Luận án Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả mù u để ứng dụng trong kiểm nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
HÀ MINH HIỂN
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT PHENOL TỪ
NHỰA VÀ VỎ QUẢ MÙ U
ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
TP Hồ Chí Minh- Năm 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
HÀ MINH HIỂN
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT PHENOL TỪ
NHỰA VÀ VỎ QUẢ MÙ U
ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc
Mã số: 62.73.15.01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ
2. TS. Nguyễn Văn Thị
TP Hồ Chí Minh- Năm 2014
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên
cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận án là trung thực và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Ha ̀ Minh Hiê ̉n
Ha ̀ Minh Hiê ̉n
MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa i
Lời cam đoan ii
Mục lục iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv
Danh mục các bảng vii
Danh mục các hình, biểu đồ, sơ đồ, đồ thị ix
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Sơ lược về cây Mù u 4
1.2. Sơ lược về hợp chất phenol 13
1.3. Tình hình nghiên cứu về hợp chất phenol từ quả Mù u 16
1.4. Một số phương pháp phân tích hợp chất phenol từ Mù u 19
1.5. Một số khái niệm về chất chuẩn đối chiếu 21
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. Đối tượng 26
2.2. Nguyên vật liệu 26
2.3. Dung môi, hóa chất và thiết bị thí nghiệm 27
2.4. Phương pháp nghiên cứu 29
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 41
3.1. Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 41
3.2. Thử tác dụng kháng khuẩn các cao chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u 44
3.3. Phân lập các hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 45
3.4. Xác định cấu trúc các hợp chất phenol phân lập được 48
3.5. Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu 61
3.6. Xây dựng và thẩm định phương pháp GC-MS xác định calophyllolid trong cao
methanol chiết từ nhựa Mù u (Phương pháp 1)
76
3.7. Xây dựng và thẩm định phương pháp GC-MS xác định calophyllolid trong vỏ quả Mù
u (Phương pháp 2)
83
3.8. Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC-DAD định lượng calophyllolid trong chế
phẩm dầu Mù u Inopilo
89
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 96
4.1. Chiết xuất hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 96
4.2. Thử tác dụng kháng khuẩn các cao chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u 97
4.3. Phân lập hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 97
4.4. Xác định cấu trúc hợp chất phenol phân lập được bằng phương pháp phổ nghiệm 98
4.5. Xác định thành phần hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 102
4.6. Thiết lập chất chuẩn đối chiếu 106
4.7. Các phương pháp ghép nối sắc ký-phổ nghiệm xác định hợp chất phenol trong nhựa, vỏ
quả Mù u và thuốc từ Mù u
108
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 110
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AMDIS Automated Mass spectral Deconvolution and Identification System
br Đỉnh giãn rộng (broad)
CDCl3 Cloroform deuteri hóa
CD3OD Methanol deuteri hóa
13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13
COSY COrrelation SpectroscopY
d Đỉnh đôi (doublet)
dd Đỉnh đôi kép (doublet of doublets)
DAD Detector dãy diod quang (Diode Array Detector)
DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO-d6 Dimethyl sulfoxid deuteri hóa
EI-MS Phổ khối lượng-ion hóa bắn phá electron (Electron Impact Mass
Spectrometry)
EMEA European Medicines Agency
ESI-MS Phổ khối lượng-ion hóa phun mù electron (Electrospray Ionization-Mass
Spectrometry)
EtOAc Ethyl acetat
EtOH Ethanol
EU Liên minh châu Âu (European Union)
FDA Cơ quan Thực Dược phẩm Hoa kỳ (Food and Drug Administration)
FHH Forum for the Harmonization of Herbal Medicine
FTIR Hồng ngoại chuyển đổi Fourier (Fourier Transform Infrared)
GC-MS Sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography- Mass Spectrometry)
HIV Human Immunodeficiency Virus
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence
1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)
HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence
HRESI-TOFMS Phổ khối lượng thời gian bay-ion hóa phun mù electron phân giải cao
(High Resolution Electrospray Ionization-Time Of Flight Mass
Spectrometry)
ICH Hội nghị quốc tế về hòa hợp (International Conference on Harmonization)
