Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối bacillus spp. làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 
TR N H U T M 
Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản 
xuất sinh khối Bacillus spp. làm nguyên liệu 
probiotic cung cấp carotenoid 
Chuyên ngành: Công nghệ dƣợc phẩm 
M số: 62 73 01 01 
TÓM TẮT U N ÁN TIẾN S DƢỢC HỌC 
Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 
Công trình được hoàn thành tại: 
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM 
Người hướng dẫn khoa học: 
1. PGS.TS. Trần Cát Đông 
2. GS.TS. Nguyễn Văn Thanh 
Phản biện 1: 
Phản biện 2: 
Phản biện 3: 
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp trường 
Họp tại:.. 
Vào hồi..giờngày..tháng..năm 
Có thể tìm hiểu luận án tại: 
- Thư viện Quốc gia Việt Nam. 
- Thư viện khoa học tổng hợp TP.HCM. 
- Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM. 
1 
GIỚI THIỆU U N ÁN 
1. Đặt vấn đề 
Trong nh ng năm gần đây, việc dùng nguồn vi khuẩn để sản xuất một số 
carotenoid quan trọng đã được quan tâm nghi n cứu. Việc sử dụng vi 
khuẩn sinh carotenoid làm nguy n liệu sản xuất thực phẩm chức năng có 
nhiều ưu điểm như dễ nuôi cấy ở qui mô lớn, tăng trưởng nhanh, sử dụng 
cơ chất giá thành thấp, ngoài ra còn có nh ng giá trị cộng th m như có 
thể bổ sung th m các men trợ ti u hóa, ổn định trong bảo quản. Trong số 
các vi khuẩn sinh carotenoid, Bacillus có nhiều ưu điểm vì ch ng có khả 
năng tạo bào tử bền với nhiệt n n dễ bảo quản và sản xuất. 
Tr n thế giới và tại Việt Nam chưa có nhiều nghi n cứu sâu, toàn diện về 
Bacillus sinh carotenoid để cung cấp carotenoid. Mục ti u luận án 
nghi n cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp. làm 
nguy n liệu probiotic cung cấp carotenoid, hướng đến nội dung sau: 
1. Phân lập Bacillus sinh carotenoid, khảo sát đặc điểm probiotic. 
2. Khảo sát khả năng sinh carotenoid từ các vi khuẩn phân lập được. 
3. Khảo sát môi trường thay thế và điều kiện nuôi cấy để xây dựng quy 
trình l n men. 
4. Xây dựng quy trình l n men ở quy mô pilot để sản xuất sinh khối 
Bacillus làm nguy n liệu probiotic cung cấp carotenoid. 
5. Xây dựng ti u chuẩn cơ sở của nguy n liệu. 
6. Nghi n cứu khả năng ứng dụng sinh khối thu được. 
2. Tính cấp thiết của đề tài 
Các chất chống oxi hóa trong tự nhi n được quan tâm và nghi n cứu rất 
nhiều như flavonoid, carotenoid, polyphenol, trong đó, carotenoid 
được ch nhiều vì có thể làm giảm t lệ m c các bệnh mạn t nh như 
ung thư, tim mạch, ch a các bệnh về m t. Các carotenoid sử dụng trong 
2 
các chế phẩm thường được chiết xuất từ thực vật hoặc tổng hợp hóa học, 
có nhiều nhược điểm như sử dụng các dung môi chiết xuất độc hại ảnh 
hưởng đến môi trường, phụ thuộc vào thời tiết, carotenoid k m bền khó 
bảo quản, 
Việc sử dụng bào tử vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid dưới dạng 
probiotic, cung cấp carotenoid ngay trong đường ti u hóa có nhiều ưu 
điểm như thời gian nuôi cấy ng n, không qua chiết xuất, bảo quản 
carotenoid đơn giản, là một hướng tiếp cận mới về nguồn và phương 
thức cung cấp carotenoid so với cách thức truyền thống là chiết xuất hay 
tổng hợp hóa học tồn tại nhiều nhược điểm đã n u. 
3. Những đóng góp mới của luận án 
Đây là nghi n cứu đầu ti n sử dụng bào tử Bacillus làm nguồn cung cấp 
carotenoid tại Việt Nam. Nghi n cứu này mở ra một hướng tiếp cận mới 
về nguồn và phương thức cung cấp carotenoid, với nh ng đóng góp mới 
cụ thể như sau: 
- Phân lập, định danh được hai chủng vi khuẩn Bacillus tại Việt Nam là 
Bacillus marisflavi DD1.1 và Bacillus infantis AT14, đáp ứng y u 
cầu làm nguy n liệu probiotic cung cấp carotenoid. 
- Xây dựng được quy trình l n men thu sinh khối bào tử ổn định ở quy 
mô pilot, với các thông số phù hợp, sử dụng nguy n liệu giá thành 
thấp, s n có tại Việt Nam, quy trình có t nh kinh tế, có thể ứng dụng 
vào thực tế tạo n n sản phẩm có giá cạnh tranh. 
- Chứng minh được khả năng hấp thu carotenoid tại ni m mạc ruột, khả 
năng điều trị ti u chảy do kháng sinh tr n mô hình động vật có v đối 
với hai chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được. 
3 
4. Bố cục luận án 
Luận án gồm: 139 trang, đặt vấn đề 2 trang, tổng quan tài liệu 26 trang, 
đối tượng - vật liệu - thiết bị và phương pháp nghi n cứu 21 trang, kết 
quả nghi n cứu 72 trang, bàn luận 14 trang, kết luận và kiến nghị 3 trang. 
