Luận án Nghiên cứu sự biểu hiện mrna của gen ciz1b, vegf và đột biến egfr với nhiễm virus merkel cell ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y
N VĂN HOÀN
HỒ VĂN SƠN 
NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN mRNA CỦA GEN CIZ1b, VEGF VÀ ĐỘT BIẾN EGFR VỚI NHIỄM VIRUS 
MERKEL CELL Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI 
KHÔNG TẾ BÀO NHỎ
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
HÀ NỘI – 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y
NGUYỄN VĂN HOÀN
HỒ VĂN SƠN
N VĂN HOÀN
NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN mRNA CỦA GEN CIZ1b, VEGF VÀ ĐỘT BIẾN EGFR VỚI NHIỄM VIRUS 
MERKEL CELL Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI 
KHÔNG TẾ BÀO NHỎ
Chuyên ngành: Khoa học y sinh
Mã số: 9 72 01 01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
 HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 	 	1. GS.TS. Nguyễn Lĩnh Toàn
	 	 	2. TS. Ngô Tất Trung	
HÀ NỘI – 2020
LỜI CAM ĐOAN
	Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng bản thân tôi, tất cả các số liệu trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa công bố trong bất kỳ công trình nào.
 TÁC GIẢ
 Hồ Văn Sơn
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Đảng ủy, Ban Giám đốc Học viện Quân y, Bộ môn Sinh lý Bệnh, Phòng Sau Đại học, Học viện Quân y đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban giám đốc Bệnh viện Quân y 175, Trung tâm tư vấn di truyền và sàng lọc ung thư (CGC), Trung tâm nghiên cứu y học Việt Đức (VG-CARE), Khoa Sinh học phân tử (C17) bệnh viện Trung ương Quân đội 108 và các cơ quan chức năng đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và thực hiện luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với GS.TS. Nguyễn Lĩnh Toàn và TS. Ngô Tất Trung, hai thầy hướng dẫn khoa học, đã tận tụy dành thời gian, trí tuệ, công sức giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn chỉnh luận án.
Tôi chân thành cảm ơn Trung tâm chẩn đoán và điều trị ung bướu, Khoa Sinh hoá Bệnh viện Quân y 175 đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Nhân dịp này chúng tôi chân thành cảm ơn các bạn bè, đồng nghiệp đã ủng hộ, động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi dành tình cảm biết ơn sâu sắc tới gia đình, bố mẹ và vợ con đã luôn động viên, giúp đỡ trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận án.
 TP Hồ Chí Minh 03/2020 
Hồ Văn Sơn
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Phần viết tắt
Phần viết đầy đủ
ALK
Anaplastic lymphoma kinase 
ALT
Alanin transaminase (enzyme chuyển amin của Alanin)
AFP
Alpha-fetoprotein 
ATP
Adenosine triphosphate
AST
Aspartate transaminase (Enzym chuyển amin của Aspartate)
AUC
Area under the curve (diện tích dưới đường cong)
BN
Bệnh nhân
CIZ1
Protein Cip1-interacting zinc finger
CIZ1b
Biến thể b của Protein Cip1-interacting zinc finger
COPD
Chronic obstructive pulmonary disease (Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính)
CT
Computed Tomography (chụp cắt lớp vi tính)
CEA
Carcinoma Embryonic Antigen
DNA
Deoxyribonucleic Acid
EGFR
epidermal growth factor receptor (gen mã hóa thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì - EGFR)
ELISA
Enzyme linked immuno sorbent assay (Xét nghiệm miễn dịch gắn enzyme)
FDA
Food and Drug Administration (Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Thuốc Hoa Kỳ)
IARC
International Agency for Research on Cancer (Cơ quan nghiên cứu ung thư thế giới)
IL
Interleukin
mRNA
Messenger RNA (RNA thông tin)
MCC
Merkel cell carcinoma
MCV/ MCPyV
Merkel Cell Polyomavirus
NCBI
National Center for Biotechnology Information (Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học)
PCR
Polymerase chaine reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
PET
Positron Emission Tomography (Chụp cắt lớp bằng phóng xạ)
PSA
Prostate-specific antigen (Kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt)
ROC
Receiver Operating Characteristic (đường cong đặc trưng hoạt động của bộ thu nhận)
cDNA
complementary Deoxyribonucleic Acid
RNA
Ribonucleic acid
SNP
Single Nucleotide Polymorphism (Đa hình Nucleotide đơn)
UTBMT
Ung thư biểu mô tuyến
UTBMTBG
Ung thư biểu mô tế bào gai
UTP
Ung thư phổi
UTPKTBN
Ung thư phổi không tế bào nhỏ
UTPTBL
Ung thư phổi tế bào lớn
UTPNP
Ung thư phổi nguyên phát
VEGF
Vascular Endothelial Growth Factor (Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu)
VEGFR
Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (thụ thể của yếu tố tăng trưởng nội mạch - VEGFR) 
WHO
World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
 DANH MỤC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
