Luận án Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa hợp chất kháng acetylcholinesterase của một số loài trong họ thạch tùng

Bệnh Alzheimer là một chứng suy giảm trí nhớ phổ biến nhất, ảnh hưởng

nghiêm trọng đến cuộc sống của người lớn tuổi. Vì bệnh không thể chữa khỏi, người

bệnh cần được chăm sóc bởi người thân. Đây quả thực là áp lực rất lớn về mặt xã hội,

tâm lý, sức khỏe, kinh tế đối với cuộc sống của những người trong gia đình. Do đó,

bệnh Alzheimer trở thành một thách thức lớn cho xã hội trong thế kỷ này [21] [95]

[111].

Alzheimer được xem như một triệu chứng của quá trình lão hoá mà đặc trưng

của bệnh là sự suy thoái trí nhớ và sự mất trí nhớ toàn bộ xảy ra khi bệnh tiến triển.

Những nghiên cứu về căn bệnh đã xác định mối tương quan đáng kể giữa sự hiện

diện của chất trung gian dẫn truyền thần kinh acetylcholin, vốn cần cho việc hình

thành và lưu giữ trí nhớ, với sự tiến triển của bệnh Alzheimer. Acetylcholin tồn tại

càng lâu trong não thì các tế bào não có thể gợi nhắc trí nhớ càng lâu. Ngày nay,

phương pháp hiệu quả nhất là sử dụng các chất có tác dụng ức chế

acetylcholinesterase như tacrin, donepezil, galantamin và rivastigmin [33] [94] [112].

Huperzin A được chiết xuất từ cây Thạch tùng răng đã gây được rất nhiều chú ý bởi

các công dụng của nó trong điều trị chứng bệnh mất trí nhớ. Các nghiên cứu khoa

học hiện đại đã chỉ ra rằng huperzin A có khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase,

loại enzym quan trọng trong quá trình gây ra bệnh mất trí nhớ. Huperzin A đã được

công nhận là một loại thuốc điều trị mất trí nhớ hiệu quả ở Trung Quốc và hiện nay

đã được cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) công nhận là 1 loại thực phẩm

chức năng cho các bệnh nhân bị Alzheimer [9] [17]. Huperzin A đã được chứng minh

bởi nhiều công trình nghiên cứu rằng nó có thể làm tăng khả năng ghi nhớ và lưu trữ

thông tin của não cũng như cải thiện sự sa sút về trí tuệ của các bệnh nhân ở Trung

Quốc [35] [49] [136]. Huperzin A cũng có khả năng bảo vệ khác như điều chỉnh tiền

chất beta-amyloid protein, qua đó chống lại sự oxi hóa, sự tự chết của tế bào thần

kinh theo quá trình apoptosis, rối loạn chức năng của ti thể và có khả năng chống

viêm nhiễm. Những khả năng bảo vệ các tế bào thần kinh của huperzin A đã giúp ích

rất nhiều cho các bệnh nhân Alzheimer [57] [117] [124] [125].

253 trang dienloan 8060

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa hợp chất kháng acetylcholinesterase của một số loài trong họ thạch tùng", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên

