Luận án Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen pb2, pb1 và pa polymerase của virus cúm A / H5N1 đương nhiễm tại Việt Nam

	BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 	BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
NGUYỄN MẠNH KIÊN
NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA POLYMERASE CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐƯƠNG NHIỄM TẠI VIỆT NAM
	Chuyên ngành	: HÓA SINH Y HỌC
	Mã số	: 62 72 01 12
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
	Người hướng dẫn khoa học:
	1. PGS.TS. LÊ THANH HÒA
	2. PGS.TS. ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG
HÀ NỘI – 2014
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án của mình, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới các Thầy (Cô):
PGS.TS. Lê Thanh Hòa – Viện Công nghệ sinh học,
PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung – Trường Đại học Y Hà Nội,
đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận án này. 
- Thầy Chủ tịch Hội đồng và các Thầy (Cô) trong Hội đồng chấm luận án, cùng các nhà khoa học trong cả nước, đã có nhiều ý kiến quí báu, giúp tôi hoàn thiện luận án của mình.
Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình, tôi nhận được sự giúp đỡ quí báu của Nhà trường, đơn vị công tác, tập thể, các nhà khoa học, gia đình và bè bạn. Tôi xin trân trọng cảm ơn:
- Ban giám hiệu Trường Đại học Y Hà Nội; Ban lãnh đạo Bệnh viện quân y 7A, Cục Hậu cần, Quân khu 7, đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.
- Thầy, cô và các anh, chị trong Bộ môn Hóa sinh, Phòng Quản lý đào tạo Sau đại học, Trung tâm Gen và Protein – Trường Đại học Y Hà Nội, Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học, đã tạo điều kiện giúp đỡ chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Cơ quan thú y các vùng trong cả nước hết lòng ủng hộ, cung cấp mẫu bệnh phẩm và thông tin dịch bệnh giúp tôi thực hiện đề tài nghiên cứu.
Ban chủ nhiệm đề tài: “Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vắc-xin phòng chống”, trong khuôn khổ Nhiệm vụ “Nghị định thư hợp tác nghiên cứu với Thái Lan”, đã giúp đỡ hỗ trợ tôi kinh phí thực hiện đề tài nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình và người thân, đã hỗ trợ động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu của mình.
	Hà Nội, ngày tháng 8 năm 2014
	NGHIÊN CỨU SINH
	Nguyễn Mạnh Kiên
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu trong luận án là một phần số liệu đề tài nghiên cứu Nghị định thư hợp tác nghiên cứu với Thái Lan có tên: “Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vắc - xin phòng chống”. Phần kết quả trong đề tài luận án này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là một thành viên chính. Tôi đã được sự đồng ý của Chủ nhiệm đề tài và toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu, cho phép sử dụng phần số liệu trên vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ. 
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là hoàn toàn trung thực. Một phần số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án đã được công bố trên các Tạp chí khoa học chuyên ngành, với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác.