Luận án có 71 bảng, 23 hình, 7 sơ đồ, 118 tài liệu tham khảo, gồm 11 tài 
liệu tiếng Việt, 107 tài liệu tiếng Anh, 13 phụ lục thể hiện các kết quả 
thực nghiệm. 
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI IỆU 
1.1. Thực phẩm chức năng: khái niệm, ti u ch . 
1.2. Probiotic: khái niệm, các ti u ch về probiotic. 
1.3. Thực phẩm chức năng và probiotic đối với sức khỏe: tác dụng của 
thực phẩm chức năng và probiotic đối với sức khỏe, y học. 
1.4. Carotenoid: cấu tr c, phân loại, đặc t nh l hóa, tác dụng sinh học 
và vai của carotenoid trong y học, các phương pháp định lượng, 
định t nh carotenoid. 
1.5. Các vi sinh vật sinh carotenoid: trình bày về chi sinh carotenoid và 
các loại carotenoid đặc trưng được sinh ra. 
1.6. Vi khuẩn Bacillus: đặc điểm của vi khuẩn và bào tử Bacillus, các 
ứng dụng. 
1.7. L n men và sản xuất sinh khối: các vấn đề môi trường l n men, yếu 
tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật. 
1.8. Nghi n cứu vi khuẩn sinh carotenoid thế giới và tại Việt Nam: tóm 
t t các nghi n cứu tr n thế giới và trong nước về tình hình nghi n 
cứu vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid. Chưa có nhiều nghi n cứu về 
vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid. 
4 
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG, V T IỆU, THIẾT BỊ 
VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu: vi khuẩn (VK) phân lập từ mẫu đất và nước 
ở à Rịa - V ng Tàu, ình Thuận, Nha Trang và Đà N ng. 
2.2. Vật liệu 
 s n v t v n v t t n m: chủng vi khuẩn ATCC, hoặc từ dự 
án Colorspore, hoặc do PTN Vi sinh Công nghệ Dược. Chuột nh t tr ng 
Swiss albio, Viện Pasteur Nha Trang. 
 t Sigma, Merck, hoặc các công ty dược trong nước. 
 M tr n TSA, TS , NA, N của Ấn Độ. MHA (Đức). 
2.3. Thiết 
Máy luân nhiệt Mastercycler Personal (Eppendorf), ộ điện di ngang 
Mini-Sub Cell GT (Bio-Rad), Máy quang phổ UV-Vis GeneQuant 1300 
(GE HealthCare), Máy tán si u âm VCX 130P (Sonics), hệ thống 
HPLC Smartline 2500 (Knauer), . 
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 
2.4.1. Phân lập chủng VK, sàng lọc, đ nh danh 
T u t p mẫu t v n ớ Vùng biển Cần Giờ, à Rịa - V ng Tàu, Đà 
N ng, ình Thuận, Nha Trang. 
P ân l p Trực khuẩn Gram (+), sinh bào tử, có màu sẽ được lưu lại để 
nghi n cứu sàng lọc khả năng sinh carotenoid. 
S n lọ : hoạt t nh chống oxy hóa, phổ UV-Vis dịch chiết sinh khối. 
Địn d n : Dựa tr n giải trình tự gen 16S rADN. 
2.4.2. Khảo sát đặc điểm pro iotic 
K ả năn s n enzym n oạ b o ủ ủn v k uẩn: khả năng sinh 
protease (caseinase, gelatinase), amylase, lipase. 
5 
T k ả năn ố k án vớ VK ây b n (chủng ATCC): S. aureus, E. 
coli, S. faecalis, P. aeruginosa, Sal. paratyphi A, K. pneumoniae. 
K ả năn ịu d dị vị v muố m t Khả năng sống sót VK sau 30, 
60, 90 ph t ở pH 2, 3; sau 1, 3 giờ ở muối mật 0,15%, 0,3%. 
T n m n ạy ảm k án s n : PP pha loãng kháng sinh trong thạch 
theo M7 - A9 và M45 – A (CLSI). Sử dụng 15 kháng sinh đại diện cho 
các nhóm penicilin, cephem, glycopeptid, aminoglycosid, macrolid, 
tetracyclin, quinolon, phenicol, ansamycin. 
2.4.3. Khảo sát điều kiện nuôi cấy và đƣờng cong tăng trƣởng 
Đ ều k n p át tr ển ủ v k uẩn từ 20 - 45oC, từ pH 6 - 11. 
Đ n on tăn tr ởn trên TSB đo OD mỗi giờ, đếm sống để kiểm 
chứng. Xác định thời gian thế hệ. 
2.4.4. Khảo sát đặc điểm sinh carotenoid 
Xá ịn m l ợn roteno d bằn PLC (Knauer - Đức): 
acetonitril:methanol:dicloromethan (7:2:1, tt/tt), RP18 (250 mm, 4,6 
mm, 5 μm); UV-Vis, λ450nm; 1 ml/ ph t; t
o
 phòng; 20μl. Xác định hàm 
lượng carotenoid qua đường chuẩn canthaxanthin. 
K ảo sát sự tạo roteno d t eo t n Đường cong tăng trưởng: mỗi 
giờ, đo OD tr n cùng 1 erlen. Hàm lượng carotenoid: định lượng bằng 
HPLC (với thông số như tr n), mỗi 6 giờ (thử nghiệm sơ bộ) hoặc 2 giờ. 