 2.1. Trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu	40
 2.2. Một số trang thiết bị, máy móc chính sử dụng trong nghiên cứu	41
 2.3. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA	42
 2.4. Thành phần phản ứng real-time PCR cho gen ABL, CIZ1b và VEGF	43
2.5. Thành phần phản ứng real-time PCR bằng bộ sinh phẩm Super-ARMS® EGFR Mutation Detection Kit	47
2.6. Giá trị Cut off của các loại đột biến	48
2.7. Thành phần phản ứng real-time PCR phát hiện MCV	51
3.1. Đặc điểm tuổi của các nhóm nghiên cứu	63
3.2. Phân bố về tuổi của các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ	63
3.3. Đặc điểm về giới của các nhóm nghiên cứu	64
3.4. Đặc điểm tế bào máu ngoại vi của nhóm bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ	66
3.5. Hoạt độ men gan của nhóm bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ	66
3.6. Chức năng thận của nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ	67
3.7. Nồng độ Glucose máu của bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ	67
3.8. Đặc điểm Ion đồ của nhóm bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ	67
3.9. Một số đặc điểm của dấu ấn ung thư liên quan đến ung thư phổi không tế bào nhỏ	68
3.10. Vị trí khối u tại phổi ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ	69
3.11. Vị trí hạch ở các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ	69
3.12. Kết quả đặc điểm mô bệnh học	70
3.13. Độ biệt hóa của khối u ở các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ	70
Bảng
Tên bảng
Trang
3.14. Phân loại giai đoạn theo TNM của nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ	71
3.15. Một số chỉ số tế bào máu ngoại vi của nhóm người bình thường	71
3.16. Một số đặc điểm về xét nghiệm hoạt độ men gan thận và dấu ấn ung thư của nhóm người bình thường	72
3.17. Kết quả so sánh các chỉ số cận lâm sàng giữa nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và nhóm người bình thường	73
3.18. Kết quả nồng độ DNA và OD 260/280 của nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và nhóm người bình thường	74
3.19. Giá trị Ct của CIZ1b thu được từ phản ứng real-time PCR	75
3.20. Giá trị Ct của VEGF thu được từ phản ứng real-time PCR	75
3.21. Giá trị Ct của ABL thu được từ phản ứng real-time PCR	76
3.22. Biểu hiện mRNA của CIZ1b huyết tương ở nhóm nghiên cứu	76
3.23. Biểu hiện mRNA của VEGF huyết tương ở nhóm nghiên cứu	77
3.24. Vị trí đột biến trên gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ	79
3.25. Tỷ lệ nhiễm MCV ở nhóm bệnh và nhóm chứng	82
3.26. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF và các rối loạn tế bào máu ngoại vi	82
3.27. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF và rối loạn hoạt độ men gan	83
3.28. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với rối loạn Glucose máu	84
3.29. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF và đặc điểm mô bệnh học của khối u	84
3.30. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF và độ biệt hóa của khối u	85
3.31. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF và giai đoạn của bệnh	86
3.32. Biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF và đột biến gen EGFR	86
3.33. Mối tương quan quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với các chỉ số tế bào máu ngoại vi	87
3.34. Mối tương quan quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với các chỉ số Ion đồ	88
Bảng
Tên bảng
Trang
3.35. Mối tương quan quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với các chỉ số hoạt độ men gan	88
3.36. Mối tương quan quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với các chỉ số chức năng thận	90
3.37. Mối tương quan quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF với các marker ung thư	90
3.38. Mối liên quan giữa giai đoạn bệnh và nhiễm MCV	91
3.39. Mối liên quan giữa độ biệt hoá tế bào khối u và nhiễm MCV	91
3.40. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với một số chỉ số tế bào máu ngoại vi và Sinh hoá	92
3.41. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với marker ung thư	93
3.42. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với đột biến EGFR	93
3.43. Mối liên quan giữa nhiễm MCV với mức độ biểu hiện gen VEGF và CIZ1b	94
 DANH MỤC HÌNH
 Hình
Tên hình
Trang
1.1. Dịch tễ học ung thư phổi trên thế giới.	4
1.2. Tăng sinh mạch (angiogensis) là một trong sáu đặc điểm nổi bật của tế bào ung thư.	9
1.3. Cấu trúc phân tử của gen VEGF	19
1.4. Sơ đồ cấu trúc protein CIZ1	23
1.5. Cấu trúc các biến thể của CIZ1	25
1.6. Con đường tín hiệu qua EGFR	27
1.7. Hình ảnh Merkel cell polyomavirus phân lập được trong bệnh ung thư tế bào merkel	29