Tóm tắt nội dung tài liệu: Luận án Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa hợp chất kháng acetylcholinesterase của một số loài trong họ thạch tùng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN NGỌC CHƯƠNG
NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA HỢP CHẤT KHÁNG
ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ LOÀI
TRONG HỌ THẠCH TÙNG
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
TP. HỒ CHÍ MINH, năm 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN NGỌC CHƯƠNG
NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA HỢP CHẤT KHÁNG
ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ LOÀI
TRONG HỌ THẠCH TÙNG
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
Mã số: 62720410
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS TRẦN CÔNG LUẬN
TS TRẦN MẠNH HÙNG
TP. HỒ CHÍ MINH, năm 2020
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu
được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở
bất kỳ nơi nào.
Tác giả luận án
i
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT ............................. iii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. vi
DANH MỤC SƠ ĐỒ .............................................................................................. viii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ .......................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC .......................................................... 3
1.2. TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ........................................... 7
1.3. CÁC PHƯƠNG CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ PHÁP PHÂN TÍCH
HUPERZIN A ....................................................................................................... 18
1.4. THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ................................................................ 20
1.5. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHẾ
ACETYLCHOLINESTERASE ............................................................................ 22
1.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM VỀ TRÍ NHỚ .............................. 23
1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HỌ THẠCH TÙNG .............................. 25
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................. 27
2.1. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU ........................................................................... 27
2.2. QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU ........................................................................ 27
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ....................................................................... 28
2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................... 29
2.4. CỠ MẪU ........................................................................................................ 29
2.5. XÁC ĐỊNH CÁC BIẾN SỐ ........................................................................... 30
2.6. DUNG MÔI - HÓA CHẤT - TRANG THIẾT BỊ ......................................... 30
2.7. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 31
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU................................................................ 51
3.1. KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC ..................................................................... 51
3.2. TÁC DỤNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC
LOÀI THẠCH TÙNG .......................................................................................... 58
3.3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC ............................................................................ 61
3.4. THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ................................................................ 82
ii
3.5. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HUPERZIN A TRONG DƯỢC
LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP CZE VÀ HPLC.................................................. 88
3.6. NGHIÊN CỨU IN VIVO TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ CỦA THẠCH
TÙNG NGHIÊN .................................................................................................104
Chương 4. BÀN LUẬN .......................................................................................106