	Hà Nội, ngày .tháng 08 năm 2014
	TÁC GIẢ
	Nguyễn Mạnh Kiên
MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa 
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
i
Danh mục chữ viết tắt trong luận án
iv
Danh mục các bảng
v
Danh mục các hình và sơ đồ
vii
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chương 1. TỔNG QUAN
3
1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A
3
1.1.1. Cấu tạo chung của virus cúm A
3
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo hệ gen của virus cúm A
4
1.1.3. Cấu tạo và chức năng của các phân đoạn RNA hệ gen virus cúm A
5
1.1.4. Đặc điểm cấu tạo và chức năng của các gen PB2, PB1 và PA
7
1.1.5. Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A
12
1.1.6. Đặc tính biến đổi di truyền các gen và hệ gen virus cúm A
14
1.2. ĐẠI DỊCH CÚM A VÀ ĐẶC ĐIỂM BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA VIRUS CÚM A GÂY ĐẠI DỊCH CÚM Ở NGƯỜI
16
1.2.1. Các đại dịch cúm A ở người trong lịch sử
16
1.2.2. Đặc điểm biến đổi các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A gây đại dịch cúm ở người
17
1. 3. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ VÀ SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1
22
1.3.1. Đặc điểm dịch tễ virus cúm A/H5N1
22
1.3.2. Đặc điểm sinh học của virus cúm A/H5N1
26
1.4. NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1, PA LIÊN QUAN ĐỘC LỰC VÀ LÂY TRUYỀN Ở NGƯỜI CỦA VIRUS CÚM A/H5N1
28
1.4.1. Trên thế giới
28
1.4.2. Tại Việt Nam
30
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
33
2.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
33
2.1.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
33
2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị
35
2.1.3. Các bộ kit sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu
36
2.1.4. Môi trường sử dụng trong dòng hóa
36
2.1.5. Các hóa chất sử dụng trong điện di trên gel agarose
36
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
37
2.2.1. Kỹ thuật tách chiết ribonucleic acid tổng số
38
2.2.2. Thiết kế các trình tự mồi nucleotide sử dụng trong nghiên cứu
38
2.2.3. Kỹ thuật RT-PCR
41
2.2.4. Tinh sạch DNA sản phẩm PCR
44
2.2.5. Kỹ thuật điện di nucleic acid trên gel agarose
45
2.2.6. Kỹ thuật dòng hóa DNA
45
2.2.7. Giải trình tự DNA
48
2.2.8. Xử lí, kiểm chứng, thu nhận trình tự nucleotide và amino acid của các gen nghiên cứu
50
2.3. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU
52
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
53
3.1. KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ GIẢI TRÌNH TỰ CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU
53
3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số và chuyển đổi cDNA hệ gen virus
53
3.1.2. Kết quả PCR thu nhận và dòng hóa DNA các gen PB2, PB1 và PA
54
3.1.3. Kết quả giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và PA
60
3.2. KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG THẾ GIỚI
61
3.2.1. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2
61
3.2.1.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2
61
3.2.1.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PB2
65
3.2.2. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1
67
3.2.2.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1
67
3.2.2.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PB1
69
3.2.2.3 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2 
69
3.2.2.4 Kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40
73
3.2.3. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA
73
3.2.3.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA
73
3.2.3.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PA
77
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU
79
3.3.1. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2
79
3.3.2. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1
82
3.3.3. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PA
85
Chương 4. BÀN LUẬN
88
4.1. VỀ KẾT QUẢ THU NHẬN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU
88
4.1.1. Về kết quả thu nhận các gen PB2, PB1 và PA
88
4.1.2. Về qui trình nghiên cứu thu nhận các gen PB2, PB1 và PA
88
4.2. VỀ KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID CÁC GEN PB2, PB1, PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI
89
4.2.1. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB2
89
4.2.2. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1
93
4.2.2.1 Về kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1
93
4.2.2.2 Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2
94
4.2.2.3 Về kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40
96
4.2.3. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PA
97
4.3. VỀ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1, CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI
99
4.3.1. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2
99
4.3.2. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1
102
4.3.3. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PA
103
4.4. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI PHỨC HỢP ENZYM POLYMERASE, TỔ HỢP CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI
105
4.3.1. Về đặc điểm biến đổi phức hợp enzym polymerase liên quan bệnh học và dịch tễ học lây truyền sang người của virus cúm A/H5N1
105
4.3.2. Về nguồn gốc tổ hợp các gen PB2, PB1 và PA polymerase
108
Nhãm báng s©u
(40 bÖnh nh©n)
Nhãm báng trung b×
(20 bÖnh nh©n)
Nhãm ®¾p trªn vïng cho da
(20 bÖnh nh©n)
BÖnh nh©n nghiªn cøu (80 bÖnh nh©n)
Nhãm c¾t ho¹i tö
(20 bÖnh nh©n)
Nhãm m« h¹t
(20 bÖnh nh©n)
KẾT LUẬN
114
KIẾN NGHỊ
116
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT
Chữ viết tắt/
Ký hiệu
Tên đầy đủ
bp
base pair
Da
dalton
DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTP
Deoxyribonucleotide Triphosphate
ddNTP
Dideoxynucleotide Triphosphate
FAO
Food and Agriculture Organization
HA
Hemagglutinin
kb
kilobase 
M 
Matrix protein
MEGA 
Molecular Evolutionary Genetics Analysis
NA
Neuraminidase
NEP
Nuclear Export Protein
NP
Nucleoprotein
NS
Non-structural protein
OIE
Office International des Epizooties
PA
Polymerase acidic protein
PB1
Polymerase basic protein 1
PB2
Polymerase basic protein 2
RT-PCR
Reverse transcription - polymerase chain reaction 
RNA
Ribonucleic acid
RNP
Ribonucleoprotein
(-) ssRNA
Negative single-strand Ribonucleic Acid
WHO
cs.