1.8. Cấu trúc bộ gen của MCV	30
2.1. Hình ảnh giải phẫu bệnh của ung thư biểu mô tế bào gai	54
2.2. Hình ảnh giải phẫu bệnh của ung thư biểu mô tuyến	55
2.3. Hình ảnh giải phẫu bệnh của ung thư biểu mô tế bào lớn 	55
2.4. Độ 1 - Carcinom tế bào gai biệt hóa rõ	56
2.5. Độ 2 - Carcinom tế bào gai biệt hóa vừa	56
2.6. Độ 3 - Carcinom tế bào gai biệt hóa kém	57
2.7. Độ 1 - Carcinom tuyến biệt hóa rõ	57
2.8. Độ 2 - Carcinom tuyến biệt hóa vừa	58
2.9. Độ 3 - Carcinôm tuyến biệt hóa kém	58
3.1. Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ khi nhập viện	64
3.2. Tiền căn cá nhân của các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ	65
3.3. Mức độ biểu hiện của mRNA của CIZ1b huyết tương ở các nhóm nghiên cứu	77
3.4. Mức độ biểu hiện của mRNA của VEGF huyết tương ở các nhóm nghiên cứu	78
3.5. Tín hiệu real-time PCR phát hiện đột biến EGFR trên exon 21 (đột biến L858R) ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ.	78
Hình
Tên hình
Trang
3.6. Tín hiệu real-time PCR phát hiện MCV huyết tương ở người bình thường.	79
3.7. Tín hiệu real-time PCR phát hiện MCV huyết tương ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ.	80
3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản MCV- DNA trong huyết tương của một số bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và người bình thường.	80
3.9. Kết quả giải trình tự đoạn gen MCV (A) và so sánh với trình tự MCV trên dữ liệu NCBI (B)	81
3.10. Mối tương quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b hoạt độ ALT	89
3.11. Mối tương quan giữa biểu hiện mRNA của CIZ1b hoạt độ AST	89
3.12. Giá trị chẩn đoán ung thư phổi không tế bào nhỏ của biểu hiện mRNA của CIZ1b	95
3.13. Giá trị chẩn đoán ung thư phổi không tế bào nhỏ của biểu hiện mRNA của VEGF	95
4.1. Nồng độ protein CIZ1 trên các nhóm bệnh ung thư phổi 	102
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư phổi nguyên phát (UTPNP) là một trong những bệnh lý ác tính thường gặp nhất hiện nay và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong các bệnh lý ung thư. Theo Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC), UTPNP chiếm khoảng 12% ung thư các loại và chiếm 18% tỷ lệ tử vong trong các bệnh ung thư [1]. Trong đó, ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) chiếm hơn 80% các trường hợp UTPNP [2], [3]. Tại Việt Nam, ung thư phổi (UTP) có sự gia tăng nhanh chóng, đó là hậu quả của tình trạng hút thuốc lá, ô nhiễm không khí, khói bụi và chất thải công nghiệp
Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán sớm và điều trị UTP, nhưng khi phát hiện hầu hết các trường hợp thường đã muộn. Tỷ lệ sống thêm 5 năm chỉ khoảng 16% đối với các bệnh nhân được chẩn đoán UTP thời kỳ cuối so với 70-90% khi bệnh được chẩn đoán và điều trị ở các giai đoạn sớm hơn [1]. Vì vậy, chẩn đoán và điều trị sớm UTP là một chiến lược nhiều triển vọng để giảm tỷ lệ tử vong và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân. Với sự phát triển nhanh chóng của y sinh học, đặc biệt là sinh học phân tử ngày càng góp phần đáng kể vào công tác chẩn đoán, theo dõi điều trị, cũng như tiên lượng UTPNP. Gần đây, các nghiên cứu về gen Cip1-interacting zinc finger (CIZ1), một gen mã hoá cho một protein nội bào tham gia vào sự khởi đầu tái bản Deoxyribonucleic Acid (DNA), trong đó, biến thể b của Cip1-interacting zinc finger (CIZ1b), biểu hiện nhiều ở mô ung thư UTPKTBN, là một dấu ấn phân tử có thể phát hiện sớm UTPNP. Biểu hiện của CIZ1b trong huyết tương, có giá trị chẩn đoán 98% các trường hợp UTPNP so với bình thường, hoặc 95% trường hợp so với u phổi lành tính [3]. Bên cạnh đó, yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu - Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) có vai trò hết sức quan trọng trong sự phát triển của khối u. VEGF vừa thúc đẩy hình thành mạch máu nuôi vừa thúc đẩy khối ung thư phát triển. Biểu hiện VEGF ở huyết tương có giá trị trong chẩn đoán, tiên lượng và dự đoán kết quả điều trị UTPNP [4],[5]. 
Đột biến Epidermal growth factor receptor (EGFR) đóng vai trò hết sức quan trọng trong cơ chế bệnh sinh UTP và là đích phân tử có giá trị trong việc điều trị. Mang lại những hiệu quả rõ rệt trong việc kéo dài thời gian sống thêm và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân UTPKTBN. 
Vai trò của truyền nhiễm trong UTP đã được nghiên cứu và chứng minh, trong đó có vai trò của nhiễm virus như Human papillomavirus (HPV), Epstein-Barr virus (EBV) và gần đây là nhiễm Virus Merkel cell (Merkel cell Carcinoma virus - MCV). Các nghiên cứu cho thấy có sự liên quan rõ rệt giữa nhiễm MCV với nguy cơ UTPKTBN và đột biến EGFR. 
