Phân tích mối tương quan giữa đột biến gen atp7b và kiểu hình của bệnh nhân wilson ở Việt Nam

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
ĐỖ THANH HƯƠNG
PHÂN TÍCH MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA 
ĐỘT BIẾN GEN ATP7B VÀ KIỂU HÌNH CỦA BỆNH NHÂN WILSON Ở VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
HÀ NỘI - 2016
	BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 	 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
ĐỖ THANH HƯƠNG
PHÂN TÍCH MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA 
ĐỘT BIẾN GEN ATP7B VÀ KIỂU HÌNH CỦA BỆNH NHÂN WILSON Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành	: Thần kinh
Mã số	: 62720147
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Trần Vân Khánh
2. PGS.TS. Nguyễn Văn Liệu
HÀ NỘI - 2016
LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Đỗ Thanh Hương, nghiên cứu sinh khóa 31 trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Thần kinh, xin cam đoan:
Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện với sự hướng dẫn của PGS. TS. Trần Vân Khánh và PGS.TS. Nguyễn Văn Liệu.
Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam.
Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam đoan này.
Hà Nội, ngày 18 tháng 3 năm 2016
Người viết cam đoan
Đỗ Thanh Hương
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, động viên của các Thầy, Cô, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp cùng các cơ quan hữu quan.
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Văn Liệu và PGS.TS. Trần Vân Khánh - những người Thầy trực tiếp hướng dẫn khoa học, tận tình giúp đỡ, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Tạ Thành Văn, Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, PGS.TS. Nguyễn Thị Hà và TS. Trần Huy Thịnh - Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, những người Thầy đã động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuân lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến:
Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học,
Ban Chủ nhiệm, các Thầy, Cô Bộ môn Thần kinh; các Thầy, Cô Bộ môn Nhi đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án.
Các Thầy, Cô trong Hội đồng thông qua đề cương, các Thầy Cô trong Hội đồng chấm Học phần Tiến sỹ, Chuyên đề Tiến sỹ, Tiểu luận tổng quan và Hội đồng đánh giá Luận án đã cho tôi những ý kiến đóng góp quý báu để hoàn thành chương trình học và hoàn thiện luận án.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Cán bộ và nhân viên Khoa Thần kinh, Khoa Gan mật, Khoa Tiêu hóa - Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Nhi Trung ương.
Ban Giám đốc, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Khoa Lưu trữ hồ sơ - Bệnh viện Bạch Mai.
Ban Giám đốc, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Khoa Lưu trữ hồ sơ - Bệnh viện Nhi Trung ương.
Tôi xin ghi nhớ sự động viên, giúp đỡ nhiệt tình của các Thầy, Cô, các cán bộ tại Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, đã taọ điều kiện giúp tôi hoàn thành luận án.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến bệnh nhân và gia đình các bệnh nhân đã đồng ý tham gia vào nghiên cứu để giúp tôi có được những số liệu trong luận án này.
Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp đã động viên giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình công tác và học tập.
Cuối cùng, tôi xin biết ơn gia đình, những người thân đã dành cho tôi sự giúp đỡ vật chất, tình thương yêu, sự chia sẻ và là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Hà Nội, ngày 18 tháng 03 năm 2016
Đỗ Thanh Hương
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATP7B	: P-type ATPase
CT	: Computer Tomography Scanner (Cắt lớp vi tính)
ddATP	: Dideoxyadenin triphosphat
ddCTP	: Dideoxycitosin triphosphat
ddGTP	: Dideoxyguanin triphosphat
ddNTP	: Dideoxynucleoside triphosphat
ddTTP	: Dideoxytimin triphosphat
DNA	: Deoxyribonucleic acid
dNTP	: Deoxynucleoside triphosphat
Kb	: Kilobase
kD	: Kilo dantol
MRI	: Magnetic Resonance Image (Cộng hưởng từ)
MRS	: Magnetic Resonance Spectroscopy (Cộng hưởng từ quang phổ)
PCR	: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi)
pDHPLC 	: Partially Denaturing High-Performance Liquid Chromatography 	 (Sắc ký lỏng cao áp biến tính một phần)
PET	: Positron Emission Tomography (Cắt lớp phát điện tử dương)
PRNP	: Protein prion
SNP	: Single Nucleotid Polymorphisms (Đa hình đơn nucleotid)
ALT	: Alanine aminotransferase
AST	: Aspartate aminotransferase
MBDs	: Metal Binding Domains (vùng gắn kim loại)
 MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG 
Bảng 1.1. 	Chỉ số tiên lượng suy gan tối cấp 	26
Bảng 1.2. 	Kế hoạch ứng dụng lâm sàng của liệu pháp gen	27
Bảng 1.3. 	Một số dạng đột biến phổ biến trên thế giới	30
Bảng 1.4. 	Kiểu gen trên bệnh nhân Wilson Trung Quốc 	34
Bảng 2.1. 	Thang điểm chẩn đoán bệnh Wilson theo Ferenci 	47
Bảng 2.2. 	Thành phần phản ứng PCR	54
Bảng 2.3. 	Chu trình nhiệt phản ứng PCR	55
Bảng 2.4. 	Thành phần của phản ứng sequencing	55
Bảng 2.5. 	Chu trình nhiệt của phản ứng sequencing	56
Bảng 3.1. 	Tuổi khởi phát bệnh	58
Bảng 3.2. 	Triệu chứng ở giai đoạn khởi phát	59
Bảng 3.3. 	Triệu chứng ở giai đoạn toàn phát	60
Bảng 3.4. 	Tiền sử gia đình của bệnh nhân Wilson	61
Bảng 3.5. 	Định lượng ceruloplasmin huyết thanh	61
Bảng 3.6. 	Định lượng transaminase huyết thanh	62
Bảng 3.7. 	Xét nghiệm đồng niệu 24 giờ	62
Bảng 3.8. 	Kết quả siêu âm ổ bụng	63
Bảng 3.9. 	Kết quả chụp MRI sọ não	64
Bảng 3.10. 	Phân bố đột biến trên gen ATP7B của bệnh nhân Wilson	67
Bảng 3.11: 	Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của các bệnh nhân Wilson mang đột biến mới và đột biến đã được công bố gây bệnh trên gen ATP7B	68
Bảng 3.12. 	Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và số alen đột biến	74
Bảng 3.13. 	Chỉ số tương quan giữa các thể lâm sàng và số alen đột biến	77
Bảng 3.14. 	Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và dạng đột biến	78
Bảng 3.15. 	Chỉ số tương quan giữa các thể lâm sàng và dạng đột biến	82
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. 	Chu trình chuyển hóa của đồng trong cơ thể 	6
Hình 1.2. 	Hình ảnh vòng Kayser-Fleischer ở rìa giác mạc	9
Hình 1.3. 	Hình ảnh đục nhân mắt hình hoa hướng dương	10
Hình 1.4: 	Hình ảnh giảm tỷ trọng trên CT sọ não bệnh nhân nữ 14 tuổi bị bệnh Wilson	15
Hình 1.5. 	Hình ảnh MRI sọ não của bệnh nhân Wilson	16
Hình 1.6. 	Hình ảnh chụp PET não của bệnh nhân Wilson	19
Hình 1.7. 	Cấu trúc protein ATP7B	29
Hình 1.8. 	Phân bố một số đột biến trên gen ATP7B.	32
Hình 1.9. 	Phân bố đột biến trên gen ATP7B	33
Hình 1.10. 	Phả hệ một gia đình bị bệnh di truyền lặn trên NST thường	35
Hình 1.11. 	Vị trí đột biến trên gen ATP7B 	37
Hình 1.12. 	Nguyên tắc kỹ thuật pDHPLC 	39
Hình 1.13. 	Hình ảnh minh họa xác định đột biến R778W trên gen ATP7B bằng kỹ thuật cắt enzym giới hạn	40
Hình 1.14. 	Trình tự nucleotid được xác định trên máy giải trình tự gen 	41
Hình 1.15. 	Các dạng đột biến và thể lâm sàng của bệnh Wilson 	43
Hình 3.1. 	Tỷ lệ mắc bệnh theo giới	58
Hình 3.2. 	Hình ảnh tăng tín hiệu nhân xám đối xứng 2 bên trên phim MRI của bênh nhân mã số W56.00 (mũi tên màu đỏ)	64
Hình 3.3. 	Các thể lâm sàng của bệnh Wilson	65
Hình 3.4. 	Hình ảnh sản phẩm PCR đoạn gen ở exon 8 của gen ATP7B.	66
Hình 3.5. 	Hình giải trình tự gen của bệnh nhân mã W8.00	72
Hình 3.6. 	Hình giải trình tự gen của bệnh nhân mã W37.00	72
Hình 3.7. 	Hình giải trình tự gen của bệnh nhân mã W38.00	73
Hình 3.8. 	Phân bố tuổi khởi phát và số alen đột biến	75
Hình 3.9. 	Phân bố nồng độ cerulopllasmin huyết thanh và số alen đột biến	75
Hình 3.10. 	Phân bố nồng độ đồng niệu 24 giờ và số alen đột biến	76
Hình 3.11. 	Phân bố thể lâm sàng và số alen đột biến	77
Hình 3.12. 	Phân bố tuổi khởi phát và dạng đột biến	79
Hình 3.13. 	Phân bố nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và dạng đột biến	80
Hình 3.14. 	Phân bố đồng niệu 24 giờ và dạng đột biến	81
Hình 3.15. 	Phân bố dạng đột biến và thể lâm sàng của bệnh Wilson	81
Hình 4.1. 	Hình ảnh bệnh nhân mã số W55.00	111
Hình 4.2. 	Hình giải trình tự gen của bệnh nhân mã W55.00	112
Hình 4.3. 	Hình ảnh bệnh nhân W31.00 (A) và hình ảnh MRI sọ não (B)	113
Hình 4.4. 	Hình giải trình tự gen của bệnh nhân mã W31.00	114
Hình 4.5. 	Hình ảnh bệnh nhân W58.00 (A) và hình ảnh MRI sọ não (B)	115
Hình 4.6. 	Hình giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số W58.00	116
Hình 4.7. 	Hình ảnh gia đình bệnh nhân mã số W58.00	118
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Y học hiện đại đã có những bước tiến nhanh trong khoảng vài thập kỷ trở lại đây, sau sự kiện các nhà khoa học hoàn tất việc giải mã bộ gen người. Cơ chế bệnh sinh dần dần được sáng tỏ ở mức độ phân tử, làm tiền đề cho việc chẩn đoán và điều trị can thiệp trúng đích nhằm giải quyết tận gốc căn nguyên của bệnh. Năm 1993 Kary Mullis, người phát minh ra kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction: phản ứng khuếch đại chuỗi) được trao giải Nobel về hóa học. Từ đó kỹ thuật PCR được nhanh chóng được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về lĩnh vực sinh học phân tử. 