2.4.5. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy 
K ảo sát MT t y t ế cho TSB: Khoai tây, b p, gạo, đậu nành, đối chứng 
với TS , chọn MT có sinh khối và carotenoid ≥ MT TS . 
K ảo sát k ả năn tạo b o t trên á MT t eo t n 
• So sánh sự tạo bào tử gi a MTTT bổ sung K+, Mg2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+ 
với DSM, TSM, 2SG (cả hai dạng lỏng và r n). 
6 
• Khảo sát ảnh hưởng của 5 khoáng đến khả năng tạo bào tử và 
carotenoid: phương pháp bề mặt đáp ứng – RSM. 
K ảo sát á t n số lên men tron MT lỏn : T lệ truyền chủng, tốc 
độ khuấy, pO2. 
2.4.6. Xây dựng tiêu chuẩn ột sinh khối ào tử 
Dựa tr n chuy n luận chế phẩm iosubtyl trong DĐVN IV. 
2.4.7. Thử nghiệm độc tính, sinh khả dụng trên chuột 
Đ tín p 14 ngày. Đối tượng: DD1.1; AT14. Đối chứng: NaCl 
0,85%, HU58 (B.subtilis). Liều: 107, 108, 5x109 bào tử/g TTC. 
Xác định LD50. Giải phẫu đại thể: tìm bất thường trong nội tạng. 
Đ tín bán tr n d ễn: 60 ngày. Đối tượng: DD1.1; AT14. Đối 
chứng: NaCl 0,85%, HU58 (B.subtilis). Liều: 107 bào tử/g TTC. 
- Theo dõi: biểu hiện bất thường. 
- X t nghiệm: bất thường sinh hóa/ huyết học. 
- Vi phẫu: bất thường mô học nội tạng. 
S n k ả dụn trên u t 60 ngày. Đối tượng: DD1.1; AT14. Đối 
chứng: NaCl 0,85%, HU58 (B.subtilis), dầu gấc (β-caroten). Liều: 106 
bào tử/g TTC. 
Đánh giá t ch l y carotenoid trong gan. 
2.4.8. Ứng dụng nguyên liệu sinh khối 
2.4.8.1. Đ ều trị t êu ảy do k án s n 
Gây ti u chảy chuột bằng streptomycin và lincomycin, duy trì bằng ¼ 
liều, 1 lần/ngày. Thử nghiệm: AT14, DD1.1, S02 (1 VK hay 2 VK, 2 
lần/ngày). Quan sát phân chuột hàng ngày đến hết ti u chảy. 
 B sun v k uẩn v o sữ u : Mẫu thử: DD1.1, AT14 (106 – 
5x10
8
 bào tử/ml). Mẫu chứng: không có bào tử VK. 
7 
Đánh giá cảm quan s a chua bổ sung VK sinh carotenoid: mùi, hương 
vị, kết cấu (điểm 9 rất th ch -! 1 rất không th ch). 
Khảo sát độ ổn định của bào tử trong s a chua: từ ngày 1 - 45. 
 3 K ảo sát n ịn b o t DD1 1, AT1 ốm, ỗn dị 
Cốm, hỗn dịch bảo quản ở 25 - 30 oC. Sau 3, 6, 9 và 12 tháng: trải mẫu 
theo dõi độ ổn định của bào tử VK. 
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
3.1. Phân lập, sàng lọc và đ nh danh vi khuẩn 
Phân lập thu được 72 chủng vi khuẩn. Khu tr lại 38 chủng trực khuẩn 
Gram dương, có bào tử để nghi n cứu tiếp. 
Khả năng b t gi DPPH: hầu hết các chủng đều có khả năng sinh chất 
chống oxy hóa, 17 chủng có khả năng b t gi tr n 50% và 4 chủng có 
khả năng b t gi ! 80% sau 60 ph t (AT14, CG05.0, DD1.1, NM4). 
Phổ UV – Vis: trừ hai chủng CG10.4, CG14.3, tất cả các chủng đều có 
đỉnh hấp thu trong vùng 400 – 550 nm (vùng hấp thu của carotenoid). 
Định danh bằng giải trình tự 16S – rADN, 38 chủng phân lập thuộc các 
loài: B. infantis, B. firmus, B. aquimaris, B. ferrariarum, B. 
amyloliquefaciens, B. catenulatus, B. cibi, B. vietnamensis, B. 
boroniphilus, B. baekryungensis, B. marisflavi, B. alcalophilus, B. 
licheniformis B. selenatarsenatis, B. mangrovensis và B. indicus. 
3.2. Khảo sát các đặc điểm pro iotic 
K ả năn s n enzym n oạ b o v ố k án K ây b n : Tất cả 
không sinh lipase, 16 chủng sinh protease và amylase. 38 chủng VK thử 
nghiệm không đối kháng với VK gây bệnh. 
8 
K ả năn ịu d: Ở pH 2, AT14, AT22, CG17.0, DD1.1 và HC28 có 
khả năng sống sót cao nhất khoảng 40 - 50%. 
K ả năn ịu muố m t: Ở nồng độ 0,3%, AT14, AT22, CG17.0, 
DD1.1 và HC28 sống sót 40 - 50%. Các chủng còn lại có khả năng th ch 
nghi, phát triển giảm. 
N ạy ảm k án s n : 25 chủng nhạy cảm với tất cả 15 kháng sinh, 
trong đó có 5 chủng tiềm năng ở tr n, vì vậy chọn AT14, AT22, CG17.0, 
DD1.1 và HC28 là nh ng chủng sẽ nghi n cứu tiếp tục. 