Tuy nhiên, ở nước ta giá trị của biểu hiện gen CIZ1b, VEGF và đột biến EGFR với tình trạng nhiễm MCV trong UTP nói chung và UTPKTBN nói riêng chưa được nghiên cứu. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự biểu hiện mRNA của gen CIZ1b, VEGF và đột biến EGFR với nhiễm virus Merkel cell ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ” với mục tiêu:
 1. Đánh giá mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b, VEGF, đột biến EGFR và tỷ lệ nhiễm virus Merkel cell ở bệnh nhân UTPKTBN.
2. Phân tích mối liên quan giữa mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b, VEGF, đột biến EGFR với nhiễm virus Merkel cell và một số triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân UTPKTBN.
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về ung thư phổi
1.1.1. Tình hình ung thư phổi trên thế giới
Ung thư phổi hiện nay vẫn là loại phổ biến nhất cả về tần suất mắc bệnh và tử vong, đặc biệt tại Mỹ, Hàn Quốc và hầu hết các nước châu Á- Thái bình dương [1]. Trên toàn thế giới có khoảng 2,1 triệu ca UTP mới được phát hiện và dự đoán có đến 1,8 triệu ca tử vong trong năm 2018 chiếm đến hơn 18% tổng số ca tử vong do ung thư. Ở nam giới, UTP là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở hầu hết các nước ở Đông Âu, Tây Á (đáng chú ý là ở Liên Xô cũ), Bắc Phi, Trung Quốc và Đông Nam Á (ví dụ: Myanmar, Philippines và Indonesia). Ở nữ, UTP là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở 28 quốc gia. Tỷ lệ mắc cao nhất được thấy ở Bắc Mỹ, Bắc và Tây Âu (đáng chú ý là ở Đan Mạch và Hà Lan), Úc/New Zealand, đặc biệt Hungary đứng hàng đầu tỷ lệ mắc bệnh lý này [1].
Tại Mỹ, năm 2018, theo Global cancer statistics 2018, dự báo có khoảng 234.030 case mắc mới (nam 121.680 case, nữ 112.350 case) [1].
Ở các nước Châu Âu, tỷ lệ mắc UTP năm 2018 có khác nhau giữa các vùng: cao nhất là ở Đông Âu 49,3 case/100.000 người đối với nam và 11,9 case/100.000 đối với nữ, Tây âu và Nam Âu tương tự nhau khoảng 43 case/100.000 đối với nam và hơn 16 case/100.000 đối với nữ. Đông- Nam Á gặp 26,3 case/100.000 với nam và 9,6 case/100.000 với nữ. UTP thường gặp ở nam nhiều hơn nữ. Tuy nhiên, tỷ lệ này đang có xu hướng giảm dần, nhất là ở những nước phát triển. Tỷ lệ mắc bệnh giữa nam và nữ thay đổi theo địa lý và thời gian. Tại Mỹ và Bắc Mỹ tỷ lệ nam/nữ hiện nay tương ứng là 1/1, tại Đông Âu 4/1, Tây Âu là 2/1. Đ ... 122.	Aberle D. R., Adams A. M., Berg C. D., et al. (2011). National Lung Screening Trial Research. Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening. N Engl J Med. 365(5): 395-409.
123.	Henschke C. I., Yankelevitz D. F., Libby D. M., et al. (2006). International Early Lung Cancer Action Program. Survival of patients with stage I lung cancer detected on CT screening. N Engl J Med. 355(17): 1763-71.
124.	Coverley D., Marr J. and Ainscough J. (2005). CIZ1 promotes mammalian DNA replication. J Cell Sci. 118(Pt 1): 101-12.
125.	Hanahan D. and Weinberg R. A. (2011). Hallmarks of cancer: the next generation. Cell, 144(5): 646-674.
126.	Ferrara N., Gerber H. P. and LeCouter J. (2003). The biology of VEGF and its receptors. Nat Med, 9(6): 669-676.
127.	Kerbel R.S. (2008). Tumor angiogenesis. N Engl J Med. 358(19): 2039-49.
128.	Kuhnert F., Kirshner J. R. and Thurston G. (2011). Dll4-Notch signaling as a therapeutic target in tumor angiogenesis. Vasc Cell. 3(1): 20.
129.	Khandekar M. J., Piotrowska Z., Willers H., et al. (2018). Role of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Inhibitors and Radiation in the Management of Brain Metastases from EGFR Mutant Lung Cancers. Oncologist, 23: 1-9.
130.	Kim M. S., Park T. I., Lee Y. M., et al. (2013). Expression of Id-1 and VEGF in non-small cell lung cancer. Int J Clin Exp Pathol. 6(10): 2102-11.
131.	Alevizakos M., Kaltsas S. and Syrigos K. N. (2013). The VEGF pathway in lung cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 72(6): 1169-81.
