Luận án Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biến và bảo quản surimi

i 
MỤC LỤC 
MỤC LỤC........................................................................................................................ i 
DANH MỤC KÝ HIỆU................................................................................................. iv 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT....................................................................................... v 
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................................vi 
DANH MỤC CÁC HÌNH.............................................................................................. ix 
TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN..........................................xiv 
MỞ ĐẦU......................................................................................................................... 1 
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN......................................................................................... 3 
1.1. GIỚI THIỆU VỀ RONG SỤN VÀ CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN............... 3 
1.1.1. Giới thiệu về rong sụn........................................................................................... 3 
1.1.2. Giới thiệu về carrageenan ..................................................................................... 4 
1.1.3. Tính chất lý hoá của carrageenan.......................................................................... 7 
1.1.4. Giới thiệu một số kỹ thuật sản xuất carrageenan ................................................ 10 
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ 
OLIGOCARRAGEENAN ............................................................................................ 13 
1.2.1. Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan ở Việt Nam.......................................... 13 
1.2.2. Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan ở nước ngoài........................................ 14 
1.3. GIỚI THIỆU VỀ ENZYME POLYSACCHARASE ............................................ 14 
1.3.1. Enzyme viscozyme L và khả năng sử dụng trong sản xuất carrageenan từ rong sụn.... 14 
1.3.2. Enzyme Termamyl 120L và khả năng sử dụng trong thủy phân carrageenan.... 16 
1.4. MỘT SỐ KỸ THUẬT TINH SẠCH CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN...17 
1.5. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN VÀ CẤU TRÚC CỦA 
CARRAGEENAN......................................................................................................... 19 
1.5.1. Phương pháp phân tích thành phần và cấu trúc của carrageenan ...................................... 19 
1.5.2. Nghiên cứu cấu trúc của carrageenan ................................................................. 22 
1.6. GIỚI THIỆU VỀ NGHIÊN CỨU ĐỘC CHẤT..................................................... 24 
ii 
1.7. SURIMI VÀ KHẢ NĂNG SỬ DỤNG CARRAGEENAN, OLIGOCARRAGEENAN 
TRONG SẢN XUẤT SURIMI................................................................................................26 
1.7.1. Giới thiệu về surimi............................................................................................. 26 
1.7.2. Nghiên cứu ứng dụng carrageenan và oligocarrageenan trong đồng tạo gel thực phẩm.. 30 
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 32 
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU............................................................................................ 32 
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................... 33 
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu và phân tích ..................................................................... 33 
2.2.2. Phương pháp tinh sạch, xác định cấu trúc và độc chất ....................................... 35 
2.2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm............................................................................ 41 
2.4. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN ........... 56 
2.4.1. Hóa chất .............................................................................................................. 56 
2.4.2. Thiết bị chủ yếu sử dụng trong luận án............................................................... 56 
2.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ...................................................................... 57 
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.................................. 58 
3.1. NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ENZYME VISCOZYME L TRONG SẢN XUẤT 
CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII (DOTY) DOTY...58 
3.1.1. Tối ưu hóa quá trình xử lý rong sụn bằng enzyme viscozyme L........................ 58 
3.1.2. Xác định chế độ chiết carrageenan ..................................................................... 66 
3.2. NGHIÊN CỨU TINH SẠCH CARRAGEENAN THU NHẬN TỪ RONG SỤN....77 
3.2.1. Xác định nhiệt độ tinh sạch................................................................................. 77 
3.2.2. Xác định nồng độ ethanol kết tủa protein trong tinh sạch carrageenan .............. 78 
