Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid cho cây trinh nữ hoàng cung

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 
***** 
NGUYỄN HỮU LẠC THỦY 
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, 
THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG 
QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID 
VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG 
(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC 
Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014 
 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MIINH 
NGUYỄN HỮU LẠC THỦY 
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, 
THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG 
QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID 
VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG 
(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) 
Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC 
Mã số: 62.73.15.01 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC 
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. VÕ THỊ BẠCH HUỆ 
Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả 
được trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ 
công trình nào khác. 
Người cam đoan, 
Nguyễn Hữu Lạc Thủy 
i 
MỤC LỤC 
MỤC LỤC ............................................................................................................... i 
BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................iii 
DANH MỤC HÌNH ẢNH...................................................................................... v 
DANH MỤC BẢNG BIỂU .................................................................................. vii 
DANH MỤC SƠ ĐỒ ........................................................................................... vii 
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1 
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 
1.1. Tổng quan thực vật học cây Trinh nữ hoàng cung ......................................... 3 
1.2. Tổng quan hóa học của chi Crinum và cây Trinh nữ hoàng cung .................. 5 
1.3. Tổng quan tác dụng sinh học chi Crinum và cây Trinh nữ hoàng cung ........ 14 
1.4. Chiết hoạt chất từ dược liệu bằng dung môi CO2 lỏng siêu tới hạn ............. 21 
1.5. Các phương pháp nghiên cứu hóa học của cây Trinh nữ hoàng cung........... 22 
1.6. Phương pháp thiết lập chất đối chiếu........................................................... 24 
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................ 27 
2.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................... 27 
2.2. Trang thiết bị .............................................................................................. 28 
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 29 
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 40 
3.1. Quy trình chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid và phân đoạn flavonoid từ cây 
Trinh nữ hoàng cung .......................................................................................... 40 
3.2. Phân lập hợp chất tinh khiết ....................................................................... 46 
3.3. Thiết lập chất đối chiếu ............................................................................... 69 
3.4. Xây dựng phương pháp HPLC, CE, dấu vân tay để định tính và định lượng 
alcaloid hoặc flavonoid trong lá TNHC ............................................................. 82 
3.5. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm bột lá 
Trinh nữ hoàng cung .......................................................................................... 99 
ii 
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ................................................................................. 102 
4.1. Các phương pháp chiết xuất hoạt chất từ cây Trinh nữ hoàng cung ........... 102 
4.2. Phân lập hợp chất tinh khiết ...................................................................... 107 
4.3. Thiết lập chất đối chiếu từ cao chiết Trinh nữ hoàng cung ........................ 111 
4.4. Quy trình định lượng alcaloid và flavonoid từ lá Trinh nữ hoàng cung...... 112 
4.5. Các chỉ tiêu cần thiết của Tiêu chuẩn kiểm nghiệm TNHC ....................... 117 
KẾT LUẬN 
KIẾN NGHỊ 
DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
PHẦN PHỤ LỤC 
iii 
BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT 