132.	Yuan A., Yu C. J., Luh K. T., et al. (2000). Quantification of VEGF mRNA expression in non-small cell lung cancer using a real-time quantitative reverse transcription-PCR assay and a comparison with quantitative competitive reverse transcription-PCR. Lab Invest. 80(11): 1671-80.
133.	Cha N., Lv M., Zhao Y. J., et al. (2014). Diagnostic utility of VEGF mRNA and SP1 mRNA expression in bronchial cells of patients with lung cancer. Respirology. 19(4): 544-8.
134.	Usuda K., Iwai S., Funasaki A., et al. (2018). Expression and Prognostic Impact of VEGF, CD31 and alphaSMA in Resected Primary Lung Cancers. Anticancer Res. 38(7): 4057-4063.
135.	Hoàng Anh Vũ, Cao Văn Động, Ngô Thị Tuyết Hạnh và cs (2011). Đột biến gen EGFR và KRAS trên bệnh nhân ung thư phổi không phải tế bào nhỏ. Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh, 14(4): 166-172.
136.	Nguyễn Ngọc Quang, Vương Diệu Linh, Lương Viết Hưng và cs (2014). Nghiên cứu tần suất và một số yếu tố liên quan đến đột biến gen EGFR tại exon 19 và exon 21 trong carcinoma tuyến của phổi. Tạp Chí Ung thự học Việt Nam, số 4: 96-101.
137.	Shi Y., Au J. S. K., Khoa M. T., et al. (2014). A prospective, molecular epidemiology study of EGFR mutations in Asian patients with advanced non-small-cell lung cancer of adenocarcinoma histology (PIONEER). J Thorac Oncol. 9(2):154-162.
138.	Cheng L., Li Y., Zhang S. B., et al. (2012). Molecular pathology of lung cancer: key to personalized medicine. Modern Pathology 25: 347–369.
139.	Xu S., Jiang J., Yu X., et al. (2014). Association of Merkel cell polyomavirus infection with EGFR mutation status in Chinese non-small cell lung cancer patients. Lung Cancer 83: 341-346.
140.	Koutras A. K., Antonacopoulou A. G., Eleftheraki A. G., et al. (2012). Vascular endothelial growth factor polymorphisms and clinical outcome in colorectal cancer patients treated with irinotecan-based chemotherapy and bevacizumab. Pharmacogenomics J., 12(6): 468-75.
141.	Schneider B.P., Wang M., Radovich M., et al. (2008). Association of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor-2 genetic polymorphisms with outcome in a trial of paclitaxel compared with paclitaxel plus bevacizumab in advanced breast cancer: ECOG 2100. J Clin Oncol, 26(28): 4672-8.
142.	Guan X., Yin M., Wei Q., et al. (2010). Genotypes and haplotypes of the VEGF gene and survival in locally advanced non-small cell lung cancer patients treated with chemoradiotherapy. BMC Cancer, 10: 431.
143.	Garcia-Donas J., Esteban E., Leandro-Garcia L. J., et al. (2011). Single nucleotide polymorphism associations with response and toxic effects in patients with advanced renal-cell carcinoma treated with first-line sunitinib: a multicentre, observational, prospective study. Lancet Oncol, 12(12): 1143-50.
144.	Schneider B. P., Shen F. and Miller K. D. (2012). Pharmacogenetic biomarkers for the prediction of response to antiangiogenic treatment. Lancet Oncol, 13(10): e427-36.
145.	Pohl A., El-Khoueiry A., Yang D., et al. (2013). Pharmacogenetic profiling of CD133 is associated with response rate (RR) and progression-free survival (PFS) in patients with metastatic colorectal cancer (mCRC), treated with bevacizumab-based chemotherapy. Pharmacogenomics J., 13(2): 173-80.
146.	Hsieh Y. H., Hsu J. L., Su I. J., et al. (2011). Genomic instability caused by hepatitis B virus: into the hepatoma inferno. Front Biosci (Landmark Ed)2011, 16: 2586–97.
147.	Fan X, Liu Y., Heilman S. A., et al. (2013). Human papillomavirus E7 induces rereplication in response to DNA damage. J Virol 2013, 87: 1200–10.
148.	Wang X., Huong S. M., Chiu M. L., et al. (2003). Epidermal growth factor receptor is a cellular receptor for human cytomegalovirus. Nature, 424: 456–61.
149.	Patton J. B., George D., Chang K. O. (2011). Bile acids promote HCV replication through the EGFR/ERK pathway in replicon-harboring cells. Intervirology, 54: 339–48.
150.	Gun-Jik K., Jae-Ho L., Deok H. L., et al. (2017). Clinical and prognostics significance of Merkel cell polyomavirus in nonsmall cell lung cancer. Medicine, 96:3.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Bệnh án nghiên cứu
BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU NHÓM BỆNH LÝ K PHỔI
1. PHẦN HÀNH CHÍNH
Họ tên BN: . Số HS: ..