4.1. VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC ........................................................................106
4.2. VỀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE IN
VITRO CỦA CÁC LOÀI THẠCH TÙNG .........................................................110
4.3. VỀ MẶT HÓA HỌC ...................................................................................112
4.4. VỀ MẶT THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ................................................119
4.5. VỀ MẶT XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HUPERZIN A TRONG
DƯỢC LIỆU .......................................................................................................121
4.6. VỀ MẶT THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC ....................................................125
KẾT LUẬN .............................................................................................................129
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................132
TÀI LIỆU THAM KHẢO
iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT
Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt
AChE Acetylcholinesterase
AD Alzheimer's Disease Bệnh Alzheimer's
BuChE Butylcholinesterase
CC Column Chromatography Sắc ký cột
COSY Correlation Spectroscopy
DCM Dicloromethan
DĐVN Dược điển Việt Nam
DEPT
Distortionless Enhancement by
Polarization Transfer
DTNB 5,5ʹ-dithio-bis-nitro benzoic
EtOAc Ethyl acetat
FDA
Food and Drug Administration Cơ quan quản lý thực phẩm
dược phẩm Hoa Kỳ
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HPLC High Pressure Liquid Chromatography Sắc ký lỏng cao áp
HRMS High Resolution Mass Spectrometry Khối phổ phân giải cao
HSQC
Heteronuclear Multiple Quantum
Correlation
IC Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế
IR Infrared Hồng ngoại
MS Mass Spectrometry Khối phổ
NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân
SKLM Sắc ký lớp mỏng
UV Ultraviolet Tử ngoại
PCRS
Primary Chemical Reference Standard Chất đối chiếu hóa học sơ
cấp
SCRS
Secondary Chemical Reference Standard Chất đối chiếu hóa học thứ
cấp
LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng
iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu ............................................................................ 29
Bảng 2.2. Thành phần một mẫu thử nghiệm theo phương pháp Ellman .................. 32
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khác nhau của các chi trong họ Thạch tùng .............. 55
Bảng 3.2. Kết quả xác định độ ẩm cao chiết MeOH và hiệu suất chiết các dược liệu
................................................................................................................................... 58
Bảng 3.3. Kết quả tác động ức chế AChE của mẫu thử nghiệm ............................... 59
Bảng 3.4. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật ..................................... 61
Bảng 3.5. Kết quả so sánh 2 quy trình phân lập alcaloid .......................................... 62
Bảng 3.6. Các phân đoạn của cột Diaion HP-20 ....................................................... 64
Bảng 3.7. Các phân đoạn của cột sắc ký MeOH 100 % ........................................... 65
Bảng 3.8. Dữ liệu phổ 1H, 113C và DEPT của hợp chất 1 ........................................ 66
Bảng 3.9. Dữ liệu phổ 1H, 113C và DEPT của hợp chất 2 ........................................ 68
Bảng 3.10. Dữ liệu phổ 1H, 113C và DEPT của hợp chất 3 ...................................... 70
Bảng 3.11. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 4 ................................ 72
Bảng 3.12. So sánh kết quả của PP1, PP2, PP3 ........................................................ 73
Bảng 3.13. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 5 ........................................................... 77
Bảng 3.14. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 6 ................................ 78
Bảng 3.15. Kết quả tác động ức chế AChE của các hợp chất phân lập được ........... 80
Bảng 3.16. Các phân đoạn của cột R-1 ..................................................................... 81
Bảng 3.17. Các phân đoạn của cột R-2 ..................................................................... 81