3.3. Khảo sát điều kiện nuôi cấy và đƣờng cong tăng trƣởng 
Điều kiện phát triển: nhiệt độ 37 oC, pH 7-9. 
Đường cong tăng trưởng: thời gian ổn định dài từ 20 -36 giờ. 
 ảng 3.1. Thời gian thế hệ và các đặc t nh phát triển của 5 chủng 
Chủng Tốc độ phát triển 
(log10/giờ) 
Thời gian thế hệ 
(giờ) 
R2 Pha ổn định* 
(giờ) 
AT14 0,346 0,870 0,956 13-34 
AT22 0,291 1,033 0,981 10-44 
DD1.1 0,329 0,914 0,968 13-48 
CG17.0 0,264 1,140 0,964 10-30 
HC28 0,251 
0,023 
1,199 
13,088 
0,969 
0,979 
08-22 
30-45 
* Thời gian t nh từ T0 
3.4. Khảo sát đặc điểm sinh carotenoid 
3.4.1. Phân t ch carotenoid bằng HPLC 
Các carotenoid từ vi khuẩn thuộc nhóm xanthophyl. 
9 
Đ
ộ
 h
ấp
 t
h
u
 (
m
A
U
) 
0 
5 
40 
20 
10 
10.1 
5.1 
DD1.1 
0 
5 
40 
20 
10 8.1 
3.9 CG17.0 
10 
40 
20 
0 
3.0 
3.9 AT22 
0 
50 
200 
150 
100 
8.1 
3.9 
AT14 
Thời gian (phút) 
0 10 20 30 40 
0 
25 
100 
75 
50 7.5 
5.1 HU36 
Thời gian (ph t) 
0 10 20 30 40 
2 
8 
4 
0 
PY79 
0 
25 
100 
75 
50 
9.9 
5.1 
8.1 
HC28 
Đ
ộ
 h
ấp
 t
h
u
 (
m
A
U
) 
Hình 3.1. S c k đồ HPLC dịch chiết carotenoid từ chủng Bacillus 
3.4.2. Khảo sát sự tạo carotenoid theo thời gian 
Carotenoid ở các chủng khảo sát đạt cực đại vào đầu pha ổn định 
(DD1.1, AT14, HU36), hoặc gi a pha ổn định (AT22, CG17.0, 
HC28). 
 ảng 3.2. Thời gian carotenoid đạt cao nhất của 6 chủng khảo sát 
Chủng Hàm lƣợng carotenoid 
(μg/g SKK) 
Thời gian 
(giờ) * 
AT14 745 22 – 24 
AT22 572 24 – 26 
DD1.1 225 16 – 18 
CG17.0 257 24 – 26 
HC28 543 28 – 30 
HU36 320 44 – 46 
 * Thời gian đạt carotenoid cao nhất, SKK – sinh khối khô. 
3.5. Khảo sát môi trƣờng thay thế 
Không tìm được MTTT th ch hợp cho các chủng CG17.0, HC28 vì MT 
thay thế (MTTT) tạo sinh khối hoặc carotenoid không cao, và AT22 vì 
hiệu suất tạo bào tử thấp, hiệu quả không cao. 
10 
3.5.1. Khảo sát môi trƣờng thay thế thu tế ào sinh dƣỡng 
Chọn được MTTT cho TSB, cụ thể: 
• Đậu 5% (Đ5) dùng cho DD1.1: số lượng tế bào và lượng carotenoid 
cao hơn 5,4 và 3,7 lần so với TS . 
• Đậu – khoai 15% (ĐK15) dùng cho AT14: số lượng tế bào và lượng 
carotenoid cao hơn TS tương ứng là 5,7 và 2,15 lần. 
3.5.2. Môi trƣờng thay thế thu sinh khối ào tử 
Từ kết quả MTTT, bổ sung khoáng, khảo sát MT lỏng và MT r n: 
• AT14: MT lỏng ĐK15% + khoáng (ĐK15K), lượng bào tử cao hơn 
4,5 lần so với DSM và 2SG. Trong đó MT r n ĐK15% + khoáng 
(ĐK15KA) cho bào tử cao hơn 4,4 lần so với ĐK15K. 
• DD1.1: MT lỏng Đậu 5% + khoáng (Đ5K), thu bào tử gấp 16,8 lần 
2SG và 30,2 lần DSM. Trong đó MTTT r n (Đ5KA) cao gấp 5 lần 
Đ5K. 
Tối ưu hóa, thu được kết quả thành phần 5 khoáng K+, Mg2+, Mn2+, Ca2+, 
Fe
2+
 cần bổ sung để tối ưu lượng bào tử và carotenoid AT14, DD1.1. 
3.6. Khảo sát thông số lên men thu ào tử môi trƣờng l ng 
 ảng 3.3. Thông số l n men thu bào tử của trong môi trường lỏng 
Chủng Tỷ lệ truyền 
chủng (%) 
Tốc độ khuấy 
(vòng/phút) 
pO2 (%) 
AT14 5 350 50 
DD1.1 5 250 50 
11 
3.7. Quy trình lên men thu ào tử 
Chủng gốc AT14 
Phân lập tr n TSA, 
37
oC, 24 giờ 
Tăng sinh cấp 1, 10 ml TSB 
37
o
C, 200 vòng/ph t, 12 giờ 
Tăng sinh cấp 2, 350 ml TSB 
37
o
C, 200 vòng/ph t, 12 giờ 
L n men ở 37oC, 
trong 48 giờ 
Th m 5 ml NaCl 0,85% 
vào mỗi hộp, dùng que 
trải thu sinh khối 
7 L Môi trường ĐK15 
bổ sung agar 105 g 
72,94 ml KCl 10% 
10,42 ml MgSO4 12% 
 10,5 ml Ca(NO3)2 1M 
 6,86 ml MnCl2 10 mM 
 5,94 ml FeSO4 1 mM 
Tiệt trùng 121oC, 
1 ...  biệt so với mẫu 
đối chứng và mức độ ưa th ch !50%. 
