Luận án Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn bacillus sp. đối kháng với vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ 
LÊ THẾ XUÂN 
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp. 
ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus 
TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ 
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 
MÃ SỐ: 62620301 
NĂM 2020 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ 
LÊ THẾ XUÂN 
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp. 
ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus 
TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ 
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 
MÃ SỐ: 62620301 
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 
PGS.TS. VŨ NGỌC ÚT 
TS. PHẠM ANH TUẤN 
NĂM 2020
i 
ii 
TÓM TẮT 
Được ghi nhận lần đầu tiên tại Trung Quốc năm 2009, bệnh Hoại tử gan 
tụy cấp ở tôm (AHPND) đã lan rộng ra nhiều quốc gia nuôi tôm trên thế giới, 
trong đó có Việt Nam và trở thành mối nguy hại hàng đầu đối với nuôi tôm 
công nghiệp tại các quốc gia này. Tác nhân gây AHPND là một số chủng 
Vibrio parahaemolyticus mang plasmid mã hóa cho độc tố nhị thể PirA/PirB 
gây hoại tử gan tụy cấp. Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm phân lập, ứng 
dụng các chủng vi khuẩn Bacillus sp. có tính đối kháng mạnh với V. 
parahaemolyticus để phòng chống AHPND trong nuôi tôm công nghiệp. Để 
đạt được mục tiêu nghiên cứu kể trên, từ các ao tôm công nghiệp không mắc 
bệnh và nghi mắc AHPND tại ba tỉnh Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau, 149 
chủng vi khuẩn nghi là Bacillus sp. và 51 chủng vi khuẩn Vibrio sp. đã được 
phân lập từ tuyến tiêu hóa tôm, bùn và nước. Bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR 
phát hiện các gen toxR, tdh, trh, pirA và pirB và các quan sát mô bệnh học khi 
cảm nhiễm trên tôm, 12 chủng V. parahaemolyticus đã được xác định, trong 
đó chủng BĐB1.4v, dương tính với cả hai gen pirA và pirB, chính là tác nhân 
gây AHPND. Bên cạnh đó, phương pháp phân loại MLST (Multilocus 
Sequence Typing) đã được sử dụng để phân loại một tập hợp gồm 26 chủng 
Bacillus sp. Kết quả phân tích cho thấy có bốn loài Bacillus chính là B. subtilis 
(11 chủng), B. velezensis (8 chủng), B. siamensis (5 chủng) và B. licheniformis 
(2 chủng). Tiếp đó, phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch đã được sử dụng để 
phân lập hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 có hoạt tính 
đối kháng cao với V. parahaemolyticus bao gồm cả chủng BĐB1.4v gây 
AHPND. Ngoài khả năng tiết enzyme protease, amylase và cellulase mạnh, 
hai chủng này còn có thể thích ứng với các điều kiện rất rộng về nhiệt độ, pH 
và độ mặn. Mật độ ức chế tối thiểu của hai chủng Bacillus này đối với chủng 
V. parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND là 106 cfu/mL. Khi thử nghiệm 
trên mô hình nuôi tôm thẻ chân trắng ở quy mô 100 lít, chủng B. subtilis 
BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 giúp phòng chống hiệu quả AHPND với tỷ 
lệ sống của tôm sau 36 giờ cảm nhiễm V. parahaemolyticus BĐB1.4v lần lượt 
là 85,56% và 76,67%. Ở quy mô 1000 lít trong khoảng thời gian theo dõi đến 
35 ngày sau cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh, chủng B. subtilis BRB2.1 
không những cho phép bảo vệ tôm khỏi AHPND mà còn cải thiện tỷ lệ sống 
và hiệu quả sử dụng thức ăn so với mẫu đối chứng không cảm nhiễm. Khả 
năng đối kháng của chủng B. subtilis BRB2.1 rất có thể liên quan đến sự có 
mặt của gen mã hóa subtilosin A, vốn là một loại bacteriocin phổ rộng. Do 
tính an toàn của B. subtilis đã được công nhận nên chủng B. subtilis BRB2.1 
có thể được ứng dụng trực tiếp để sản xuất các chế phẩm sinh học phòng 
chống AHPND trong nuôi tôm nước lợ. 