3.2.3. Xác định chế độ kết tủa carrageenan trong dung dịch car sau kết tủa protein.... 80 
3.2.4. Đề xuất quy trình tinh sạch carrageenan bằng ethanol ....................................... 82 
3.3. NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN CARRAGEENAN THÀNH OLIGOCARRAGEENAN 
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYME POLYSACCHARASE ......................... 86 
3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme polysaccharase thích hợp cho thủy phân carrageenan 
thành oligocarrageenan ................................................................................................. 86 
iii 
3.3.2. Nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân carrageenan 
thành oligocar bằng enzyme Termamyl 120L .............................................................. 88 
3.4. NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CẤU TRÚC 
CỦA OLIGOCARRAGEENAN................................................................................... 97 
3.4.1. Xác định nhiệt độ tinh sạch................................................................................. 97 
3.4.2. Xác định nồng độ ethanol kết tủa phân đoạn protein.......................................... 98 
3.4.3. Xác định chế độ kết tủa oligocarrageenan trong dung dịch oligocarrageenan sau 
kết tủa protein.............................................................................................................. 100 
3.4.4. Đề xuất quy trình tinh sạch oligocarrageenan bằng ethanol ............................. 103 
3.4.5. Đánh giá độ sạch của oligocarrageenan tinh sạch............................................. 104 
3.4.6. Xác định một số đặc tính cấu trúc của oligocarrageenan.................................. 107 
3.5. NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐỘC CHẤT HỌC CỦA CARRAGEENAN VÀ 
OLIGOCARRAGEENAN .......................................................................................... 121 
3.5.1. Đánh giá độc tính liều đơn ................................................................................ 121 
3.5.2. Đánh giá độc tính liều lặp lại ............................................................................ 125 
3.6. THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN 
TRONG SẢN XUẤT SURIMI TỪ CÁ ĐỔNG ......................................................... 134 
3.6.1. Thử nghiệm sử dụng carrageenan trong sản xuất surimi từ cá đổng ................ 134 
3.6.2. Thử nghiệm sử dụng oligocarrageenan trong sản xuất surimi từ cá đổng........ 145 
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ......................................................................... 157 
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ............................................................ 159 
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 160 
PHỤ LỤC 
iv 
DANH MỤC KÝ HIỆU 
 : Kappa 
 : Iota 
 : Lambda 
v/w : Thể tích/khối lượng 
v/v : Thể tích/thể tích 
kDA : kilodalton 
v 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 
BLO: hồng cầu hoặc máu ẩn 
BIL: bilirubin 
Car: Carrageenan 
ĐVTN: động vật thí nghiệm 
EU: Liên minh châu Âu 
GLEU: bạch cầu 
GLU: đường niệu 
 JECFA: Ủy ban Chuyên gia về Phụ gia Thực phẩm 
KPH: không phát hiện 
KET: Ketin 
Liều TB: liều trung bình 
MPV: thể tích tiểu cầu 
NIT: Nitrit; 
Oligocar: Oligocarrageenan 
Pro: Protein 
QCVN: quy chuẩn Việt Nam 
SG: tỷ trọng 
TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam 
Thận T: thận trái 
Thận P: thận phải 
URO: Urobilin 
 w/v: khối lượng/thể tích 
WFT: nước cất pha tiêm vô khuẩn 
vi 
DANH MỤC CÁC BẢNG 
Bảng 1.1. Thành phần hóa học cơ bản của rong sụn.......................................................4 
Bảng 1.2. Một số tính chất đặc trưng của các loại carrageenan..................................... 8 
Bảng 1.3. Độ dịch chuyển hoá học sigma từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của dạng glucose 
và galactose ...................................................................................................................21 
Bảng 2.1. Thành phần hóa học chính của cá Đổng cờ..................................................33 
Bảng 2.2. Tóm tắt thiết kế nghiên cứu đối chứng.........................................................39 
Bảng 2.3. Đánh giá các biểu hiện lâm sàng trên chuột thí nghiệm an toàn ..................39 
Bảng 2.4. Tóm tắt thiết kế nghiên cứu đối chứng không làm mù.................................40 
Bảng 2.5. Các tiêu chí đánh giá kết quả trong nghiên cứu độc tính .............................41 
Bảng 2.6. Nhiệt độ và pH tối thích của các enzyme .....................................................48 
Bảng 3.1. Điều kiện thí nghiệm được chọn...................................................................58 
Bảng 3.2. Kết quả ma trận thực nghiệm trực giao cấp I, k = 3 .....................................58 
Bảng 3.3. Tối ưu hóa quá trình xử lý rong sụn bằng enzyme Viscozyme L theo hàm 
mục tiêu sức đông của carrageenan ..............................................................................61 
Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm leo dốc theo hàm mục tiêu hiệu suất thu car từ rong sụn ........63 
Bảng 3.5. Kết quả thí nghiệm theo hướng leo dốc của hàm chập YL ...........................64 
Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm leo dốc cho hàm mục tiêu YL........................................65 
Bảng 3.7. So sánh các thí nghiệm leo dốc theo từng hàm mục tiêu .............................65 
Bảng 3.8. Kết quả đánh giá chất lượng carrageenan theo phương pháp xử lý bằng 
enzyme với phương pháp xử lý bằng hóa chất .............................................................74 
Bảng 3.9. Thành phần hóa học chính của mẫu carrageenan trước tinh sạch ................77 
Bảng 3.10. Nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ đông đặc của carrageenan thô .................77 
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới hàm lượng protein, lipid, carbohydrate trong 
kết tủa và trong dung dịch car sau tinh chế ........................................................................78 
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới khối lượng kết tủa car và hàm lượng 
protein, lipid, car còn lại trong dung dịch .....................................................................80 
vii 
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng kết tủa carrageenan...................82 
Bảng 3.14. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của carrageenan trước và sau tinh sạch ..84 
Bảng 3.15. Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của carrageenan trước và sau 
tinh sạch.........................................................................................................................84 
Bảng 3.16. Thành phần hóa học chính của mẫu oligocarrageenan trước tinh sạch......97 
Bảng 3.17. Nhiệt độ đông đặc và tan chảy của oligocarrageenan thô ..........................98 
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới hàm lượng protein, lipid, carbohydrate 
trong kết tủa và trong dung dịch oligocar sau tinh chế .................................................99 
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới khối lượng kết tủa oligocarrageenan và 
hàm lượng protein, lipid, oligocar còn lại trong dung dịch .........................................101 
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng kết tủa oligocarrageenan.........102 
Bảng 3.21. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của oligocarrageenan trước và sau 
tinh sạch.......................................................................................................................104 
Bảng 3.22. Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của oligocarrageenan trước và 
sau tinh sạch ................................................................................................................105 
Bảng 3.23. Kết quả phân tích thành phần hoá học của oligocarrageenan ..................110 
Bảng 3.24. Một số dải hấp thụ chính trên phổ hồng ngoại .........................................111 
Bảng 3.25. Độ dịch chuyển hoá học 13C-NMR...........................................................112 
Bảng 3.26. So sánh độ dịch chuyển hóa học trong phổ 13C-NMR của mẫu carrageenan 
chuẩn (của Hãng Sigma) ............................................................................................114 
Bảng 3.27. Độ dịch chuyển hóa học của các proton ở vị trí α ...................................115 
Bảng 3.28. Liên kết từ phổ 1H-1H COSY ...................................................................118 
Bảng 3.29. Tương tác của các proton trên phổ ROESY .............................................120 
Bảng 3.30. Độ dịch chuyển hoá học 13C NMR và 1H NMR của oligocarrageenan....121 
Bảng 3.31. Biểu hiện lâm sàng của chuột nhắt uống carrageenan và oligocarrageenan ......122 
Bảng 3.32. Kết quả xét nghiệm nước tiểu chuột lang .................................................127 
Bảng 3.33. Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, carrageenan, 21 ngày .....128 
viii 
Bảng 3.34. Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, carrageenan, 42 ngày .....129 
Bảng 3.35. Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, oligocarrageenan, 21 ngày ... 130 
Bảng 3.36. Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, oligocarrageenan, 42 ngày ... 130 
Bảng 3.37. Trọng lượng tươi trung bình của các cơ quan gan, lách, thận (2 bên) của lần 
giải phẫu thứ nhất (ngày 21) .......................................................................................131 
Bảng 3.38. Trọng lượng tươi trung bình của các cơ quan gan, lách, thận (2 bên) của lần 
giải phẫu thứ hai (ngày 42) .........................................................................................132 
Bảng 3.39. Kết quả đánh giá surimi sản xuất thử nghiệm ..........................................145 
Bảng 3.40. Kết quả đánh giá surimi sản xuất thử nghiệm ..........................................156 
ix 
DANH MỤC CÁC HÌNH 
Hình 1.1. Hình ảnh về rong sụn Kappaphycus alvarerii (Doty) Doty............................3 
Hình 1.2. Cấu trúc của carrageenan với luân phiên liên kết của 1,3 βD Galactose 
pyranose và 1,4 αD Galactose pyranose .........................................................................5 
Hình 1.3. Cấu trúc của κ-carrageenan................................ ... ịnh [η] ta có thể 
tính được phân tử khối M của polime. Giá trị K và α đối với một số hệ polime - dung 
môi cho sẵn trong các tài liệu tra cứu. 