	Những tiến bộ của ngành hoá sinh, sinh học phân tử đã giúp sàng lọc, chẩn đoán sớm, phòng bệnh, điều trị tốt hơn các bệnh rối loạn chuyển hóa và di truyền... Mặc dù không phổ biến như một số nhóm bệnh khác nhưng đây là nhóm gây nhiều khó khăn trong điều trị và để lại hậu quả rất nặng nề về sức khỏe, tinh thần cũng như chất lượng cuộc sống cho bệnh nhi, đồng thời trở thành, gánh nặng cho gia đình và toàn thể xã hội. 
	Bệnh Wilson thuộc nhóm bệnh lý rối loạn chuyển hóa và di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường với tỷ lệ mắc bệnh là 1/30.000 trẻ [1]. Bệnh gây nên do đột biến gen ATP7B, là gen có vai trò điều hòa quá trình chuyển hóa đồng trong cơ thể. Khi đột biến gen xảy ra sẽ gây rối loạn quá trình chuyển hóa đồng, làm cho lượng đồng tăng cao trong cơ thể và tích lũy dần ở các cơ quan (gan, não, mắt) gây ra các triệu chứng đa dạng trên lâm sàng, các triệu chứng này tiến triển nặng dần cùng với quá trình lắng đọng đồng theo thời gian. Ngoài ra, đồng có thể lắng đọng ở hầu hết các cơ quan khác trong cơ thể nhưng thường biểu hiện nhẹ và muộn hơn. Bệnh nhân Wilson thường biểu hiện triệu chứng vềề gan nhiều hơn triệu chứng về thần kinh ở nhóm dưới 10 tuổi, các triệu chứng thần kinh hay gặp hơn ở bệnh nhân sau 30 tuổi [1].
	Hiện nay, để chẩn đoán xác định bệnh cần có sự kết hợp giữa các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình như: nồng độ ceruloplasmin huyết thanh, nồng độ đồng trong nước tiểu 24 giờ, định lượng đồng trong gan hoặc chẩn đoán hình ảnh não và gan.
	Trong thực hành lâm sàng, chẩn đoán và điều trị sớm bệnh Wilson đóng vai trò quan trọng vì có thể tránh được các tiến triển nặng của bệnh dẫn đến tử vong. Ngày nay, phát hiện đột biến trên gen ATP7B sẽ giúp chẩn đoán xác định bệnh sớm hơn, phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh nhằm ngăn ngừa và làm giảm tỷ lệ mắc bệnh. Bên cạnh đó, xác định mối tương quan giữa kiểu gen ATP7B với thể lâm sàng của bệnh Wilson sẽ giúp cho tiên lượng bệnh và có phác đồ điều trị chính xác, hiệu quả hơn.
	Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về xác định đột biến gen ATP7B, xác định mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh Wilson. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về bệnh Wilson trước đây chủ yếu là mô tả về đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng [2],[3],[4]. Trong vài năm gần đây, một số nghiên cứu về phát hiện đột biến trên gen ATP7B đã bắt đầu được triển khai [5],[6],[7],[8]. Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào về phân tích mối tương quan giữa kiểu gen ATP7B và kiểu hình của bệnh Wilson tạo cơ sở cho việc tiên lượng bệnh và đưa ra phác đồ điều trị chính xác, hiệu quả. Do đó đề tài: “Phân tích mối tương quan giữa đột biến gen ATP7B và kiểu hình trên bệnh nhân Wilson ở Việt Nam” được thực hiện với 2 mục tiêu:
Mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân Wilson.
