → 162 với mức năng lượng va chạm Collision 
Energy = 32V. 
* Chuẩn bị mẫu: 
- Dung dịch chuẩn: Dung dịch tetrodotoxin chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 
2,5 µg/ml trong pha động 
- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 63 mg chế phẩm vào bình 25,0ml, thêm 
15 ml pha động, lắc siêu âm 10 – 15 phút. Để nguội, thêm pha động vừa đủ 
25,0 ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm. 
- Mẫu trắng: Dung môi pha mẫu. 
* Tiến hành: 
Tiến hành tiêm lần lượt các dung dịch mẫu trắng, dung dịch mẫu chuẩn, dung 
dịch mẫu thử vào hệ thống sắc ký, ghi lại diện tích pic. 
* Tính kết quả 
Hàm lượng tetrodotoxin (C12H17N3O8) trong chế phẩm được tính theo công thức: 
X(%) = 
St
Sc
´CC ´
25
mt
´100 
Trong đó: 
St: Diện tích pic tetrodotoxin thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử 
Sc: Diện tích pic tetrodotoxin thu được trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 
Cc: Nồng độ C12H17N3O8 trong dung dịch chuẩn (mg/ml). 
mt: Lượng mẫu thử đã cân để pha dung dịch thử (mg). 
 PL-68 
III. Đóng gói, ghi nhãn, bảo quản 
3.1. Đóng gói, ghi nhãn 
Đóng gói dạng lọ chứa 1,0 g chế phẩm. 
Nhãn ghi rõ ràng, đúng quy chế. 
3.2. Bảo quản 
Nhiệt độ bảo quản: 2-8oC, tránh ánh sáng trực tiếp.