Tóm tắt Luận án Nghiên cứu cơ sở khoa học sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng để gieo ươm và trồng thông nhựa (pinus merkusii jungh. et de vriese) trên đất thoái hóa ở miền bắc Việt Nam

 ,huẩn3.10﷽﷽﷽﷽﷽itơ các chủng N2.10.XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXgiảiXXX﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽của vi sinh vật. Ơ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXBỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM
========================
NGUYỄN THỊ THUÝ NGA
TÓM TẮT LUẬN ÁN
NGHIÊN CỨU CƠ SỞ KHOA HỌC SẢN XUẤT CHẾ PHẨM 
VI SINH VẬT ĐA CHỦNG ĐỂ GIEO ƯƠM 
VÀ TRỒNG THÔNG NHỰA (Pinus merkusii Jungh. Et de Vriese) 
TRÊN ĐẤT THOÁI HÓA Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ LÂM NGHIỆP
HÀ NỘI - 2016
Công trình được hoàn thành tại: VIỆN KHOA HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. PHẠM QUANG THU
Phản biện 1: 
.
Phản biện 2 
..
Phản biện 3: 
..
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam
vào hồi giờ ngày tháng năm 2016
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
Nguyễn Thị Thuý Nga, Phạm Quang Thu (2009), Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật phân giải lân có hiệu lực cao và đặc điểm sinh học của chúng để sản xuất phân vi sinh cho cây lâm nghiệp. Tạp chí khoa học lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, số 3, tr 1038 – 1045.
 Nguyễn Thị Thuý Nga (2015), Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn nội sinh tạo chất kích thích sinh trưởng Indole-3-acetic axit (IAA) và đối kháng nâm Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cây thông. Tạp chí khoa học lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, số 3, tr 3948 - 3959. 
Nguyễn Thị Thuý Nga (2015), Nghiên cứu tạo chế phẩm đa chủng VSV và đánh giá hiệu quả của chế phẩm đối với sản xuất cây con Thông nhựa (Pinus merkusii) ở vườn ươm. Tạp chí khoa học lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, số 3, tr 3960 – 3968.
MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ.
	Thông là cây trồng Lâm nghiệp, được gây trồng ở hầu khắp các tỉnh trung du và miền núi nước ta. Cây thông được coi là cây loại trồng chủ yếu, với diện tích đứng thứ ba sau bạch đàn và keo. Theo quyết định số 3135/QĐ-BNN-TCLN ngày 06/8/2015 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công bố số liệu hiện trạng rừng toàn quốc năm 2014, diện tích rừng trồng thông các loại là khoảng 400.000 ha (chiếm gần 12% tổng diện tích rừng trồng trong cả nước). Loài thông được trồng chủ yếu là Thông nhựa (Pinus merkusii), cây Thông nhựa mang lại giá trị lớn về mặt kinh tế, xã hội.
	Các loài cây hạt trần nói chung và thông nói riêng, lông hút ở rễ kém phát triển, nên trong tự nhiên có quá trình cộng sinh bắt buộc với nấm. Sợi nấm giúp cây trồng hấp thụ nước và dinh dưỡng khoáng tốt hơn. Quy trình kỹ thuật gieo ươm thông do Bộ Lâm nghiệp nay là Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành năm 1983 đã quy định tiêu chuẩn, chất lượng cây thông con khi xuất vườn phải có nấm rễ. Để đạt được điều đó các cơ sở sản xuất phải sử dụng 10% đất mặt rừng thông đã khép tán trộn với thành phần ruột bầu, để có nguồn nấm cộng sinh. Việc làm này đã gây nên nhiều bất lợi như : nấm cộng sinh không được tuyển chọn; mang theo mầm sâu, bệnh đặc biệt bệnh lở cổ rễ và bệnh rơm lá thông; hệ sinh thái của rừng thông khép tán bị ảnh hưởng nghiêm trọng, và chi phí lớn. Ở nước ta hiện nay gieo ươm thông tại vườn ươm còn mắc nhiều bệnh như: bệnh vàng còi do cây thông không có nấm cộng sinh, bệnh thối cổ rễ do nấm Fusarium spp. Tỷ lệ cây con bị chết ở vườn ươm do nấm Fusarium spp. gây ra ước tính từ 40% đến 50%. Không những thế năng suất rừng trồng thông hiện nay còn hạn chế, cây thông sinh trưởng phát triển kém, kéo theo sức đề kháng yếu, dễ bị bệnh và sự tấn công của nhiều loài sâu và bệnh. Trên thế giới cũng như ở nước ta, đã sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc vi sinh vật (VSV) để bổ xung vào bầu ươm cây con, cũng như trồng rừng thông, việc làm này đã mang lại lợi ích kinh tế cao hơn và thân thiện với môi trường, nhằm tăng năng suất giá trị của cây trồng và làm giảm hiện tượng thoái hóa đất. 