3.3. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CẢM QUAN [29] 
Phương pháp đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm thực phẩm được thực hiện 
theo Tiêu Chuẩn Việt Nam TCVN 3215-79. Phương pháp này sử dụng thang điểm 20 
với 6 bậc 5 điểm (từ 0 đến 5) trong đó điểm 0 ứng với chất lượng sản phẩm “bị hỏng”, 
còn từ điểm 1 đến điểm 5 ứng với mức khuyết tật giảm dần. Ở điểm 5 sản phẩm coi 
như không có sai lỗi và khuyết tật nào. Tổng hệ số trọng lượng (hệ số quan trọng hoặc 
trọng số) của tất cả các chỉ tiêu được đánh giá cho một sản phẩm bằng 4. 
Chất lượng cảm quan của surimi được xác định bởi các chỉ tiêu: trạng thái, màu 
sắc, mùi và vị. Hệ số quan trọng được trình bày ở bảng 3.7 và thang điểm cảm quan 
được trình bày ở Bảng 3.8. Hội đồng đánh giá gồm 5 thành viên. Khi đánh giá chất 
lượng cảm quan, thành viên đánh giá phải ở trạng thái không quá no hay quá đói, 
không dùng chất kích thích. 
Bảng 3.7. Hệ số quan trọng của các chỉ tiêu cảm quan của surimi 
STT Chỉ tiêu Hệ số quan trọng 
1 Màu 0,8 
2 Mùi 0,8 
3 Vị 0,7 
4 Trạng thái 1,7 
Bảng 3.8. Thang điểm đánh giá cảm quan của surimi cá đổng 
Chỉ tiêu 
Điểm chưa có 
trọng lượng 
Cơ sở đánh giá 
5 Màu sáng trắng trong 
4 Màu sáng kém trong 
3 Màu trắng hơi đục 
Màu sắc 
2 Màu trắng đục 
1 Màu trắng hơi ngà 
0 Màu trắng ngà 
5 Không mùi 
4 Tanh rất nhẹ 
3 Tanh nhẹ 
2 Mùi tanh cá 
1 Mùi tanh đặc trưng của cá 
Mùi 
0 Mùi tanh rất đặc trưng của nguyên liệu 
5 Khi hấp chín có vị ngọt đậm của đạm, không có vị lạ 
4 Khi hấp chín có vị ngọt của đạm, không có mùi vị lạ 
3 Khi hấp chín có vị ngọt của đạm, hơi có vị lạ 
2 Khi hấp chín có vị ngọt của đạm nhưng kém, có vị lạ. 
1 
Khi hấp chín không có vị ngọt của đạm, vị đặc trưng 
của cá hấp. 
Vị 
0 Khi hấp chín có vị đặc trưng của cá hấp. 
5 
Bề mặt lát cắt bóng mịn, độ dẻo dai, đàn hồi rất tốt. 
Độ uốn gập: Gập tư không gãy (cả 5 mẫu) 
4 
Bề mặt lát cắt bóng mịn, độ dẻo dai, đàn hồi tốt. 
Độ uốn gập: 1 trong 5 mẫu có vết nứt khi gập 4 
3 
Bề mặt lát cắt bóng mịn, độ dẻo dai, đàn hồi khá 
Độ uốn gập: Cả 5 miếng khi gập đôi đều nứt nhẹ 
2 
Bề mặt lát cắt không bóng mịn, độ dẻo dai, đàn hồi kém 
Độ uốn gập: Gập đôi gãy nhưng 2 miếng vẫn dính nhau 
1 
Bề mặt lát cắt không bóng mịn, độ dẻo dai, đàn hồi kém 
Độ uốn gập: Gãy hoàn toàn thành 2 miếng khi gập đôi 
Trạng thái 
0 
Bề mặt lát cắt không bóng, đàn hồi rất kém 
Độ uốn gập: Bị gãy rời khi uốn 
Điểm đánh giá cảm quan chung bằng tổng điểm cảm quan có trọng số của các 
chỉ tiêu đánh giá. Căn cứ vào điểm cảm quan chung để phân cấp chất lượng của sản 
phẩm (theo tiêu chuẩn TCVN 3215-79) 
Bảng 3.9. Phân mức chất lượng 
Mức chất lượng Điểm chất lượng 
Yêu cầu về điểm trung bình chưa có trọng lượng 
của các chỉ tiêu 
Tốt 18,6 – 20,0 Các chỉ tiêu quan trọng nhất từ 4,7 trở lên 
Khá 15,2 – 18,5 Các chỉ tiêu quan trọng nhất từ 3,8 trở lên 
Trung bình 11,2 – 15,1 Mỗi chỉ tiêu từ 2,8 trở lên 
Kém 7,2 – 11,1 Mỗi chỉ tiêu từ 1,8 trở lên 
Rất kém 4,0 – 7,1 Mỗi chỉ tiêu từ 1,0 trở lên 
Hỏng 0,0 – 3,9 
3.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN MONOSACCHARIDE 
Xác định bằng phương pháp sắc ký khí thông qua phản ứng axetyl hóa các sản 
phẩm thủy phân car theo qui trình của Stevenson và Furneaux [56]. 