World Health Organization
Cộng sự
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
1.1.
Tóm tắt đặc tính cấu tạo 8 phân đoạn RNA hệ gen và chức năng các protein của virus cúm A
6
1.2.
Tóm tắt lịch sử các đại dịch và dịch cúm A ở người
17
1.3.
Các vị trí thay đổi amino acid trong protein PB2, PB1 và PA, giữa virus cúm A ở gia cầm với chủng virus A/H1N1/1918 và virus cúm A ở người
19
1.4.
Số người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 từ 2003 đến nay
23
1.5.
Các vị trí thay đổi amino acid ở 3 protein PB2, PB1 và PA, liên quan đến độc lực và thích nghi lây truyền của virus cúm A/H5N1 trên người
29
2.1.
Danh sách 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 sử dụng trong nghiên cứu
33
2.2.
Danh sách 19 chủng virus cúm A/H5N1 đại diện sử dụng trong so sánh đặc tính di truyền các gen PB2, PB1 và PA
34
2.3.
Danh sách 31 chủng virus cúm A/H5N1 bổ sung xây dựng cây phả hệ nguồn gốc các gen PB2, PB1 và PA
35
2.4.
Danh sách mồi chuyển cDNA, kiểm tra cDNA hệ gen, thu nhận và giải trình tự các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu
39
2.5.
Thành phần và qui trình phản ứng chuyển đổi cDNA hệ gen virus cúm A/H5N1 từ RNA tổng số trong nghiên cứu
42
2.6.
Thành phần phản ứng của kỹ thuật PCR kiểm tra cDNA hệ gen 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu
43
2.7.
Chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR kiểm tra cDNA hệ gen 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu
43
2.8.
Thành phần phản ứng của kỹ thuật PCR thu nhận DNA các gen PB2, PB1 và PA từ cDNA hệ gen của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu
44
2.9.
Chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR thu nhận DNA các gen PB2, PB1 và PA từ cDNA hệ gen 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu
44
2.10.
Thành phần phản ứng ghép-nối đoạn cDNA sản phẩm PCR vào plasmid pCR®2.1-TOPO®
47
2.11.
Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng E.coRI
48
2.12.
Thành phần phản ứng PCR giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và PA của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu
49
2.13.
Chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và PA của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu
50
3.1.
Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trong trình tự gen PB2 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh
63
3.2.
Các vị trí thay đổi amino acid trong protein PB2 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 được so sánh
64
3.3.
Tỉ lệ tương đồng (%) thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh
66
3.4.
Các vị trí sai khác nucleotide trong trình tự protein PB1 dẫn đến thay đổi amino acid trong protein PB1 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh
68
3.5.
Tỉ lệ tương đồng (%) thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh
70
3.6.
Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trong trình tự gen PB1-F2 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh
71
3.7.
Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trong trình tự gen PA của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh
75
3.8.
Các vị trí thay đổi amino acid trong trình tự gen PA của 25 chủng virus cúm A/H5N1 được so sánh
76
3.9.
Tỉ lệ tương đồng (%) thành phần nucleotide và amino acid gen PA của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh
78
4.1.
Các vị trí thay đổi amino acid ở 3 protein PB2, PB1 và PA polymerase, liên quan độc lực gây bệnh, lây truyền của virus cúm A/H5N1 trên người
106
4.2.
Nguồn gốc tiến hóa xác định theo genotype của các gen PB2, PB1 và PA polymerase, trong hệ gen 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu và các chủng virus tham chiếu phân lập từ năm 2003 đến nay
109
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Hình/
Sơ đồ
Tên hình, sơ đồ
Trang
1.1.