 ào tử VK ổn định trong quá trình bảo quản s a chua (1 - 45 ngày). 
3.12.2. Độ ổn định của cốm và hỗn dịch bổ sung bào tử vi khuẩn 
Sau 12 tháng theo dõi độ ổn định của cốm và hỗn dịch bổ sung bào tử 
AT14 và DD1.1 ở nhiệt độ phòng (25 - 30oC), độ ẩm 70 – 75%, số lượng 
bào tử vi khuẩn không thay đổi nhiều. Vì vậy, có thể sử dụng AT14 hoặc 
DD1.1 trong bào chế cốm hoặc hỗn dịch. 
Chƣơng 4. BÀN U N 
4.1. Vi khuẩn sinh carotenoid 
Nghi n cứu này đã tiến hành thu thập mẫu rộng hơn tại vùng biển một số 
tỉnh Việt Nam, bao gồm cả việc lấy mẫu lặp lại tại nh ng địa điểm đã 
cho kết quả khả quan của nghi n cứu trước, kết quả đã phân lập được 72 
chủng, trong đó có 38 chủng có tiềm năng. Với 38 chủng phân lập được, 
16 
kèm theo d liệu nghi n cứu về các đặc t nh probiotic có thể làm tiền đề 
cho các nghi n cứu sâu hơn trong việc theo đuổi mục ti u nghi n cứu sử 
dụng Bacillus ứng dụng trong thực phẩm chức năng hoặc thuốc. 
Kết quả qu t phổ UV-Vis của các dịch chiết này cho thấy đa số các mẫu 
có đỉnh hấp thu trong vùng 450 - 500nm (vùng hấp thu của carotenoid). 
 n cạnh đó, kết quả phân t ch HPLC với đầu dò UV-Vis trong đề tài 
này, c ng như bởi nhóm nghi n cứu của Dự án Colorspores của Đại học 
Hoàng gia Holloway Anh Quốc có thể kết luận các chủng phân lập được 
có khả năng sinh carotenoid. 
Dựa tr n đặc t nh quan trọng của carotenoid là khả năng chống oxy hóa, 
đối chiếu với các chất chống oxy hóa đã biết như HT, vitamin C, β-
caroten, lutein, lycopene, zeaxanthin, nhận thấy khả năng chống oxy hóa 
của dịch chiết từ các chủng vi khuẩn tương đương với các chất chống 
oxy hóa truyền thống mà ch ng ta đang dùng như vitamin C, β-caroten, 
lutein,... điều này mở ra nhiều triển vọng cho các nghi n cứu s p tới về 
khả năng ứng dụng các chất chống oxy hóa từ vi khuẩn. 
Định danh bằng giải trình tự 16S rADN, 38 chủng phân lập đều thuộc 
chi Bacillus, ngoài một số loài đã được ghi nhận bởi các tác giả khác về 
khả năng sinh carotenoid, ri ng các chủng thuộc các loài: B. infantis, B. 
ferrariarum, B. catenulatus, B. vietnamensis, B. boroniphilus, B. 
baekryungensis, B. alcalophilus, B. selenatarsenatis và B. mangrovensis 
chưa thấy có tài liệu nào ghi nhận về khả năng sinh carotenoid ngoài 
nghi n cứu này. Điều này cho thấy các vi khuẩn thuộc chi Bacillus có 
nh ng loài có khả năng sinh carotenoid chưa được biết đến. 
Hầu hết các chủng có khả năng sinh enzym protease (caseinase hoặc 
gelatinase) và enzym amylase, như vậy các chủng vi khuẩn này ngoài 
17 
khả năng cung cấp carotenoid còn có thể tiết các enzym hỗ trợ cho hệ 
ti u hóa. Các chủng khảo sát có khả năng sống sót cao ở điều kiện pH và 
muối mật của hệ ti u hóa, đây là một trong nh ng đặc t nh quan trọng 
đối với việc sử dụng làm probiotic vì đảm bảo khả năng sống sót của vi 
khuẩn để có thể đến ruột non và phát huy tác dụng mong muốn. 
Các carotenoid sinh ra từ VK phân lập được đều thuộc nhóm xanthophyl. 
So sánh với chất chuẩn nhận thấy: 
• DD1.1: 2 loại carotenoid, thời gian lưu 5,1 và 10,1 ph t (ứng với 
canthaxanthin). 
• AT14: 2 loại carotenoid, đỉnh ch nh 8,1 ph t, đỉnh phụ 3,9 ph t 
(tương tự astaxanthin). 
• HC28 có đỉnh ch nh là 5,1 ph t, 2 đỉnh khác ở 8,1 và 9,9 ph t. 
• CG17.0 và AT22 có đỉnh ch nh là 3,9 ph t tương tự astaxanthin. Hai 
chủng này còn có carotenoid khác là 8,1 và 3,0 ph t. 
