Luận án Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng cải thiện khả năng sinh tinh của viên nang y10

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG
VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN QUÂN ĐỘI
LÊ MINH HOÀNG
NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ
 TÁC DỤNG CẢI THIỆN KHẢ NĂNG 
SINH TINH CỦA VIÊN NANG Y10
LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC
HÀ NỘI - 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG
VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN QUÂN ĐỘI
LÊ MINH HOÀNG
NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ
 TÁC DỤNG CẢI THIỆN KHẢ NĂNG 
SINH TINH CỦA VIÊN NANG Y10
Chuyên ngành 	: Y học cổ truyền
Mã số 	: 62.72.02.01
LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. NGUYỄN DUY BẮC
PGS.TS. PHẠM XUÂN PHONG
HÀ NỘI - 2019
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa học và hoàn tất luận án này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc: 
Đảng ủy, Ban Giám đốc, Trung tâm Huấn luyện - Đào tạo Viện Y học cổ truyền Quân đội; Viện NCYDHQS, bộ môn Dược lý - Học viện Quân y đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Duy Bắc, PGS.TS Phạm Xuân Phong, là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo tận tình và cho tôi nhiều ý kiến quý báu trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án này. 
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Hoàng Ngân, PGS.TS Phan Anh Tuấn, TS Trịnh Hoài Nam và TS Phan Hoài Trung, là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án.
Cuối cùng tôi gửi lời cảm ơn gia đình tôi, vợ tôi, cơ quan bạn bè, đồng nghiệp đã tạo điều kiện và cho tôi động lực, ở bên tôi trong suốt quá trình học tập để hoàn thành luận án này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Nghiên cứu sinh
Lê Minh Hoàng
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam số liệu trong đề tài luận án là một phần số liệu trong đề tài nghiên cứu có tên: “Nghiên cứu bào chế, tính an toàn và một số tác dụng sinh học của chế phẩm từ lộc nhung và đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) nuôi cấy tại Việt Nam” cấp Bộ Quốc Phòng, mã số: 247/2016/HĐ-NCKHCN. Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là một thành viên chính. Tôi đã được Chủ nhiệm đề tài và toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng đề tài này vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Nghiên cứu sinh
Lê Minh Hoàng
MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt 
Danh mục các bảng
Danh mục các biểu đồ
Danh mục các hình ảnh
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU 
ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ALT 	Alanin Transminase 
AST 	Aspartat Transaminase 
CNT 	Chuột nhắt trắng 
DHEA 	Dehydroepiandrosteron
DHT	Dihydrotestosteron
DNA 	Deoxyribonucleic acid
DPPH 	Diphenylpicrylhydrazyl
ĐTHT	Đông trùng hạ thảo
FSH 	Follicle-stimulating hormon 
ICSI	Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng
IUI	Bơm tinh trùng vào buồng tử cung
IVF	Thụ tinh trong ống nghiệm	
LD 	Lethal Dose (Liều gây chết)
LH 	Luteinizing hormon 
MCH 	Mean corpuscular hemoglobin (số lượng hemoglobin
 	trung bình trong một hồng cầu)
MCHC 	Mean corpuscular hemoglobin concentration (nồng độ
 	hemoglobin trung bình trong một hồng cầu)
MCV 	Mean corpuscular volume (thể tích trung bình hồng cầu)	
MT 	Mẫu thử
NC 	Nghiên cứu
NST 	Nhiễm sắc thể
OECD 	Organization for Economic Cooperation and Development