Thủy phân lần 1: cho 100l car (nồng độ 10mg/ml) trong một ống nghiện có nắp 
chứa 50l MMB (metylmorpholin boran) 80mg/ml và 100l TFA (triflo axetic) 6M để 
đạt nồng độ cuối cùng của TFA là 2,4M. Đun cách thủy ở 80 0C trong 30 phút làm lạnh 
dung dịch đến nhiệt độ phòng. Thêm 50l MMB và cho bay hơi ở 50 – 55 0C với dòng khí N2. 
Thủy phân lần 2: thêm 100l nước cất và 100l TFA 4M vào ống nghiệm trên. 
Phản ứng được thực hiện ở 120 0C trong 1h. Để nguội đến nhiệt độ phòng lại thêm 100 
l MMB và làm khô mẫu ở 50 – 55 0C với dòng khí N2. 
Thêm vào ống 500 l etyl axetat và 1,5ml anhydric axetic và 50 l HClO4 siêu 
âm ở nhiệt độ phòng 10 phút, để yên 15 phút rồi thêm vào 5ml nước cất. Chiết dung 
dịch với 2ml CH2Cl2 rồi phân tích sắc kí khí. 
3.5. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SUNPHAT (Terho, 1971) 
Việc xác định hàm lượng nhỏ sunphat có mặt trong các nhánh polysaccharide là 
rất quan trọng. Phương pháp được sử dụng phổ biến là dựa trên sự kết tủa của sunphat 
với benzidin và đo benzidin được kết tủa sau khi diazo hóa hoặc đo trực tiếp bằng phổ 
UV. Nhưng do độ hòa tan của benzidin sunphat khá cao, cho nên bằng phương pháp 
này ta không thể xác định được lượng sunphat dưới 3 – 4 µg. 
Phương pháp được mô tả dưới đây dựa trên phản ứng hình thành hợp chất màu 
của Ba2+ với thuốc thử rhodizonate natri. Theo sự giảm cường độ màu của dung dịch 
khi SO4
2- vô cơ kết tủa với Ba2+ của phức màu ta có thể xác định được hàm lượng 
sunphat có trong mẫu. 
- Thuốc thử: dung dịch đệm BaCl2: lấy 10 ml acid acetic 2M, 2ml BaCl2 và 8ml 
NaHCO3 0,02M vào bình định mức 100ml. Thêm ethanol tuyệt đối đến vạch mức. 
- Dung dịch rhodizonate natri: 5 mg (Merck) hòa tan trong 20 ml nước cất khử 
ion. Thêm 100 mg acid ascobic và lắc dung dịch cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Định 
mức dung dịch trong bình định mức 100 ml ethanol. Dung dịch này có thể có màu nâu 
nhạt. Dung địch có thể sử dụng sau 30 phút. 
- Dung dịch sunphat chuẩn: pha đường chuẩn từ 2 – 12 µg sunphat trong 0,5 
ml nước cất loại ion. 
Tiến hành: lấy 0,5 ml mẫu chuẩn, nước cất và mẫu Car vào các ống nghiệm (10 x 
75mm, có tráng teflon). Thêm 2 ml ethanol, nếu có kết tủa cần phải ly tâm cho đến sạch. 
Thêm 1 ml dung dịch đệm BaCl 2và 1,5 ml thuốc thử rhodizonate natri. Đậy nắp và trộn 
đều. Đặt các ống nghiệm trong tối 10 phút ở nhiệt độ phòng. Đo mật độ quang của dung 
dịch ở bước sóng 520 nm với cuvet 1cm, màu dung dịch không đổi sau 30 phút. 
Thủy phân polysaccharide: sự thủy phân được thực hiện với HCl loãng (0,5 – 
1N), ở 1000C trong 2 giờ. Dung dịch thủy phân sau đó được cô trong chân không ở 60 
– 650C cho đến khô. Hòa tan phần khô đến thể tích 50ml với nước cất loại ion. Lấy 0,5 
ml để xác định sunphat. 