Tuổi: Giới tính: ☐ 0 = Nam ☐ 1 = Nữ
Địa chỉ: 
ĐT: 
Ngày vào viện: 
Chẩn đoán: 
2. TIỀN CĂN
2.1. Cá nhân:
- Bệnh phổi:	☐0 = Không 	☐1 = Có 	 
- Bệnh tim mạch: 	☐0 = Không 	☐1 = Có 
- Bệnh khác:	☐0 = Không 	☐1 = Có 
- Hút thuốc:	☐0 = Không 	☐1 = Có 	
Thời gian: . năm; Số lượng: 	/1 năm
- Uống rượu, bia: ☐0 = Không 	☐1 = Có 	
Thời gian: 	 năm; Số lượng: 	 /1 năm
- Làm trong môi trường khói bụi amiante: ☐0 = Không ☐1 = Có 
Thời gian :..năm.
2.2. Gia đình có ai bị ung thư: ☐ 0 = Không ☐ 1 = Có 
 ☐ 2 = K phổi 
3. LÂM SÀNG
3.1. Lý do nhập viện: 
☐ 0 = Ho ( ho khan, ho ra máu, ho có đàm)	
☐ 1 = Đau ngực ☐ 2 = khó thở ☐ 3 = Sụt cân ☐ = Khác 
Mạch: ck/p Huyết áp: mmHg Nhiệt độ : OC
3.2. Triệu chứng khởi phát: 
 ☐1 = ho	☐2 = ho ra máu	☐3= ho khan không đờm
 ☐4 = ho có đờm	☐5 = khó thở	☐6 = đau ngực 
 ☐7 = khàn tiếng	☐8= sụt cân/thời gian	☐9 = sốt 
3.3. Thời gian khởi bệnh: tuần
3.4. Triệu chứng lâm sàng lúc vào viện KPS (KRNAosky performance scale status): 
 ☐1 = ho	☐2 = ho ra máu	☐3 = ho khan không đờm
 ☐4= ho có đờm	☐5 = khó thở	☐6 = đau ngực 
 ☐7 = khàn tiếng	☐8= sụt cân/thời gian	☐9 = sốt 
 ☐10 = Không có hạch	☐11= Có hạch	
3.5. Hội chứng:
- Hội chứng phế quản:	☐0 = không	☐1 = có
- Hội chứng nhiễm trùng: ☐0 = không	☐1 = có
- Hội chứng suy hô hấp: ☐0 = không	☐1 = có
- Hội chứng đông đặc:	☐0 = không	☐1 = có
- Hội chứng TDMP: 	☐0 = không	☐1 = có
- Hội chứng cận u: 	☐0 = không	☐1 = có
- Hội chứng u: 	☐0 = không	☐1 = có
4. XÉT NGHIỆM THƯỜNG QUY
4.1. Huyết đồ: ☐ 0 = không thiếu máu	☐ 1= có thiếu máu 
WBC = K/uL	NEU% = %	HCT= %
RBC = M/uL	LYM% = %	
PLT = K/uL	MONO% = %	
4.2. Hoạt độ men gan: 
☐ 0 = Không thực hiện	 ☐ 1 = Bình thường	 ☐ 2 = RL chức năng
AST = U/L	ALT = U/L
4.3. Chức năng thận: 
☐ 0 = Không thực hiện	 ☐ 1 = Bình thường	 ☐ 2 = Suy chức năng
Urê/BUN = mmol/L	Creatinin = umol/L
4.4. Đường máu: 
☐ 0 = Không thực hiện	 ☐ 1 = Bình thường	 ☐ 2 = Có rối loạn
Glucose = mmol/L	
4.5. Ion đồ:	 
☐ 0 = Không thực hiện	 ☐ 1 = Bình thường	 ☐ 2 = Có rối loạn
Na = mmol/l	Kali = mmol/l	Clo = mmol/l
4.6. Bilan tim mạch ( ECG và hoặc siêu âm tim):
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2 = Có bệnh lý
4.7. Bilan hô hấp (đo chức năng hô hấp):
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2=Có bệnh lý hô hấp
5. NỒNG ĐỘ MARKERS 
5.1. Nồng độ CEA = ng/mL 
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2 = Bất thường
5.2. Nồng độ CYFRA 21- 1 
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2 = Bất thường
5.3. EGFR 
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Không biểu hiện	☐ 2 = Có biểu hiện
6. CHẨN ĐOÁN HÌNH ẢNH
6.1. Siêu âm bụng tổng quát:
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2 = Có bệnh lý
6.2. Siêu âm màng phổi:
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 3 = Có khối U
☐ 4 = Tràn dịch màng phổi	☐ 5 = Dày dính màng phổi
6.3. Xạ hình xương:
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2 = Có bệnh lý
6.4. X Quang (quy ước lồng ngực):
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2 = Có bệnh lý
6.5. CT Scanner lồng ngực:
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 3 = Có khối U