 	(Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế)
SGTT	Suy giảm tinh trùng
WHO	World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới)
YHCT	Y học cổ truyền
YHHĐ	Y học hiện đại
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. 	Chỉ số tinh dịch đồ bình thường theo WHO (2010)	13
Bảng 1.2. 	Nghiên cứu tác dụng lên chức năng sinh dục nam của một số bài thuốc YHCT ở Việt Nam	33
Bảng 1.3. 	Các nghiên cứu trên thực nghiệm về tác dụng lên cơ quan và chức năng sinh dục nam của một số dược liệu ở Việt Nam	34
Bảng 2.1. 	Số lượng động vật thực nghiệm	43
Bảng 2.2. 	Các giá trị tinh dịch đồ được lựa chọn là SGTT theo WHO 2010	58
Bảng 2.3 	Chỉ số các hormon sinh dục bình thường	58
Bảng 2.4. 	Phân loại chẩn đoán của tinh dịch đồ ở bệnh nhân nghiên cứu	61
Bảng 3.1. 	Độc tính cấp của viên nang Y10 trên chuột nhắt trắng 	63
Bảng 3.2.	Sự thay đổi về thể trọng chuột (g)	64
Bảng 3.3. 	Ảnh hưởng đến điện tim chuột	65
Bảng 3.4. 	Ảnh hưởng lên số lượng hồng cầu và hàm lượng huyết sắc tố	66
Bảng 3.5. 	Ảnh hưởng lên hematocrit và thể tích trung bình hồng cầu	67
Bảng 3.6. 	Ảnh hưởng của viên nang Y10 lên số lượng bạch cầu và tiểu cầu trong máu chuột	68
Bảng 3.7. 	Ảnh hưởng đến hoạt độ AST và ALT	69
Bảng 3.8. 	Ảnh hưởng lên albumin và bilirubin toàn phần trong máu	70
Bảng 3.9. 	Ảnh hưởng lên cholesterol toàn phần trong máu (mmol/l)	71
Bảng 3.10. 	Nồng độ creatinin máu chuột (µmol/l)	71
Bảng 3.11. 	Tỷ lệ chuột cái thụ thai ở các lô	76
Bảng 3.12: 	Số hoàng thể/1 chuột mẹ ở các lô	76
Bảng 3.13: 	Số thai sống/1 chuột mẹ ở các lô (%)	77
Bảng 3.14: 	Số thai chết sớm/1 chuột mẹ ở các lô (%)	77
Bảng 3.15: 	Số thai chết muộn/1 chuột mẹ ở các lô (%)	78
Bảng 3.16: 	Số trứng tiêu/1 chuột mẹ ở các lô (%)	78
Bảng 3.17: 	Số lượng chuột con/1 lứa đẻ ở các lô	79
Bảng 3.18: 	Số chuột con chết/1 lứa đẻ ở các lô (%)	79
Bảng 3.19. 	Ảnh hưởng của chế phẩm đến số lượng NST tế bào tủy xương	80
Bảng 3.20. 	Ảnh hưởng của chế phẩm đến cấu trúc NST tế bào tủy xương	81
Bảng 3.21. 	Ảnh hưởng của chế phẩm đến nhiễm sắc thể tinh hoàn	83
Bảng 3.22. 	Nồng độ testosteron huyết thanh chuột	84
Bảng 3.23. 	Ảnh hưởng của viên nang Y10 lên mật độ tinh trùng	85
Bảng 3.24. 	Mức độ di động của tinh trùng	86
Bảng 3.25. 	Tỷ lệ tinh trùng có hình thái cấu trúc bất thường	87
Bảng 3.26. 	Trọng lượng của các cơ quan sinh dục chuột	88
Bảng 3.27. 	Đường kính ống sinh tinh của các lô nghiên cứu	90
Bảng 3.28. 	Tỉ lệ vô sinh I và vô sinh II	91
Bảng 3.29. 	Nồng độ testosteron, LH, FSH huyết thanh	92
Bảng 3.30. 	So sánh theo phân loại nồng độ testosteron, LH, FSH huyết thanh trước và sau điều trị	93
Bảng 3.31. 	Tỉ lệ số mẫu tinh dịch đồ theo phân loại tinh trùng 	94
Bảng 3.32. 	So sánh thể tích tinh dịch, độ pH, số lượng bạch cầu trước và sau điều trị	94
Bảng 3.33. 	So sánh các chỉ số tinh dịch đồ trước và sau điều trị 	95
Bảng 3.34. 	Kết quả điều trị lâm sàng	95
Bảng 3.35. 	Sự biến đổi sau điều trị so với trước điều trị của các triệu chứng theo YHCT	96
Bảng 3.36. 	Dấu hiệu lâm sàng không mong muốn	96
Bảng 3.37. 	Kết quả xét nghiệm ALT, AST, ure, creatinin huyết thanh	97
Bảng 3.38. 	Kết quả xét nghiệm huyết học	97
DANH MỤC ẢNH
Ảnh 2.1. 	Chuột nhắt trắng và chuột cống trắng sử dụng trong nghiên cứu	44
Ảnh 2.2. 	Máy xét nghiệm huyết học và sinh hóa sử dụng trong nghiên cứu	45
Ảnh 2.3. 	Lấy máu hốc mắt chuột làm các xét nghiệm nghiên cứu	48
Ảnh 2.4. 	Phẫu tích quan sát đại thể các tạng gan, lách, thận và làm mô bệnh học	49