iii 
ABSTRACT 
Since its emergence in China in 2009, acute hepatopancreatic necrosis 
disease (AHPND) has been causing massive losses in aquaculture. To date, the 
disease has been recognized as the biggest threat to the shrimp farming 
industry in many countries (including Vietnam). The causative agent of 
AHPND has been identified as Vibrio parahaemolyticus strains that harbor a 
large plasmid encoding binary toxins PirA/PirB. The aim of this study was to 
isolate and apply Bacillus isolates that are strongly antagonistic against V. 
parahaemolyticus to prevent AHPND in cultured shrimps. To this end, we 
have isolated 149 presumptive Bacillus sp. isolates and 51 Vibrio sp. isolates 
from shrimp digestive tract, sediment and water samples from commercial 
shrimp ponds in Bac Lieu, Soc Trang and Ca Mau provinces. By detecting 
toxin genes (toxR, tdh, trh, pirA và pirB) with PCR and performing 
histological observation, we have identified 12 V. parahaemolyticus isolates, 
among which, BĐB1.4v strain, positive for both pirA and pirB, was shown to 
be the direct cause of AHPND. Furthermore, Multi-locus Sequence Typing 
(MLST) was used to describe the genetic diversity of a collection of 26 
Bacillus isolates. The results showed 4 major clusters, corresponding to 4 
Bacillus species, namely B. subtilis (11 isolates), B. velezensis (8 isolates), B. 
siamensis (5 isolates) và B. licheniformis (2 isolates). Additionally, agar 
diffusion method was used to reveal the strong antagonistic activity of B. 
subtilis BRB2.1 and B. siamensis BĐK2.3 to V. parahaemolyticus (including 
strain BĐB1.4v causing AHPND). These two Bacillus isolates could not only 
secrete high level of protease, amylase, and cellulase, but also adapt to a vast 
range of temperature, pH and salinity. Results showed that when inoculated at 
106 cfu/mL or higher, these two isolates could inhibit the growth of V. 
parahaemolyticus BĐB1.4v. When tested on Litopenaeus vannamei cultured 
in tanks of 100L, B. subtilis BRB2.1 and B. siamensis BĐK2.3 strains were 
proved to be effective against AHPND (shrimps’ survival rates were 85,56% 
and 76,67% when being cultured with the two isolates). In larger model 
(1000L), B. subtilis BRB2.1 strain not only protected shrimps from AHPND 
but also improved their food conversion rate. The antagonistic activity to V. 
parahaemolyticus of this strain may be explained by the presence of the gene 
encoding for subtilosin A, which is a wide-spectrum bacteriocin. Since B. 
subtilis is considered as GRAS, B. subtilis BRB2.1 could be used directly to 
produce probiotics that prevent AHPND in shrimp farming. 
iv 
v 
MỤC LỤC 
Trang 
LỜI CẢM TẠ ......................................................................................................................... i 
TÓM TẮT.............................................................................................................................. ii 
ABSTRACT ......................................................................................................................... iii 
CAM KẾT KẾT QUẢ ......................................................... Error! Bookmark not defined. 
MỤC LỤC ............................................................................................................................. v 
DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................................... x 
DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................................... xi 
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................... xiii 
Chương 1: GIỚI THIỆU ..................................................................................................... 1 
1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................................................... 1 
1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu ..................................................................................... 2 
1.2.1 Mục tiêu tổng quát .................................................................................... 2 
1.2.2 Mục tiêu cụ thể .......................................................................................... 2 
1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................................ 2 
1.4 Ý nghĩa nghiên cứu .......................................................................................................... 3 
1.5 Tính mới của luận án: ...................................................................................................... 3 
1.6 Thời gian thực hiện .......................................................................................................... 3 
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 4 
2.1 Khái quát về hiện trạng nuôi tôm sú và tôm thẻ chân trắng (tôm nước lợ) ......... 4 
2.1.1 Tình hình nuôi tôm nước lợ trên thế giới .................................................. 4 
2.1.2 Tình hình nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam ................................................... 5 
2.2 Tình hình dịch AHPND ở tôm nuôi trên thế giới và Việt Nam ............................. 6 
2.3 Tác nhân gây AHPND trên tôm nuôi ......................................................................... 7 
2.4 Chẩn đoán AHPND và các biện pháp phòng, trị bệnh trên tôm nuôi .................. 8 
2.4.1 Chẩn đoán AHPND ................................................................................... 8 
2.4.2 Phòng chống AHPND ở tôm nuôi ............................................................. 9 
2.5 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ........................................................................... 12 
2.5.1 Đặc tính chủng V. parahaemolyticus ...................................................... 12 
2.5.2 Các độc tố của V. parahaemolyticus ....................................................... 14 
2.5.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển của V. 