Phân tích mối tương quan giữa kiểu gen ATP7B và kiểu hình của bệnh nhân Wilson.
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm bệnh Wilson
1.1.1. Khái niệm về bệnh Wilson 
Từ năm 1912, tác giả Wilson đưa ra những khái niệm đầu tiên về bệnh: bệnh thoái hóa gan - nhân đậu có tính chất gia đình [9].
Sau đó bệnh Wilson được mô tả là bệnh di truyền, rối loạn chuyển hóa đồng với các tổn thương đặc trưng ở não, gan và mắt.
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh Wilson
Trên thế giới 
Bệnh Wilson được mô tả từ cuối thế kỷ XIX với các triệu chứng mang tính chất đơn lẻ: triệu chứng run với tên gọi là bệnh "xơ cứng giả hiệu"; vòng Kayser và Fleischer màu xanh ở rìa giác mạc [10].
Năm 1912, bệnh mang tên Wilson, với những mô tả đầy đủ các triệu chứng tổn thương thoái hóa gan và não, có tính chất gia đình [9].
Những năm sau đó, các tác giả tìm thấy rối loạn chuyển hóa đồng ở các bệnh nhân Wilson, ứng dụng trong điều trị thải đồng và ghép gan [10],[11], [12],[13],[14],[15].
Từ sau năm 1993, các nhà khoa học đã phát hiện gen gây bệnh Wilson là gen lặn ATP7B trên nhiễm sắc thể số 13, ở vị trí 13q14.3 [16],[17].
Năm 1995, với những nghiên cứu phát hiện đột biến đầu tiên: đột biến p.H1069Q ở châu Âu và p.R778L ở châu Á đã mở ra một kỷ nguyên mới cho các nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B ở các bệnh nhân Wilson [18],[19].
Từ đó đến nay, có rất nhiều các công trình nghiên cứu về phát hiện đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson và đã phát hiện ra hơn 500 dạng đột biến gen khác nhau được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen (
Ở Việt Nam
Năm 1969, Bùi Quốc Hương và cộng sự đã báo cáo 8 trường hợp bệnh nhân Wilson Việt Nam đầu tiên tại Hội nghị Thần kinh học Quốc tế lần thứ IX ở Mỹ [20]. 
Năm 1975, Chu Văn Tường và cộng sự nhận xét hai trường hợp bệnh Wilson đầu tiên tại Bệnh viện Nhi Trung Ương [21]. 
Từ năm 1977 đến năm 2003, Lê Đức Hinh và cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 81 bệnh nhân Wilson ở Việt Nam [2],[3].
Năm 2010, Đỗ Thanh Hương và cộng sự là nhóm nghiên cứu đầu tiên phân tích đột biến trên gen ATP7B. Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu mới chỉ tập trung phân tích một dạng đột biến phổ biến ở vùng châu Á là đột biến Arg778Leu bằng phương pháp cắt enzym giới hạn. Nghiên cứu đã phát hiện được 2/29 bệnh nhân mang đột biến Arg778Leu dạng dị hợp tử [5].
Năm 2012, Lê Hoàng Phúc phát hiện 8/16 bệnh nhân mang đột biến trên các exon 8, 10, 12, 13, 15, 16 và 20 ở bệnh nhân Wilson tại Bệnh viện Nhi Đồng 1, Thành phố Hồ Chí Minh [6].
Năm 2015, nghiên cứu tại Bệnh viện Nhi Trung ương phát hiện 10/16 bệnh nhi mang đột biến khi giải trình tự gen trên các exon 2b, 8, 11, 12 và 13 [7].
Năm 2015, nghiên cứu của Phan Tôn Hoàng tại Trường Đại học Y Hà Nội tiến hành phát hiện đột biến trên 21 exon của gen ATP7B, nghiên cứu đã phát hiện 48/61 (78,6%) bệnh nhân Wilson có đột biến gen ATP7B [8].
1.1.3. Dịch tễ bệnh Wilson 
Tại Hoa Kỳ, tỷ lệ người mang gen bệnh là 1/90. Tỷ lệ mắc bệnh Wilson là 1/30.000 người.
Trên thế giới, tỷ lệ hiện mắc bệnh Wilson là 10 - 30 triệu người, trong đó tỉ lệ người mang dị hợp tử là 1/ 100.000 người, với tần số đột biến gen khác nhau 0,3-0,7%. Tại Nhật Bản, tỷ lệ này là 1/30.000 dân, so với 1/100.000 dân ở Úc. Sự gia tăng tần số bệnh ở một số nước là do tỷ lệ cao c ... -Qing Huang, Xuan Shang, et al (2011). Mutation analysis of 73 southern Chinese Wilson’s disease patients: identification of 10 novel mutations and its clinical correlation. Journal of Human Genetics. 56, 660-665.