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát hàm ẩm và nhiệt độ nóng chảy, độ tinh khiết ........... 82
Bảng 3.19. Bảng tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết sắc ký của
huperzin A ................................................................................................................. 83
Bảng 3.20. Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các nguyên liệu thiết lập CĐC
................................................................................................................................... 84
Bảng 3.21. Kết quả phân tích phương sai một yếu tố theo ANOVA ........................ 87
Bảng 3.22. Kiểm tra tính phù hợp hệ thống và kết quả xác định hàm lượng huperzin
A tại 2 phòng thí nghiệm (n = 6) ............................................................................... 87
Bảng 3.23. Xác định giá trị công bố ......................................................................... 87
Bảng 3.24. Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống trên mẫu chuẩn ....................... 92
Bảng 3.25. Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử ............................ 92
v
Bảng 3.26. Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng huperzin A trong Thạch
tùng răng .................................................................................................................... 93
Bảng 3.27. Tương quan giữa nồng độ và tỉ lệ diện tích đỉnh chuẩn hóa của huperzin
A ................................................................................................................................ 94
Bảng 3.28. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng huperzin A ..... 95
Bảng 3.29. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu chuẩn huperzin A .... 97
Bảng 3.30. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng huperzin A trong
Râu rồng .................................................................................................................... 98
Bảng 3.31. Kết quả tính toán hàm lượng huperzin A trong cây Râu rồng ............... 99
Bảng 3.32. Tương quan nồng độ và diện tích đỉnh của huperzin A ......................... 99
Bảng 3.33. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng ......................100
Bảng 3.34. Kết quả xác định hàm lượng huperzin A của 10 loài trong họ Thạch tùng
.................................................................................................................................103
Bảng 4.1. Các hệ thống phân loại họ Thạch tùng ...................................................107
vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của bốn nhóm Lycopodium alcaloid ............................................. 8
Hình 1.2. Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung lycodin ................................ 8
Hình 1.3. Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung lycopodin ............................ 9
Hình 1.4. Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung fawcettimin ......................... 9
Hình 1.5. Cấu trúc của một số Lycopodium alcaloid trong cây Thạch tùng răng ..... 10
Hình 1.6. Cấu trúc của một số acid phenolic được phân lập từ loài Lycopodium
clavatum .................................................................................................................... 11
Hình 1.7. Cấu trúc một số terpenoid được phân lập từ loài Lycopodium japonicum
................................................................................................................................... 11
Hình 1.8. Cấu trúc của một số flavonoid trong chi Lycopodium .............................. 12
Hình 1.9. Cấu trúc của một số alcaloid trong cây Thạch tùng nghiên ...................... 14
Hình 1.10. Cấu trúc của huperzin A .......................................................................... 15
Hình 3.1. Các loài Thạch tùng nghiên cứu ............................................................... 54
Hình 3.2. So sánh đặc điểm vi phẫu rễ của 3 loài thuộc 3 chi trong họ Thạch tùng 56
Hình 3.3. So sánh đặc điểm vi phẫu thân của 3 loài thuộc 3 chi trong họ Thạch tùng
................................................................................................................................... 57
Hình 3.4. So sánh đặc điểm vi phẫu lá của 3 loài thuộc 3 chi trong họ Thạch tùng 58
Hình 3.5. Sắc ký đồ dịch chiết alcaloid từ quy trình 1 và quy trình 2 ...................... 62