parahaemolyticus ............................................................................................. 18 
2.5.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................... 18 
2.5.3.2 Ảnh hưởng của pH ............................................................................ 18 
2.5.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn ..................................................................... 18 
2.6 Khái quát chung về Bacillus subtilis. ......................................................................... 19 
2.6.1 Sơ lược về B. subtilis ............................................................................... 19 
2.6.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của B. subtilis . 20 
2.6.3 Phân loại Bacillus theo phương pháp truyền thống ................................. 22 
2.6.4 Phân loại Bacillus theo các phương pháp phân tử ................................... 22 
2.6.5 Ứng dụng của B. subtilis trong công nghiệp và nuôi trồng thủy sản ....... 26 
2.7 Bacteriocin ..................................................................................................................... 29 
2.7.1 Khái niệm ................................................................................................ 29 
2.7.2 Phân loại Bacteriocin .............................................................................. 31 
2.7.3 Ứng dụng của bacteriocin từ Bacillus trong thủy sản ............................. 31 
vi 
2.7.4 Subtilosin A ............................................................................................. 33 
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 35 
3.1 Địa điểm nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu ........................................................ 35 
3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 35 
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu .............................................................................. 36 
3.2.2 Phương pháp phân lập Vibrio sp. và xác định V. parahaemolyticus từ ao 
nuôi tôm ........................................................................................................... 37 
3.2.3 Phương pháp phát hiện gen độc tố ở các chủng Vibrio sp. phân lập được
.......................................................................................................................... 37 
3.2.3.1 pirA .................................................................................................... 39 
3.2.3.2 pirB .................................................................................................... 39 
3.2.3.3 toxR ................................................................................................... 39 
3.2.3.4 tdh ...................................................................................................... 40 
3.2.3.5 trh ...................................................................................................... 40 
3.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (nhiệt độ, 
pH, độ mặn) đến sự phát triển của V. parahaemolyticus .................................. 40 
3.2.5 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus trong ao nuôi tôm 
công nghiệp ...................................................................................................... 41 