ICP-MS Khối phổ plasma cảm ứng (Inductively Coupled Plasma- Mass
Spectrometry)
IR Hồng ngoại (Infrared)
LC-MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography- Mass Spectrometry)
m Đỉnh đa (multiplet)
MDL Giới hạn phát hiện nhỏ nhất (Minimum Detection Limit)
MeCN Acetonitril
MeOH Methanol
MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration)
MRSA Staphylococcus aureus đề kháng methicilin (Methicillin-resistant
Staphylococcus aureus)
MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry)
NIST Viện Công nghệ và Tiêu chuẩn Quốc gia Hoa kỳ (National Institute of
Standards and Technology)
NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)
Pđ. Phân đoạn
PLE Chiết lỏng dưới áp suất (Pressurized Liquid Extraction)
q Đỉnh bốn (quartet)
Rf Hệ số di chuyển (Relative to front)
RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
s Đỉnh đơn (singlet)
SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)
SIM Ion lựa chọn kiểm tra (Selected Ion Monitoring)
t Đỉnh ba (triplet)
TGA Phân tích nhiệt trọng lượng (Thermogravimetric Analysis)
TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)
TMS Tetramethyl silan
TT Thuốc thử
tt/tt Thể tích/thể tích
USP Dược điển Mỹ (United States Pharmacopoeia)
UV-Vis Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet-Visible)
VLC Sắc ký lỏng chân không (Vacuum Liquid Chromatography)
WHO Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)
max Bước sóng hấp thu cực đại
max Số sóng hấp thu cực đại
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng số Tên bảng Trang
1.1. Phân loại các hợp chất phenol theo Harborne 13
2.1. Tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn đối chiếu theo WHO 37
2.2. Các yếu tố và mức để chọn điều kiện xử lý mẫu 39
2.3. Thiết kế thí nghiệm chọn điều kiện xử lý mẫu 39
3.1. Kết quả chiết xuất hợp chất phenol từ vỏ quả Mù u bằng PLE và soxhlet 43
3.2. Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của cao chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u 44
3.3. Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất N1 (CD3OD và DMSO-d6, máy 500
MHz)
49
3.4. Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất N2 (CD3OD, máy 500 MHz) 51
3.5. Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất N3 (CDCl3, máy 500 MHz) 54
3.6. Dữ liệu độ dài liên kết tiêu biểu của hợp chất N3 56
3.7. Dữ liệu độ dài và góc liên kết hydrogen của hợp chất N3 57
3.8. Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của calophyllolid điều chế
được với tài liệu tham khảo
64
3.9. Kết quả khảo sát % diện tích của các tạp chất hữu cơ tại một số bước sóng 66
3.10. Tính phù hợp của hệ thống HPLC-DAD (n=6) 67
3.11. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của tạp chất 1 (1); calophyllolid (2); tạp
chất 2 (3)
69
3.12. Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian của phương pháp 70
3.13. Độ tinh khiết calophyllolid trong quá trình đóng lọ 71
3.14. Kết quả xác định độ tinh khiết của calophyllolid tại 3 phòng thí nghiệm 72
3.15. Khảo sát chương trình nhiệt độ cột 76
3.16. Tính phù hợp của hệ thống GC-MS (n=6) trong phương pháp GC-MS
(phương pháp 1)
78
3.17. Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của calophyllolid trong phương
pháp GC-MS (phương pháp 1)
80
3.18. Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian của phương pháp GC -
MS (phương pháp 1)
81
3.19. Kết quả độ đúng của phương pháp GC-MS (phương pháp 1) 82
3.20. Tính phù hợp của hệ thống GC-MS (n=6) trong phương pháp GC-MS
(phương pháp 1)
85
3.21. Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của calophyllolid trong phương
pháp GC-MS (phương pháp 1)
85
3.22. Kết quả độ lặp lại của phương pháp GC-MS (phương pháp 2) 86
3.23. Kết quả độ đúng của phương pháp GC-MS (phương pháp 2) 87
3.24. Kết quả thí nghiệm chọn điều kiện chuẩn bị mẫu 90
3.25. Tính phù hợp của hệ thống HPLC-DAD (n=6) 90
3.26. Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của calophyllolid trong phương
pháp HPLC-DAD
92
3.27. Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian của phương pháp HPLC -DAD 94
3.28. Kết quả độ đúng của phương pháp HPLC-DAD 95
DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
Hình số Tên hình, biểu đồ, sơ đồ, đồ thị Trang
1.1. Sơ đồ cây đánh giá chất chuẩn đối chiếu dùng cho định lượng 25
2.1. Sơ đồ quá trình ép dầu và tách loại nhựa Mù u 26
2.2. Đo đường kính vòng vô khuẩn 33
3.1. Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ nhựa Mù u bằng n-hexan 41