Việc t ch l y carotenoid có thể theo một trong hai hướng: 
• ớn 1 (tí lũy ùn vớ s n k ố tế b o - DD1.1, AT14, HU36): 
carotenoid được t ch l y cùng với sinh khối tế bào và đạt cực đại với 
sinh khối tối ưu, tương tự nghi n Veiga-Crespo và cộng sự. 
• ớn (tí lũy l ên qu n enzym t n ợp roteno d - AT22, 
CG17.0, HC28): cần đạt được hàm lượng enzym cần thiết cho việc 
sinh tổng hợp, carotenoid gần như không tăng ở pha l y thừa, tăng 
dần ở pha ổn định và đạt cực đại vào gi a hoặc cuối pha ổn định. 
Tương tự nghi n cứu Kim và cộng sự. 
4.2. Môi trƣờng thay thế 
Nhằm hướng đến mục ti u sản xuất, cần phải tìm được nguồn nguy n 
liệu giá thành thấp, s n có tại Việt Nam để thay thế môi trường thương 
18 
mại có giá thành cao, đảm bảo t nh khả thi của quy trình l n men khi đưa 
vào ứng dụng trong thực tế. 
Nghi n cứu này đã tìm ra được môi trường thay thế ở dạng r n và lỏng, 
cùng với thành phần tối ưu của khoáng chất để tạo bào tử chủng AT14 
và DD1.1 với năng suất cao và giá thành rẻ hơn gấp nhiều lần so với môi 
trường thương mại. Cụ thể đối với chủng AT14: MT lỏng ĐK15% + 
khoáng (ĐK15K) cho lượng bào tử cao hơn 4,5 lần so với DSM và 2SG. 
Trong đó MT r n ĐK15% + khoáng (ĐK15KA) cho bào tử cao hơn 4,4 
lần so với ĐK15K. Chủng DD1.1: MT lỏng Đậu 5% + khoáng (Đ5K), 
thu bào tử gấp 16,8 lần 2SG và 30,2 lần DSM. Trong đó MTTT r n 
(Đ5KA) cao gấp 5 lần Đ5K. 
4.3. ên men thu ào tử và tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối 
Từ nh ng kết quả nghi n cứu thu được, đề xuất bốn quy trình pilot l n 
men thu sinh khối bào tử đối với hai chủng vi khuẩn Bacillus sinh 
carotenoid AT14 và DD1.1 phân lập được (hai quy trình l n men tr n 
môi trường r n và hai quy trình trong môi trường lỏng) với qui mô lớn 
hơn 10.000 liều (109 bào tử/liều). 
Áp dụng sản xuất ở quy mô pilot, nhận thấy quy trình cho lượng bào tử 
ổn định, giá thành thấp hơn nhiều so với môi trường thương mại từ 2-3 
lần (l n men tr n môi trường lỏng) và từ 3,8–6,5 lần (môi trường r n). 
Nguy n liệu bào tử thu được có chi ph sản xuất giao động từ 80 – 130 
VNĐ /liều 109 bào tử AT14 (lượng carotenoid trung bình 1,13 – 1,52 
µg/liều) và 26 – 39 VNĐ /liều 109 bào tử DD1.1 (lượng carotenoid trung 
bình 0,31 – 0,42 µg/liều), chứng tỏ quy trình đáp ứng về mặt kỹ thuật và 
hiệu quả kinh tế có thể ứng dụng để sản xuất, cung cấp nguy n liệu bào 
tử AT14 và DD1.1 cho ngành dược và thực phẩm chức năng. 
19 
Quy trình l n men r n hoặc trong nồi l n men đều có nghĩa ứng dụng 
thiết thực. Cụ thể, quy trình l n men tr n môi trường r n có nhược điểm 
là tương đối thủ công, giới hạn quy mô sản xuất, tuy nhi n có thể áp 
dụng ngay để sản xuất mà không đòi hỏi phải đầu tư th m cơ sở vật chất, 
trang thiết bị, vì vậy đơn vị ứng dụng có thể dễ dàng triển khai trong giai 
đoạn đầu thăm dò thị trường, hoặc khi nhu cầu thị trường còn nhỏ. 
Ngược lại, quy trình l n men trong nồi l n men đòi hỏi phải đầu tư cơ sở 
vật chất và trang thiết bị khá tốn k m như nồi l n men, nhưng ưu điểm là 
có thể tự động hóa, sản xuất được nh ng mẻ lớn hơn so với quy trình l n 
men tr n môi trường r n, vì vậy quy trình này phù hợp khi thị trường sản 
phẩm khả quan, cần sản xuất lô lớn để cung cấp cho nhu cầu của người 
sử dụng. 
4.4. Độc tính của hai chủng AT14 và DD1.1 
Liều cao nhất 1011 bào tử/con chuột vẫn không gây chết chuột sau 72 giờ 
và 14 ngày thử nghiệm, có thể kết luận liều LD50 đường uống của DD1.1 
và AT14 >1011 bào tử /con chuột, tức >5x1012 bào tử /kg thể trọng. 
Đối với probiotic tr n thị trường, liều VK cao nhất cho người trưởng 
thành sử dụng là 1011 CFU/kg thể trọng / ngày, như vậy liều khảo sát của 
đề tài là ! 5 x 1012 bào tử /kg thể trọng/ngày đã cao gấp 50 lần so với 
liều cao nhất thực tế sử dụng. 