3.2.5.1 Phương pháp lấy mẫu........................................................................ 41 
3.2.5.2 Phương pháp phân lập Bacillus từ ao nuôi tôm ................................ 41 
3.2.6 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp....................... 42 
3.2.6.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính đối 
kháng V. parahaemolyticus ........................................................................... 42 
3.2.6.2 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính 
protease cao ................................................................................................... 42 
3.2.6.3 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính 
amylase cao ................................................................................................... 42 
3.2.6.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính 
cellulase cao .................................................................................................. 43 
3.2.7. Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA hệ gen của Bacillus ............ 43 
3.2.8 Phương pháp phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng 
Bacillus BRB2.1 ............................................................................................... 43 
3.2.8.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1
 .................................................................................................. ... ẳng Răng cưa Không Khôn
g 
0.3 
8 SNK5.3 Trắng 
đục 
Dị hình, có núm 
lồi xung quanh 
Lồi Dị hình Không Có 3.0 
9 SNK6.1 Trắng 
hơi 
trong 
Dị hình, có núm 
lồi xung quanh 
Lồi Không 
đều 
Không Có 3.0 
10 SNK6.2 Trắng 
đục 
Dị hình, bề mặt 
khô 
Phẳng Răng cưa Không Khôn
g 
3.0 
 160 
12 SĐB5.1 Trắng 
Tròn 
không đều 
Mô Răng cưa Có 2 
13 SĐB6.1 Trắng Dị hình Nổi Chia thùy Có 5 
14 SĐB6.2 Trắng 
Tròn 
không đều 
Mô Nguyên Không 3 
15 SĐB6.3 Trắng ngà Dị hình lài Răng cưa Có 4 
Bảng C.15: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong 
ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) 
STT 
Kí hiệu 
mẫu 
Màu sắc 
khuẩn lạc 
Hình 
dạng 
Độ 
nổi 
Dạng 
bìa 
Nhớt 
Kích 
thước 
(mm) 
1 SRK1.1 Trắng đục Hơi Tròn Phẳng 
Răng 
cưa 
Không 2-3 
2 SRK1.2 Vàng nhạt Hình tròn Phẳng Nguyên Không 4-5 
3 SRK1.3 Vàng Hơi tròn Phẳng 
Răng 
cưa 
Không 3-4 
4 SRK1.4 Trắng đục Hình tròn Lài Nguyên Không 2-3 
5 SRK2.1 Trắng đục Hơi tròn Phẳng 
Răng 
cưa 
Không 2-3 
6 SRK2.2 Vàng nhạt Hình tròn Phẳng Nguyên Không 4 
7 SRK2.3 Vàng nhạt Hơi tròn Phẳng 
Răng 
cưa 
Không 4 
8 SRK3.1 Trắng đục Dị hình Lài 
Chia 
thùy 
Không 3 
9 SRK3.2 Vàng nhạt Hình tròn Lài Nguyên Không 4-5 
10 SRK3.3 Trắng đục Hơi tròn Lài 
Lượn 
sóng 
Không 4-5 
11 SRK3.4 
Trắng 
trong 
Hình 
trứng vỡ 
Mô 
Lượn 
sóng 
Không 5-7 
12 SRK3.5 Vàng nhạt Hình tròn Phẳng 
Lượn 
sóng 
Không 4-5 
 161 
PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ ĐỊNH TÊN CỦA 30 CHỦNG NGHI LÀ 
BACILLUS BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RDNA 
Chủng Loài xác định được Độ tương đồng 
Kí hiệu 
GenBank 
BRB 2.1 B. subtilis NR_112686.1 100.0% 
B. mojavensis NR_118290.1 99.9% 
B. tequilensis NR_104919.1 99.9% 
B. halotolerans NR_115063.1 99.9% 
BRB 2.2 B. velezensis NR_075005.2 99.9% 
B. amyloliquefaciens NR_117946.1 99.8% 
B. subtilis NR_102783.2 99.7% 
B. vallismortis NR_024696.1 99.6% 