Ảnh 2.5. 	Kỹ thuật chọc kim lấy máu ở tim chuột	54
Ảnh 2.6. 	Phẫu tích cơ quan sinh dục của chuột cống đực	57
Ảnh 3.1. 	Hình ảnh đại thể gan, lách, thận chuột đại điện của các lô chuột nghiên cứu	72
Ảnh 3.2. 	Hình ảnh mô bệnh học gan chuột đại điện của các lô chuột nghiên cứu, sau 90 ngày uống thuốc	73
Ảnh 3.3. 	Hình ảnh mô bệnh học lách chuột đại điện của các lô chuột nghiên cứu sau 90 ngày uống thuốc	74
Ảnh 3.4. 	Hình ảnh mô bệnh học thận chuột đại điện của các lô chuột nghiên cứu sau 90 ngày uống thuốc	75
Ảnh 3.5. 	NST tế bào tuỷ xương chuột nhắt trắng bình thường lô chứng	81
Ảnh 3.6. 	NST tế bào tuỷ xương lô uống chế phẩm liều thấp	82
Ảnh 3.7. 	NST tế bào tuỷ xương lô uống chế phẩm liều cao	82
Ảnh 3.8. 	Hình ảnh mô học tinh hoàn chuột đại điện của các lô chuột nghiên cứu	89
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1.	Mô hình nghiên cứu tính an toàn, tác dụng dược lý trên mô hình thực nghiệm và tác dụng trên lâm sàng của viên nang Y10	46
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. 	Phân bố bệnh nhân theo lứa tuổi 	91
Biểu đồ 3.2. 	Phân loại tỉ lệ testosteron, LH, FSH huyết thanh bình thường và ngoài giá trị bình thường trước điều trị 	92
ĐẶT VẤN ĐỀ
Vô sinh do nam giới là một bệnh mang tính xã hội. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) dự báo, vô sinh là căn bệnh nguy hiểm thứ ba của thế kỷ XXI, đứng sau ung thư và các bệnh tim mạch. Hiện nay, vấn đề vô sinh đang có tỷ lệ ngày càng tăng cao và phức tạp hơn. Trên thế giới, tỷ lệ những cặp vợ chồng bị mắc bệnh vô sinh trung bình khoảng 15%. Tại Việt Nam, có khoảng 8% số cặp vợ chồng không có khả năng sinh con nếu không có sự can thiệp y tế, tỷ lệ gia đình hiếm muộn cũng đang có xu hướng tăng lên [1], [2], [3], [4]. 
Vô sinh, hiếm muộn ở nam có nhiều nguyên nhân, thường gặp nhất là vô tinh hoặc thiểu tinh hay còn gọi chung là suy giảm tinh trùng (SGTT) [3], [4], [5]. Y học hiện đại (YHHĐ) đã đạt được nhiều thành tựu trong điều trị vô sinh do SGTT, nhưng kết quả chưa ổn định và đa số thuốc sử dụng đều có những tác dụng không mong muốn do SGTT thường phải điều trị kéo dài. 
Vấn đề này cũng rất được sự quan tâm của Bộ Quốc Phòng. Theo kết quả tiến hành điều tra, khảo sát tình hình vô sinh, hiếm muộn trong quân đội của Ủy ban Dân số - Gia đình và Trẻ em/Bộ Quốc phòng (UB DS-GĐ-TE/BQP) năm 2012 cho thấy có khoảng 1500 gia đình quân nhân hiếm muộn; toàn lực lượng bộ đội biên phòng có 299 gia đình quân nhân vô sinh, hiếm muộn [6]. Hỗ trợ, giúp đỡ và tìm cách điều trị vô sinh, hiếm muộn là việc làm có ý nghĩa giáo dục về đạo lý, trách nhiệm, tình cảm, mang tính nhân văn sâu sắc của các cơ quan, đơn vị và cán bộ, chiến sĩ Quân đội [7]. 
Trong y học cổ truyền (YHCT) không có bệnh danh SGTT mà qua đối chiếu triệu chứng của SGTT với các y văn cổ thì bệnh SGTT phù hợp phạm trù các bệnh chứng như "bất dục", "hư lao", "vô tinh", "tinh thiểu", "tinh lãnh"... [8], [9]. Từ xa xưa, nền y học cổ truyền phương đông trải qua hàng ngàn năm tích lũy kinh nghiệm cũng đã có những phương pháp điều trị vô sinh, hiếm muộn nam giới đặc thù và mang lại kết quả tốt.
Ngày nay, rất nhiều các công trình nghiên cứu khoa học đã chứng minh các phương pháp điều trị bằng YHCT có tác dụng tốt trong việc điều trị vô sinh nam nói chung và SGTT nói riêng. Đặc biệt nhiều bài thuốc, vị thuốc bổ thận trong YHCT có tác dụng tốt trên trục Hạ đồi - Tuyến Yên - Tinh hoàn góp phần cải thiện số lượng và chất lượng tinh trùng đã được nghiên cứu và công bố.