ASEAN Association of Southeast Asian Nations 
(Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á) 
AL-NK Phân đoạn alcaloid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp ngấm kiệt 
AL-SA Phân đoạn alcaloid chiết từ lá TNHC bằng sóng siêu âm 
AL-SFE Phân đoạn alcaloid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp SFE 
AR-96 Phân đoạn alcaloid chiết từ rễ TNHC với dung môi cồn 96% 
As Hệ số bất đối 
CĐC Chất đối chiếu 
CE Caplillary Electrophoresis (Điện di mao quản) 
Corr Area Corrected Area (Diện tích pic được chuẩn hóa) 
CZE Caplillary Zone Electrophoresis (Điện di mao quản vùng) 
d doublet (đỉnh đôi) 
DĐVN IV Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ IV 
DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer 
DSC Differential Scanning Calorimetry (Nhiệt vi sai) 
DMSO Dimethylsulfoxyd 
DVT Dấu vân tay 
ESI Electrospray Ionization (Ion hóa bằng cách phun ion) 
FL-NK Phân đoạn flavonoid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp ngấm kiệt 
FL-SA Phân đoạn flavonoid chiết từ lá TNHC bằng sóng siêu âm 
FL-SFE Phân đoạn flavonoid chiết từ lá TNHC bằng phương pháp SFE 
FR-96 Phân đoạn flavonoid chiết từ rễ TNHC với dung môi cồn 96% 
GC Gas Chromatography (Sắc ký khí) 
GC-MS Gas Chromatography – Mass Spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ) 
GLP Good Laboratory Practices (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc) 
HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) 
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation 
HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation 
IR Infrared (Hồng ngoại) 
iv 
J Coupling constant (Hằng số ghép) 
LC-MS Liquid Chromatography – Mass Spectrometry 
(Sắc ký lỏng ghép khối phổ) 
L-SFE Cao toàn phần chiết từ lá TNHC bằng phương pháp SFE 
MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography (Sắc ký mixen điện động) 
MS Mass Spectrometry (Khối phổ) 
NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) 
PĐ Phân đoạn 
PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang) 
PCRS Primary Chemical Reference Standard 
(Chất đối chiếu hóa học sơ cấp) 
PTN Phòng thí nghiệm 
RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) 
Rs độ phân giải giữa pic có thời gian lưu nhỏ và lớn hơn kề bên 
S Diện tích pic (µV x giây) 
s singlet (Đỉnh đơn) 
SKĐ Sắc ký đồ 
SCRS Secondary Chemical Reference Standard 
(Chất đối chiếu hóa học thứ cấp) 
SDS Sodium Dodecyl Sulfate 
SFE Supercritical Fluid Extraction (Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn) 
SKLM Sắc ký lớp mỏng 
TCKN Tiêu chuẩn kiểm nghiệm 
TR Thời gian lưu (phút) 
TM Thời gian di chuyển (phút) 
TNHC Trinh nữ hoàng cung 
TGA Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhiệt trọng lượng) 
TT Thuốc thử 
UV-Vis Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến) 
VLC Vacuum Liquid Chromatography (Sắc ký cột chân không) 
v 
DANH MỤC HÌNH ẢNH 
Hình 1.1: Hình vẽ cây TNHC ................................................................................. 5 
Hình 1.2: Các cấu trúc hóa học của alcaloid khung crinin ....................................... 6 
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học alcaloid khung lycorin (A) và khung tazettin (B) ......... 6 
Hình 1.4: Cấu trúc hóa học khung belladin (C) và cấu trúc khung galanthamin (D) 7 
Hình 1.5: Cấu trúc hóa học khung lycorenin (E) và cấu trúc khung cheryllin (F) .... 7 
Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của các flavonoid trong chi Crinum ............................. 8 
Hình 1.7: Cấu trúc hóa học các hợp chất flavonoid trong cây TNHC .................... 10 
Hình 3.1: Hình lá và cụm hoa của cây TNHC (Crinum latifolium L.) ................... 40 
Hình 3.2: Hình hoa Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) .......................... 40 
Hình 3.3: SKĐ các hợp chất phân lập từ các phân đoạn alcaloid. .......................... 48 
Hình 3.4: SKĐ các hợp chất phân lập từ phân đoạn alcaloid AR và flavonoid. ..... 48 
Hình 3.5: Cấu trúc hóa học và dữ liệu phổ NMR (500 MHz, CDCl3) của (2). ....... 58 
Hình 3.6: Cấu trúc hóa học của 6-ethoxyundulatin................................................ 58 
Hình 3.7: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC crinamidin bằng HPLC. .............. 71 
Hình 3.8: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC 6-hydroxycrinamidin HPLC. ............ 72 