Hình 3.6. Sắc ký đồ các phân đoạn MeOH 100 % ................................................... 64
Hình 3.7. Công thức cấu tạo của huperzin A ............................................................ 67
Hình 3.8. Công thức cấu tạo của một số hợp chất khung cấu trúc Phlegmariurin B 68
Hình 3.9. Công thức cấu tạo của hợp chất 2 (Lycosquarosin A) .............................. 69
Hình 3.10. Các tương tác xa của hợp chất 2 (lycosquarosin A) ............................... 69
Hình 3.11. Công thức cấu tạo của acetylaposerratinin ............................................. 71
Hình 3.12. Công thức cấu tạo của huperzinin ........................................................... 72
Hình 3.13. Sắc ký đồ các phân đoạn alcaloid ........................................................... 75
Hình 3.14. Sắc ký đồ các phân đoạn cột Diaion ....................................................... 75
Hình 3.15. Công thức cấu tạo của lycocernuin ......................................................... 76
Hình 3.16. Khung cấu trúc dihydrobenzofuran neolignan glycosid ......................... 79
Hình 3.17. Cấu trúc hóa học và các tương tác của lycocernuasid A......................... 80
Hình 3.18. Sắc ký đồ các phân đoạn cột R-1 ............................................................ 81
vii
Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của chất chuẩn huperzin A .......................................... 83
Hình 3.20. Điện di đồ của mẫu thử khảo sát dung dịch đệm .................................... 88
Hình 3.21. Điện di đồ của mẫu thử khảo sát nồng độ dung dịch đệm ...................... 88
Hình 3.22. Khảo sát nồng độ đệm đến (a) độ phân giải, (b) thời gian dịch chuyển, (c)
thời gian xuất hiện pic chuẩn nội .............................................................................. 89
Hình 3.23. Điện di đồ của mẫu thử khảo sát sự ảnh hưởng của pH .. ... ........................................................... 58
Phụ lục 59. Phổ HSQC (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất chất 3 (vùng 2,0-4,0 ppm,
vùng 20-55 ppm) ........................................................................................................................... 59
Phụ lục 60. Phổ NOESY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất chất 3 ......................... 60
Phụ lục 61. 1. Phổ UV của hợp chất 4 ........................................................................................ 61
Phụ lục 61. 2. Phổ IR của hợp chất 4 61
Phụ lục 62. Phổ MS vủa hợp chất 4 ............................................................................................. 62
Phụ lục 63. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 500 MHz) của chất 4 ........................................................ 63
Phụ lục 64. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của chất 4 ......................................................... 64
Phụ lục 65. Phổ COSY (CDCl3, 500MHz) của hợp chất 4 ....................................................... 65
Phụ lục 66. Phổ HSQC (CDCl3, 500MHz) của hợp chất 4 ....................................................... 66
Phụ lục 67. Phổ HMBC (CDCl3, 500MHz) của hợp chất 4 ...................................................... 67
Phụ lục 68. 1. Phổ IR của hợp chất 5 ........................................................................................... 68
Phụ lục 68. 2. Phổ hrms của hợp chất 5. 68
Phụ lục 69. Phổ 13C-NMR (MeOD, 500 MHz) hợp chất 5 ....................................................... 69
Phụ lục 70. Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) hợp chất 5 ........................................................ 70
Phụ lục 71. Phổ DEPT (MeOD, 500 MHz) của hợp chất 5 ...................................................... 71
Phụ lục 72. Phổ HSQC (MeOD, 500 MHz) của hợp chất 5 ..................................................... 72
Phụ lục 73. Phổ COSY (MeOD, 500 MHz) của hợp chất 5 ..................................................... 73
Phụ lục 74. Phổ HMBC (MeOD, 500 MHz) của hợp chất 5 ................................................... 74
Phụ lục 75. Phổ HR-FAB-MS của hợp chất 6 ............................................................................ 75
Phụ lục 76. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 6 .............................................. 76