Ở nước ta, Lộc nhung (Cornu cervi parvum) và Đông trùng hạ thảo nuôi cấy tại Việt Nam (Cordyceps militaris) là 2 loại dược liệu quí, được dân gian sử dụng trong điều trị vô sinh, hiếm muộn và các chứng của suy giảm chức năng sinh dục sinh sản nam, có tiềm năng tốt trong điều trị SGTT [10], [11]. Đặc biệt hai dược liệu này đều đảm bảo được nguồn tự cung cấp tại Việt Nam, nhưng đến nay vẫn chưa có các nghiên cứu khoa học chi tiết về tác dụng của Lộc nhung và Đông trùng hạ thảo và hiệu quả khi kết hợp 2 vị thuốc nói chung lên chức năng sinh dục và sinh sản. Vì vậy nhóm nghiên cứu chúng tôi mong muốn tạo ra một sản phẩm đông dược vừa có tác dụng điều trị vừa dễ bảo quản, tiện dụng và an toàn cho bệnh nhân của chế phẩm từ Lộc nhung và Đông trùng nuôi cấy tại Việt Nam dưới dạng viên nang cứng với tên thương phẩm là Y10.
Xuất phát từ những lý do trên, nhóm nghiên cứu chúng tôi tiến hành đề tài nhằm mục tiêu:
1. 	Đánh giá tính an toàn và tác dụng cải thiện khả năng sinh tinh của viên nang Y10 trên động vật thực nghiệm. 
2. 	Đánh giá tác dụng cải thiện khả năng sinh tinh của viên nang Y10 trên bệnh nhân SGTT.
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình vô sinh, suy giảm tinh trùng ở Việt Nam và trên thế giới
Hiện nay, vấn đề vô sinh đang có tỷ lệ ngày càng tăng cao và phức tạp hơn. Theo các nghiên cứu dịch tễ học của WHO, tỉ lệ các cặp vợ chồng trong cộng đồng bị vô sinh chiếm từ 12 - 18% tùy từng nước, trung bình là 15%, tỉ lệ này có xu hướng ngày càng tăng [1], [2], [3]. Tại nước ta, có khoảng 8% số cặp vợ chồng không có khả năng sinh con nếu không có sự can thiệp y tế, một số ngành nghề đặc thù như quân đội, tỷ lệ gia đình quân nhân hiếm muộn cũng đang có xu hướng tăng lên [4], [6], [7]. 
Theo thống kê, trong số các cặp vợ chồng ở độ tuổi sinh sản, 30% nguyên nhân do nam giới, 40% do nữ, 20% do cả nam và nữ và 10% không rõ nguyên nhân. Trong các nguyên nhân do nam giới, thường gặp nhất là do suy giảm tinh trùng [3], [12]. SGTT là hiện tượng suy giảm số lượng và chất lượng tinh trùng. Theo WHO 2010, số lượng và chất lượng tinh trùng người trên thế giới đang ngày càng có xu hướng giảm mật độ tinh trùng tối thiểu đang giảm từ 40 triệu/ml (1980) xuống 20 triệu/ml (1999), và 15 triệu/ml (2010). Tỉ lệ tinh trùng tiến tới giảm từ 50% (1999) xuống 32% [2], [3].
Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu dịch tễ cụ thể tuy nhiên ở đất nước bên cạnh chúng ta, nghiên cứu dịch tễ của Huang Chun Yan và cs (2010) về chất lượng và số tinh trùng của nam giới Trung Quốc từ năm 1985 đến năm 2008 cho thấy, chất lượng và số lượng tinh trùng của nam giới Trung Quốc có xu hướng giảm rõ rệt, mật độ tinh trùng giảm từ 81,5 triệu/ml (1995) xuống còn 66,7 triệu/ml (2008); tổng số lượng trung bình giảm từ 257,2 triệu/ml (1995) xuống 185,9 triệu/ml (2008) [13].
1.2. Quan điểm của y học hiện đại về Suy giảm tinh trùng
1.2.1. Tinh hoàn và quá trình sinh tinh
Cơ quan sinh dục nam gồm có: Các cơ quan sinh dục trong (tinh hoàn, mào tinh hoàn, ống dẫn tinh, túi tinh, tuyến tiền liệt và tuyến hành niệu đạo) và các cơ quan sinh dục ngoài (dương vật, niệu đạo và bìu). Trong đó tinh hoàn là bộ phận chủ yếu của cơ quan sinh dục nam [14], [15].
1.2.1.1. Tinh hoàn
Tinh hoàn là một tuyến sinh dục nam ở phía ngoài phúc mạc, nằm ở trong bìu. Ở cơ thể nam giới bình thường có hai tinh hoàn. Mỗi tinh hoàn, hình quả trứng, chiều dài từ 3,5- 5,5cm, chiều rộng từ 2,0- 3,0cm tương ứng với thể tích là 12- 15 mm3, trọng lượng trung bình là 20gr. Tinh hoàn là cơ quan đảm nhận chức năng tạo ra tinh trùng và tiết vào trong máu những hormon sinh dục nam [14].
- Chức năng: Tinh hoàn là một tuyến pha vừa có chức năng ngoại tiết sản xuất ra tinh trùng, vừa có chức năng nội tiết sản xuất ra hormon sinh dục nam giới [15], [16], [17].