Hình 3.9: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC lycorin bằng HPLC. .................... 72 
Hình 3.10: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC hippadin bằng HPLC. ............... 73 
Hình 3.11: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC astragalin bằng HPLC............... 73 
Hình 3.12: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC isoquercitrin bằng HPLC. ......... 74 
Hình 3.13: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu trong quy trình định lượng đồng thời 6 
alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC. ................................................ 85 
Hình 3.14: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu trong quy trình định lượng đồng thời 
astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC. .................... 89 
Hình 3.15: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng 
thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE. ........................................... 92 
vi 
Hình 3.16: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng 
thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp CE. .................. 95 
Hình 3.17: Sắc ký đồ DVT – SKLM alcaloid TNHC. ........................................... 97 
Hình 3.18: Sắc ký đồ DVT – SKLM flavonoid TNHC.......................................... 98 
Hình 4.1: SKĐ alcaloid TNHC bằng HPLC, kỹ thuật rửa giải isocratic. ............. 113 
Hình 4.2: SKĐ alcaloid TNHC bằng HPLC, kỹ thuật rửa giải gradient. .............. 113 
Hình 4.3: Điện di đồ so sánh mẫu thử alcaloid phân tích bằng CZE và MEKC. . 114 
Hình 4.4: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong methanol. ................................ 115 
Hình 4.5: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong đệm dinatri tetraborat 25 mM. . 115 
Hình 4.6: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha trong dung dịch acid H3PO4. ............. 115 
Hình 4.7: SKĐ so sánh khả năng rửa giải mẫu flavonoid TNHC bằng HPLC với pha 
động methanol và acetonitril . .............................................................................. 116 
DANH MỤC SƠ ĐỒ 
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ khảo sát quy trình chiết hoạt chất từ cây TNHC. .......................... 29 
Sơ đồ 2.2 Sơ đồ khảo sát chiết hoạt chất từ lá TNHC kết hợp hai phương pháp SFE 
và phương pháp chiết ngấm kiệt với cồn 70%........................................................ 32 
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết cao cồn, PĐ alcaloid và PĐ flavonoid từ lá TNHC .............. 42 
Sơ đồ 3.2 Sơ đồ chiết alcaloid và flavonoid từ rễ TNHC. ...................................... 42 
Sơ đồ 3.3 Sơ đồ chiết alcaloid và flavonoid bột lá kết hợp hai phương pháp chiết. 45 
Sơ đồ 3.4 Sơ đồ phân lập hợp chất (2) và (3) từ PĐ alcaloid AL-SFE. .................. 50 
Sơ đồ 3.5 Sơ đồ chiết alcaloid AL-SA hoặc flavonoid FL-SA. .............................. 82 
vii 
DANH MỤC CÁC BẢNG 
Bảng 1.1: Alcaloid của TNHC Crinum latifolium L. ............................................. 11 
Bảng 3.1: Hiệu suất chiết (%) hoạt chất bằng phương pháp ngấm kiệt. ................. 41 
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian lên hiệu suất chiết. ..................... 43 
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của áp suất lên hiệu suất chiết. .................. 44 
Bảng 3.4: Kết quả tách phân đoạn mẫu AL-SFE và FL-NK bằng VLC. ................ 46 
Bảng 3.5: Các hợp chất tinh khiết phân lập được từ cao chiết TNHC. ................... 47 
Bảng 3.6: Kết quả phân lập alcaloid từ phân đoạn ALS1. ..................................... 48 
Bảng 3.7: Kết quả triển khai sắc ký cột với chất hấp phụ pha đảo. ........................ 49 
Bảng 3.8: Kết quả phân lập (2) và (3) từ PĐ n–hexan. .......................................... 49 
Bảng 3.9: Kết quả phân lập các (8), (9), (10) từ PĐ alcaloid AL-NK. ................... 51 
Bảng 3.10: Dữ liệu phổ NMR (Máy 500 MHz, CDCl3) của hợp chất (2)............... 56 
Bảng 3.11: Các tương tác proton trên phổ COSY, HMBC của hợp chất (2). ......... 57 
Bảng 3.12: Kết quả độ tinh khiết; hàm ẩm bằng phân tích nhiệt trọng lượng. ........ 69 
Bảng 3.13: Thành phần pha động và bước sóng phát hiện của quy trình xác định độ 
tinh khiết của các nguyên liệu CĐC bằng phương pháp HPLC. ............................. 70 