	Hiện nay trên thị trường phân bón nước ta, có một số thương hiệu phân vi sinh nhưng chủ yếu phục vụ cho phát triển cây Nông nghiệp và cây ăn quả, những loại phân VSV riêng cho cây lâm nghiệp còn ít hoặc rất hạn chế. Phát triển cây Lâm nghiệp và cải tạo đất thoái hoá là cần thiết và quan trọng trong việc phát triển kinh tế, xã hội, bảo vệ môi trường và đặc biệt là phát triển nghề rừng. Để khắc phục những tồn tại trên tôi tiến hành nghiên cứu luận án “Nghiên cứu cơ sở khoa học sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng để gieo ươm và trồng Thông nhựa (Pinus merkusii Jungh. Et de Vriese) trên đất thoái hoá ở Miền Bắc Việt Nam”. 
2. MỤC TIÊU
2.1. Mục tiêu tổng quát
- Xác định cơ sở khoa học sản xuất được chế phẩm vi sinh vật đa chủng (gồm nấm ngoại cộng sinh, vi khuẩn sinh IAA và đối kháng nấm gây bệnh, vi sinh vật phân giải phốt phát khó tan và cố định nitơ tự do) để gieo ươm, gây trồng thông nhựa nhằm tăng sinh trưởng, hạn chế bệnh thối cổ rễ và cải tạo đất thoái hoá.
2.2. Mục tiêu cụ thể
-Tuyển chọn được chủng nấm ngoại cộng sinh, thuộc loài Pisolithus tinctorius, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn nội sinh cây Thông nhựa, có khả năng sinh tổng hợp IAA và đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cây Thông nhựa; phân lập và tuyển chọn vi sinh vật phân giải phốt phát khó tan và cố định nitơ tự do có hiệu lực cao.
- Xác định được đặc điểm sinh học của các chủng VSV tuyển chọn.
- Xác định được cơ sở khoa học tạo chế phẩm VSV đa chủng.
- Sản xuất được chế phẩm VSV đa chủng có khả năng tăng sinh trưởng, hạn chế bị bệnh đối với cây Thông nhựa ở vườn ươm và rừng trồng, cải tạo đất thoái hoá, bạc màu.
3. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Lần đầu tiên phân lập và tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis nội sinh cây Thông nhựa, có khả năng sinh tổng hợp IAA vừa có khả năng đối kháng với nấm F.oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cây thông.
- Lần đầu tiên phân lập và tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn Burkholderia cenocepacia, Azotobacter beijerinskii có khả năng phân giải phốt phát khó tan vừa có khả năng cố định nitơ tự do.	