+ Chức năng sản sinh tinh trùng: 
Tinh trùng sinh ra từ các liên bào ống sinh tinh. Sự sản sinh tinh trùng xảy ra ở tất cả các ống sinh tinh trong suốt đời sống sinh dục của nam giới. Từ khoảng 15 tuổi tinh hoàn bắt đầu sản sinh tinh trùng, chức năng này được duy trì trong suốt cuộc đời, tuy nhiên ở tuổi ngoài 40, chức năng này bị giảm đi. 
+ Chức năng nội tiết của tinh hoàn
Tinh hoàn bài tiết một số hormon sinh dục nam mà thường gọi là androgen. Các hormon này bao gồm testosteron, dihydrotestosteron, và androstenedion trong đó testosteron được coi là quan trọng nhất của tinh hoàn. Ngoài ra tinh hoàn còn bài tiết một hormon khác nữa là inhibin.
Vai trò của Testosteron: Trong thời kỳ bào thai, Testosteron biệt hoá trung khu sinh dục vùng dưới đồi theo hướng nam (Quy định giới tính nguyên phát), phát triển cơ quan sinh dục. Vào tháng thứ 7 - 8 của thai nhi, Testosteron kích thích sự di chuyển của tinh hoàn từ bụng xuống bìu. Đến tuổi dậy thì Testosteron kích thích sự phát triển và hoàn thiện bộ máy sinh dục: Tinh hoàn, dương vật, bìu, tuyến tiền  ... Li E., Wang C.S., (2012). “Ophiocordyceps sinensis, the flagship fungus of China: terminology, life strategy and ecology”. Mycology. 3:2-10.
Đỗ Tuấn Bách, Vũ Hoài Nam, Ma Thị Trang & Hà Văn Hướng, et al. (2017), “Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện nuôi trồng tới khả năng tạo quả thể của nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris” Tạp chí khoa học công nghệ, số 161(01): 113 - 118.
金田,石俊英(2011)。近五年北虫草药理作用研究进展. 食品与药品, 2011, 13(9):358-361
Kim Điền, Thạch Tuấn Anh (2011), “Những tiến bộ về nghiên cứu tác dụng dược lý của Bắc Đông trùng hạ thảo”, Tạp chí Thực phẩm và dược phẩm” số 13(9), tr 358 -361.
张宗豪(2009)。冬虫夏草在抗癌方面的研究进展. 安徽农学 报, 2009, 15(17):33-34
Trương Tông Hào (2009), “Những tiến bộ trong nghiên cứu chống ung thư của Đông trùng hạ thảo”. Báo Khoa học nông nghiệp An Huy -Trung Quốc, 15(17), tr 33-34
靳镭 (2008)。冬虫夏草对抗环磷酰胺致小鼠睾丸氧化损伤的作用.中国妇幼保健 ，2008，13：1858-l859.
Cận Lôi (2008), “Tác dụng của đông trùng hạ thảo đối với mô hình chuột gây tổn thương tinh hoàn bằng Cyclophosphamide”, Tạp chí Sức khỏe bà mẹ trẻ em Trung quốc, số 13 -2018, tr 1858-1859.
Sohn, S. , Lee, S. , Hwang, S. , Kim, S. , Kim, I. , & Ye, M. , et al. (2012). Effect of long-term administration of cordycepin from cordyceps militaris on testicular function in middle-aged rats. Planta medica, 78(15). 
Viện Dược liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ thảo dược, Nhà xuất bản khoa học và Kỹ thuật
Litchfield, J.T. and F. Wilcoxon (1953), The reliability of graphic estimates of relative potency from dose-per cent effect curves, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 108(1): p. 18-25.
Bộ Y Tế (2014), Công văn 19098/QLD-ĐK về việc lưu hành thuốc từ dược liệu có phối hợp mới thành phần dược liệu
Bộ Y tế (2018), “Quy định về thử thuốc trên lâm sàng”, Thông tư số 29/2018/TT-BYT ngày 29 tháng 10 năm 2018 
World Health Organization (2000), Working group on the safety and efficacy of herbal medicine, Report of regional office for the western pacific of the World Health Organization
WHO (2001), General guidelines for methodologies on research and evaluational of tradition medicine, World Health Organization.
OECD (2016), Guidelines for the testing of chemicals (478), Rodent Dominant Lethal Test
OECD (2002). Drug Safety Evaluation I: Acute and subchronic toxicity assessement; USA Academy Press.
Ali Esmail Al Snafi, Ráid M.H. Al Salih and Abbas Muhsin Abbas. Endocrine (2013). Reproductive Effects of Antiepileptic Drugs in Male Rats. Global Journal of Pharmacology 7 (1): 95-98
Bairy L, Paul V, Rao Y (2010). Reproductive toxicity of sodium valproate in male rats. Indian J Pharmacol. Apr;42(2):90-4. doi: 10.4103/0253-7613.64503.