3.2. Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ nhựa Mù u bằng MeOH-nước 42
3.3. Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ vỏ quả Mù u bằng phương pháp
PLE
42
3.4. Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ vỏ quả Mù u bằng phương pháp
soxhlet
43
3.5. Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ vỏ quả Mù u bằng phương pháp
ngấm kiệt
44
3.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất phenol từ cao n-hexan nhựa Mù u 45
3.7. Sơ đồ phân lập các hợp chất phenol từ cao methanol nhựa Mù u 46
3.8. Sơ đồ phân lập các hợp chất phenol từ cao ethyl acetat vỏ quả Mù u 46
3.9. Sắc ký đồ TLC của các hợp chất phân lập từ nhựa và vỏ quả Mù u 47
3.10. Công thức cấu tạo của hợp chất N1 49
3.11. Công thức cấu tạo của hợp chất N2 51
3.12. Sơ đồ phân mảnh EI-MS của hợp chất N3 52
3.13. Cấu trúc của hợp chất N3 (nhiễu xạ tia X) 57
3.14. Công thức cấu tạo của hợp chất N3 57
3.15. Công thức cấu tạo của hợp chất N4 59
3.16. Phổ UV-Vis (EtOH) của calophyllolid điều chế được 61
3.17. Phổ IR (KBr) của calophyllolid điều chế được 62
3.18 Phổ MS (EI-MS) của calophyllolid điều chế được 62
3.19. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz)) của calophyllolid điều chế được 63
3.20. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz)) của calophyllolid điều chế được 63
3.21. Phổ UV và độ tinh khiết pic calophyllolid điều chế được (1); tạp chất 1 (2)
và tạp chất 2 (3)
68
3.22. Phổ 3D của calophyllolid điều chế được 68
3.23. Đồ thị tương quan giữa nồng độ các dung dịch calophyllolid và diện tích pic
tạp chất 1 (1); calophyllolid (2); tạp chất 2 (3)
69
3.24. Sắc ký đồ HPLC-DAD calophyllolid điều chế được (phát hiện ở 270 nm) 70
3.25. Sắc ký đồ xác định tạp chất hữu cơ của chất 4-hydroxyxanthon 75
3.26. Các mảnh ion đặc trưng của calophyllolid 77
3.27. Đồ thị tương quan giữa nồng độ dung dịch chuẩn đối chiếu (1), dung dịch
mẫu thử (2) và diện tích pic căn bản m/z 401
79
3.28. Sắc ký đồ GC-MS (Scan mode) cao methanol nhựa Mù u 83
3.29. Sắc ký đồ GC-MS (Scan mode) dịch chiết bằng PLE vỏ quả Mù u 88
3.30. Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng calophyllolid
trong dầu Mù u INOPILO
91
3.31. Phổ UV và độ tinh khiết pic calophyllolid trong dung dịch mẫu thử dầu Mù
u INOPILO
91
3.32. Phổ 3D của calophyllolid trong mẫu thử dầu Mù u INOPILO 91
3.33. Sắc ký đồ HPLC của mẫu thử dầu Mù u INOPILO 91
3.34. Đồ thị tương quan giữa nồng độ các dung dịch đối chiếu (1), dung dịch mẫu
thử (2) và diện tích pic calophyllolid
93
MỞ ĐẦU
Cây Mù u có tên khoa học là Calophyllum inophyllum L. Clusiaceae còn gọi là Hồ
đồng, Khung tung, Khehyong, từ lâu đã được nhân dân ta sử dụng các bộ phận khác
nhau như: hạt, dầu hạt, nhựa cây, rễ, lá để chữa một số bệnh. Có thể kể như: dầu ép
từ hạt Mù u dùng chữa ghẻ, nấm tóc và các bệnh về da nói chung, chữa viêm dây
thần kinh trong bệnh cùi, chống nhiễm khuẩn vết thương và bôi trị thấp khớp [2].
Tại Ấn độ, toàn cây Mù u dùng làm thuốc chữa bệnh thấp khớp và các bệnh ngoài
da. Nước ép dùng làm thuốc tẩy xổ và dầu hạt cũng được chỉ định dùng để trị bệnh
thấp khớp và các bệnh về da như: bệnh ghẻ, bệnh herpes mảng tròn, bệnh da. Vỏ
cây dùng chữa xuất huyết nội và là một chất làm se. Tại Buso và Papua New
Guinea, nhựa mủ từ lá được pha loãng với nước và dung dịch này được bôi lên mắt
bị kích ứng. Chất gôm làm thuốc gây nôn và thuốc tẩy xổ [9].
Tổng quan về cây Mù u cho thấy có các thành phần hóa học thuộc nhóm coumarin,
xanthon, flavonoid, dẫn xuất chromanon, triterpen, steroid chứa trong nhiều bộ phận
khác nhau như: lá, quả, hạt, phần tiếp xúc với không khí, vỏ rễ, gỗ. Trong đó các
hợp chất phenol thuộc nhóm coumarin, xanthon, flavonoid và neoflavonoid được
nghiên cứu có các tác dụng sinh học đáng kể như: kháng virus, kháng khuẩn, kháng
nấm, kháng viêm, chống ung thư, chống oxy hóa [9], [43]. Cụ thể các inophyllum B
và P có tác dụng ức chế HIV-1 Reverse Transcriptase và hoạt tính kháng HIV-1
trong môi trường nuôi cấy tế bào [21], hoặc gần đây tại Pháp, các nhà khoa học đã
xác định trong nhựa tách từ dầu Mù u trồng ở Polynesia thuộc Pháp một số
coumarin thuộc các họ: inophyllum, calanolid, inocalophyllin và tamanolid trong đó
đáng quan tâm nhất là calophyllolid, chất có tác dụng ngăn chặn ung thư bằng cách
ức chế elastase [101]. Do có nhiều chất có hoạt tính sinh học như vậy, các bộ phận
của cây Mù u là đối tượng có tiềm năng rất lớn sử dụng làm thuốc và trong nghiên
cứu phát hiện các chất làm thuốc.