Đường chuẩn xác định sunphat bằng rhodizonate natri thì tuyến tính trong 
khoảng nồng độ lặp lại với sai số trung bình 5%. Độ nhạy của phép xác định hàm 
lượng sunphat đạt từ 0 – 12 µg. Nếu sử dụng dung dịch BaCl2 đặc hơn có thể đạt 20 µg. 
Chú ý: khi tính toán hàm lượng sunphat trong mẫu cần phải tính bù trừ độ hấp 
thụ quang của mẫu nước cất. 
3.6. XÁC ĐỊNH ĐỘ NHỚT [33] 
3.6.1. Thiết bị, dụng cụ 
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể các thiết 
bị, dụng cụ sau đây: 
- Cốc có mỏ, dung tích 600 ml. 
- Nồi cách thủy, có thể ổn định ở nhiệt độ từ 75 0C đến 80 0C. 
- Nhớt kế Brookfield, loại LVF hoặc LVT. 
3.6.2. Cách tiến hành 
Lấy 7,5 g phần mẫu thử dạng bột, phân tán trong 450 ml nước đã khử ion đựng 
trong cốc có mỏ dung tích 600 ml, khuấy trong 10 min đến 20 min. Thêm vào lượng 
nước cần thiết để đạt khối lượng cuối cùng 500 g, gia nhiệt trong nồi cách thủy, trong 
khi vẫn khuấy, đến khi nhiệt độ đạt 80 0C (khoảng 20 min đến 30 min). Cho thêm 
nước vào để bù vào lượng nước mất đi do bay hơi, làm nguội đến 76 0C hoặc 77 0C, 
gia nhiệt trong nồi cách thủy ở nhiệt độ không đổi 75 0C. 
Gia nhiệt trước phao và bộ phận bảo vệ của nhớt kế Brookfield đến khoảng 75 0C 
trong nước. Sấy phao và bộ phận bảo vệ của nhớt kế và lắp chúng vào nhớt kế đã được 
trang bị trục quay số 1 (đường kính 19 mm, chiều dài khoảng 65 mm), có thể quay ở tốc 
độ 30 r/min. Điều chỉnh độ cao của phao trong dung dịch mẫu, bắt đầu quay nhớt kế với 
tốc độ 30 r/min. Đọc kết quả đo trên thang 0 đến 100 sau sáu vòng quay của nhớt kế. 
Nếu độ nhớt rất thấp thì có thể tăng độ chính xác của kết quả đo bằng cách sử 
dụng bộ tiếp hợp Brookfield UL hoặc tương đương. 
CHÚ THÍCH: Mẫu thử của một số dạng carrageenan có thể có độ nhớt quá lớn, 
vượt khỏi thang đo khi sử dụng trục quay số 1. Các mẫu đạt yêu cầu kỹ thuật về độ 
nhớt, nhưng nếu cần đọc chính xác độ nhớt thì sử dụng trục quay số 2 và đọc kết quả 
đo trên thang 0 đến 100 hoặc thang 0 đến 500. 
3.6.3. Biểu thị kết quả 
Biểu thị kết quả theo centipoise (cP), theo số đọc trên nhớt kế nhân với hệ số 
được đưa ra bởi nhà sản xuất. 
3.7. XÁC ĐỊNH SỨC ĐÔNG [33] 
3.7.1. Thuốc thử 
Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hai lần hoặc nước 
có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác. 
3.7.2. Thiết bị, dụng cụ 
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể thiết 
bị, dụng cụ sau đây: 
- Bình thủy tinh, dung tích 100 ml hoặc 150 ml. 
- Nồi cách thủy, có thể ổn định ở nhiệt độ 80 0C. 
- Ống khuôn, bằng thuỷ tinh hoặc thép không gỉ, có nút dài 100 mm đến 200 
mm, đường kính trong 30 mm. 
-Thiết bị đo sức đông. 
- Cân, có thể cân chính xác đến 0,001 g. 
3.7.3. Cách tiến hành 
Hòa tan 1,7 g phần mẫu thử vào bình thủy tinh chứa 98,3 ml nước ở nhiệt độ 80 0C 
để tạo thành dung dịch carrageenan có nồng độ 1,5 % khối lượng. Bổ sung kali clorua 
vào bình sao cho nồng độ kali clorua là 0,2 % khối lượng, hòa tan trong dung dịch. 