Ebru ALDEMİR1, Fisun AKDENİZ2 (2009). Effects of Valproate on Male Reproductive Functions. Turkish Journal of Psychiatry, 1-8..
Alaaeldin A. Hamza and Amr Amin (2007). Apium graveolens modulate Sodium Valproate - Induced Reproductive Toxicity in rats. Journal of experimental zoology 307A:199-206. 
郑筱萸 (2002), 中药新药临床研究指导原则(试行);中国医药科技出版社
Trịnh Tiểu Du (2002), Hướng dẫn nghiên cứu thuốc trung dược tân dược trên lâm sàng (thí hành); Nhà xuất bản Y Dược Khoa học
United Nations (2011). Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), 4th edition. 
Shayne C.Gad (2002). Chapter 5: Acute toxicity testing in Drug safety evaluation. Drug Safety Evaluation, 2nd edition, John Wiley and Sons, Inc., New York, 130-175. 
David Arome, Enegide Chinedu (2014). The importance of toxicity testing. J.Pharm.BioSci, 4, 146-148. 
Đỗ Trung Đàm (1996). Phương pháp xác định độc tính của thuốc, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
Nguyễn Quang Tuấn (2014). Thực hành đọc điện tim, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
Vũ Đình Vinh (2001), Hướng dẫn sử dụng các xét nghiệm sinh hoá, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
Nguyễn Đạt Anh, Nguyễn Thị Hương (2013). Các xét nghiệm thường quy áp dụng trong lâm sàng, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
Đại học Y Hà Nội (2006). Bài giảng Huyết học-Truyền máu (sau đại học), Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
Phạm Thị Minh Đức (2011). Sinh lý học (sách đào tạo bác sĩ đa khoa), Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
 Đại học Y Hà Nội (2013). Hóa sinh lâm sàng, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
National Research Council (1996). Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academic Press. 
The Jackson Laboratory (2007). Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice, A Jackson Laboratory Resource Manual. ko.cwru.edu/info/breeding_strategies_manual.pdf.
Nguyễn Xuân Viết (2009). Giáo trình tiến hóa, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.
Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies. Birth Defects Research. Part B, 80 (2), 84-97. 
Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. 
Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. and Reynolds V.L..(1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights. Reproductive Toxicology, 13: 383-390.
Nguyễn Văn Thanh (2006). Sinh học phân tử, Nhà xuất bản y học.
Trịnh Thanh Bảo (2008). Di truyền y học, Nhà xuất bản y học.
Abel MH, Wootton AN, Wilkins V, Huhtaniemi I, Knight PG, Charlton HM (2000). The effect of a null mutation in the follicle-stimulating hormone receptor gene on mouse reproduction. Endocrinology;141:1795-1803.
Baker PJ, Pakarinen P, Huhtaniemi IT, Abel MH, Charlton HM, Kumar TR, O’Shaughnessy PJ (2003). Failure of normal Leydig cell development in follicle-stimulating hormone (FSH) receptor deficient mice, but not FSH beta-deficient mice role for constitutive FSH receptor activity. Endocrinology ;144:138-145.
O'Bryan MK, de Kretser D (2006). Mouse models for genes involved in impaired spermatogenesis. Int J Androl;29:76-89; discussion 105-8.
J.H., P. (2009). Effects of heat stress on mamalian reproduction. Phil. Trans. R. Soc. B,364, 3341-3350.
Hou Y, Wang X, Lei Z et al. (2015). Heat-stress-induced metabolic changes and altered male reproductive function. Journal of Proteome Research,14(3), 1495-1503. 
A Walaa H Khalifa, Gamal A El-Sisy, Walid S El-Nattat, AAAMourad, Nagwa Maghraby (2018). Effect of water extract of dates palm(Phoenix dactylifera) on semen characteristics and oxidative status in serumof male New Zealand rabbits under heat stress. Asian Pacific Journal of Reproduction, 7(1), pp. 22-26.
Almeida S.A., Petenusei S.O., Anselmo-Franci J.A., et al. (1998). Decreased spermatogenic and androgenic testicular functions in adult rats submitted to immobilization induced stress from puberty. Braz J Med Biol Res., 31:1443-1448.
Almeida S.A., Petenusei S.O, Franci J.A., et al. (2000). Chronic immobilization induced stress decreases plasma testosterone and delay testicular maturation in pubertal rats. Andrologia., 32:7-11.
Kirby, E. D., Geraghty, A. C., Ubuka, T., Bentley, G. E. & Kaufer, D (2009). Stress increases putative gonadotropin inhibitory hormone and decreases luteinising hormone in male rats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 11324-11329. 
Dobrzyńska M.M. (2003). The changes in the quantity and quality of semen following subchronic exposure of mice to irradiation, In: Cebulska-Wasilewska A., Au W.W., Sram R.J., (Eds.), Human Monitoring for Genetic Effects, IOS Press, Amsterdam.