Phụ lục 77. Phổ 13C -NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 6 ............................................. 77
Phụ lục 78. Phổ HMQC -NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 6 ...................................... 78
Phụ lục 79. Phổ HMBC -NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 6 ...................................... 79
Phụ lục 80. Phổ UV của hợp chất M23 ....................................................................................... 80
Phụ lục 81. Phổ IR của hợp chất M23 ......................................................................................... 81
Phụ lục 82. Phổ HRMS của hợp chất M23 ................................................................................. 82
Phụ lục 83. Phổ 13C – NMR của hợp chất M23 .......................................................................... 83
Phụ lục 84. Phổ 1H – NMR của hợp chất M23 ........................................................................... 84
Phụ lục 85. Phổ DEPT - NMR của hợp chất M23 ..................................................................... 85
Phụ lục 86. Phổ COSY – NMR của hợp chất M23 .................................................................... 86
Phụ lục 87. Phổ HSQC của hợp chất M23 .................................................................................. 87
Phụ lục 88. Phổ HMBC–NMR của hợp chất M23 ..................................................................... 88
Phụ lục 89. 1 Hình SKĐ trong quá trình phân lập hợp chất 5 từ phân đoạn 4 ...................... 89
Phụ lục 89. 2 Hình SKĐ các phân đoạn trong quá trình sắc ký của phân đoạn 8. 89
Phụ lục 89. 3 Hình SKĐ các phân đoạn sắc ký phân lập hợp chất 6 từ phân đoạn 8.8 89
Phụ lục 90. Bảng số liệu khảo sát độ lặp lại của phương pháp HPLC trên chất đối chiếu ... 90
Phụ lục 91. Hình SKĐ khảo sát độ lặp lại của phương pháp HPLC trên chất đối chiếu ...... 91
Phụ lục 92. Điện di đồ mẫu Thạch tùng răng ở bước sóng 230 nm và 310 nm ..................... 92
Phụ lục 93. Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập được.......................................................... 923
PL.1
Phụ lục 1. 1. Hình vi phẫu rễ (A), thân (B), lá (C) Râu rồng (Huperzia squarrosa)
Phụ lục 1. 2. Hình vi phẫu rễ (A), thân (B), lá (C) Thạch tùng đuôi ngựa (Huperzia phlegmaria)
PL.2
Phụ lục 2. 1. Vi phẫu rễ (A), thân (B), lá (C) Thạch tùng sóng (Huperzia carinata)
Phụ lục 2 2. Vi phẫu rễ (A), thân (B), lá Thạch tùng Fordi (Huperzia fordii)
PL.3
Phụ lục 3. 1. Hình vi phẫu rễ (A), thân (B), lá (C) Thạch tùng vuông (Huperzia tetrasticha)
Phụ lục 3. 2. Hình vi phẫu rễ (A), thân (B), lá (C) Thạch tùng răng (Huperzia serrata)
Biểu bì
Vòng đai mô cứng
Lông hút
Trụ bì
Gỗ
Libe
Lỗ khí
Bó dẫn
A
C
Trụ bì
Libe
Gỗ
Vòng đai mô cứng
Mô mềm
A
PL.4
Phụ lục 4. 1. Hình vi phẫu rễ (A), thân (B), lá (C) Thạch tùng dẹp (Lycopodium complanatum)
Phụ lục 4. 2. Hình vi phẫu rễ (A), thân (B), lá (C) Thạch tùng dùi (Lycopodium clavatum)
PL.5
Phụ lục 5. 1. Hình vi phẫu rễ (A), thân (B), lá (C) Thạch tùng dương (Lycopodium casuarinoides)
Phụ lục 5. 2. Hình vi phẫu rễ (A), thân (B), lá (C) Thạch tùng nghiên (Lycopodiella cernua)
Biểu bì
Bó đẫn
Mô
mềm C
PL.6
Phụ lục 6. Hình ảnh cây Thạch tùng vuông (Huperzia tetrasticha)
PL.7
Phụ lục 7. Phổ UV của hợp chất 1
PL.8
Nr. Pos. (1/cm) Inten. (%T) Nr. Pos. (1/cm) Inten. (%T)
1 408,9 32,19 26 1242,1 24,52
2 435,9 32,12 27 1282,6 41,11
3 462,9 30,97 28 1303,8 29,54
4 478,3 26,95 29 1325,0 31,27
5 520,7 14,14 30 1352,0 21,20
6 559,3 32,20 31 1379,0 24,57
7 609,5 26,36 32 1404,1 15,71
8 628,8 23,98 33 1421,4 12,59
9 659,6 9,20 34 1436,9 11,18
10 719,4 30,07 35 1456,2 5,94
11 758,0 36,16 36 1548,7 10,57
12 775,3 22,36 37 1612,4 2,71
13 840,9 9,34 38 1647,1 0,37
14 875,6 21,21 39 2065,6 61,17
15 904,6 14,97 40 2175,6 55,72
16 939,3 9,57 41 2349,1 50,87
17 997,1 29,73 42 2515,9 39,34
18 1037,6 33.25 43 2823,6 15,29
19 1068,5 40,23 44 2885,3 9,49
20 1082,0 38,77 45 2906,5 8,73
21 1097,4 25,50 46 2964,4 13,60
22 1122,5 35,03 47 3178,5 17,79
23 1174.6 31,69 48 3261,4 17,72
24 1209,3 35,32 49 3340,5 12,21
25 1228,6 32,62 50 3477,4 11,03
Phụ lục 8. Phổ IR của hợp chất 1
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
%T
500.0 750.0 1000.0 1250.0 1500.0 1750.0 2000.0 2750.0 3500.0
1/cm M2X 0204
PL.9
Phụ lục 9. Phổ HRMS của hợp chất 1
PL.10
Phụ lục 10. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 1