Mô hình và ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A 
4
1.2.
Mô hình cấu trúc hệ gen virus cúm A
5
1.3.
Sơ đồ sắp sếp và trình tự vị trí codon AUG xác định điểm khởi đầu các ORF trong vùng đầu 5’- RNA thông tin gen PB1 virus cúm A
9
1.4.
Mô hình phân bố các vùng chức năng của protein PA
12
1.5.
Mô hình cấu trúc 3D và vị trí phức hợp polymerase trong cấu trúc mỗi phân đoạn RNP hệ gen của virus cúm A
12
1.6.
Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ
13
1.7.
Sơ đồ minh họa đặc tính biến đổi di truyền của các phân đoạn và hệ gen virus cúm A
15
1.8.
Sơ đồ hình thành các virus cúm A gây đại dịch cúm ở người
21
1.9.
Cây phả hệ minh họa sự hình thành và lưu hành xâm nhiễm gây bệnh ở người của các clade HA(H5) virus cúm A/H5N1 ở châu Á từ 2003 – 2011
23
1.10.
Sơ đồ minh họa tái tổ hợp hình thành các genotype Z, G và V của virus cúm A/H5N1
24
1.11.
Các genotype virus cúm A/H5N1 hình thành ở Việt Nam
26
2.1.
Sơ đồ qui trình tổng quát nghiên cứu các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm A/H5N1
37
2.2.
Sơ đồ bố trí vị trí bám mồi chuyển cDNA, thực hiện kỹ thuật PCR và giải trình tự các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A/H5N1
41
2.3.
Sơ đồ nguyên lí của kỹ thuật PCR
41
2.4.
Sơ đồ cấu trúc của vector pCR®2.1TOPO (Invitrogen)
47
3.1.
Kết quả điện di kiểm tra DNA một phần gen HA(H5) với cặp mồi H5F1 – H5R1 của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu
53
3.2.
Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB2 của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR
54
3.3.
Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB1 của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR
55
3.4.
Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PA của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR
56
3.5.
Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB2 của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI
57
3.6.
Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB1 của 6 biến  ... y. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins.
Taubenberger JK, Reid AH, Lourens RM, Wang R, Jin G, Fanning TG (2005), “Characterization of the 1918 influenza virus polymerase genes”, Nature, 437(7060), pp. 889-893.
Ito T and Kawaoka Y (2000), “Host-range barrier of influenza A viruses”. Vet Microbiol, 74, pp. 71–75.
Swayne DE and Suarez DL (2000), “Highly pathogenic avian influenza”, Rev Sci Tech Off Int Epiz, 20, pp. 463-482.
Baigent SJ and Mc Cauley JW (2003), “Influenza type A in humans, mammals and birds: determinants of virus virulence, host-range and interspecies transmission”, Bioessays, 25, pp. 657– 671.
Phạm Văn Ty (2005), Virus học. Nhà xuất bản giáo dục, 334 trang. 
Hurt AC, Selleck P, Komadina N, Shaw R, Brown L, Barr IG (2007), “Susceptibility of highly pathogenic A(H5N1) avian influenza viruses to the neuraminidase inhibitors and adamantanes”, Antiviral Res, 73, pp. 228-231.
Reperant LA, van de Bildt MW, van Amerongen G, Leijten LM, Watson S, Palser A, Kellam P, Eissens AC, Frijlink HW, Osterhaus AD, Kuiken T (2012), “Marked endotheliotropism of highly pathogenic avian influenza virus H5N1 following intestinal inoculation in cats” J Virol., 86(2), pp. 1158-1165.
Taubenberger JK and Kash JC (2010), “Influenza virus evolution, host adaptation, and pandemic formation”, Cell Host Microbe, 7, pp 440–451.
Chen JM, Sun YX, Chen JW, Liu S, Yu JM, Shen CJ, Sun XD, Peng D (2009), “Panorama phylogenetic diversity and distribution of type A influenza viruses based on their six internal gene sequences”, Virology Journal, 6(137), pp.1186-1206.