Tại Việt Nam, Mù u khai thác bằng cách đập quả bỏ vỏ, lấy hạt để ép dầu. Tinh chế
dầu thô bằng cách loại nhựa để thu được dầu Mù u dược dụng. Nhựa loại ra khi tinh
chế dầu Mù u và vỏ quả Mù u Việt nam chưa được nghiên cứu để sử dụng. Dầu Mù
u được dùng riêng hoặc phối hợp với các dược liệu khác sử dụng rộng rãi để trị
bỏng, viêm loét da, làm mau lành các vết thương
Về mặt tiêu chuẩn hóa thì chỉ tiêu định tính dầu Mù u theo dược điển Việt Nam 4
chưa đủ đặc hiệu và không dễ thực hiện do chưa có dầu Mù u chuẩn hoặc chất
chuẩn đối chiếu [1]. Các dược điển: Hoa kỳ 2012, Anh 2013, châu Âu 7.0, Nhật
2006, Quốc tế 4, Trung quốc 2010 đều chưa thấy có chuyên luận về các bộ phận
dùng cũng như các chế phẩm từ dược liệu Mù u.
Tiêu chuẩn cơ sở của dầu Mù u cũng như các chế phẩm từ dầu Mù u này tuy đã có
nhưng chưa đáp ứng với các nguyên tắc, tiêu chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc đối
với cơ sở sản xuất thuốc từ dược liệu của tổ chức Y tế thế giới (GMP-WHO) [121]
mà Bộ Y tế đã đưa ra lộ trình áp dụng kể từ ngày 01/01/2014 vì không có chỉ tiêu
xác định thành phần có hoạt tính hoặc chất điểm chỉ do thiếu chất chuẩn đối chiếu
và phương pháp phân tích, kiểm nghiệm tin cậy.
Tại Việt nam, ngoài công trình của tác giả Trần Thanh Thạo về phân lập và xác
định cấu trúc của calophyllolid từ hạt cây Mù u mọc tại Việt Nam [5], có rất ít công
trình nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa loại bỏ khi tinh chế dầu Mù u
cũng như vỏ quả Mù u.
Vì vậy, đề tài:
“Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u để ứng dụng
trong kiểm nghiệm” được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu cụ thể sau:
- Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u mọc ở Việt Nam
bằng một số kỹ thuật sắc ký và phổ nghiệm để chọn chất điểm chỉ dùng trong
kiểm nghiệm nguyên liệu và chế phẩm từ dược liệu Mù u.
- Nghiên cứu thiết lập 01 chất chuẩn đối chiếu để định tính và 01 dùng cho định
lượng trong số các hợp chất phenol phân lập được.
- Ứng dụng chất chuẩn đối chiếu đã thiết lập để kiểm nghiệm nguyên liệu và chế
phẩm từ dược liệu Mù u.
Để đạt được các mục tiêu trên, chúng tôi đã tiến hành các nội dung sau đây:
- Xây dựng quy trình chiết xuất ... pic tạp chất hữu cơ gần nhất phải không dưới 1,5, độ lệch chuẩn
tương đối của diện tích pic calophyllolid và các tạp chất hữu cơ không được lớn hơn
2%. Tính hàm lượng phần trăm của tổng tạp chất hữu cơ trong mẫu theo công thức:
100 (rU/rT) trong đó: rU là tổng diện tích các pic thu được trong sắc ký đồ của dung
dịch thử ngoại trừ pic của calophyllolid, rT là tổng diện tích các pic thu được trong
sắc ký đồ của dung dịch thử ngoại trừ pic của dung môi pha mẫu.
Tiêu chuẩn chấp nhận: Không quá 3,8% tính theo chế phẩm nguyên trạng
2.4.2. Xác định tạp chất bay hơi (nước và các dung môi hữu cơ)
Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng. Tiến hành theo USP.
Tốc độ gia nhiệt: 6 oC/phút.
Khoảng nhiệt độ: 30-150 oC.
Khí: Nitrogen.
Tốc độ dòng: 100 ml/phút.
Tiêu chuẩn chấp nhận: Không quá 1,1%
2.4.3. Xác định tạp chất vô cơ (Chì, arsen, thủy ngân)
Phương pháp ICP-MS. Tiến hành theo phụ lục IX Dược điển Trung quốc 2010.
Công suất ICP RF: 1300 W
Tốc độ khí nebulizer: 0,55 l/phút
Tốc độ khí plasma: 15 l/phút
Dwell: 15 ms
Tiêu chuẩn chấp nhận: Không quá 20 ppm
2.5. Định lượng
% Calophyllolid = 100% – (% tạp chất hữu cơ) – (% tạp chất bay hơi) – (% tạp chất
vô cơ)
Tiêu chuẩn chấp nhận: Không ít hơn 95% C26H24O5
3. Bảo quản
Đựng trong lọ thủy tinh màu nâu kín, tránh ánh sáng, nhiệt độ 2-8 oC.