PL.11
Phụ lục 11. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 1 (vùng 𝜹𝑯 5,2-8,0 ppm)
PL.12
Phụ lục 12 Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 1 (vùng 𝜹𝑯 1,4-3,8 ppm)
PL.13
Phụ lục 13. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất hợp chất 1
PL.14
Phụ lục 14. Phổ DEPT (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 1
PL.15
Phụ lục 15. Phổ COSY (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 1
PL.16
Phụ lục 16. Phổ COSY (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 1 (vùng 𝜹𝑯 1,5-5,5 ppm)
PL.17
Phụ lục 17. Phổ HMBC (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 1
PL.18
Phụ lục 18. Phổ HMBC (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 1
(vùng 𝜹𝑯 5,0-8,5 ppm, vùng 𝜹𝑪 120-165 ppm
PL.19
Phụ lục 19. Phổ HMBC (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 1
(vùng 𝜹𝑯 1,4-4,0 ppm; vùng 𝜹𝑪 110-145 ppm )
PL.20
Phụ lục 20. Phổ HMBC (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 1
(vùng 𝜹𝑯 5,0-8,0 ppm; vùng 𝜹𝑪 10-55 ppm)
PL.21
Phụ lục 21. Phổ HMBC (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 1
(vùng 𝜹𝑯 2-4 ppm; vùng 𝜹𝑪 10-55 ppm)
PL.22
Phụ lục 22. Phổ HSQC (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 1
PL.23
Phụ lục 23. Phổ HSQC (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 1
(vùng 𝜹𝑯 5-8 ppm; vùng 𝜹𝑪 110-140 ppm)
PL.24
Phụ lục 24. Phổ HSQC (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 1
(vùng 𝜹𝑯 1,4-3,6 ppm; vùng 𝜹𝑪 10-50 ppm)
PL.25
Phụ lục 25. 1. Phổ UV của hợp chất 2
Phụ lục 25.2. Phổ IR của hợp chất 2
255 nm
PL.26
Phụ lục 26. Phổ HRMS của hợp chất 2
PL.27
Phụ lục 27. Phổ 1H-NMR (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2
PL.28
Phụ lục 28. Phổ 1H-NMR (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 2,4-4,1 ppm
PL.29
Phụ lục 29. Phổ 1H-NMR (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 1,1-2,8 ppm)
PL.30
Phụ lục 30. Phổ 13C-NMR (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất hợp chất 2
PL.31
Phụ lục 31. Phổ 13C-NMR (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 80-210 ppm)
PL.32
Phụ lục 32. Phổ 13C-NMR (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 15-55 ppm )
PL.33
Phụ lục 33. Phổ COSY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2
PL.34
Phụ lục 34. Phổ COSY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2
(vùng 2,4-5,2 ppm)
PL.35
Phụ lục 35. Phổ COSY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2(vùng 1,2-4,0
ppm)
PL.36
Phụ lục 36. Phổ COSY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 2,0-4,0
ppm)
PL.37
Phụ lục 37. Phổ HMBC (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 1,0-5,5
ppm, vùng 20-200 ppm)
PL.38
Phụ lục 38. Phổ HMBC (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 1,4-3.2
ppm, vùng 140-205 ppm)
PL.39
Phụ lục 39. Phổ HMBC (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 1,0-5,0
ppm, vùng 20-80 ppm)
PL.40
Phụ lục 40. Phổ HSQC (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2
PL.41
Phụ lục 41. Phổ NOESY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2
PL.42
Phụ lục 42. Phổ NOESY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 1,0-3,4
ppm)
PL.43
Phụ lục 43. Phổ NOESY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 1,0-5,0
ppm)
PL.44
Phụ lục 44. Phổ HRMS của hợp chất 3
PL.45
Phụ lục 45. Phổ 1H-NMR (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 3
PL. 46
Phụ lục 46. Phụ lục 37. Phổ 1H-NMR (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 3 (vùng 𝜹𝑯 2,6-4,0 ppm)
PL. 47
Phụ lục 47. Phổ 1H-NMR (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của chất 3 (vùng 1,7-2,5 ppm)
PL. 48
Phụ lục 48. Phụ lục 39. Phổ 13C-NMR (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của chất 3
PL. 49
Phụ lục 49. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 500 MHz) của chất 3 (vùng 𝜹𝑪 15–55 ppm)
PL. 50
Phụ lục 50. Phổ DEPT (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 3
PL. 51
Phụ lục 51. Phổ DEPT (CDCl3 & meOD, 500 MHz) của hợp chất 3 (vùng 𝜹𝑪 20–80 ppm)
PL. 52
Phụ lục 52. Phổ COSY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất chất 3
PL. 53
Phụ lục 53. Phổ COSY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất chất 3 (vùng
𝜹𝑯 1,0-2,8 ppm)
PL. 54
Phụ lục 54. Phụ lục 45. Phổ HMBC (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất chất 3
(vùng 𝜹𝑯 1,0-5,5 ppm, vùng 𝜹𝑪 20-220 ppm)
PL. 55