- Tạo chế phẩm vi sinh vật đa chủng cho cây Thông nhựa có khả năng kích thích sinh trưởng, cố định đạm, phòng trừ nấm gây bệnh thối cổ rễ và cải tạo đất thoái hoá bạc màu, thay thế việc sử dụng 10% đất mặt rừng thông khi gieo ươm và thay thế việc sử dụng phân NPK bón lót khi trồng rừng.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NGOÀI NƯỚC
1.1.1. Nghiên cứu về nấm cộng sinh.
	Nấm cộng sinh đã được các nhà nghiên cứu vi sinh vật quan tâm từ rất sớm, ở Venezuela, người ta lấy lớp đất mặt của các rừng trồng thông đã khép tán trộn với đất của vườn ươm để tạo ruột bầu gieo ươm cây con, nấm cộng sinh chủ yếu ở đây là loài Thelephora terrestric. Từ những năm 1980, bào tử nấm Pisolithus tinctorius được bang Georgia của Mỹ nhiễm cho cây thông con ở vườn ươm. Marx và đồng tác giả (1982) đã nghiên cứu, được chế phẩm P. tinctorius đã được sản xuất và bán rộng rãi ngoài thị trường, hầu hết các cây con gieo ươm đều được nhiễm chế phẩm này trên quy mô lớn. Theo Marx và đồng tác giả (1989) bào tử nấm P. tinctorius được thu từ thể quả của nấm ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, cộng sinh với nhiều loài cây chủ, đã tạo cho chế phẩm bằng bào tử có tính đa dạng về mặt sinh học hơn chế phẩm bằng hệ sợi. Hơn tám triệu cây con, đã được nhiễm chế phẩm bằng hệ sợi và nhiều triệu cây con đã được nhiễm chế phẩm bằng bào tử, cho kết quả sinh trưởng vượt trội.
1.1.2. Nghiên cứu về VSVNS sinh IAA kích thích tăng trưởng thực vật.
	Các chất kích thích tăng trưởng thực vật là những chất tự nhiên được sản xuất bởi các VSV nội sinh. Chúng có tác dụng kích thích hoặc ức chế một số quá trình sinh lý, sinh hóa ở thực vật và vi sinh vật. Brakel và Hilger (1965) cho rằng, vi khuẩn Azotobacter có thể sản sinh ra axit indol-3-acetic (IAA) là chất tăng trưởng thực vật. Chandramohan và Mahadevan (1968b) đã phân lập được vi khuẩn sinh IAA tăng trưởng thực vật từ cây Bông. Những năm trước đây nhiều nhà khoa học cho rằng IAA được sản suất bởi vi sinh vật chỉ là chất chuyển hóa thứ cấp. Nhưng gần đây nhà nghiên cứu Stijn và Jos (2010) cho rằng, VSV nội sinh như những nhà máy khổng lồ, sản xuất IAA tăng kích thính sinh trưởng thực vật. Ruben và đồng tác giả (2012) cho rằng, có mặt của các vi sinh vật sinh IAA sẽ làm tăng sản lượng cây trồng một cách rõ rệt.
1.1.3. Nghiên cứu về vi sinh vật phân giải phốt phát khó tan.
	Johri và đồng tác giả (1999), đã phân lập và mô tả đặc điểm của khoảng 4.800 chủng VSV có khả năng phân giải phốt phát khó tan. Tuy nhiên, các tác giả chỉ dừng ở mô tả đặc điểm của các chủng, mà chưa ứng dụng những chủng vi sinh vật phân giải phốt phát này vào sản xuất phân vi sinh. Alan (2000) cho rằng, vi sinh vật đất đóng vai trò quan trọng trong việc hấp thụ và quá trình biến đổi của các chất dinh dưỡng trong đất. Đối với phốt pho, vi sinh vật đất có ảnh hưởng nhiều đến quá trình biến đổi phốt pho, đặc biệt vi sinh vật có thể phân giải phốt pho từ các hợp chất phốt pho có trong đất. José và đồng tác giả (2001) nghiên cứu, các chủng vi khuẩn phân giải phốt phát được phân lập từ các nguồn khác nhau có hiệu lực phân giải phốt phát khác nhau.Việc sử dụng vi sinh vật phân giải phốt phát, không những có tác dụng cải tạo đất, mà còn làm tăng lượng phốt pho cho cây trồng và đem lại kết quả tốt cho mùa vụ. 