59.	Yasuaki Tatsumi, Ai Hattori, Hisao Hayashi, et al (2010). Current state of Wilson disease patients in central Japan. International Medicine. 49, 809-815.
60.	Danadevi Kuppala, Jie Deng, et al (2009). Wilson disease mutations in the American population: Identification of five novel mutations in ATP7B. The Open Hepatology Journal. 1, 1-4.
61.	Marta M. Deguti, Janine Genschel, et al (2004). Wilson disease: Novel mutation in the ATP7B gene and clinical correlation in Brazilian Patients. Human mutation. 698.
62.	Annu Aggarwal, Gursimran Chandhok, Theodor Todorrov, et al (2013). Wilson disease mutation pattern with genotype-phenotype correlations from Western India: Confirmation of p.C271* as a common Indian mutation and identification of 14 novel mutation. Annals of Human Genitics. 77, 299-307.
63.	Tawhida Y, Abdelghaffar, et al (2008). Mutational analysis of ATP7B gene in Egyptian children with Wilson disease: 12 novel mutations. Journal of Human Genetics. 53, 681-687.
64.	Narges Zali, Seyed Reza Mohebbi, et al. (2011). Prevalence of ATP7B gene mutations in Itanian patients with Wilson disease. Hepatitis Monthly. 11(11). 890-894.
65.	Aleksandra Tomic, Valerija Dobricie, et al (2013). Mutational analysis of ATP7B gene the genotype-phenotype correlation in patients with Wilson's disease in Serbia. Vojnosanitetski Pregled. 70(5), 457-462.
66.	Gromadzka G., Schmidt HJ., Genschel J., et al (2005). Frameshift and nonsense mutations in the gene for ATP7B are associated with severe impairment of cooper metabolism and with 	an early clinical manifestation of Wilson's disease. Clinical Genetics. 68, 	524-532.
67.	Slavka Vrabelova, Ondrej Letocha, Marek Borsky, et al (2005). Mutation analysis of the ATP7B gene and genotype-phenotype 	corelation in 227 patients with Wilson disease. Molecular Genetics 	and Metabolism. 86, 277-285.
68.	Maria-Barbara Lepori, Antonietta, et al (2012). Mutation analysis of the ATP7B gene in a new group of Wilson's disease patients: contribution to diagnosis. Molecular and Cellular Probes. 26, 147-150.
69.	Ferenci P. (2006). Regional distribution of mutations of the ATP7B gene in patients with Wilson disease: impact on genetic testing. Human Genetics. 120(2), 151-159.
70.	Xiao-Qing Liu, Ya-Fen Zhang, Tze-Tze Liu, et al (2004). Correlation of ATP7B genotype with phenotype in Chinese patients with Wilson disease. World Journal of Gastroenterology.  10(4), 590-593.
71.	Tạ Thành Văn, Hồ Cẩm Tú, Tạ Minh Hiếu và cộng sự (2011). Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson. Tạp chí nghiên cứu Y học. 3.
72.	Dominik Huster, Angelika Kühne, Ashima Bhattacharjee (2012). Diverse functional properties of Wilson disease ATP7B variants. Gastroenterology. 142(4), 947-956.
73.	Theru A. Sivakumaran, Kiran Kucheria and Peter J. Oefner (2003). Denaturing high performance liquid chromatography in the molecular diagnosis of genetic disorders. Current science. 84(3), 293.
74.	Sandeep Kumar, Baburam Thapa, et al (2007). Analysis of most common mutations R778G, R778L, R778W, I1102T and H1069Q 	in Indian Wilson disease patients: Correlation between genotype/phenotype/copper ATPase activity. Molecular and 	Cellular Biochemistry. 294, 1–10

75.	Khuất Hữu Thanh (2005). Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
76.	Litwin T., G. Gromadzka, J. Samochowiec, et al (2012). 	Association of dopamine receptor gene polymorphisms with the clinical course of 	Wilson disease. JIMD Reports. 163.
77.	J. Jason L. Burkhead., Lawrence W. Gray, Svetlana Lutsenko (2011). System biology approach to Wilson’s disease. Biometals. 24(3), 455-466.
78.	Peter Ferenci (2014). Phenotype-genotype correlations in patients with Wilson’s disease. Annals New York Academyof Sciences. 1315, 1-5.
79.	Toshihide Okada, Yuta Shiono, Yoshibumi Kaneko (2010). High prevalence of fulminant hepatic failure among patients with mutant alleles for truncation of ATP7B in Wilson’s disease. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 45, 1232-1237.
80.	Tawhida Y Abdel Ghaffar, Solaf M Elsayed, Suzan Elnaghy, et al (2011). Phenotypic and genetic characterization of a cohort of pediatric Wilson disease patients. BMC Pediatrics,  11(56).