Yao Y, Mingay LJ, Mccauley JW, Barclay WS (2001), “Sequences in influenza A virus PB2 protein that determine productive infection for an avian influenza virus in mouse and human cell lines”, J Virol, 75, pp. 5410-5415.
Subbarao K, London W, Murphy BR (1993), “A single amino acide in the PB2 gene of influenza A virus is a determinant of host range”, J Virol, 67, pp. 1761-1764. 
Massin P, van der Werf S, Naffakh N (2001), “Residue 627 of PB2 is a determinant of cold sensitivity in RNA replication of avian influenza viruses”, J Virol, 75, pp. 5398-04.
Rolling T, Koerner I, Zimmermann P, Holz K, Haller O, Staeheli P, Kochs G (2009), “Adaptive mutations resulting in enhanced polymerase activity contribute to high virulence of influenza A virus in mice” J Virol, 83(13), pp. 6673-80. 
Steel J, Lowen AC, Mubareka S, Palese P (2009), “Transmission of influenza virus in a mammalian host is increased by PB2 amino acids 627K or 627E/701N”, PloS Pathog, 5, pp. 252-265.
Bussey KA, Bousse TL, Desmet EA, Kim B, Takimoto T (2010), “PB2 residue 271 plays a key role in enhanced polymerase activity of influenza A viruses in mammalian host cells”, J Virol, 84(9), pp. 4395-406.
Zhou B, Li Y, Halpin R, Hine E, Spiro DJ, Wentworth DE (2011), “PB2 residue 158 is a pathogenic determinant of pandemic H1N1 and H5 influenza a viruses in mice”, J Virol, 85(1), pp. 357-65.
Wagner R, Matrosovich M, Klenk H (2002), “Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections”, Med Virol, 12(3), pp. 159-166.
Cheung CL, Rayner JM, Smith GJD, Wang P, Zhang J, Yuen KY, Webster RG, Peiris JSM, Guan Y, Chen H (2006), “Distribution of amantadine-resistant H5N1 avian influenza variants in Asia”, J Infect Dis, 193, pp. 1626-1629.
Reid AH, Taubenberger JK, Fanning TG (2004), “Evidence of an absence: the genetic origins of the 1918 pandemic influenza virus”, Nat Rev Microbiol, 2, pp. 909–914.
Taubenberger JK and Morens DM (2006), “1918 influenza: the mother of all pandemics”, Emerg Infect Dis, 12, pp. 15-22.
WHO (2013a), “Cumulative number of confirmed human cases for avian influenza A(H5N1) reported to WHO, 2003-2013”, on 12 April 2013,  
Chen H, Deng G, Li Z, Tian G, Li Y et al. (2004), “The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China”, PNAS, 101(28), pp. 10452-10457.
Chen H, Smith GJD, Li KS, Vijaykrishna D, Zhang JX, Zhang LJ, Guo CT, Cheung CL, Xu KM, Duan L, Wu WL, Chen Y, Nguyen TD, Webster RG, Peiris JSM, Guan Y (2006), “Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic control”, PNAS USA, 103, pp. 2845-2850.
WHO/OIE/FAO - H5N1 Evolution Working Group (2012), “Continued evolution of highly pathogenic avian influenza A (H5N1)”: updated nomenclature. Influenza Other Respi Viruses. 2012 Jan; 6(1), pp. 1-5.
WHO (2013b), “Antigenic and genetic characteristics of zoonotic influenza viruses and development of candidate vaccine viruses for pandemic preparedness”, on 20_2_2013, 
Li Y, Shi J, Zhong G, Deng G, Tian G, Ge J, et al (2010), “Continued evolution of H5N1 influenza viruses in wild birds, domestic poultry and humans in China from 2004 to 2009”, J Virol, 84, pp. 8389–8397. 
Wan XF, Dong L, Lan Y, Long LP, Xu C, et al. (2011), “Indications that live poultry markets are a major source of human H5N1 influenza virus infection in China”, J Virol. 85 (24), pp. 13432-13438. 