1.1.4. Nghiên cứu vi sinh vật đối kháng với nấm gây bệnh.
	Alecxander Fleming (1928), tình cờ phát hiện ra quan hệ đối kháng giữa nấm Penicillinum notatum với khuẩn Staphylococus aureus và đã tìm ra chất kháng sinh đầu tiên là penicillin. Hiện nay, trên thế giới có khoảng 13.000 chất kháng sinh tự nhiên, trong đó có hơn 3.000 chất do thực vật tạo ra, hơn 9.000 chất kháng sinh do VSV tổng hợp được và hàng ngàn dẫn chất là kháng sinh bán tổng hợp. Chanway (1996) cho rằng, VK nội sinh thúc đẩy quá trình sinh trưởng của cây chủ, vì đã tạo ra một hàng rào kiểm soát sinh học bằng việc tiêu diệt trực tiếp các mầm bệnh xâm nhiễm vào cây chủ. Joseph và đồng tác giả (1997) đã ứng dụng VSV đối kháng nấm gây bệnh, bằng cách tiêm chủng VK vào 2 cây, là Cà chua và Dưa chuột đã đem lại hiệu quả ức chế một số loại mầm bệnh và giảm mức độ bị bệnh. Yuparet (1999) đã phân lập và tuyển chọn, một số loài VK sống trong mô của cây cỏ có khả năng sản xuất ra chất kháng sinh L-Asparaginase. 
1.1.5. Nghiên cứu về vi sinh vật cố định nitơ tự do.
	Các tác giả Maryenko (1964) và Arun (2007) nghiên cứu cho rằng, mật độ vi khuẩn Azotobacter trong vùng gần rễ của cây trồng có mật độ cao hơn các vùng đất hoang. Họ đã phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật cố định nitơ tạo phân bón sinh học bón cho cây trồng như lúa, ngô, mía và rau đã thúc đẩy sự tăng trưởng của các loại cây trồng. Ngoài ra, tác giả còn khẳng định rằng, các loại phân bón sinh học có khả năng tổng hợp nitơ rất ổn định, không gây hại cho môi trường và đảm bảo chất lượng nông sản sạch. Theo Timmusk (1999) vi khuẩn Paenibacillus được phân lập trong rễ cây và trong đất có khả năng cố định nitơ tự do, thúc đẩy kích thích tăng trưởng thực vật sản xuất enzym thuỷ phân, sản xuất thuốc kháng sinh chống lại vi sinh vật gây hại cho con người và gây bệnh thực vật 
1.1.6. Sử dụng chế phẩm vi sinh vật hỗn hợp.
	De và đồng tác giả (1988) đã sản xuất chế phẩm nấm cộng sinh dưới dạng viên nén bằng bào tử của các loại nấm P. tinctorius và Scleroderma spp, để nhiễm cho các loài cây lá kim và các loài thông, kết quả rất rõ khi đường kính của các cây con được nhiễm chế phẩm tăng hơn so với đối chứng là 75% sau 16-18 tháng tuổi. Nhà nghiên cứu người Nam Phi Lubanza và đồng tác giả (2012) cho rằng chế phẩm vi sinh vật hỗn hợp bao gồm Azospirillum và Rhizobium có khả năng thúc đẩy sự phát triển và tăng sản lượng của cây trồng. Olubukola và Bernard (2012) hai nhà khoa học người Mỹ đã nghiên cứu chế phẩm hỗn hợp các loài vi sinh vật khác nhau tạo phân bón. Phân bón hỗn hợp vi sinh vật gồm vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật, vi sinh vật đối kháng bệnh và vi khuẩn chống lại sự xâm hại của sâu bệnh. 