Bảng 3.14: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC. .... 70 
Bảng 3.15: Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các CĐC bằng HPLC. ........ 74 
Bảng 3.16: Dữ liệu phổ UV-Vis, MS và điểm chảy của các CĐC. ........................ 75 
Bảng 3.17: Dữ liệu phổ IR của các CĐC. .............................................................. 75 
Bảng 3.18: Kết quả đánh giá đồng nhất lô của các CĐC sau khi đóng gói. ............ 77 
Bảng 3.19: Kết quả phân tích robust A của CĐC crinamidin. ................................ 79 
Bảng 3.20: Kết quả phân tích robust A của CĐC 6-hydroxycrinamidin................. 79 
Bảng 3.21: Kết quả phân tích robust A của CĐC hippadin. ................................... 80 
Bảng 3.22: Kết quả phân tích robust A của CĐC lycorin. ..................................... 80 
Bảng 3.23: Kết quả phân tích robust A của CĐC astragalin. ................................. 81 
viii 
Bảng 3.24: Kết quả phân tích robust A của CĐC isoquercitrin. ............................. 81 
Bảng 3.25: Kết quả xác định giá trị ấn định và giá trị công bố các CĐC. .............. 81 
Bảng 3.26: Chương trình dung môi định lượng 6 alcaloid bằng HPLC.................. 83 
Bảng 3.27: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình định lượng đồng 
thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6). .......................... 83 
Bảng 3.28: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trong quy trình định lượng đồng 
thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6). .......................... 86 
Bảng 3.29: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng đồng thời 6 
alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9). .................................... 87 
Bảng 3.30: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình đinh lượng đồng 
thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6). . 88 
Bảng 3.31: Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định lượng đồng thời 
astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng HPLC (n = 6)............................... 90 
Bảng 3.32: Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng đồng thời astragalin 
và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9). ........................ 90 
Bảng 3.33: Kết  ... s”, 
Phytochemistry, 65 (21), pp. 2893-2896. 
[67]. Huber L. (2007), Validation and qualification in analytical laboratories, Informa 
Healthcare USA, Inc., pp.140, 142-144, 146-148. 
[68]. I.C.H. Harmonised tripartite guiline (2005), Validation of analytical procedure: text 
and methodology, pp.1-13. 
[69]. Ilavenil S, Kaleeswaran B., Ravikumar S. (2011), “Protective effects of lycorine 
against carbon tetrachloride induced hepatotoxicity in Swiss albino mice”, 
Fundamental and Clinical Pharmacology, 26 (3), pp. 393-401. 
[70]. Ilavenil S., Kaleeswaran B., Ravikumar S. (2010), “Antioxidant and 
hepatoprotective activity of lycorine against Carbon tetrachloride-induced 
oxidative stress in Swiss albino mice”, Der Pharma Chemica, 2(6), pp. 267–272. 
[71]. Indradevi S., Ilavenil S., Kaleeswaran B., Srigopalram S., Ravikumar S. (2012), 
“Ethanolic extract of Crinum asiaticum attenuates hyperglycemia-mediated 
oxidative stress and protects hepatocytes in Alloxan induced experimental 
diabetic rats”, Journal of King Saud University - Science, 24 (2), pp. 171-177. 
[72]. International Organisation for Standardization (2000), ISO Guide 31-Reference 
materials-Contents of certificates and labels. 
[73]. International Organisation for Standardization 13528 (2005), ISO 13528-Statistical 
methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons. 
[74]. Jimenez A., Santos A., Alonso G., Vazquez D. (1976), “Inhibitors of protein 
synthesis in eukaryotic cells comparative effects of some Amaryllidaceae 
alkaloids”, Biochimica et Biophysica Acta, 425 (3), pp. 342-348. 
[75]. Jose L.M. (2008), “Application of supercritical fluids in traditional chinese 
medicines and natural products”, Supercritical fluid extraction of nutraceuticals 
and bioactive compounds, CRC Press, pp. 233-236. 
[76]. Kang J., Zhang Y., Cao X. (2012), “Lycorine inhibits lipopolysaccharide-induced 
- 7 - 
iNOS and COX-2 up-regulation in RAW264.7 cells through suppressing P38 
and STATs activation and increases the survival rate of mice after LPS 
challenge”, International Immunopharmacology, 12 (1), pp. 249-256. 