Hasegawa G., Wilson L.D., Russell L.D., Meistrich M.L. (1997), Radiation-induced cell death in the mouse testis: Relationship to apoptosis, Radiat. Res, 147, 457-467.
Lee, W., Son, Y., Jang, H., Bae, M. J., Kim, J., & Kang, D., et al. (2015). Protective effect of administered rolipram against radiation-induced testicular injury in mice. World Journal of Mens Health, 33(1), 20-29.
Azza H. El-Medany and Hanan H. Hagar (2002), Effect of fluconazole on the fertility of male rabbits, Arzneim.-Forsch. Drug Res. 52(8), pp. 636-640.
Warren G. FosterI, Serena Maharaj-BriceñoI, Daniel G. Cyr (2011). Dioxin-induced changes in epididymal sperm count and spermatogenesis. Ciência & Saúde Coletiva, 16(6):2893-2905. 
G.G. Akunna, E.N. Obikili, G.E. Anyawu and E.A. Esom (2017). Evidences for Spermatozoa Toxicity and Oxidative Damage of Cadmium Exposure in Rats. Journal of Pharmacology and Toxicology, 12: 50-56. DOI: 10.3923/jpt.2017.50.56.
Francisco Marco-Jiménez, José Salvador Vicente (2017), Overweight in young males reduce fertility in rabbit model, PLoS ONE, 12(7): e0180679. 
Yong Fan, Yue Liu, Ke Xue, Guobao Gu, Weimin Fan, Yali Xu, and Zhide Ding (2015). Diet-Induced Obesity in Male C57BL/6 Mice Decreases Fertility as a Consequence of Disrupted Blood-Testis Barrier. PLoS One; 10(4): e0120775. doi: 10.1371/journal.pone.0120775
Liu Y, Zhao W, Gu G, Lu L, Feng J, Guo Q, et al (2014). Palmitoyl-protein thioesterase 1 (ppt1): an obesity-induced rat testicular marker of reduced fertility. Molecular Reproduction & Development, 81(1), 55-65. 
P. Syntin, B. Robaire (2001). Sperm structural and motility changes during aging in the Brown Norway rat. Journal of Andrology, 22 (2) (2001), pp. 235-244, 10.1002/j.1939-4640.2001.tb02176.x11229797.
C.P. Weir, B. Robaire (2007). Spermatozoa have decreased antioxidant enzymatic capacity and increased reactive oxygen species production during aging in the Brown Norway rat. Journal of Andrology, 28 (2), pp. 229-240, 10.2164/jandrol.106.001362.
Burak Ozkosem, Sheldon I. Feinstein, Aron B.Fisher, CristianO’ Flaherty (2015). Advancing age increases sperm chromatin damage and impairs fertility in peroxiredoxin 6 null mice. https://doi.org/10.1016/j.redox.2015.02.004
Cooke HJ, Saunders PT (2002). Mouse models of male infertility. Nat Rev Genet.;3:790-801.
National Insitute for Health and Care Exellent (2012). “The epilepsies: the diagnosis and management of the epilepsies in adults and children in primary and secondary care: pharmacological update of clinical guideline 20.”,137, 23-40.
Xiao-Jian, Z., Li-Hua, M., & Xiao-Jie, L. I.. (2009). Study of the relationship between 1091 infertile men semen with ages. Sichuan Medical Journal
李海松, 卫元璋, 刘福鼎, 王旭昀, 杨杰, & 商建伟. (2010). 500例男性不育症中医证型分布研究. 中华中医药学会男科学术大会.
Lý Hải Tùng, Vệ Nguyên Chương, Lưu Phúc Đỉnh, Vương Húc Quân, Dương Kiệt và Thương Kiện Vĩ (2010). Nghiên cứu phân thể lâm sàng theo y học cổ truyền của 500 nam giới vô sinh. Hội thảo học thuật Nam học Trung y dược Trung Quốc
曹亮, 马静, 杨倩倩, 张莎, 刘阿庆, & 贾承明, et al. (2016). 补肾法治疗少弱精症的系统评价. 中医药导报(23), 81-88.
Tào Lượng, Mã Tĩnh, Dương Thiến Thiến, Trương Sa, Lưu A Khánh, Cổ Thừa Minh và cộng sự (2016). Đánh giá có hệ thống pháp bổ thận trong điều trị thiểu nhược tinh chứng. Tạp chí hướng dẫn y học Trung Quốc, số 23, tr 81-88. 
World Health Organization (1987), WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-cervical Mucus Interaction, 1987 2nd edn. Cambridge Cambridge University Press pg. 80 p.
World Health Organization (1992), WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-cervical Mucus Interaction, 1992 3rd edn. Cambridge Cambridge University Press pg. 107 p
World Health Organization (1999), WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-cervical Mucus Interaction, 1999 4th edn. Cambridge Cambridge University Press pg. 128 p.