1.1.7. Nghiên cứu về gieo trồng Thông nhựa.
	Thông nhựa có vùng phân bố khá rộng, từ miền Nam Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Phillippin đến Indonesia và miền Đông Myanmar. Chúng được trồng từ rất lâu ở nhiều nước thuộc khu vực Đông Nam Á như Việt Nam, Lào, Campuchia, Philippines, Malaysia và Indonesia. Các nghiên cứu cho rằng, biện pháp xử lý lập địa khác nhau và các loại cây trồng khác nhau đã có ảnh hưởng rất khác nhau đến độ phì của đất, trong đó xử lý lập địa để trồng cây thông nhựa khác nhau thì độ phì của đất rừng Thông nhựa khác nhau, năng suất rừng trồng Thông nhựa phụ thuộc lớn vào các biện pháp lâm sinh và xử lý lập địa khác nhau. Ngoài ra khi nhân giống gây trồng Thông nhựa nhiều nước đã sử dụng các loại nấm cộng sinh như P. tinctorius, Boletus granulatus, Scleroderma spp., Thelephora terrestris, Cenoccocum graniforme, Amantita spp., và Rhizopogon spp. gây nhiễm vào đất ươm hạt, cây con sẽ có bộ rễ tốt và sinh trưởng nhanh. 
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở TRONG NƯỚC
1.2.1. Nghiên cứu về nấm cộng sinh.
	Quy trình kỹ thuật gieo ươm thông do bộ Lâm nghiệp nay là bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành năm 1983 đã quy định tiêu chuẩn, chất lượng cây thông con khi xuất vườn phải có nấm rễ. Khi gieo ươm thông tại vườn ươm, các cơ sở sản xuất đều sử dụng lớp đất mặt của các rừng trồng thông đã khép, tán trộn với đất đóng bầu nhằm lấy nguồn nấm cộng sinh có trong tự nhiên. Phạm Quang Thu (2004), chế phẩm nấm cộng sinh đã được thử nghiệm cho cây thông con, bạch đàn, keo, phi lao ở vườn ươm và cho thông ở rừng trồng bước đầu đã có kết quả tốt. Nhưng chế phẩm này còn ở dạng thô và chưa tổng hợp nhiều chủng vi sinh vật có ích. Phạm Quang Thu và Đặng Như Quỳnh (2007), đã điều tra thu thập được 33 loài nấm ngoại cộng sinh với thông và bạch đàn trong đó: có 16 loài cộng sinh với thông; 14 loài cộng sinh với bạch đàn và 3 loài cộng sinh với cả thông và bạch đàn. 
1.2.2. Nghiên cứu về VSVNS sinh tổng hợp IAA kích thích tăng trưởng.
	Nguyễn Kim Anh và đồng tác giả (2008), đã nghiên cứu phân lập được 8 chủng vi khuẩn Azotobacter từ 30 mẫu đất. Trong đó có 6 chủng có hoạt tính sinh tổng hợp IAA. Đỗ Kim Nhung và Vũ Thành (2011) đã phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây mía có khả năng sinh IAA, trong số 12 dòng vi khuẩn Azospirillum sp. và 14 dòng vi khuẩn Gluconacetobacter sp. đã được khảo sát thì có 2 dòng vi khuẩn A1 và G10 vừa có khả năng tổng hợp IAA vừa có khả năng cố định đạm đạt ở mức cao. Trần Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp (2011) đã phân lập được 49 dòng vi khuẩn nội sinh trên cây Dứa, tuyển chọn được 9 dòng đều có 3 đặc tính tốt như cố định đạm, khả năng phân giải lân và sinh tổng hợp IAA. Nguyễn Thị Huỳnh Như và đồng tác gi ... 0% với trình tự ADN mã số trên genbank EU557030 là loài Bacillus subtilis. Chủng N2.1 có trình tự ADN tương đồng 100% với trình tự ADN mã số trên genbank CP000959 là loài Burkholderia cenocepacia. Chủng V4.2 có trình tự ADN tương đồng 99.5% với trình tự ADN mã số trên genbank EF100165 là loài Azotobacter beijerinskii. 