WHO (2013c), Human infection with avian influenza A(H7N9) virus in China – update. Available from 
Vijaykrishna D, Bahl J, Riley S, Duan L, Zhang JX, et al. (2008), “Evolutionary dynamics and emergence of panzootic H5N1 influenza viruses”, PloS Pathog, 4(9), pp. 1-10.
Li KS, Guan Y, Wang J, Smith GJ, Xu KM, Duan L, et al. (2004), “Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia”, Nature, 430, pp. 209-213.
Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Trần Bình (2008), “Virus cúm A/H5N1: Vấn đề dịch tễ học, tiến hóa, hình thành genotype và tương đồng kháng nguyên – miễn dịch – vaccine”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(4A), tr. 529-553. 
Wan XF, Nguyen TD, Davis CT, Smith CB, Carrel M, Do HT, Mai DT, Cox NJ, Nguyen CV, Klimov A, Donis RO (2008), “Evolution of highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses in Vietnam between 2001 and 2007”, PLoS One, 3, pp. 1-12.
Nguyen T, Rivailler P, Davis CT, Hoa do T, Balish A, Dang NH, Jones J, Vui DT, Simpson N, Huong NT, Shu B, Loughlin R, Ferdinand K, Lindstrom SE, York I.A, Klimov A, Donis RO (2012), “Evolution of highly pathogenic avian influenza (H5N1) virus populations in Vietnam between 2007 and 2010”, Virology, 432(2), pp. 405-416.
Nguyen TD, Nguyen TV, Vijaykrishna D, Webster RG, Guan Y, Peiris MJS. and Smith GJD (2008), “Multiple Sublineages of Influenza A Virus (H5N1), Vietnam, 2005−2007”, Emerging Infectious Diseases, 14(4), pp. 632-636.
Nguyen TD, Davis CT, Stembridge W, Ngo HT, Wan XF, Mc Carron M, Lindstrom SE, Cox NJ, Nguyen CV, Klimov AI, Donis RO (2009), “Characterization of a highly pathogenic avian influenza H5N1 virus sublineage in poultry seized at ports of entry into Vietnam”, Virology, 387, pp. 250-256.
Lê Quỳnh Mai (2011), “Đặc điểm phân tử của virút cúm A/H5N1 tại miền Bắc Việt Nam, 2003 – 2008”, Tạp chí Y học thực hành, 764(5/2011), tr. 86 – 89. 
Nguyễn Thị Kim Tiến (2005), “Dịch tễ học, virus học bệnh cúm A(H5N1) trên người tại khu vực phía Nam”, Tạp chí Y học thực hành, 517 (8/2005), tr. 46-49.
Smith GJ, Naipospos TS, Nguyen TD, de Jong M, Hien TT, Webster RG, Guan Y (2006), “Evolution and adaptation of H5N1 influenza virus in avian and human hosts in Indonesia and Vietnam”, Virology, 350, pp. 258-268.
Wang J, Vijaykrishna D, Duan L, Webster RG, Peiris JSM, Chen H, Smith GJD, Guan Y (2008), “Identification of the progenitors of Indonesian and Vietnamese avian influenza A (H5N1) viruses from southern China”, J Virol, 82, pp. 3405-3414.
Nguyễn Ngọc Tiến, Hoàng Văn Năm, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Tùng và Ken Inui (2011), “Lưu hành của virút cúm gia cầm độc lực cao H5N1 tại Việt Nam và vaxcin phòng bệnh cúm gia cầm”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XVIII(6), tr. 76 - 78.
Đậu Huy Tùng, Đồng Văn Quyền, Nguyễn Tùng, Nguyễn Nam Thắng, Trần Xuân Hạnh, Kim Young Bong và Đinh Duy Kháng (2012), “Đánh giá hiệu lực vacxin cúm H5N1 (chủng NIBRG14) trên một số clade lưu hành ở Việt Nam năm 2011và phân tích đặc tính di truyền của virut H5N1 clade 2.3.2.1b”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XIX(6), tr. 5-16. 
Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa (2012), “Xác định các nhóm kháng nguyên 1.1 và 2.3.2.1 của cúm A/H5N1 xuất hiện mới tại Việt Nam qua phân tích đặc điểm di truyền và phả hệ gen hemagglutinin (H5) giai đoạn 2004 – 2011”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XIX(2), tr. 20-28.