☐ 4 = Tràn dịch màng phổi	☐ 5 = Dày dính màng phổi
6.6. Pet- CT
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 3 = Có khối U
☐ 4 = Tràn dịch màng phổi	☐ 5 = Dày dính màng phổi
☐ 6 = Có khối tổn thương ác tính	☐ 7 = Hạch
6.7. Vị trí bướu (trên CT và hoặc X Quang qui ước):
☐ 1 = Thùy trên Phổi phải	☐ 4 = Thùy trên Phổi trái	
☐ 2 = Thùy giữa Phổi phải	☐ 5 = Rốn phổi ( Phải)	
☐ 3 = Thùy dưới Phổi phải	☐ 6 = Thùy dưới Phổi trái	
6.8. Kích thước bướu (trên CT và hoặc XQ qui ước) : mm
6.9. Hạch: ☐ 0 = Không	☐ 1 = Có 
	☐ 2 = Vị trí hạch: 
	☐ 3 = Số lượng hạch: 
* MRI sọ não : bình thường
7. MÔ BỆNH HỌC 
7.1. Phương pháp: ☐ 1 = Tế bào học	☐ 2 = Sinh thiết
7.2. Phương pháp lấy bệnh phẩm qua:
☐ 1 = nội soi phế quản	☐ 4 = sinh thiết xuyên thành ngực 
☐ 2 = nội soi trung thất	☐ 5 = sinh thiết hạch	
 ☐ 3 = mở thành ngực thám sát + ST	
7.3. Kết quả MBH: ☐ 1= UTPKTBN	☐ 2=UTPTBN
7.4. Với ung thư phổi không tế bào nhỏ:
☐ 1 = Carcinoma tuyến	☐ 3 = Carcinoma TB lớn
☐ 2 = Carcinoma TB gai	☐ 4 = Carcinoma TB gai-tuyến
7.5. Độ biệt hóa: 
☐ 0 = Không đánh giá	☐ 1 = Tốt
 ☐ 2 = vừa	☐ 3 = Kém
8. XẾP HẠNG THEO TNM (WHO) 2015
8.1. cTNM 
T
☐ Tx: Không xác định, tế bào ác tính(+).
☐ T0: Không có khối u.
☐ T1: < 3cm.
☐ T2: > 3cm.
☐ T3: Khối u > 7cm lan tới lá thành, cơ hoành, màng tim.
☐ T4: Kích thước bất kỳ, xâm nhập vào các cơ quan trung thất, mạch máu lớn.
N
☐ NX: Không xác định được hạch.
☐ N0: Không thấy hạch.
☐ N1: Hạch một bên rốn phổi hoặc phế quản phổi.
☐ N2: Hạch trung thất dưới carina, hạch trên đòn cùng bên.
☐ N3: Hạch trên đòn hoặc rốn phổi trung thất bên kia.
M
☐ M0: Chưa di căn.
☐ M1: Có di căn.
8.2. Xếp giai đoạn: 
☐ 1 = IA( T1N0M0)	☐ 4 = IIB(T2N1M0 hoặc T3N0-N1M0)	
☐ 2 = IB( T2N0M0);	☐ 5 = IIIA(T1-T3N2M0) 
☐ 3 = IIA(T1N1M0);	☐ 6 = IIIB( T bất kỳ -T4N3MO) 
	☐ 7 = IV( M1) 
9. KẾT QUẢ SINH HỌC PHÂN TỬ ( NỒNG ĐỘ VEGF VÀ CIZ1b)
Nồng độ DNA =	Nồng độ ABL =	
Nồng độ VEGF =	Nồng độ log VEGF =	
Nồng độ CIZ1b =	Nồng độ log CIZ1b =	
Nồng độ OD 260/280 =	
Nồng độ CIZ1b_ABL Normalisation =	
Nồng độ VEGF_ABL Normalisation =	
 Nghiên cứu sinhBỆNH ÁN NGHIÊN CỨU
(NHÓM NGƯỜI BÌNH THƯỜNG)
1. PHẦN HÀNH CHÍNH
Họ tên BN: 
Tuổi:	Giới tính: ☐ 0 = Nam ☐ 1 = Nữ
Địa chỉ ;
Ngày khám sức khoẻ: 
Kết luận: 
2. TIỀN CĂN
2.1. Cá nhân: khoẻ mạnh
2.2. Gia đình có ai bị ung thư: ☐ 0 = Không ☐ 1 = Có ☐ 2 = K phổi 
3. LÂM SÀNG
3.1. Tuần hoàn: 
 ☐ 0 = bình thường ☐ 1 = có bệnh lý tim mạch
3.2. Hô hấp: 
 ☐0 = bình thường	 ☐1 = có bệnh lý hô hấp
3.3. Tiêu hoá- gan mật : 
 ☐0 = bình thường	 ☐1 = có bệnh lý tiêu hoá- gan mật
3.4. Nội tiết :
 ☐0 = bình thường ☐1 = có bệnh lý nội tiết 
3.5. Tâm thần kinh:
☐0 = Bình thường	 ☐1 = Có bệnh lý	
4. XÉT NGHIỆM THƯỜNG QUY
4.1. Huyết đồ: ☐ 0 = không thiếu máu	☐ 1= có thiếu máu 
WBC = K/uL	NEU% = %	HCT= %
RBC = M/uL	LYM% = %	
 PLT = K/uL	MONO% = %	
4.2. Hoạt độ men gan: 
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2 = RL chức năng
AST = U/L	ALT = U/L
4.3. Chức năng thận: 
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2 = Suy chức năng
Urê/BUN = mmol/L	Creatinin = umol/L