Đổ dung dịch nóng vào ống khuôn sau đó ngâm trong nước ở nhiệt độ 20 0C trong 
2 h đến 3 h. Mở miệng ống khuôn, cho thạch carrageenan ra, dùng dao cắt thành từng 
khoanh có bề dày 15 mm. 
Đặt khoanh thạch carrageenan lên thiết bị đo sức đông, đặt nhẹ nhàng con dấu 
của thiết bị lên khoanh thạch. Nếu thạch chưa vỡ thì đặt thêm cốc thủy tinh lên đĩa (đặt 
phía trên khoanh thạch), nếu vẫn chưa thấy vỡ thì nhỏ từ từ nước bằng buret cho đến 
khi thạch vỡ ra thì dừng lại. Cân ống trụ của thiết bị cùng với cốc thủy tinh chứa nước 
(nếu sử dụng), chính xác đến 0,001 g. 
Tiến hành ba phép xác định trên cùng một mẫu thử. 
3.7.4. Biểu thị kết quả 
Sức đông của carrageenan được biểu thị bằng gam trên xentimet vuông (g/cm2). 
Kết quả là trung bình cộng của ba phép xác định. 
3.8. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP 
HEINKEL [5] 
3.8.1. Nguyên tắc và định nghĩa 
1. Nguyên tắc 
Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường 
độ màu của hỗn hợp với dung dịch iod. 
2. Định nghĩa 
Đơn vị hoạt động của enzyme ( hoạt động) là lượng enzyme có khả năng phân 
giải 1mg tinh bột sau 30 phút ở 30 0C. 
3.8.2. Hóa chất 
1. Dung dịch NaCl 0.1% 
2. Dung dịch acid sunfosalisilic 20% 
3. Dung dịch iod: hòa tan 1 gam iod vào 5 ml dung dịch có chứa 2 gam kI, thêm 
nước cất đến 300 ml. Khi dùng pha loãng dung dịch này đến 150 lần. 
4. Dung dịch đệm photphat 0.05 M, pH=6.0. 
5. Dung dịch tinh bột 1% trong dung dịch đệm photphat 0.05 M, pH=6.0: cân 1 
gam tinh bột trộn với khoảng 10 ml dung dịch đệm, thêm vào 80 ml dung dịch đệm 
đang sôi, để nguội, thêm dung dịch đệm cho vào đến 100ml. Để bảo quản dung dịch 
tinh bột có thể thêm 1 gam natri benzoexan. 
6. Dung dịch tinh bột tiêu chuẩn 1%: cân 1 gam tinh bột trộn với khoảng 10ml 
nước cất, thêm 80 ml nước cất đang sôi khuấy đều, để nguội cho thêm nước cất đến 
100ml. Từ dung dịch chuẩn này, chuẩn bị các dung dịch có chứa 2, 4, 6, 8 và 10mg tinh 
bột trong 1 ml bằng cách lấy 2, 4, 6, 8 và 10 ml tinh bột 1% và thêm nước cất đến 10 ml. 
7. Lập đồ thị chuẩn: Lấy 0,1 ml dung dịch đã chuẩn như trên thêm 0,1 ml dung 
dịch NaCl 0,1%; 0,2 ml dung dịch đệm; 0,1 ml nước cất; 0,5 ml dung dịch acid 
sunfosalisilic 20% lắc đều, thêm 9 ml dung dịch iot đã pha loãng 150 lần, so màu. Vẽ 
đồ thị chuẩn, trên trục hoành ghi số miligam tinh bột, trục tung ghi số đọc được trên 
máy tương ứng. 
8. Chuẩn bị enzyme 
Lấy 1ml dung dịch enzyme gốc cho vào bình định mức 100ml. Cho thêm nước 
cất vào bình định mức cho đủ 100ml, lắc đều. Lấy 5ml dung dịch enzyme đã pha loãng 
từ bình định mức trên cho vào bình định mức 50ml, cho thêm nước cất vào bình định 
mức cho đủ 50ml, lắc đều. Cho vào tủ ủ ấm ở 300C. 
Cân 5 gam Malt cho vào bình định mức 500ml. Cho thêm nước cất vào bình định 
mức cho đủ 500ml, khuấy đều trên máy khuấy từ trong khoảng 10 phút. Sau đó cho 
vào tủ ủ ấm ở 470C trong 30 phút. Lọc, làm lạnh về 300C. 