Bộ Y tế Việt Nam (2013), Thông cáo chung: Tình hình Cúm A(H7N9),  Truy cập 18/4/2013.
Guan Y, Smith GJD, Webby RJ and Webster RG (2009), “Molecular epidemiology of H5N1 avian influenza”, Rev sci tech Off int Epiz, 28 (1), pp. 39-47.
Seo SH, Hoffmann E, Webster RG (2002), “Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responses”, Nat Med, 8, pp. 950-954.
Seo SH, Hoffmann E, Webster RG (2004), “The NS1 gene of H5N1 influenza viruses circumvents the host anti-viral cytokine responses”, Virus Res, 103, pp. 107-113.
References and further reading may be available for this article. To view references and further reading you must purchase this article.
Lycett SJ, Ward MJ, Lewis FI, Poon AF, Kosakovsky PSL, Brown AJ (2009), “Detection of mammalian virulence determinants in highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses: multivariate analysis of published data”, J Virol, 83(19), pp. 9901-9910.
Duan L, Smith GJD, Wang J, Vijaykrishna D, Li KS, Shortridge KF, Webster RG, Peiris JSM, Chen H and Guan Y (2008), “The development and genetic diversity of H5N1 influenza virus in China, 1996–2006”, Virology, 380(2), pp. 243–254.
Chen H, Bright RA, Subbarao K, Smith C, Cox NJ, Katz JM, Matsuoka Y (2007), “Pyolygenic virulence factors involved in pathogenesis of 1997 Hong Kong H5N1 influenza viruses in mice”, Virus Res, 128(1-2), pp.159-63.
Le MTQ, Wertheim HFL, Nguyen HD, Taylor W, Hoang PVM, et al. (2008), “Influenza A H5N1 clade 2.3.4 virus with a different antiviral susceptibility profile replaced clade 1 virus in humans in Northern Vietnam”, PloS ONE, 3(10), pp. 1-8.
Le QM, Sakai-Tagawa Y, Ozawa M, Ito M, Kawaoka Y (2009), “Selection of H5N1 influenza virus PB2 during replication in humans”, J Virol, 83(10), pp. 5278-5281. 
Hatta M, Hatta Y, Kim JH, Watanabe S, Shinya K, Nguyen T, Lien PS, Le QM. & Kawaoka Y (2007), “Growth of H5N1 influenza A viruses in the upper respiratory tracts of mice”, PLoS Pathog 3, pp. 1374-1379.
Katz JM, Lu X, Tumpey TM, Smith CB, Shaw MW (2000), “Molecular correlates of Influenza A/H5N1 virus pathogenesis in mice”. J Virol, 74(22), pp. 10807-10810.
Hatta M, Gao P, Halfmann P, Kawaoka Y (2001), “Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses”, Science, 293(5536), pp. 1840-1842.
Li J, Ishaq M, Prudence M, Xi X, Hu T, Liu Q, Guo D (2009), “Single mutation at the amino acid position 627 of PB2 that leads to increased virulence of an H5N1 avian influenza virus during adaptation in mice can be compensated by multiple mutations at other sites of PB2”, Virus Res, 144(1-2), pp. 123-129.
 Subbarao K, Shaw MW (2000), “Molecular aspects of avian influenza (H5N1) viruses isolated from humans. in Medical”, Virology, 10(5), pp. 337-348. Reviews.
Song MS, Pascua PN, Lee JH, Baek YH, Lee OJ, Kim CJ, et al. (2009), “The polymerase acidic protein gene of influenza a virus contributes to pathogenicity in a mouse model”, J Virol, 83, pp.12325-35.
Lê Trần Bình, Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Nguyễn Thị Bích Nga, Trương Nam Hải (2006), Phân tích mối tương đồng kháng nguyên và miễn dịch giữa các chủng virus cúm A, các chủng cường độc đương nhiễm và các chủng vacxin cúm A/H5N1, Tạp chí Công nghệ sinh học,4(3), tr. 1-7.