81.	Beom H. Lee, Joo H. Kimim, Sun Y. Lee, Hye Y. Jin, et al (2011). Distinct clinical courses according to presenting phenotypes and their correlations to ATP7B mutations in a large Wilson’s disease cohort. Liver International.
82.	Członkowska (2014). Concordance rates of Wilson’s disease phenotype among siblings. Journal of Inherited Metabolic Disease. 37. 131-135.
83.	Violeta Mihaylova, Teodor Todorov, Hristo Jelev (2012). Neurological symptoms, genotype-phenotype correlations and ethnic specific differences in Bulgarian patients with Wilson disease. The Neurologist. 18(4), 13-16.
84.	Xin-Hua Li, Yi Lu, Yun Ling, Qing-Chun Fu, et al (2011). Clinical and molecular characterization of Wilson’s disease in China: identification of 14 novel mutations. BMC Medical Genetics. 12(6). 16-21.
85.	Lisbeth Birk Moller, Nina Horn, Tina Dysgard Jeppesen (2011). Clinical presentation and mutations in Danish patients with Wilson disease. European Journal of Human Genetics. 19, 935-941.
86.	Sheng Ye, Liang Gong, Quan-Xiang Shui, et al (2007). Wilson disease: Identification of two novel mutations and clinical correlation in Eastern Chinese patients. World Journal of Gastroenterology.  13(38), 5147-5150.
87.	Santhosh S., RV Shaji, CE Eapen, (2008). Genotype-phenotype correlation in Wilson’s disease within families a report on four south Indian families. World Journal of Gastroenterology,  com/1007-9327/full/v10/i4/590.htm. 14(29), 4672-4676.
88.	Ricardo Schmitt de Bem, Salmo Raskin (2013). Wilson’s disease in Southern Brazil: genotype-phenotype correlation and description of two novel mutations in ATP7B gene. Archives of Neuropsychiatry. 71(8), 503-507.
89.	Waldenström E., Lagerkvist A., Dahlman T., et al (1996). The Wilson disease gene: spectrum of mutations and their consequences. Nature Genetics. 9, 210-217.
90.	Stapelbroek JM., Bollen CW., Ploos van Amstel JK., et al (2004). The H1069Q mutation in ATP7B is associated with late and neurologic presentation in Wilson disease: results of a meta-analysis. J Hepatol. 41, 758-763.
91.	Gromadzka G., Chabik G., Mendel T., (2010). Middle-aged heterozygous carriers of Wilson’s disease do not present with significant phenotypic deviations related to copper metabolism. Journal of Genetics. 89(4), 463-467.
92.	Dastsooz H., Dehghani SM., Imanieh MH. (2013). A new ATP7B gene mutation with severe condition in two unrelated Iranian families with Wilson disease. Gene Reviews, 514(1), 48-53.
93.	Radan Bruha, Zdenek Marecek, Lenka Pospisilova (2010). Long term follow up of Wilson Disease: natural history, treatment, mutations analysis and phenotypic correlation. Liver International. ISSN 1478-3223, 83-91.
94.	Karl Heinz Weiss, Uta Merle, Mark Schaefer (2006). Copper toxicosis gene MURR1 is not changed in Wilson disease patients with normal blood ceruloplasmin levels. World Journal of Gastroenterology. 
	 12(14), 2239-2242.
95.	Prashanth LK., Taly AB., et al. (2004). Wilson's disease: diagnosis errors and clinical implications. Journal of Neurology Neurosurgery and Psychiatry. 907-909.
96.	Maier Dobersberger T., Peter Ferenci (1997). Detection His1069Gln mutation in Wilson disease by rapid polymerase chain reaction. Pubmed ID. 127(1), 21-26.
97.	Emanuele Nicastro, et al (2009). Genotype-phenotype correlation in Italian children with Wilson's disease. Hepatology. 50, 555-561.
98.	Tan Nguyen Nang (2005). Clinical feature and magnetic resonance imaging of Wilson disease-4 cases report. Parkison and related disorders: international congress on PD and related disorder Berlin. 11, 149.
99.	Jayantee Kalita, Bindu I Somarajan, et al. R778L, H1069, and I1102T mutation study in neurologic Wilson disease (2010). Neurology India. 58, 627-630.
100.	Shantala Hegde, Sanjib Sinha, et al (2010). Cognitive profile and structural findings in Wilson's disease: A neuropsychological and MRI-based study. Neurology India. 58, 708-813.
101.	Cullen LM, Prat L, Cox DW (2003). Genetic variation in the promoter and 5' UTR of the copper transporter, ATP7B, in patients with Wilson disease. Clinical Genetics, 64, 429-432.