Thử nghiệm độc t nh bán trường diễn của DD1.1, AT14 trong 60 ngày 
thử nghiệm nhận thấy không có sự khác biệt gi a lô thử nghiệm, lô 
chứng và lô đối chứng. Ngoài ra, ở các nghi n cứu trước, DD1.1, AT14 
đã được chứng minh không mang gen gây độc. 
Từ đó, có thể kết luận hai chủng DD1.1, AT14 an toàn và có khả năng 
làm probiotic. 
20 
4.5. Hấp thu, tích lũy carotenoid từ AT14 và DD1.1 ở gan chuột 
Chuột uống bào tử AT14 và DD1.1 lượng carotenoid t ch l y trong gan 
tương đương với việc sử dụng dầu gấc và cao gấp 16 lần so với lô NaCl 
0,85% hoặc lô sử dụng bào tử VK không sinh carotenoid như B. subtilis 
HU58. 
Như vậy, có thể nói nghi n sử dụng bào tử Bacillus làm nguồn cung cấp 
carotenoid có nhiều ưu điểm: 
• Cung cấp carotenoid ngay trong đường ti u hóa và cơ thể vật chủ có 
thể hấp thu trực tiếp qua ni m mạc ruột; 
• Không cần chiết xuất trước n n không sử dụng các loại dung môi độc 
hại ảnh hưởng đến môi trường, đồng thời hạn chế nhược điểm của 
carotenoid là k m bền với nhiệt độ và tác nhân oxi hóa, gi p việc bảo 
quản đơn giản hơn. 
Đây là một hướng tiếp cận mới về nguồn và phương thức cung cấp 
carotenoid. 
4.6. Khả năng điều tr tiêu chảy liên quan đến kháng sinh 
Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng làm probiotic và thực phẩm 
chức năng của AT14, DD1.1 nói ri ng và các vi khuẩn Bacillus sinh 
carotenoid nói chung là rất lớn, không chỉ giới hạn trong phạm vi làm 
nguồn cung cấp carotenoid. Đồng thời qua kết quả này, có thể r t ra một 
số nhận x t như sau: 
- Không nhất thiết chỉ sử dụng các vi khuẩn có t nh đối kháng với vi 
khuẩn gây bệnh trong phòng và điều trị ti u chảy, nhận định này 
không nhằm mục đ ch bác bỏ các kết quả nghi n cứu đã công bố 
trước đây, nhưng là một d liệu bổ sung nhằm gi p cho các nghi n 
21 
cứu tiếp theo trong định hướng sàng lọc, lựa chọn chủng, tránh bỏ sót 
các chủng tiềm năng. 
- Gián tiếp chứng tỏ bào tử hai chủng AT14 và DD1.1 đã nảy mầm trở 
lại thành dạng sinh dư ng sau khi vào đường ti u hóa, l luận này bổ 
sung và tiếp tục khẳng định đối với kết quả hấp thu và t ch l y 
carotenoid trong gan chuột trong đề tài này, đó là: sau khi được uống 
vào, bào tử vi khuẩn đã nảy mầm và cung cấp carotenoid ngay tại 
ni m mạc ruột. 
- AT14 và DD1.1 mặc dù không có lợi điểm đề kháng với kháng sinh, 
nhưng khi dùng chung với kháng sinh liều duy trì thì có tác dụng, 
điều này là một kết quả rất đáng quan tâm vì ch ng ta sẽ không phải 
lo ngại nguy cơ chuyển gen đề kháng kháng sinh, nhưng chủng 
nghi n cứu vẫn đảm bảo được ưu điểm đó là khả năng dùng chung 
với kháng sinh trong điều trị ti u chảy. 
4.7. Khả năng ứng dụng ào tử AT14 và DD1.1 sinh carotenoid trên 
một số d ng chế phẩm 
Tr n các dạng chế phẩm thử nghiệm như s a chua, thuốc cốm, hỗn dịch, 
bào tử AT14 và DD1.1 cho các kết quả khả quan. Độ ổn định của bào tử 
là 45 ngày đối với s a chua, 12 tháng đối với thuốc cốm và hỗn dịch. 
Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của bào tử AT14 và DD1.1 tr n 
các dạng chế phẩm là rất lớn, có thể sử dụng bào tử vi khuẩn AT14 và 
DD1.1 làm probiotic để cung cấp carotenoid. 
KẾT U N 
Mục ti u của đề tài là nghi n cứu, phân lập một số vi khuẩn Bacillus sinh 
carotenoid, từ đó xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối làm nguy n 
22 
liệu probiotic cung cấp carotenoid. Sau thời gian thực hiện, các kết quả 
nghi n cứu trong luận án đã đáp ứng các mục ti u đặt ra, đã hoàn thành 
các nội dung nghi n cứu: 
1. Phân lập vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid và khảo sát đặc điểm 
probiotic 
Đã phân lập, định danh 38 chủng Bacillus, ngoại trừ khả năng đối kháng 
với vi khuẩn gây bệnh, 38 chủng đều có nh ng đặc điểm probiotic và có 
khả năng sinh carotenoid. Từ đó chọn được hai chủng có tiềm năng là 
Bacillus infantis AT14, Bacillus marisflavi DD1.1 để nghi n cứu sản 
xuất và ứng dụng. 
2. Đặc điểm sinh carotenoid từ các chủng phân lập đƣợc 
Các chủng tiềm năng đều có khả năng sinh carotenoid thuộc nhóm 
xanthophyl. Hàm lượng carotenoid t ch l y đạt cực đại vào cuối pha l y 
thừa hoặc trong pha ổn định tr n đường cong tăng trưởng. Do đó, có thể 
thu nhận carotenoid cao nhất cùng với thời điểm sinh khối tế bào đạt cực 
đại. 