[77]. Kapu S.D., Ngwai Y.B., Kayode O., Akah P.A., Wambebe C., Gamaniel K. (2001), 
“Anti-inflammatory, analgesic and anti-lymphocytic activities of the aqueous 
extract of Crinum giganteum”, Journal of Ethnopharmacology, 78 (1), pp. 7-13. 
[78]. Kaur A., Kamboj S.S., Singh J. (2006), “Isolation of a new lectin from the bulbs of 
Crinum latifolium L.”, Journal of Biological Sciences, 6 (1), pp. 9-14. 
[79]. Kaur A., Singh R., Kamboj S.S., Singh J., Kotwal G.J. (2008), “In vitro antiviral 
activity of Crinum latifolium lectin against Poxvirus replication”, Journal of 
Biological Sciences, 8 (7), pp. 1236-1240. 
[80]. Kaur K., Jain M., Kaur T., Jain R. (2009), “Antimalarials from nature”, Bioorganic 
& Medicinal Chemistry, 17 (9), pp. 3229-3256. 
[81]. Kim D.K, Chung I.S, Kim S.H, Baek N.I (2007), “Isolation of Flavonoids from the 
Fruits of Cornus kousa Burg”, Journal of Applied Biological Chemistry, 50 (3), 
pp. 144-147. 
[82]. Kim J, Choi I.H., Yoo K.P. (2001), “Supercritical fluid extraction of alkaloids”, 
Pergamon, pp. 415-430. 
[83]. Kobayashi S., Tokumoto T., Kihara M., Imakura Y., Shingu T., Taira Z. (1984), 
“Alkaloidal constituents of Crinum latifolium and Crinum bulbispermum 
Amaryllidaceae”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 32(8), pp. 3015-3022. 
[84]. Kobayashi S., Tokumoto T., Taira Z. (1984), “Latifine, a biogenetic isomer of 
Cherylline, from Crinum latifolium L.”, Journal of the Chemical Society, 
Chemical Communications, pp. 1043-1044. 
[85]. Kwok-nam L., Pui-yin L., Lai-ping K., Po-ki L. (2005), “Immunomodulatory 
effects of esculetin (6,7-Dihydroxycoumarin) on Murine Lymphocytes and 
Peritoneal Macrophages”, Cellular & Molecular Immunology, (2) 3 pp. 181-188. 
[86]. Lang Q., Wai C.M. (2001), “Supercritical fluid extraction in herbal and natural 
product studies – A practical review”, Talanta, 53 (4), pp. 771 – 782. 
[87]. Lei Y., Wang H., Zu Y.G., Zhao C., Zhang L., Chen X., Zhang Z. (2011), 
“Ultrasound-assisted extraction of the three terpenoid indole alkaloids vindoline, 
catharanthine and vinblastine from Catharanthus roseus using ionic liquid 
aqueous solutions”, Chemical Engineering Journal, 172 (2-3), pp. 705-712. 
- 8 - 
[88]. Lin Y.L., Wang W.Y., (2000), “Nonsteroidal Constituents from Solanum incanum 
L.”, Journal of the Chinese Chemical Society, 47, pp. 247-251. 
[89]. Ling J.Y., Zhang G.Y., Cui Z.J., Zhang C.K. (2007), “Supercritical fluid extraction 
of quinolizidine alkaloids from Sophora flavescens Ait. and purification by high-
speed counter-current chromatography”, Journal of Chromatography A, 1145 
(1-2), pp. 123-127. 
[90]. Liza M.S., Rahman R.A., Mandana B., Jinap S., Rahmat A., Zaidul I.S.M., (2010), 
“Supercritical carbon dioxide extraction of bioactive flavonoid from 
Strobilanthes crispus”, Food and Bioproducts Processing, 88 (2-3), pp. 316-326. 
[91]. Maartje. F.K. (2005), Supercritical Carbon Dioxide, WILEY-VCH, pp. 5-7. 
[92]. Machocho A., Viladomat F., Chhabra S.C., Codina C., Bastida J. (1999), “Alkaloids 
from Ammocharis tinneana”, Phytochemistry, 51(8), pp. 1185-1191. 