Quy cách đóng gói: 10 mg/lọ.
KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CHẤT LƯỢNG CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU
CALOPHYLLOLID
Chỉ tiêu Mức chất lượng Kết quả Kết luận
Tính chất Chế phẩm là tinh thể không màu, , dễ tan
trong aceton, benzen, ether ethylic, alcol.
Tinh thể không màu, dễ tan trong
aceton, benzen, ether ethylic, alcol.
Đạt
Định tính
Phổ UV-Vis Phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến của chế
phẩm thu được trong dải sóng từ 220 nm
đến 350 nm phải có các cực đại hấp thu
ở: 235, 270 và 295 nm
233, 269 và 294 nm. Đạt
Phổ IR Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải có
các đỉnh có số sóng: 1726, 1662, 1579,
1133, 759, 702 cm-1.
1726, 1662, 1581, 1134, 758, 700 cm-1. Đạt
Phổ MS Phổ khối lượng EI-MS (70 eV) của mẫu
thử phải có các pic m/z 416 [M]+, 401,
m/z 83, 55.
m/z 416 [M]+, 401, m/z 83, 55. Đạt
Phổ NMR Phổ 13C-NMR và phổ 1H-NMR của mẫu
thử phải phù hợp với phổ 13C-NMR và
phổ 1H-NMR theo tài liệu tham khảo.
1H-NMR (CD3Cl3, 300 MHz): 7,26 m x
2; 7,40 m x 2; 0,97 s x 2; 1,9 d (6,3);
2,01 s; 5,48 d (9,9); 6,02 s; 6,45 d (9,6),
6,57 q (6,0).
13C-NMR (CD3Cl3, 75 MHz): 10,7;
15,2; 26,8 x 2; 63,0; 77,4; 105,6; 110,7;
114,2; 115,0; 115,9; 127,2 x 2; 127,5 x
2; 127,7; 129,0; 139,5; 139,9; 144,2;
151,7; 152,0; 155,0; 155,8; 159,4;
194,3.
Đạt
Điểm chảy 154-156 oC 155,6 oC. Đạt
Tạp chất hữu cơ Không quá 3,8% 3,59%. Đạt
Tạp chất bay hơi Không quá 1,1% 1,05%. Đạt
Tạp chất vô cơ Không quá 20 ppm Pb: Không phát hiện (MDL: 2,49 ppb).
As: Không phát hiện (MDL: 4,69 ppb).
Hg: Không phát hiện (MDL: 0,56 ppb).
Đạt
Định lượng Không ít hơn 95% 95,42%. Đạt
PHỤ LỤC 13
TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU
4-HYDROXYXANTHON C13H8O3
1. Cấu trúc
Công thức cấu tạo:
Công thức phân tử: C13H8O3
Phân tử lượng: 212,2.
Tên khoa học: 4-hydroxy-9H-xanthen-9-one
2. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu
2.1. Tính chất: Chế phẩm là tinh thể hình kim, không màu, dễ tan trong aceton,
methanol.
2.2. Định tính
2.2.1. Phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến:
Tiến hành theo phụ lục 4.1. DĐVN IV. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử trong methanol
(TT) có nồng độ 0,6 g/ml. Phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến của chế phẩm thu
được trong dải sóng từ 220 nm đến 400 nm phải có các cực đại hấp thu ở: 231, 248
và 348 nm.
2.2.2. Phổ hồng ngoại:
Tiến hành theo phụ lục 4.2. DĐVN IV. Chuẩn bị mẫu bằng cách tạo viên nén KBr.
Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải có các đỉnh có số sóng: 3197, 1652, 1589, 1292,
754, 729 cm-1.
7
6
5
8
O 4
3
2
1
O
9a
4a
8a
10a
OH
2.2.3. Phổ khối lượng:
Phổ khối lượng EI-MS (70 eV) của mẫu thử phải có các pic m/z 212 [M]+ (pic căn
bản), m/z 184, 155, 128, 102, 63.
2.2.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân:
Phổ 13C-NMR và phổ 1H-NMR của mẫu thử phải phù hợp với phổ 13C-NMR và phổ
1H-NMR theo phụ lục đính kèm.
2.3. Điểm chảy: Tiến hành theo phụ lục 6.7 DĐVN IV
Tiêu chuẩn chấp nhận: 228-230 oC.
2.4. Độ tinh khiết
2.4.1. Xác định tạp chất hữu cơ
Phương pháp sắc ký lỏng. Tiến hành theo phụ lục 5.3 DĐVN IV
Pha động: Hỗn hợp acetonitril: nước với chương trình dung môi
Thời gian
(phút)
% acetonitril % nước
0 50 50
20 90 10
30 100 0
37 100 0
45 50 50
55 50 50
Chuẩn bị dung môi pha mẫu: Acetonitril – Nước (50 : 50)
Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 2,5 mg chế phẩm vào bình định
mức 25 ml, thêm 20 ml dung môi pha mẫu, siêu âm hòa tan trong 3 phút, thêm dung
môi pha mẫu vừa đủ 25 ml, lọc qua màng lọc 0,45µm.