102.	Lee CC., Wu JY., Tsai FJ., et al (2000). Molecular analysis of Wilson disease in Taiwan: identification of one novel mutation and evidence of haplotype-mutation association. Journal of Human Genetics. 45, 275-279.
103.	Huyng-Doo Park, Huyn Kyung Park (2010). Association of ATP7B mutation detection rate with biochemical characteristics in Korean patients with Wilson disease. Annals of clinical laboratory science. 40(1), 15-19.
104.	Curtis D, Durkie M. A (1999). Study of Wilson disease mutations in Britain. Human Mutations. 14, 4-11.
105.	Julnar Usta J., Antonios Wehbeh, Khaled Rida et al (2014). Phenotype-genotype correlation in Wilson disease in a large Lebanese family: Association of c.2299insC with hepatic and of p.Ala1003Thr with neurologic phenotype. Plos one, www.plosone.org. 9(11), e109727, 1-9.
PHỤ LỤC 1
Nghiên cứu được thực hiện tại Trung Tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài: “Nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson”, Trích từ ngân sách sự nghiệp khoa học cấp Bộ Y tế.
Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. TRẦN VÂN KHÁNH
PHỤ LỤC 2
BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU BỆNH WILSON
STT: ......	Mã bệnh án: .................	Mã nghiên cứu: ...........
Ngày thu thập bệnh án:
I. Hành chinh
Họ và tên bệnh nhân: 
Tuổi
Giới: 	1. Nam	2. Nữ
Nghề nghiệp: 
Dân tộc: 
Địa chỉ:
Điện thoại liên hệ: 
Họ tên bố:	Tuổi: 	Nghề nghiệp:
Họ và tên mẹ:	Tuổi:	Nghề nghiệp:
Ngày vào viện
Ngày ra viện:
Lý do vào viện:
II. Phần hỏi bệnh
1. Bệnh sử:
- Thời gian mắc bệnh: tháng ....... năm ........ (khoảng thời gian: ................................)
- Cách thức khởi phát bệnh: 	1. Cấp 	2. Bán cấp 	3. Mạn tính
- Triệu chứng khởi phát:
- Triệu chứng toàn phát:
- Đã được khám ở đâu:
- Chẩn đoán bệnh gì:
- Thuốc điều trị:
- Diễn biến điều trị
2. Tiền sử
2.1. Tiền sử bản thân:
- Sản khoa:
- Bệnh tật:
2.2. Tiền sử gia đình
- Bố mẹ hôn nhân cùng huyết thống
- Bố mẹ bị bệnh:
- Anh chị em bị bệnh:
- Họ hàng bị bệnh:
III. Khám bệnh 
1. Khám toàn thân
- Phù
- Da xạm
- Da xanh, niêm mạc nhợt
- Xuất huyết dưới da
- Móng tay màu xanh
2. Khám thần kinh
- Ý thức:
- Giảm vận động
- Run ngọn chi: 	1. Đối xứng	2. Không đối xứng
- Nói khó:
- Nuốt khó
- Chảy nước dãi
- Thất điều
- Bàn tay vụng về
- Bộ mặt bất động (vô cảm)
- Tăng trương lực cơ ngoại tháp
- Múa vờn, múa giật
- Cơn động kinh
- Rối loạn cơ tròn
2. Khám tâm thần
- Thay đổi nhân cách
- Rối loạn hành vi
- Dễ xúc động
- Suy giảm nhận thức
- Suy giảm trí nhớ
3. Khám mắt
- Vòng Kayser – Fleischer
- Đục thuỷ tinh thể hình hoa hướng dương
- Giảm thị lực
4. Khám tiêu hoá
- Cổ trướng
- Gan to
- Lách to
- Xao mạch
- Dấu hiệu bàn tay son
- Tuần hoàn bàng hệ
- Vàng da, vàng mắt
- Phân đen
5. Khám hệ tiết niệu
- Đái máu
6. Khám xương khớp
- Viêm xương khớp
- Tổn thương sụn
7. Khám cơ quan khác
- Tiếng tim bất thường
IV. Xét nghiệm
1. Xét nghiệm máu
- Công thức máu: 
HC	BC	TC	Hb:
- Sinh hoá máu: 
Ure:	Creatinin:	GOT: 	GPT:	ALP
Protein:	Albumin	