BRB 6.3 B. licheniformis NR_118996.1 99.8% 
B. haynesii NR_157609.1 99.6% 
B. sonorensis NR_113993.1 99.4% 
B. aerius NR_042338.1 99.2% 
BDB 1.1 B. amyloliquefaciens NR_117946.1 99.9% 
B. velezensis NR_116240.1 99.9% 
B. subtilis NR_102783.2 99.7% 
B. siamensis NR_117274.1 99.7% 
BDB 1.2 B. subtilis NR_104873.1 100.0% 
B. tequilensis NR_104919.1 99.9% 
B. mojavensis NR_118290.1 99.9% 
B. halotolerans NR_115063.1 99.9% 
BDB 11.1 B. velezensis NR_075005.2 99.9% 
B. amyloliquefaciens NR_117946.1 99.8% 
B. subtilis NR_102783.2 99.7% 
B. vallismortis NR_024696.1 99.6% 
BDB 3.1 B. subtilis NR_102783.2 99.9% 
B. tequilensis NR_104919.1 99.9% 
B. mojavensis NR_112725.1 99.7% 
B. halotolerans NR_115063.1 99.7% 
BDB 3.2 B. subtilis NR_113265.1 100.0% 
B. tequilensis NR_104919.1 99.9% 
B. mojavensis NR_118290.1 99.8% 
B. halotolerans NR_115063.1 99.8% 
 162 
BDB 3.4 B. subtilis NR_104873.1 100.0% 
B. mojavensis NR_112725.1 99.9% 
B. halotolerans NR_115063.1 99.9% 
B. nakamurai NR_151897.1 99.8% 
BDB 3.5 B. amyloliquefaciens NR_117946.1 99.8% 
B. velezensis NR_116240.1 99.7% 
B. subtilis NR_117274.1 99.7% 
B. siamensis NR_102783.2 99.6% 
BDB 6.1 B. licheniformis NR_118996.1 99.9% 
B. haynesii NR_157609.1 99.7% 
B. sonorensis NR_113993.1 99.6% 
B. aerius NR_042338.1 99.4% 
BNB 1.1 B. velezensis NR_075005.2 99.9% 
B. amyloliquefaciens NR_117946.1 99.8% 
B. subtilis NR_102783.2 99.7% 
B. vallismortis NR_024696.1 99.6% 
BNB 1.2 B. velezensis NR_075005.2 99.9% 
B. amyloliquefaciens NR_117946.1 99.8% 
B. subtilis NR_102783.2 99.7% 
B. vallismortis NR_024696.1 99.6% 
BNB 5.2 B. velezensis NR_075005.2 99.9% 
B. amyloliquefaciens NR_117946.1 99.8% 
B. subtilis NR_102783.2 99.7% 
B. vallismortis NR_024696.1 99.6% 
BNB 9.3 B. subtilis NR_112686.1 99.9% 
B. halotolerans NR_115063.1 99.9% 
B. mojavensis NR_118290.1 99.9% 
B. tequilensis NR_104919.1 99.9% 
BRK 1.1 B. subtilis NR_113265.1 100.0% 
B. tequilensis NR_104919.1 99.9% 
B. vallismortis NR_113994.1 99.7% 
B. mojavensis NR_112725.1 99.7% 
BRK 4.4 B. subtilis NR_113265.1 100.0% 
B. tequilensis NR_104919.1 99.9% 
B. mojavensis NR_112725.1 99.8% 
 163 
B. halotolerans NR_115063.1 99.8% 
BRK 5.4 B. velezensis NR_075005.2 99.9% 
B. amyloliquefaciens NR_117946.1 99.8% 
B. subtilis NR_102783.2 99.7% 
B. vallismortis NR_024696.1 99.6% 
BRK 6.1 B. subtilis NR_113265.1 100.0% 
B. tequilensis NR_104919.1 99.9% 
B. mojavensis NR_112725.1 99.8% 
B. halotolerans NR_115063.1 99.8% 
BRK 7.3 B. subtilis NR_113265.1 100.0% 
B. tequilensis NR_104919.1 99.9% 
B. mojavensis NR_112725.1 99.8% 
B. halotolerans NR_115063.1 99.8% 
BDK 2.3 B. velezensis NR_075005.2 99.9% 
B. amyloliquefaciens NR_117946.1 99.9% 
B. subtilis NR_102783.2 99.8% 
B. vallismortis NR_024696.1 99.7% 
BDK 9.2 B. subtilis NR_113265.1 100.0% 
B. tequilensis NR_104919.1 99.9% 
B. mojavensis NR_118290.1 99.8% 
B. halotolerans NR_115063.1 99.8% 
BNK 2.2 B. velezensis NR_075005.2 99.8% 
B. amyloliquefaciens NR_117946.1 99.7% 
B. subtilis NR_102783.2 99.6% 
B. nakamurai NR_151897.1 99.5% 
BNK 2.3 B. amyloliquefaciens NR_117946.1 99.8% 
B. velezensis NR_116240.1 99.7% 
B. siamensis NR_117274.1 99.7% 
B. subtilis NR_102783.2 99.6% 
BNK 7.1 B. velezensis NR_116240.1 99.9% 
B. amyloliquefaciens NR_117946.1 99.9% 
B. subtilis NR_102783.2 99.8% 
B. vallismortis NR_024696.1 99.7% 