3.8.3. Cách tiến hành 
Cho vào ống nghiệm 1 ml NaCl 0,1 % và 2 ml dung dịch tinh bột 1% trong dung 
dịch đệm phốt phát 0,05 M, pH = 6,0 lắc đều và giữ ở 300C trong 15÷20 phút để dung 
địch đạt được đến 300C. Thêm vào hỗn hợp 1 ml dung dịch enzyme đã đạt đến 300C. Lắc 
đều, tiếp tục giữ ở 300C đúng 30 phút. Lấy ống nghiệm ra khỏi tủ ống, cho ngay 5ml dung 
dịch acid sunfosalisilic 20% để làm ngừng phản ứng, sau vài phút tiến hành lọc. 
Song song với mẫu thí nghiệm, ta làm mẫu kiểm tra cũng tương tự như trên 
nhưng cho dung dịch acid sunfosalisilic vào trước rồi mới cho dung dịch enzyme. 
Lấy 1 ml dịch lọc ở mẫu thí nghiệm cũng như mẫu kiểm tra cho vào ống nghiệm, 
thêm 9 ml dung dịch iot pha loãng 150 lần. So màu ở máy so màu (với bước sóng 560 
nm). Lấy hiệu số đọc trên máy giữa mẫu kiểm tra và thí nghiệm, đối chiếu đường 
chuẩn đã làm tính được số miligam tinh bột đã bị phân giải. 
3.8.4. Tính kết quả 
Từ số miligam tinh bột tra được ở đường chuẩn tức là số đơn vị hoạt động 
enzyme tương ứng số ml dịch enzyme ở 1 ml dịch pha loãng cho vào so màu. Từ đó 
muốn tính ra đơn vị hoạt động cho 1 ml dịch chế phẩm ban đầu hay số gam chế phẩm 
dùng chiết dịch enzyme để so sánh đơn vị hoạt động theo 1 ml dung dịch hay 1 gam 
chế phẩm đề quy ra do phương pháp chiết và phương pháp pha loãng thu dịch enzyme 
khác nhau. 
Bảng 3.10. Kết quả xác định mối quan hệ giữa hàm lượng tinh bột và độ hấp thụ 
ánh sáng của mẫu tinh bột 1% pha với dung dịch đệm acetate pH=6,0 
Tinh bột (mg) Độ hấp thụ (560nm:ABS) 
0 0 
2 0,065 
4 0,162 
6 0,234 
8 0,299 
10 0,369 
y = 0.037x + 0.001
R² = 0.996
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0 2 4 6 8 10 12
Đ
ộ
 h
ấ
p
 t
h
ụ
 (
A
b
s)
Hàm lượng tinh bột (mg/ml)
Hình 3.4. Đồ thị đường chuẩn xác định hoạt độ enzyme amylase 
PHỤ LỤC 4. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THIẾT BỊ SỬ DỤNG THÍ NGHIỆM 
VÀ THỰC HIỆN LUẬN ÁN 
4.1. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THIẾT BỊ SỬ DỤNG THÍ NGHIỆM 
Máy đo lưu biến 
(Rheometer của Sun Scientific – 
Nhật Bản CR – 500Dx) 
Kính hiển vi soi nổi 
(SMZ168TL – 
MoticXiamen/Trung Quốc) 
Máy sấy hút chân không 
(LVO2040 + LVO1003 – 
Lebtech/Hàn Quốc) 
Thiết bị đo độ nhớt 
(LVDV – I /Brookfield/Mỹ) 
Máy cô quay chân không Máy đo độ nhớt 
Bếp cách thủy BW – 10G Máy sấy lạnh Máy sấy hồng ngoại 
Máy ly tâm 
Máy đông khô Lyobeta35 
Máy quang phổ hấp thu 
nguyên tử ASS 
Máy FT-IR Bruker 
Thiết bị cộng hưởng từ hạt 
nhân Avance 500 Bruker 
Thiết bị sắc khí lỏng hiệu 
năng cao ghép nối khối phổ 
HPLC-MS Agilen 1100 
4.2. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THỰC HIỆN LUẬN ÁN 
- Qúa trình thu mẫu và sản xuất Car 
- Qúa trình tinh chế oligocar 
Dung dịch car và oligocar thô 
Kết tủa protein trong dung dịch oligocar thô bằng ethanol 
Dung dịch oligocar thô tại thời điểm vừa cho ethanol vào 
Dung dịch oligocar thô tại thời điểm cho ethanol vào sau 60 phút 
Tủa oligocar thu bằng phương pháp kết tủa với ethanol