[93]. Machocho A.K., Bastida J., Codina C., Viladomat F. (2004), “Augustamine type 
alkaloids from Crinum kirkii”, Phytochemistry, 65(23), pp. 3143-3149. 
[94]. Manna A.K., Samanta S.K., Panda B.R., Nanda U. (2010), “Free radical scavenging 
and analgesic properties of the bulb of Crinum defixum ker gawl on experimental 
animal model”, International Journal of Biological & Pharmaceutical Research, 
1 (2), pp. 82-87. 
[95]. Marcel J., Nguyen T.N.T., Wondrak A. (2011), “Crinum latifolium leave extracts 
suppress immune activation cascades in peripheral blood mononuclear cells and 
proliferation of prostate tumor cells”, Scientica Pharmaceutica, 79 (2), pp. 323-
335. 
[96]. McNulty J., Nair J., Codina C., Bastida J., Pandey S., (2007), “Selective apoptosis-
inducing activity of Crinum-type Amaryllidaceae alkaloids”, Phytochemistry, 
68, pp. 1068–1074. 
[97]. Metz B., Davidson O., Coninck H., Loos M., Meyer L. (2005), Carbon Dioxide 
Capture and Storage, Cambridge University Press, pp. 385-389. 
[98]. Ministry of Health Malaysia, National Pharmaceutical Control Bureau (2000), 
Guidelines for the establishment, handling, storage and use of CRS, Malaysia, 
pp. 1-5. 
[99]. Mukhopadhyay M. (2000), Natural Extracts Using Supercritical Carbon Dioxide, 
CRC Press LLC, pp. 2, 3, 14, 26, 148, 203, 212, 239. 
- 9 - 
[100]. Nair J.J., Campbell W.E., Brun R., Viladomat F., Codina C., Bastida J. (2004), 
“Alkaloids from Nerine filifolia”, Phytochemistry, 66 (3), pp. 373-382. 
[101]. Nair J.J., Campbell W.E., Gammon D.W., Albrecht C.F., Viladomat F (1998), 
“Alkaloids from Crinum delagoense”, Phytochemistry, 49 (8), pp. 2539–2543. 
[102]. Nguyen C.H., Le T.D., Nguyen N.S. (2002), “6-hydroxycrinamidine from the 
bulbs of Crinum latifolium”, Journal of Chemistry, 40 (4), pp. 1-2. 
[103]. Nguyen H.N., Jae Y.Y. (2009), “NF-kB inhibitory activities of the methanol 
extracts and some constituents therein of some Vietnamese medicinal plants”, 
Scientia Pharmaceutica, 77 (2), pp. 389-399. 
[104]. Nguyen H.N., Kim Y., You Y.J., Hong D.H., Kim H.M., (2004), “New 
constituents from Crinum latifolium with inhibitory effects against tube-like 
formation of human umbilical venous endothelial cell”, Natural Product 
Research, 18 (6), pp. 485-491. 
[105]. Nguyen T.H.V., Nguyen T.H.A, Tran V.S., Franke K., Wessjohann L., (2005), 
“Studies on chemical composition of Angelica sinensis”, Journal of Chemistry, 
43 (6), pp.749-752. 
[106]. Nguyen T.N.T., Mitova M., Bankova V., Handjieva N., Popov S.S. (2002), “GC-
MS of Crinum latifolium L. alkaloids”, Z. Naturforsch C., 57 (3-4), pp. 239-242. 
[107]. Nguyen T.N.T., Titorenkova T.V., St Bankova V., Handjieva N.V., Popov S.S. 
(2002), “Crinum L. (Amaryllidaceae)”, Fitoterapia, 73 (3), pp. 183-208. 
[108]. Ode O.J., Nwaehujor C.O., Onakpa M.M. (2010), “Evaluation of antihaemorrhagic 
and antioxidant potentials of Crinum jagus bulb”, International Journal of 
Applied Biology and Pharmaceutical Technology, 1 (3), pp. 1330-1336. 
[109]. Okpo S.O., Adeyemi O.O. (2002), “The anti-allergic effects of Crinum glaucum 
aqueous extract”, Phytomedicine, 9 (5), pp. 438-441. 