BNK 8.1 B. amyloliquefaciens NR_117946.1 99.9% 
B. velezensis NR_116240.1 99.9% 
 164 
B. subtilis NR_102783.2 99.7% 
B. siamensis NR_117274.1 99.7% 
 PHỤ LỤC E: KẾT QUẢ THỐNG KÊ 
E1: Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn 
Vibrio 
Bảng E1.1: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn 
Vibrio sau 24 h 
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 
Between groups 243.206 5 48.6412 2084.13 0.0000 
Within groups 0.280067 12 0.0233389 
Total (Corr.) 243.486 17 
Bảng E1.2: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn 
Vibrio sau 24 h 
Nhiet do Count Mean Homogeneous Groups 
10 3 1.17 X 
20 3 8.23 X 
26 3 8.21 X 
30 3 8.55333 X 
37 3 8.39 XX 
45 3 0 X 
Bảng E1.3: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn 
Vibrio sau 48 h 
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 
Between groups 247.43 5 49.4859 1877.63 0.0000 
Within groups 0.316267 12 0.0263556 
Total (Corr.) 247.746 17 
Bảng E1.4: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn 
Vibrio sau 48 h 
Nhiet do Count Mean Homogeneous Groups 
10 3 1.30667 X 
20 3 8.42667 X 
26 3 8.43333 X 
 165 
30 3 8.46 X 
37 3 8.58667 X 
45 3 0 X 
Bảng E1.5: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn 
Vibrio sau 24 h 
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 
Between groups 131.741 4 32.9353 371.79 0.0000 
Within groups 0.885867 10 0.0885867 
Total (Corr.) 132.627 14 
Bảng E1.6: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Vibrio 
sau 24 h 
pH Count Mean Homogeneous Groups 
5 3 0 X 
6 3 7.32 X 
7 3 7.60667 X 
7.5 3 7.37 X 
8 3 7.32 X 
Bảng E1.7: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn 
Vibrio sau 48 h 
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 
Between groups 157.273 4 39.3183 760.71 0.0000 
Within groups 0.516867 10 0.0516867 
Total (Corr.) 157.79 14 
Bảng E1.8: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Vibrio 
sau 48 h 
pH Count Mean Homogeneous Groups 
5 3 0 X 
6 3 7.52667 X 
7 3 8.12 XX 
7.5 3 8.18 XX 
8 3 8.42 XX 
Bảng E1.9: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn 
Vibrio sau 24 h 
 166 
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 
Between groups 274.324 5 54.8649 1968.05 0.0000 
Within groups 0.334533 12 0.0278778 
Total (Corr.) 274.659 17 
Bảng E1.10: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn 
Vibrio sau 24 h 
NaCl Count Mean Homogeneous Groups 
0 3 0 X 
5 3 0 X 
10 3 0.3 X 
20 3 7.46333 X 
30 3 8.11 X 
40 3 8.10667 X 
Bảng E1.11: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi 
khuẩn Vibrio sau 48 h 
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 
Between groups 301.481 5 60.2961 1243.50 0.0000 
Within groups 0.581867 12 0.0484889 
Total (Corr.) 302.063 17 
Bảng E1.12: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn 
Vibrio sau 48 h 
NaCl Count Mean Homogeneous Groups 
0 3 0 X 
5 3 0 X 
10 3 0.566667 X 
20 3 8.39333 X 
30 3 8.44667 X 
40 3 8.25333 X 
E2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính đối kháng với 
Vibrio sp. 
Bảng E2.1: Phân tích ANOVA về khả năng đối kháng của Bacillus sp. với 
Vibrio sp. 
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 
Between groups 590.667 29 20.3678 32.73 0.0000 
 167 
Within groups 37.3333 60 0.622222 
Total (Corr.) 628.0 89 
Bảng E2.2: Kiểm định LSD về khả năng đối kháng của Bacillus sp. với Vibrio 
sp. 
Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups 
BNB11.1-BDB1.4v 3 4.33333 X 
BNB11.1-CNB6v 3 4.33333 X 
BNB11.1-BDB1.3v 3 5.0 XXX 
BNB11.1-BNB3.1v 3 7.33333 XXX 
BNB11.1-BDB1.1v 3 8.33333 XX 
BNK6.1-BDB1.3v 3 4.66667 XX 
BNK6.1-BDB1.4v 3 5.0 XXX 
BNK6.1-CNB6v 3 5.66667 XXX 
BNK6.1-BNB3.1v 3 8.66667 XX 
BNK6.1-BDB1.1v 3 9.66667 XX 
BRK4.4-CNB6v 3 5.0 XXX 
BRK4.4-BDB1.3v 3 5.33333 XXX 
BRK4.4-BDB1.4v 3 6.0 XXX 
BRK4.4-BDB1.1v 3 6.66667 XXX 
BRK4.4-BNB3.1v 3 7.0 XXX 
BNK7.1-CNB6v 3 6.66667 XXX 
BNK7.1-BDB1.3v 3 7.0 XXX 
BNK7.1-BNB3.1v 3 7.33333 XXX 
BNK7.1-BDB1.4v 3 8.0 XXX 
BNK7.1-BDB1.1v 3 8.33333 XX 
BRB2.1-CNB6v 3 8.66667 XX 
BRB2.1-BDB1.3v 3 9.0 XX 
BRB2.1-BDB1.1v 3 11.3333 XXX 
BRB2.1-BNB3.1v 3 11.6667 XX 
BRB2.1-BDB1.4v 3 13.3333 X 
 168 
Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups 
BĐK2.3-BDB1.3v 3 10.3333 XX 
BĐK2.3-BNB3.1v 3 10.6667 XXX 
BĐK2.3-CNB6v 3 11.0 XXX 
BĐK2.3-BDB1.1v 3 11.6667 XX 
BĐK2.3-BDB1.4v 3 12.0 X 
E3: Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn 
Bacillus 
Bảng E3.1: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn 
Bacillus sau 24 h 
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 
Between groups 0.903533 3 0.301178 0.93 0.4716 
Within groups 2.60433 8 0.325542 
Total (Corr.) 3.50787 11 
Bảng E3.2: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn 
Bacillus sau 24 h 
Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups 
BĐK 2.3-26oC 3 9.39 X 
BĐK 2.3-30oC 3 9.46 X 
BĐK 2.3-37oC 3 9.57 X 
BĐK 2.3-40oC 3 9.51 X 
BRR 2.1-26oC 3 9.32 X 
BRR 2.1-30oC 3 9.39 X 
BRR 2.1-37oC 3 9.55 X 
BRB 2.1-40oC 3 9.49 X 
Bảng E3.3: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn 
Bacillus sau 24 h 
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 
Between groups 0.20483 9 0.0227589 6.50 0.0003 
Within groups 0.07 20 0.0035 
Total (Corr.) 0.27483 29 
Bảng E3.4: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn 
Bacillus sau 24 h 
NT pH Count Mean Homogeneous Groups 
BĐK2.3-4 3 9.1 X 
BĐK2.3-5 3 9.13667 XX 
BĐK2.3-6 3 9.20333 XX 
 169 
NT pH Count Mean Homogeneous Groups 
BĐK2.3-7 3 9.32667 XX 
BĐK2.3-8 3 9.14 XX 
BRB2.1-4 3 9.22 XX 
BRB2.1-5 3 9.20333 XX 
BRB2.1-6 3 9.25667 XX 
BRB2.1-7 3 9.36 X 
BRB2.1-8 3 9.12333 XX 
Bảng E3.5: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn 
Bacillus sau 24 h 
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 
Between groups 1.47538 7 0.295077 2.04 0.1443 
Within groups 1.73387 12 0.144489 
Total (Corr.) 3.20925 17 
Bảng E3.6: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn 
Bacillus sau 24 h 
Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups 
BRB 2.1-0‰ 3 9.12 X 
BRB 2.1-5‰ 3 9.07 X 
BRB 2.1-20‰ 3 9.15 X 
BRB 2.1-40‰ 3 9.12 X 
BĐK 2.3-0‰ 3 9.03 X 
BĐK 2.3-5‰ 3 8.96 X 
BĐK 2.3-
20‰ 
3 9.01 X 
BĐK 2.3-
40‰ 
3 9.05 X 