Điều kiện sắc ký:
Cột: Gemini NX C-18 bằng thép không gỉ (15 cm x 4,6 mm x 5 µm) hoặc tương
đương.
Detector chuỗi diod quang (280 nm).
Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút.
Thể tích tiêm: 5 µl.
Cách tiến hành:
Tiêm dung môi pha mẫu. Tiêm 6 lần dung dịch thử. Số đĩa lý thuyết của pic 4-
hydroxyxanthon và các tạp chất hữu cơ phải không dưới 2000, độ phân giải giữa pic
4-hydroxyxanthon và pic tạp chất hữu cơ gần nhất phải không dưới 1,5, độ lệch
chuẩn tương đối của diện tích pic 4-hydroxyxanthon và các tạp chất hữu cơ không
được lớn hơn 2%. Tính hàm lượng phần trăm của tổng tạp chất hữu cơ trong mẫu
theo công thức: 100 (rU/rT) trong đó: rU là tổng diện tích các pic thu được trong sắc
ký đồ của dung dịch thử ngoại trừ pic của 4-hydroxyxanthon, rT là tổng diện tích
các pic thu được trong sắc ký đồ của dung dịch thử ngoại trừ pic của dung môi pha
mẫu.
Tiêu chuẩn chấp nhận: Không quá 6,0% tính theo chế phẩm nguyên trạng
4.2. Xác định tạp chất bay hơi
Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng. Tiến hành theo USP 34.
Tốc độ gia nhiệt: 6 oC/phút.
Khoảng nhiệt độ: 30-150 oC.
Khí: Nitrogen.
Tốc độ dòng: 100 ml/phút.
Tiêu chuẩn chấp nhận: Không quá 1,0%
5. Định lượng
%4-hydroxyxanthon = 100% – (% tạp chất hữu cơ) - (% tạp chất bay hơi)
Tiêu chuẩn chấp nhận: Không ít hơn 90% C13H8O3
KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CHẤT LƯỢNG CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU
4-HYDROXYXANTHON
Chỉ tiêu Mức chất lượng Kết quả Kết luận
Tính chất Chế phẩm là tinh thể hình kim,
không màu. Dễ tan trong aceton,
methanol
Tinh thể hình kim, không màu. Dễ tan
trong aceton, methanol
Đạt
Định tính
Phổ UV-Vis Phổ hấp thụ tử ngoại và khả
kiến của chế phẩm thu được
trong dải sóng từ 220 nm đến
400 nm phải có các cực đại
hấp thu ở: 231, 248 và 348 nm
231, 248 và 348 nm. Đạt
Phổ IR Phổ hồng ngoại của chế phẩm
phải có các đỉnh có số sóng:
3197, 1652, 1589, 1292, 754,
729 cm-1.
3197, 1652, 1589, 1292, 754, 729 cm-1. Đạt
Phổ MS Phổ khối lượng EI-MS (70 eV)
của mẫu thử phải có các pic
m/z 212 [M]+, m/z 184, 155,
128, 102, 63.
m/z 212 [M]+, m/z 184, 155, 128, 102,
63.
Đạt
Phổ NMR Phổ 13C-NMR và phổ 1H-NMR
của mẫu thử phải phù hợp với
phổ 13C-NMR và phổ 1H-NMR
theo tài liệu tham khảo.
1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): 7,73 dd
(8,0; 2,0); 7,25 t (8,0); và 7,31 dd (8,0;
1,5); 7,68 dd (8,5; 0,5); 7,83 dt (8,5; 1,5);
7,44 dt (7,5; 1,0); và 8,26 dd (8,0; 2,0).
13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): 179,2;
157,4; 147,9; 147,1; 136,4; 127,3; 125,3;
125,1; 123,6; 122,5; 121,5; 119,4; 117,1.
Đạt
Điểm chảy 228-230 oC 229,1oC. Đạt
Tạp chất hữu cơ Không quá 6,0% 5,57%. Đạt
Tạp chất bay hơi Không quá 1,0% 0,52%. Đạt
Định lượng Không ít hơn 90% 93,91%. Đạt
PHỤ LỤC 14
QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH CALOPHYLLOLID
TRONG CAO METHANOL TỪ NHỰA MÙ U BẰNG
PHƯƠNG PHÁP GC-MS
Cao nhựa Mù u điều chế bằng phương pháp chiết với methanol –nước (9:1) nhựa
Mù u loại ra khi tinh chế dầu Mù u.
Mô tả
Cao nhựa Mù u có thể chất mềm, đồng nhất. Màu nâu sẫm. Mùi đặc biệt.