3. Môi trƣờng nuôi cấy thay thế và điều kiện nuôi cấy 
Xác định được các điều kiện tăng trưởng của các chủng và tìm được môi 
trường giá thành thấp như đậu và khoai tây để thay thế các môi trường 
thương mại đ t tiền. Môi trường nghi n cứu có giá thành rẻ hơn và khả 
năng tạo bào tử cao hơn nhiều lần so với môi trường thương mại. 
4. Quy trình lên men ở quy mô pilot để sản xuất sinh khối ào tử 
Đã xây dựng được các quy trình l n men ổn định, có năng suất cao và 
giá thành thấp tr n môi trường r n và lỏng để sản xuất sinh khối bào tử 
của các vi khuẩn B. marisflavi DD1.1 và B. infantis AT14. 
23 
- L n men tr n môi trường r n với qui mô mỗi mẻ 15.000 liều bào tử 
Bacillus infantis AT14 (10
9
 bào tử /liều) và 75.000 liều bào tử 
Bacillus marisflavi DD1.1 (10
9
 bào tử/liều). 
- L n men trong môi trường lỏng với qui mô mỗi mẻ 25.000 liều 
Bacillus infantis AT14 (10
9
 bào tử/liều), và 55.000 liều Bacillus 
marisflavi DD1.1 (10
9
 bào tử /liều). 
5. Tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu 
Đã xây dựng các ti u chuẩn cơ sở cho nguy n liệu bột sinh khối. 
6. Khả năng ứng dụng của sinh khối ào tử thu đƣợc 
Các chủng B. marisflavi DD1.1 và B. infantis AT14 không có độc t nh 
qua thử nghiệm độc t nh cấp và bán cấp, với LD50 > 5x10
12
 CFU/kg. 
Đã chứng minh được các carotenoid sinh ra từ các chủng B. marisflavi 
DD1.1 và B. infantis AT14 được hấp thu vào cơ thể vật chủ qua ni m 
mạc ruột và t ch l y ở gan chuột. 
 ào tử B. marisflavi DD1.1 và B. infantis AT14 đã được chứng minh có 
khả năng điều trị ti u chảy li n quan đến kháng sinh tr n mô hình chuột 
khi sử dụng độc lập hoặc phối hợp với chủng B. subtilis BS02. 
 ào tử của các chủng B. marisflavi DD1.1 và B. infantis AT14 có thể 
được sử dụng làm vi khuẩn probiotic bổ sung vào chế phẩm s a chua 
cung cấp carotenoid với liều l n đến 1010 bào tử/ 100 ml s a chua mà 
không làm mất cảm quan hay mùi vị sản phẩm. 
 ột nguy n liệu bào tử và các dạng thuốc cốm, hỗn dịch chứa bào tử của 
các chủng B. marisflavi DD1.1 và B. infantis AT14 ổn định trong 12 
tháng. 
24 
KIẾN NGHỊ 
Tiến hành thử nghiệm độc t nh và thử nghiệm lâm sàng tr n người 
tình nguyện đối với các chủng này. 
Tăng qui mô l n men để thu bào tử với lượng lớn hơn. 
 ào chế các chế phẩm sử dụng các chủng này để phục vụ việc chăm sóc 
và bảo vệ sức khỏe. 
DANH MỤC CÁC C NG TR NH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC 
GIẢ ĐÃ C NG BỐ IÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI U N ÁN 
1. Trần H u Tâm, Trần Cát Đông, Nguyễn Văn Thanh (2014), 
“Nghi n cứu t nh an toàn và sinh khả dụng của hai chủng vi 
khuẩn Bacillus sinh carotenoid”, Tạp í D ợ ọ , số 457: 
tr.30-36. 
2. Trần H u Tâm, Nguyễn Thị Linh Giang, Nguyễn Văn 
Thanh, Trần Cát Đông (2014), “Khả năng điều trị ti u chảy 
li n quan đến kháng sinh tr n mô hình chuột của bào tử của 
trực khuẩn sinh carotenoid phân lập tại Việt Nam”, Tạp í Y 
 ọ T ự n , số 916: tr.28-31. 
3. Trần H u Tâm, Trần Thị Thanh Thảo, Trần Cát Đông 
(2014), “Nghi n cứu bổ sung Bacillus sinh carotenoid vào 
s a chua”, Tạp í Y ọ TP CM. 18(2): tr.267-271. 
4. V Thanh Thảo, Nguyễn Minh Thái, Nguyễn Thị Linh 
Giang, Trần H u Tâm, Trần Cát Đông (2014), “Nghi n cứu 
đặc t nh probiotic của Bacillus subtilis S02”, Tạp í Y ọ 
t ự n , số 907(3): tr. 20-24. 
5. L Minh Tr , Trần H u Tâm, Trần Thị Thanh Thảo, Trần 
Cát Đông (2011), “Khảo sát môi trường nuôi cấy Bacillus 
sinh carotenoid từ các nguồn nguy n liệu rẻ tiền”, Tạp í Y 
 ọ TP.HCM. 15(1): tr. 189-194. 
6. V Thanh Thảo, Trần H u Tâm, Trần Thành Đạo, Trần Cát 
Đông (2011), “Khảo sát sự tạo carotenoid theo thời gian ở 
pha sinh dư ng của một số chủng B llus”. Tạp í Y ọ 
TP.HCM. 15(1): tr. 211-217.