Hình 3.27: KL chủng (QI1)
P.fluorescens 
Hình 3.28:Tế bào chủng (QI1)
P. fluorescens 
Hình 3.29: Tế bào chủng (QI1)
 P.fluorescens 
Hình 3.30: KL chủng (QI24)
B. subtilis 
Hình 3.31: TB chủng (QI24)
B. subtilis 
Hình 3.32: TB chủng (QI24)
B. subtilis 
Hình 3.33: Khuẩn lạc chủng (N2.1)
B.cenocepacia 
Hình 3.34: Tế bào chủng (N2.1)
B.cenocepacia 
Hình 3.35: TB (N2.1)
B.cenocepacia 
Hình 3.36: Khuẩn lạc chủng (V4.2)
A. beijerinskii 
Hình 3.37: Tế bào chủng (V4.2)
 A.beijerinskii 
Hình 3.38: Tế bào chủng (V4.2)
 A. beijerinskii 
3.3. Nghiên cứu tạo chế phẩm đa chủng VSV
3.3.1. Kết quả nghiên cứu sự tương tác của các VK trong cùng hỗn hợp.
	Các chủng VSV vẫn tồn tại và phát triển bình thường trong cùng một môi trường nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc của các chủng đều đạt mức độ cao sau 9 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, cũng có chủng vi khuẩn phát triển mạnh hơn các chủng còn lại, như chủng vi khuẩn cố định nitơ Azotobacter beijerinskii phát triển mạnh nhất đường kính khuẩn lạc của chúng lớn nhất đạt 26,23 sau 9 ngày nuôi cấy. Các chủng vi khuẩn khác cũng phát triển tốt khi được cấy vạch trên cùng trên môi đĩa môi trường (Hình 3.39). 
Hình 3.39 Hình ảnh các chủng VK cùng tồn tại và phát triển trên môi trường
3.3.2. Kết quả nghiên cứu xác định giá thể tạo chế phẩm.
- Công thức chất mang phù hợp để sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng cho cây thông ở rừng trồng là công thức 2: Với 10kg nguyên liệu trong đó 35% bột apatit, 35% mùn, 10% potassium polyacrylamide, 20% tổng số các loại VSV (trong đó 0,05% bào tử hữu tính nấm P. tinctorius, 5% sinh khối dung dịch VSV sinh IAA QI1, 5% sinh khối dung dịch VSV phân giải phốt phát khó tan N2.1, 5% sinh khối dung dịch VSV đối kháng với nấm bệnh thối cổ rễ cây thông QI24 và 5% sinh khối dung dịch VSV cố định nitơ V4.2).
- Chế phẩm vi sinh vật đa chủng dùng cho vườn ươm là công thức 2: Với 10kg nguyên liệu trong đó 40% bột apatit, 40% mùn, 20% tổng số các loại VSV (trong đó 0,05% bào tử hữu tính nấm P. tinctorius, 5% dung dịch VSV sinh IAA QI1, 5% dung dịch VSV phân giải phốt phát khó tan N2.1, 5% dung dịch VSV đối kháng với nấm bệnh thối cổ rễ cây thông QI24 và 5% dung dịch VSV cố định nitơ V4.2).
3.3.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính các chủng VSV trong chế phẩm.
	Hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn đều có hoạt lực giảm nhẹ dần theo thời gian. Như chủng B. cenocepacia (N2.1) phân giải phốt phát khó tan, sau 8 tuần đường kính vòng phân giải vẫn đạt là 20,2 mm, nồng độ lân dễ tiêu đạt là 312,12 ppm chứng tỏ chúng vẫn có khả năng phân giải phốt phát khó tan rất mạnh. Chủng vi khuẩn P.fluorescens (QI1) sinh tổng hợp IAA, có kết quả tổng hợp IAA khá cao đạt 9,718 mg/l, như vậy thời gian 4 tháng, khả năng tổng hợp IAA của chúng vẫn tốt. 