4.4. Đường máu: 
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2 = Có rối loạn
Glucose = mmol/L	
4.6. Bilan tim mạch ( ECG và hoặc siêu âm tim):
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2 = Có bệnh lý
4.7. Bilan hô hấp (đo chức năng hô hấp):
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2=Có bệnh lý hô hấp
5. NỒNG ĐỘ MARKERS 
5.1. Nồng độ CEA = ng/mL 
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2 = Bất thường
5.2. Nồng độ CYFRA 21- 1 = ng/mL 
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2 = Bất thường
6. CHẨN ĐOÁN HÌNH ẢNH
6.1. Siêu âm bụng tổng quát:
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2 = Có bệnh lý
6.4. X Quang (quy ước lồng ngực):
☐ 0 = Không thực hiện	☐ 1 = Bình thường	☐ 2 = Có bệnh lý
9. KẾT QUẢ SINH HỌC PHÂN TỬ ( NỒNG ĐỘ VEGF VÀ CIZ1b)
Nồng độ DNA =	Nồng độ ABL =	
Nồng độ VEGF =	Nồng độ log VEGF = 
Nồng độ CIZ1b =	Nồng độ log CIZ1b =	
Nồng độ OD 260/280 = 
Nồng độ CIZ1b_ABL Normalisation =	 
Nồng độ VEGF_ABL Normalisation =
 Nghiên cứu sinh
PHỤ LỤC 3: Phân loại TNM của WHO về UTP năm 2015 [7, tr.11].
 Chẩn đoán giai đoạn ( theo TNM)
* T: Khối u nguyên phát:
- TX : Không xác định được khối u nguyên phát.
- To: không thấy khối u nguyên phát.
- Tis : có khối u tại chỗ.
- T1: Khối u có kích thước lớn nhất <= 3 cm, được bao quanh bởi nhu mô phổi hoặc lá tạng màng phổi, không xâm lấn vào phế quản thùy. 
+ T1a: Khối u <= 2cm; 
+ T1b: Khối u > 2cm nhưng <=3cm.
- T2: Khối u > 3cm nhưng = 2cm, xẹp/viêm phổi do tắc nghẽn có thể lan đến rốn phổi nhưng không gây xẹp toàn bộ phổi.
+ T2a: Khối u >3cm nhưng <=5cm; 
+ T2b: Khối u >5cm nhưng <=7cm.
- T3: Khối u >7cm hoặc có xâm lấn trực tiếp vào thành ngực, cơ hoành, thần kinh hoành, màng phổi, trung thất hoặc lá thành màng tim. Hoặc khối u trong phế quản gốc cách carina < 2 cm; hoặc xẹp/viêm phổi do tắc nghẽn toàn bộ một phổi, hoặc có một khối u hoặc nốt riêng biệt cùng thùy.
- T4: Khối u kích thước bất kỳ nhưng có xâm lấn vào tim, mạch máu lớn, khí quản, dây thần kinh quặt ngược, thực quản, cột sống hoặc cựa khí quản. Hoặc có khối u hoặc nốt riêng biệt khác thùy cùng bên.
* N: Hạch vùng
- NX : Không xác định được hạch. 
- No: Không có di căn vào hạch vùng.
- N1: di căn hạch cạnh phế quản cùng bên và/hoặc hạch rốn phổi bao gồm cả sự xâm lấn trực tiếp của khối u vào các hạch đó.
- N2: di căn đến hạch trung thất cùng bên và/hoặc hạch dưới cựa khí quản.
- N3: di căn hạch trung thất đối bên, hạch rốn phổi đối bên, hạch cơ bậc thang cùng bên hoặc đối bên hoặc hạch thượng đòn.
* M: di căn
- Mo: Không có di căn xa.
- M1: Có di căn
+ M1a: Có các khối riêng biệt ở một thùy đối bên. Hoặc khối u có các khối ở màng phổi hoặc có các tổn thương ác tính ở màng phổi.
+ M1b: di căn xa.
Giai đoạn
TNM
Không xác định
Tx N0 M0
Giai đoạn 0
Tis N0 M0
Giai đoạn IA
T1a N0 M0
T1b N0 M0
Giai đoạn IB
T2a N0 M0
Giai đoạn IIA
T1a N1 M0
T1b N1 M0
T2a N1 M0
T2b N0 M0
Giai đoạn IIB
T2b N1 M0
T3 N0 M0
Giai đoạn IIIA
T1 N2 M0
T2 N2 M0
T3 N1 M0
T3 N2 M0
T4 N0 M0
Giai đoạn IIIB
T4 N2 M0
T bất kỳ N3 M0
Giai đoạn IV
T bất kỳ N bất kỳ M1a
T bất kỳ N bất kỳ M1b