Billirubin TP:	Billirubin TT:	Billirubin GT:
Đồng
Ceruloplasmin:
- Đông máu cơ bản: 	Fibrinogen:	APTT:	PT
- Test Coomb
2. Nước tiểu
- Protein
- Calci
- Hồng cầu
- Đồng niệu 24 giờ:
- Test D-Penicilamin: 	Trước:	Sau:
3. Siêu âm ổ bụng
- Mật độ gan
- Kích thước gan
- Kích thước lách
- Đường mật trong gan
- Tĩnh mạch cửa
- Dịch ổ bụng
4. Chụp cắt lớp vi tính sọ não
5. Chụp cộng hưởng từ sọ não
6. Phân tích gen ATP7B
- Bệnh nhân:
- Anh, chị, em ruột của bệnh nhân:
- Bố, mẹ của bệnh nhân:
- Người thân khác cùng huyết thống với bệnh nhân:
V. Chẩn đoán
Tổng điểm theo Ferrenci:
VI. Điều trị
1. D - Penicillamin 300mg
2. Trientine 250 mg 
3. Kẽm
4. Vitamin E
5. Vitamin B6
6. Điều trị khác
	Người làm bệnh án
14,15,18,26,29,33,35,38,40,41,43,50,62,64,67,68,69,74,75,77,78,79,81,82,83,111,113
1-13,16,17,19-25,27-28,30-32,34,36,37,39,42,44-49,51-61,63,65,66,70-73,76,80,84-110,112,114-
PHỤ LỤC 3
 Nồng độ và độ tinh sạch của 60 mẫu DNA ở nhóm bệnh nhân
STT
Nồng độ DNA (ng/µl)
Độ tinh sạch (A260/280)
STT
Nồng độ DNA (ng/µl)
Độ tinh sạch (A260/280)
STT
Nồng độ DNA (ng/µl)
Độ tinh sạch (A260/280)
1
237
1,7
21
303
1,7
41
315
1,7
2
313
1,7
22
264
1, 8
42
382
1,8
3
291
1,8
23
213
1,7
43
279
1,7
4
256
1,7
24
214
1,7
44
290
1,7
5
351
1,8
25
319
1,7
45
263
1,7
6
257
1,7
26
244
1,7
46
219
1,7
7
255
1,9
27
213
1,8
47
280
1,8
8
321
1,8
28
216
1,8
48
211
1,8
9
365
1,8
29
249
1,8
49
301
1,9
10
238
1,9
30
264
1,9
50
199
1,9
11
275
1,8
31
322
1,8
51
322
1,8
12
221
1,7
32
227
1,8
52
265
1,8
13
343
1,8
33
298
1,8
53
322
1,8
14
312
1,7
34
230
1,7
54
287
1,7
15
278
1,7
35
312
1,7
55
391
1,7
16
239
1,7
36
234
1,7
56
203
1,7
17
278
1, 8
37
309
1,8
57
280
1,8
18
299
1,7
38
325
1,7
58
283
1,7
19
284
1,7
39
224
1,7
59
230
1,7
20
293
1,7
40
312
1,7
60
293
1,7
Nồng độ và độ tinh sạch của 40 mẫu DNA ở nhóm chứng
STT
Nồng độ DNA (ng/µl)
Độ tinh sạch (A260/280)
STT
Nồng độ DNA (ng/µl)
Độ tinh sạch (A260/280)
STT
Nồng độ DNA (ng/µl)
Độ tinh sạch (A260/280)
1
256
1,7
15
263
1,7
29
254
1,7
2
254
1,9
16
254
1,7
30
352
1,9
3
320
1,8
17
253
1,8
31
259
1,7
4
265
1,8
18
256
1,8
32
260
1,8
5
258
1,9
19
245
1,8
33
251
1,8
6
255
1,8
20
254
1,9
34
305
1,9
7
225
1,7
21
352
1,8
35
199
1,9
8
347
1,8
22
257
1,8
36
352
1,8
9
332
1,7
23
268
1,8
37
245
1,8
10
378
1,8
24
235
1,7
38
352
1,8
11
259
1,7
25
352
1,8
39
267
1,7
12
258
1,8
26
254
1,7
40
371
1,7
13
249
1,7
27
369
1,8
14
254
1,7
28
345
1,7
PHỤ LỤC 4
HÌNH ẢNH KHUẾCH ĐẠI CHUỖI CỦA 21 EXON TRÊN GEN ATP7B
Chú thích: M: Marker 100bp. BN: Bệnh nhân. (+): mẫu đối chứng dương. (-): mẫu đối chứng âm không có DNA
PHỤ LỤC 5
HÌNH ẢNH GIẢI TRÌNH TỰ 21 EXON TRÊN GEN ATP7B
Exon 1
Exon 2
Exon 3
Exon 4
Exon 5
Exon 6
Exon 7
Exon 8
Exon 9
Exon 10
Exon 11
Exon 12
Exon 13
Exon 14
Exon 15
Exon 16
Exon 17
Exon 18
Exon 19
Exon 20
Exon 21
9,10,
15,16,19,27,29,31,32,36,38,39,46,56,62,63,64,70,71,73,74,75,77,78,79,108,1
15,16,19,27,29,32,33,37,39-41,49,58,64-66,72,73,75-77,79-81,111-116,118,153-164
1-14,17-18,20-26,28,30-31,34-36,38,42-48,50-57,59-63,67-71,74,78,82-110,117,119-152