 Trần Quang Vui, Nguyễn Thị Bích Nga, Đoàn Thị Thanh Hương, Nguyễn Bá Hiên, Lê Thanh Hòa (2009), “Gen PB1 và PB1-F2 của virus cúm A/H5N1 chủng A/CK/VietNam/HG4/2005, và so sánh với một số chủng phân lập 2004-2007 tại vùng đồng bằng sông Cửu Long”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 7(2), tr. 1-8. 
Cao Thị Bảo Vân, Võ Hồ Hồng Hải, Ngô Thanh Long, Lê Hà Tầm Dương (2005), “Đánh giá về độc tính và khả năng lây cho người của virus cúm A/H5N1 qua các vụ dịch 2004-2005 tại miền Nam Việt Nam qua giám sát đột biến gen”, Tạp chí Y học dự phòng, 15(6), tr. 5-10.
Bộ Y tế Việt Nam (2005), “Hướng dẫn lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển bệnh phẩm virus cúm A/H5N1”, Ban hành kèm theo quyết định số 1269/QĐ-BYT ngày 07 tháng 4 năm 2005 của Bộ trưởng Bộ Y tế.
 Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd editon.). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-0-87969-577-4.
 Clark David P (2005), Molecular Biology: Academic Cell Update Edition, Elsevier Academic Press, Jun 9, 2005 - Science - 816 pages. ISBN: 0-12-175551-7.
Bae SH, Cheong HK., Lee JH, Cheong C, Kainosho M, Choi BS. (2001), “Structural features of an influenza virus promoter and their implications for viral RNA synthesis”, Proc Nat Acad Sci USA, 98, pp. 10602–10607. 
Hoffmann E, Stech J, Guan Y, Webster RG, Perez DR (2001), “Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses”. Arch Virol, 146, pp. 2275–89. 
Chan CH, Lin KL, Chan Y, Wang YL, Chi YT, Tu HL, Shieh HK, Liu WT (2006), “Amplification of the entire genome of influenza A virus H1N1 and H3N2 subtypes by reverse-transcription polymerase chain reaction”, Journal of Virological Methods, 136, pp. 38-43.
O’Connell J (2002), RT-PCR protocols in “Methods in Molecular Biology”, 193, © Humana Press Inc., Totowa, NJ, 378 pp, 
Hagemann TL, Kwan SP (2008), SeqEd: Manipulation of sequence data and Choromatograms from the ABI DNA Sequencer Analysis Files: 55-63, in “Sequence data analysis guidebook (Methods in Molecular Biology)” Eds: Swindell SR. Humana Press Inc., Totowa, NJ.
Nicholas KB. and Nicholas HB (1997), Gendoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments. Distributed by the author. 
 Tamura K, Dudley MN, Kumar S (2007) “MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0”, Mol Biol Evol, 24, pp. 1596-1599.
Kim HR, Lee YJ, Choi KP, Oem JK, Lee OS, Kang HM, Choi JG, and Bae YC (2012), “Highly pathogenic avian influenza (H5N1) outbreaks in wild birds and poultry, South Korea”, Emerg Infect Dis, 18(3), pp. 480-483. 
Sonnberg S, Phommachanh P, Naipospos TS, McKenzie J, Chanthavisouk C, Pathammavong S, Darnell D, Meeduangchanh P, Rubrum AM, Souriya M, Khambounheuang B, Webby RJ, Douangngeun B, Webster RG (2012), “Multiple introductions of avian influenza viruses (H5N1), Laos, 2009-2010”, Emerg Infect Dis., 18(7). pp. 1139-1143.
Guan Y, Peiris JSM, Chinh NT, Hien TT, Farrar J (2006), “Fatal outcome of human influenza A (H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia”, Nat Med, 12, pp. 1203-1207.
 Jiao P, Tian G, Li Y, Deng G, Jiang Y, Liu C, Liu W, Bu Z, Kawaoka Y, Chen H (2008), “Single-amino-acid substitution in the NS1 protein changes the pathogenicity of H5N1 avian influenza viruses in mice”, J Virol, 82, pp. 1146-1154.
TRANG WEB 
 RG15a.pdf.
PHỤ LỤC LUẬN ÁN