[110]. Oloyede K.G., Oke M.J. (2010), “Antioxidant and anticonvulsant alkaloids in 
Crinum ornatum bulb extract”, World Journal of Chemistry, 5 (1), pp. 26–31. 
[111]. Orio Laura, Alexandru L., Cravotto G., Mantegna S., Barge A. (2012), “UAE, 
MAE, SFE-CO2 and classical methods for the extraction of Mitragyna speciosa 
leaves”, Ultrasonics Sonochemistry, 19 (3), pp. 591-595. 
[112]. Ramadan M.A., Kamel M.S., Ohtania K., Yamasakia K. (2000), “Minor phenolics 
from Crinum bulbispermum bulbs”, Phytochemistry, 54 (8), pp. 891-896. 
- 10 - 
[113]. Ratnasooriya W.D., Deraniyagala S.A., Bathige S.D.N.K., Hettiarachchi H.D.I. 
(2005), “Leaf extract of Crinum bulbispermum has antinociceptive activity in 
rats”, Journal of Ethnopharmacology, 97 (1), pp. 123-128. 
[114]. Razdan T.K., Qadri B., Harkar S., Waicht E.S., (1987), “Chromones and 
coumarins from Skimmia laureola”, Phytochemistry, 26 (7), 2063-2069. 
[115]. Refaat J., Mohamed S.K., Ramadan M.A. (2011), “Analgesic, anti-inflammatory 
and antimicrobial activities of Crinum augustum and Crinum asiaticum L.”, 
Research Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 3 (6), pp. 289-296. 
[116]. Refaat J., Mohamed S.K., Ramadan M.A., Ali A.A. (2012), “Crinum; An endless 
source of bioactive principles: A review, Part 1-Crinum alkaloids: Lycorine-type 
alkaloids”, International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 3 
(7), pp. 1883-1890. 
[117]. Rhee I.K., Van D.M.M., Ingkaninan K., Verpoorte R. (2001), “Screening for 
acetylcholinesterase from Amaryllidaceae using TLC in combination with 
bioactivity staining”, Journal of Chromatography A, 915 (1-2), pp. 217-223. 
[118]. Rodrigues R.F., Tashima A.K., Pereira R.M.S., Mohamed R.S., Cabral F.A. 
(2008), “Coumarin solubility and extraction from Emburana (Torresea 
cearensis) seeds with supercritical carbon dioxide”, The Journal of Supercritical 
Fluids, 43 (3), pp. 375-382. 
[119]. Sahena F., Zaidul I.S.M., Jinap S., Karim A.A., Abbas K.A., Norulaini N.A.N., 
Omar A.K.M. (2009), “Application of supercritical CO2 in lipid extraction – A 
review”, Journal of Food Engineering, 95 (2), pp. 240-253. 
[120]. Santos S.A.O., Villaverde J.J., Silva C.M., Pascoal Neto C., Silvestre A. J. D. 
(2012),“Supercritical fluid extraction of phenolic compounds from Eucalyptus 
globulus Labill bark”, Journal of Supercritical Fluids, 71 (1), pp. 71-79. 
[121]. Shu X.S, Gao Z.H., Yang X.L. (2004), “Supercritical fluid extraction of 
sapogenins from tubers of Smilax China”, Fitoterapia, 75 (7-8), pp. 656-666. 
[122]. Soromou L.W., Na C., Lanxiang J., Meixia H., Miaomiao W., Xiao C., (2012), 
“Astragalin attenuates lipopolysaccharide-induced inflammatory responses by 
down-regulating NF-jB signaling pathway”, Biochemical and Biophysical 
Research Communications, 419, pp. 256–261. 
- 11 - 
[123]. Strahil B., Stefania R., Maria H., Francesc V., Carles C. (2011), “Antiproliferative 
Alkaloids from Crinum zeylanicum”, Phytotherapy Research, 25, pp.1686-1692. 
[124]. Szlavik L., Gyuris A., Minarovits J., Forgo P., Molnár J. (2004), “Alkaloids from 
Leucojum vernum and antiretroviral activity of Amaryllidaceae alkaloids”, 
Planta Medica; 70 (9), pp. 871–873. 