Định tính
Trong phần xác định hàm lượng calophyllolid, trên sắc ký đồ của dung dịch thử
phải có pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic calophyllolid trên
sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (khác biệt về thời gian lưu phải ở trong khoảng ±
2%). Phải có các mảnh ion phân tử ở m/z 416, pic căn bản ở m/z 401, mảnh ion ở
m/z 83 và 55.
Hàm lượng calophyllolid
Tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng
Phương pháp sắc ký khí ghép phổ khối
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,04 g cao methanol vào ống eppendorf,
thêm chính xác 2,0 ml methanol (TT), lắc xoáy 1 phút rồi siêu âm trong 10 phút. Ly
tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút. Hút chính xác 1,0 ml dịch methanol cho vào bình
định mức 10,0 ml rồi pha loãng bằng methanol (TT) đến định mức. Lắc đều.
Dung dịch chuẩn đối chiếu: Hòa tan chất chuẩn đối chiếu calophyllolid trong
methanol (TT) để được dung dịch có nồng độ 12,5 g/ml.
Điều kiện sắc ký:
Cột sắc ký: DB-5MS 25 m x 0,22 mm ID, df = 5 µm.
Khí mang: heli dùng cho sắc ký (TT) với tốc độ dòng 1,43 ml/phút
Kiểu bơm mẫu: không chia dòng
Nhiệt độ:
Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC)
Cột 0 80
5,5 300
14,5 300
Buồng tiêm mẫu 250
Nguồn ion 250
Giao diện 200
Kiểu ion : Bắn phá điện tử
Khoảng quét : 50-550 amu
Kiểu thu dữ liệu : SCAN và SIM
Các ion định lượng : Ion đích m/z 401; ion tham chiếu m/z 83 và 55
Thể tích tiêm mẫu : 1 l
Cách tiến hành:
Phép thử chỉ có giá trị khi hệ số đối xứng của pic chính trên sắc ký đồ của dung
dịch chuẩn đối chiếu không quá 2 và độ lệch cường độ tương đối (%) các ion ở m/z
55, 83, 416 trong dung dịch chuẩn đối chiếu và dung dịch thử không quá 20%.
Tiêm lần lượt dung dịch thử và dung dịch chuẩn đối chiếu vào máy GC-MS và ghi
sắc ký đồ. Định tính bằng cách so sánh thời gian lưu và các mảnh ion của dung dịch
thử và dung dịch chuẩn đối chiếu ở kiểu thu dữ liệu SCAN.
Xác định hàm lượng phần trăm calophyllolid (X%), C26H24O5, bằng cách so sánh
cường độ mảnh m/z 401 của dung dịch thử và dung dịch chuẩn đối chiếu trong kiểu
thu dữ liệu SIM theo công thức:
X% (g/100 g) = (At/Ac) x (C x D)/mt x 0,1
At : Cường độ mảnh m/z 401 của dung dịch thử
Ac : Cường độ mảnh m/z 401 của dung dịch chuẩn đối chiếu
C : Hàm lượng calophyllolid trong dung dịch chuẩn đối chiếu (g/ml)
D : Độ pha loãng
mt : Khối lượng cao đem thử (mg)
PHỤ LỤC 15
QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH CALOPHYLLOLID
TRONG VỎ QUẢ MÙ U BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS
Xử lý mẫu
Xay vỏ quả thành bột bằng máy nghiền và rây để thu được các hạt có kích thước
trung bình là 1,84 mm xác định theo phương pháp Dược điển Mỹ 30 (2007).
Tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng
Cân chính xác khoảng 5 g bột vỏ quả cho vào ống chiết được đặt lọc 10 µm ở một
đầu, kế đến là lớp bông thủy tinh, thêm các hạt thủy tinh dày 1-2 mm để hạn chế
khoảng trống trong ống, tiếp tục cho lớp bông thủy tinh và lọc 10 µm ở đầu kia.
Điều kiện chiết
Thiết bị chiết lỏng dưới áp suất: ASE-100-Dionex
Áp suất : 1500 psi
Nhiệt độ : 120 oC
Thời gian chiết : 15 phút
Chu kỳ chiết : 1
Thể tích rửa : 60%
Thời gian làm sạch hệ thống bằng khí nitrogen : 90 giây
Cô dịch chiết dưới áp xuất giảm ở 40 oC rồi định mức đến 100 ml bằng methanol
(TT). Lọc dịch chiết bằng giấy lọc Whatman 40 (Dịch chiết V).
Định tính
Trong phần xác định hàm lượng calophyllolid, trên sắc ký đồ của dung dịch thử
phải có pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic calophyllolid trên
sắc ký đồ của dung dịch chuẩn đối chiếu (khác biệt về thời gian lưu phải ở trong
khoảng ± 2%). Phải có các mảnh ion phân tử ở m/z 416, pic căn bản ở m/z 401,
mảnh ion ở m/z 83 và 55.
Hàm lượng calophyllolid
Tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng
Phương pháp sắc ký khí ghép phổ khối
Dung dịch thử: Dịch chiết V.