Phụ lục 55. Phổ HMBC (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất chất 3 (vùng 𝜹𝑯
2,0-5,0 ppm, vùng 𝜹𝑪 100-220 ppm)
PL. 56
Phụ lục 56. Phổ HMBC (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất chất 3 (vùng 1,0-
5,5 ppm, vùng 20-95 ppm)
PL. 57
Phụ lục 57. Phổ HMBC (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất chất 3 (vùng 1,0-
2,6 ppm, vùng 20-70 ppm)
PL. 58
Phụ lục 58. Phổ HSQC (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất chất 3 (vùng 1,0-
5,0 ppm, vùng 15-75 ppm)
PL. 59
Phụ lục 59. Phổ HSQC (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất chất 3 (vùng 2,0-
4,0 ppm, vùng 20-55 ppm)
PL. 60
Phụ lục 60. Phổ NOESY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất chất 3
PL. 61
Phụ lục 61. 1. Phổ UV của hợp chất 4
Phụ lục 61.2. Phổ IR của hợp chất 4
PL. 62
Phụ lục 62. Phổ MS vủa hợp chất 4
PL. 63
Phụ lục 63. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 500 MHz) của chất 4
PL. 64
Phụ lục 64. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của chất 4
PL. 65
Phụ lục 65. Phổ COSY (CDCl3, 500MHz) của hợp chất 4
PL. 66
Phụ lục 66. Phổ HSQC (CDCl3, 500MHz) của hợp chất 4
PL. 67
Phụ lục 67. Phổ HMBC (CDCl3, 500MHz) của hợp chất 4
PL. 68
Phụ lục 68. 1. Phổ IR của hợp chất 5
Phụ lục 68.2. Phổ HRMS của hợp chất 5
PL. 69
Phụ lục 69. Phổ 13C-NMR (MeOD, 500 MHz) hợp chất 5
PL. 70
Phụ lục 70. Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) hợp chất 5
PL. 71
Phụ lục 71. Phổ DEPT (MeOD, 500 MHz) của hợp chất 5
PL. 72
Phụ lục 72. Phổ HSQC (MeOD, 500 MHz) của hợp chất 5
PL. 73
Phụ lục 73. Phổ COSY (MeOD, 500 MHz) của hợp chất 5
PL. 74
Phụ lục 74. Phổ HMBC (MeOD, 500 MHz) của hợp chất 5
PL. 75
Phụ lục 75. Phổ HR-FAB-MS của hợp chất 6
PL. 76
Phụ lục 76. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 6
PL. 77
Phụ lục 77. Phổ 13C -NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 6
PL. 78
Phụ lục 78. Phổ HMQC -NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 6
PL. 79
Phụ lục 79. Phổ HMBC -NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 6
PL. 80
Phụ lục 80. Phổ UV của hợp chất M23
PL. 81
Phụ lục 81. Phổ IR của hợp chất M23
Nr. Pos. (1/cm) Inten. (%T) Nr. Pos. (1/cm) Inten. (%T)
1 410.8 51 27 1228.6 46.53
2 437.8 52.32 28 1242.1 31.94
3 462.9 52.88 29 1280.6 58.61
4 478.3 43.73 30 1309.6 42.8
5 520.7 18.95 31 1325 43.02
6 559.3 46.94 32 1352 28.58
7 609.5 39.21 33 1379 36.22
8 630.7 36.95 34 1406 21.71
9 661.5 11.09 35 1421.4 16.28
10 719.4 43.11 36 1456.2 4.1
11 758 54.88 37 1548.7 11.98
12 777.3 31.91 38 1612.4 1.68
13 796.5 53.47 39 1651 0.08
14 840.9 13.14 40 2351.1 66.67
15 877.6 31.82 41 2516.9 53.37
16 912.3 21.18 42 2823.6 17.23
17 939.3 10.95 43 2854.5 15.77
18 997.1 40.07 44 2885.3 9.55
19 1037.6 44.2 45 2906.5 8.52
20 1068.5 54.23 46 2964.4 14.38
21 1082 51.53 47 3112.9 28.49
22 1097.4 32.28 48 3178.5 20.41
23 1122.5 48.11 49 3261.4 20.21
24 1176.5 42.86 50 3340.5 11.24
25 1188.1 54.45 51 3481.3 10.7
26 1209.3 50.18
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.
%T
500.0 750.0 1000.0 1250.0
PL. 82
Phụ lục 82. Phổ HRMS của hợp chất M23
PL. 83
Phụ lục 83. Phổ 13C – NMR của hợp chất M23
PL. 84
Phụ lục 84. Phổ 1H – NMR của hợp chất M23
PL. 85
Phụ lục 85. Phổ DEPT - NMR của hợp chất M23
PL. 86
Phụ lục 86. Phổ COSY – NMR của hợp chất M23
PL. 87
Phụ lục 87. Phổ HSQC của hợp chất M23
PL. 88
Phụ lục 88. Phổ HMBC–NMR của hợp chất M23
PL. 89
Phụ lục 89.1. Hình SKĐ trong quá trình phân lập hợp chất 5 từ phân đoạn 4
Phụ lục 89. 2 Hình SKĐ các phân đoạn trong quá trình sắc ký của phân đoạn 8
Phụ lục 89.3. Hình SKĐ các phân đoạn sắc ký phân lập hợp chất 6 từ phân đoạn 8.8
UV365
UV254
TT Dragendorff
PL. 90
Phụ lục 90. Bảng số liệu khảo sát độ lặp lại của phương pháp HPLC trên chất đối
chiếu
PL. 91
\
Phụ lục 91. Hình SKĐ khảo sát độ lặp lại của phương pháp HPLC trên chất đối
chiếu
PL. 92
Phụ lục 92. Điện di đồ mẫu Thạch tùng răng ở bước sóng 230 nm và 310 nm
230 nm
310 nm
Huperzin A
Imidazol
PL. 93
huperzin A (Hợp chất 1)
Lycosquarosin A (Hợp chất 2)
Acetylaposerratinin (Hợp chất 3)
Huperzinin (Hợp chất 4)
Lycocernuin (Hợp chất 5)
Lycocernuasid A (Hợp chất 6)
Phụ lục 93. Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập được
11
12
13
4
5
6
7
N
H
1
23
14
8
15
O
10 N
H
16
H H
N N
O
H H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
OH

File đính kèm:

luan_an_nghien_cuu_tieu_chuan_hoa_hop_chat_khang_acetylcholi.pdf