[125]. Tsuda Y., Kashiwaba N., Kumar V. (1984), “The alkaloidal consituents of Goda-
manel Crinum zeylanicum, a Sri Lankan folk medicine”, Chemical and 
Pharmaceutical Bulletin, 32 (8), pp. 3023-3027. 
[126]. Validomat F., Bastida J., Codina C., Campbell W.E., Mathee S. (1994), “Alkaloids 
from Brunsvigia josephinae”, Phytochemistry, 35 (3), pp. 809-812. 
[127]. Vatcharin R., Nanthaphong K., Yaowapa S. (2010), “Cyclohexene, Lactone and 
Phenol Derivatives from the Sea Fan-derived Fungi Nigrospora sp. PSU-F11 
and PSU-F12”, Archives of pharmacal research, 33(3), 375-380 
[128]. Veggi P.C., Cavalcanti R.N., Meireles M.A.A. (2011), “Modifier effects on 
supercritical fluid extraction (SFE) of some Brazilian plants: Antioxidant 
activity and economical evaluation”, Procedia Food Science, 1, pp. 1717-1724. 
[129]. Viladomat F., Almanza G.R., Codina C., Bastida J., Campbell W.E (1996), 
“Alkaloids from Brunsvigia orientalis”, Phytochemistry, 43 (6), pp. 1379-1384. 
[130]. Viladomat F., Codina C., Bastida J., Campbell W.E., Mathee S. (1995), “Further 
alkaloids from Brunsvigia josephinae”, Phytochemistry, 40 (3), pp. 961-965. 
[131]. Wang H., Guo S., Qian D., Qian Y. (2012), “Comparative analysis of quinolizidine 
alkaloids from different parts of Sophora alopecuroides seeds by UPLC–
MS/MS”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 67-68, pp.16-21. 
[132]. WHO (2006), General guidelines for the establishment, maintenance and 
distribution of chemical reference substances, p. 47, pp. 59-64. 
[133]. Xie P.S, Sibao C., Yi-zeng L., Xianghong W. (2006), “Chomatographic fingerprint 
analysis rational approach for quality assessment of traditional Chinese herbal 
medicine”, Journal of Chromatography A (1112), pp. 171-180. 
[134]. Xie Q., Wei Y., Zhang G. (2010), “Separation of flavonol glycosides from Flaveria 
identis (L.) Kuntze by high-speed counter-current chromatography”, Separation 
and Purification Technology, 72, pp. 229–233. 
- 12 - 
[135]. Yang L., Li L.L., Liu T.T. (2013), “Development of sample preparation method 
for isoliquiritigenin, liquiritin, and glycyrrhizic acid analysis in licorice by ionic 
liquids-ultrasound based extraction and HPLC detection”, Food Chemistry, 138 
(1), pp. 173-179. 
[136]. Zhou Q., Liu Y., Wang X., Di X. (2012), “Microwave-assisted extraction in 
combination with capillary electrophoresis for rapid determination of 
isoquinoline alkaloids in Chelidonium majus L.”, Talanta, 99, pp. 932-938. 
[137]. Zhou X.Q., Feng Y.H. (2007), “Advances in the application of supercritical CO2 
extraction in active constituents in traditional Chinese medicine plants”, Natural 
Science, Journal of Hainan University, 25, pp. 101-105. 
[138]. Ziaullah, Khushwant S. B., Sumudu N.W. (2013), “Biocatalytic synthesis, 
structural elucidation, antioxidant capacity and tyrosinase inhibition activity of 
long chain fatty acid acylated derivatives of phloridzin and isoquercitrin”, 
Bioorganic & Medicinal Chemistry, 21, pp. 684–692. 
[139]. Zvetkova E., Wirleitner B., Nguyen T.N.T, Schennach H., Fuchs D. (2001), 
“Aqueous extracts of Crinum latifolium (L.) and Camellia sinensis show 
immunomodulatory properties in human peripheral blood mononuclear cells", 
International Immunopharmacology, 1 (12), pp. 2143-2150.