Trevor G. Cooper, Elizabeth Noonan, Sigrid von Eckardstein, Jacques Auger, H. W. Gordon Baker, Hermann M. Behre, Trine B. Haugen, Thinus Kruger, Christina Wang, Michael T. Mbizvo, and Kirsten M. Vogelsong (2010), “World Health Organization reference values for human semen characteristics”, Human Reproduction, 16(3), pp. 231-45.
Esteves SC, Zini A, Aziz N, Alvarez JG, Sabanegh ES Jr., Agarwal A (2012). Critical appraisal of World Health Organization’s new reference values for human semen characteristics and effect on diagnosis and treatment of subfertile men. Urology;79(1):16-22.
Yerram N, Sandlow JI, Brannigan RE (2012). Clinical implications of the new 2010 WHO reference ranges for human semen characteristics. J Androl; 33(3):289-90.
Agarwal A, Virk G, Ong C, du Plessis SS (2014). Effect of oxidative stress on male reproduction. World J Mens Health.;32(1):1-17. doi: 10.5534/wjmh.2014.32.1.1.
Hampl R, Drábková P, Kanďár R, Stěpán J (2012). Impact of oxidative stress on male infertility. Ceska Gynekol;77:241-245. 
Gharagozloo P, Aitken RJ (2011). The role of sperm oxidative stress in male infertility and the significance of oral antioxidant therapy. Hum Reprod;26:1628-1640.
Lombardo F, Sansone A, Romanelli F, Paoli D, Gandini L, Lenzi A (2011). The role of antioxidant therapy in the treatment of male infertility: an overview. Asian J Androl;13:690-697.
Vickram Sundaram, Muthugadhalli Srinivas, Jayaraman Gurunathan, Kamini Rao, Ramesh Pathy Maniyan, Sridharan Balasundaram (2012). Influence of trace elements and their correlation with semen quality in fertile and infertile subjects. Turk J Med Sci 43: 1000-1007. doi:10.3906/sag-1211-54.
Wong WY, Flik G, Groenen PM, Swinkels DW, Thomas CM, Copius-Peereboom JH (2001). The impact of calcium, magnesium, zinc, and copper in blood and seminal plasma on semen parameters in men. Reprod Toxicol; 15: 131-136.
Colagar AH, Marzony ET, Chaichi MJ. Zinc (2009). Levels in seminal plasma are associated with sperm quality in fertile and infertile men. Nutr Res, 29: 82-88.
Yan-Bin, W., Mo, S., Qin, L., & Chao, M. A.. (2013). Clinical research of 272 cases of male infertility in xinjiang region. Chinese Journal of Basic Medicine in Traditional Chinese Medicine,19(1). p 60-65.
PHẦN PHỤ LỤC
Phụ lục 1. 	Các phiếu trả kết quả xét nghiệm viên nang Y10 trên thực nghiệm
Phụ lục 2. 	Quy trình bào chế viên nang Y10 
Phụ lục 3. 	Tiêu chuẩn cơ sở Đông trùng hạ thảo nuôi cấy 
Phụ lục 4. 	Tiêu chuẩn cơ sở Lộc nhung
Phụ lục 5. 	Tiêu chuẩn cơ sở viên nang Lộc nhung Đông trùng hạ thảo Y10 
Phụ lục 6. 	Hồ sơ đạo đức nghiên cứu
Biên bản Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học của đề tài
Chứng chỉ học thực hành tốt thử nghiệm lâm sàng
Phụ lục 7. Phiếu chấp thuận tình nguyện tham gia nghiên cứu 
Phụ lục 8. 	 Bệnh án nghiên cứu
Phụ lục 9. 	Danh sách bệnh nhân tình nguyện tham gia nghiên cứu
Mã số .
PHIẾU CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU TÌNH NGUYỆN
(Áp dụng cho đối tượng tình nguyện tham gia nghiên cứu không cần bí mật danh tính) 
Họ và tên: 
Mã số Nc: ......
Tuổi:
Đơn vị:
 Sau khi được Bác sỹ thông báo về mục đích, quyền lợi, nghĩa vụ, những nguy cơ tiềm tàng và lợi ich của đối tượng tham gia vào nghiên cứu: “Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng cải thiện khả năng sinh tinh của viên nang Y10”
 Tôi (hoặc người đại diện trong gia đình) đồng ý tự nguyện tham gia vào trong nghiên cứu này (đồng ý lấy máu, nước tiểu, tinh dịch đồđể xét nghiệm). Tôi xin tuân thủ các quy định của nghiên cứu.
 Tôi đồng ý tham gia trong nghiên cứu này.
Ký tên, viết tên của người tham gia
Ngày/tháng/năm
Ký tên, viết tên của người làm chứng
Ngày/tháng/ năm
.