Dung dịch chuẩn đối chiếu: Hòa tan chất chuẩn đối chiếu calophyllolid trong
methanol (TT) để được dung dịch có nồng độ 12,5 g/ml.
Điều kiện sắc ký:
Cột sắc ký: DB-5MS 25 m x 0,22 mm ID, df = 5 µm.
Khí mang: heli dùng cho sắc ký (TT) với tốc độ dòng 1,43 ml/phút
Kiểu bơm mẫu: không chia dòng
Nhiệt độ:
Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC)
Cột 0 80
5,5 300
17,5 300
Buồng tiêm mẫu 250
Nguồn ion 250
Giao diện 200
Kiểu ion : Bắn phá điện tử
Khoảng quét : 50-450 amu
Kiểu thu dữ liệu : SCAN và SIM
Các ion định lượng
- Ion đích : m/z 401
- Ion tham chiếu : m/z 83, 55
Thể tích tiêm mẫu : 1 l
Cách tiến hành:
Phép thử chỉ có giá trị khi hệ số đối xứng của pic chính trên sắc ký đồ của dung
dịch chuẩn đối chiếu không quá 2 và độ lệch cường độ tương đối (%) các ion ở m/z
55, 83, 416 của calophyllolid trong dung dịch chuẩn đối chiếu và dung dịch thử
không quá 20%.
Tiêm lần lượt dung dịch thử và dung dịch chuẩn đối chiếu vào máy GC-MS và ghi
sắc ký đồ. Định tính bằng cách so sánh thời gian lưu và các mảnh ion của dung dịch
thử và dung dịch chuẩn đối chiếu ở kiểu thu dữ liệu SCAN.
Xác định hàm lượng phần trăm calophyllolid (X%), C26H24O5, bằng cách so sánh
cường độ mảnh m/z 401 của dung dịch thử và dung dịch chuẩn đối chiếu ở kiểu thu
dữ liệu SIM theo công thức sau:
X% = (At/Ac) x (C x D)/mt x 0,1
At : Cường độ mảnh m/z 401 của dung dịch thử
Ac : Cường độ mảnh m/z 401 của dung dịch chuẩn đối chiếu
C : Hàm lượng calophyllolid trong dung dịch chuẩn đối chiếu (g/mL)
D : Độ pha loãng
mt : Khối lượng vỏ quả đem thử (mg)
PHỤ LỤC 16
QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CALOPHYLLOLID TRONG
CHẾ PHẨM “DẦU MÙ U INOPILO” BẰNG PHƯƠNG PHÁP
HPLC-DAD
Tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng.
Tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng theo DĐVN IV (Phụ lục 5.3)
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 120 mg mẫu thử cho vào bình định mức 10
ml, làm ấm mẫu ở 60 oC trong 10 phút rồi thêm 6 ml hỗn hợp methanol-nước (TT)
(9:1), siêu âm trong 15 phút. Bổ sung hỗn hợp methanol-nước (TT) (9:1) đến thể
tích. Lọc mẫu qua lọc 0,45 m.
Dung dịch chuẩn đối chiếu: pha các dung dịch chuẩn calophyllolid trong methanol
(TT) có nồng độ khoảng 75 g/ml; 60 g/ml và 45 g/ml. Lọc mẫu qua lọc 0,45
m.
Điều kiện sắc ký:
Pha động A: Acetonitril (TT)
Pha động B: Dung dịch acid acetic 2%
Tiến hành chạy sắc ký theo chương trình ở bảng sau:
Thời gian (phút) Acetonitril (%) Dung dịch acid acetic 2% (%)
0
30
35
40
20
80
20
20
80
20
80
80
Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C18 (5 μm), cột Zorbax là
phù hợp
Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu: 10 μl.
Nhiệt độ cột: 40 oC.
Detector DAD đặt ở bước sóng 270 nm.
Cách tiến hành:
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn
đối chiếu. Hệ số đối xứng thu được từ pic calophyllolid phải nằm trong khoảng 0,8-
1,5, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic calophyllolid trong 6 lần tiêm lặp lại
không được quá 2,0 %, số đĩa lý thuyết của pic calophyllolid phải không dưới 2000.
Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn đối chiếu và dung dịch thử.
Vẽ đồ thị biểu diễn diện tích pic calophyllolid theo nồng độ của calophyllolid trong
các dung dịch chuẩn đối chiếu và xác lập phương trình hồi quy tuyến tính, dựa vào
đó tính nồng độ calophyllolid trong dung dịch thử (g/ml).
Tính hàm lượng phần trăm (kl/kl) calophyllolid, C26H24O5, trong chế phẩm dựa vào
diện tích pic thu được từ dung dịch thử, các dung dịch chuẩn đối chiếu và hàm
lượng C26H24O5 của calophyllolid chuẩn đối chiếu theo công thức:
X% (g/ 100 g) = Ct/mt
Ct: Nồng độ calophyllolid trong dung dịch thử (g/ml).
mt: Khối lượng mẫu thử (mg).