E4: Khảo sát ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Vibrio đến tôm thẻ theo 
thời gian 
Bảng E4.1: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Vibrio 
đến tôm thẻ ở thời gian 36 h 
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 
Between groups 23538.5 5 4707.7 224.22 0.0000 
Within groups 251.948 12 20.9957 
Total (Corr.) 23790.4 17 
Bảng E4.2: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Vibrio đến 
tôm thẻ ở thời gian 36 h 
Vibrio Count Mean Homogeneous Groups 
BĐB 1.3v 3 3.33333 X 
 170 
BĐB 1.4v 3 100.0 X 
BNB 3.1v 3 3.33333 X 
BRB 1.1v 3 6.66667 X 
CĐB 6v 3 2.22 X 
DC 3 0 X 
E5: Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Vibrio của các chủng vi khuẩn 
Bảng E5.1: Phân tích ANOVA về tỉ lệ sống của tôm ở các nghiệm thức tại 
thời điểm 36 h 
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 
Between groups 17575.1 4 4393.76 246.00 0.0000 
Within groups 178.607 10 17.8607 
Total (Corr.) 17753.7 14 
Bảng E5.2: Kiểm định LSD về tỉ lệ sống của tôm ở các nghiệm thức tại thời 
điểm 36h 
NT Count Mean Homogeneous Groups 
BĐB1.4v 3 0 X 
BRB2.1-BĐK23-BĐB1.4v 3 64.44 X 
BĐK23-BĐB1.4v 3 76.67 X 
BRB2.1-BĐB1.4v 3 85.56 X 
DC 3 97.78 X 
E6: Khả năng át chế của Bacillus sp. đối với Vibrio Parahaemolyticus và 
ảnh hưởng lên sự phát triển của tôm thẻ. 
Bảng E6.1: Phân tích ANOVA về tỉ lệ sống của tôm thẻ tại thời điểm 35 ngày 
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 
Between groups 11817.7 2 5908.86 548.24 0.0000 
Within groups 64.6667 6 10.7778 
Total (Corr.) 11882.4 8 
Bảng E6.2: Kiểm định LSD về tỉ lệ sống của tôm thẻ tại thời điểm 35 ngày 
NT Count Mean Homogeneous Groups 
D2 3 0 X 
 171 
D1 3 55.0 X 
D3 3 87.8333 X 
Bảng E6.3: Phân tích ANOVA về hệ số chuyển đổi thức ăn FCR sau 35 ngày 
nuôi 
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 
Between groups 3.00242 2 1.50121 1422.20 0.0000 
Within groups 0.00633333 6 0.00105556 
Total (Corr.) 3.00876 8 
Bảng E6.4: Kiểm định LSD về hệ số chuyển đổi thức ăn FCR sau 35 ngày 
nuôi 
NT Count Mean Homogeneous Groups 
D2 3 0 X 
D3 3 1.10667 X 
D1 3 1.31667 X 
PHỤ LỤC F: MỘT SỐ HÌNH THỰC NGHIỆM 
 172 
Kiểm tra các yếu tố môi trường nước 
 173 
Lấy mẫu gan tụy và ruột tôm kiểm tra mật số vi khuẩn Vibrio ban đầu 
Cố định mẫu tôm trong dung dịch cồn và Davidson’s 
 174 
Hệ thống thí nghiệm 100 lít 
 175 
 176 
Hệ thống thí nghiệm 1000 lít 
 177 
THÔNG TIN TỔNG QUÁT 
Họ tên Nghiên cứu sinh: Lê Thế Xuân Giới tính: Nam 
Ngày tháng năm sinh: 19/5/1976 Nơi sinh: Thanh Hóa 
 Điện thoại: 0918039764 
Đơn vị công tác: Công ty TNHH SX & TM Trúc Anh 
Địa chỉ hiện nay: Công Điền, Vĩnh Trạch, Bạc Liêu 
Tốt nghiệp Đại học ngành: Nuôi trồng thủy sản Năm:1999 
Tại: Đại học Nha Trang 
Tốt nghiệp Thạc sĩ ngành: Công nghệ sinh học Năm: 2012 
 Tại: Đại học Bách khoa Hà Nội