3.3.4. Kết quả nghiên cứu thời gian bảo quản của chế phẩm.
	Khi bảo quản chế phẩm đa chủng VSV ở hai thang nhiệt độ khác nhau là nhiệt độ phòng và điều kiện nhiệt độ phòng từ 15 – 200C trong nhiệt độ phòng, mật độ tế bào hữu hiệu của các chủng vi sinh vật nhìn chung ít thay đổi sau các thời gian bảo quản khác nhau và có giảm nhẹ sau 6 tháng bảo quản. 
Hình 3.40: Quy trình SX CP VSV đa chủng để gieo ươm và trồng Thông nhựa
Dung dịch sinh khối các loại vi khuẩn 
Cân và nghiền nguyên liệu thô
Nguyên liệu thô
NCS 
P. tinctorius
Chủng QI1
Chủng QI24
Chủng N2.1
Chủng V4.2
Chất giữ ẩm
Sấy bột nguyên liệu thô
Nhân sinh khối VK
Phối trộn hỗn hợp
Đóng gói bảo quản
CHẾ PHẨM VI SINH VẬT ĐA CHỦNG
Bước 3
Bước 1
Bước 4
Bước 2
Bước 5
Bước 6
Bước 7
Hình 3.41: Chế phẩm đa chủng vi sinh vật
3.4. Kết quả ảnh hưởng của CP VSV đa chủng tới cây Thông nhựa và đất thoái hoá.
3.4.1. Hiệu quả của chế phẩm vi sinh vật đa chủng tới cây Thông nhựa.
3.4.1.1. Hiệu quả của chế phẩm vi sinh vật đa chủng tới cây Thông nhựa ở vườn ươm.
	Số liệu đo đếm chiều cao, đường kính gốc, tỷ lệ bị bệnh, tỷ lệ cộng sinh cây Thông nhựa kết quả được trình bày tại Bảng 3.8.
Bảng 3.8: Hiệu quả của CP VSV đến sinh trưởng của Thông nhựa ở vườn ươm
STT
Công thức thí nghiệm
Sau 2 tháng
Sau 4 tháng
Sau 6 tháng
Sau 8 tháng
TLB TB tháng (%)
TLCS TB tháng (%)
Hvn
(cm)
Dg
(mm)
Hvn
(cm)
Dg
(mm)
Hvn
(cm)
Dg
(mm)
Hvn
(cm)
Dg
(mm)
1
CT1 đ/c
5,95
1,22
7,88
1,66
12,28
2,26
17,43
2,95
22,2
23,5
2
CT 2
6,43
1,32
9,88
1,92
16,78
2,92
20,63
3,12
4,62
89,5
3
CT 3
7,14
1,74
11,58
2,24
18,38
3,57
22,54
4,12
3,10
90,0
4
CT 4
6,94
1,34
10,05
2,04
16,55
3,06
19,85
3,59
4,21
85,6
5
MF1
6,85
1,41
10,15
1,91
16,65
3,11
19,78
3,48
3,42
85,1
6
TB
6,66
1,41
9,91
1,96
16,13
2,99
20,05
3,45
7,51
40,6
7
Lsd
1,73
0,72
1,50
0,42
0,17
0,12
0,27
0,32
1,72
2,36
8
Fpr
0,050
0,080
0,05
0,05
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001
	Sau thời gian 4 tháng, chiều cao cây Thông nhựa công thức 1 (bón 1%lân như đóng bầu thông thường) đạt 7,884 cm, trong khi tại công thức 3 (bón 2 g chế phẩm đa chủng vi sinh vật) cho kết quả là 11,883 cm (tăng 47% so với đối chứng, tăng 17% so với công thức 2, tăng 15% so với công thức). Đường kính gốc của cây Thông nhựa sau 4 tháng, tại công thức 3 (bón 2 g chế phẩm đa chủng vi sinh vật) cho kết quả là 2,24 mm (tăng 35% so với đối chứng, tăng 25% so với công thức 2, tăng 16% so với công thức 4, và cũng tăng 16% so với bón 2g MF1). 
	Sau 8 tháng thí nghiệm công thức 3 bón (2g chế phẩm) cũng cho chiều cao tăng 24% so với đối chứng và tăng hơn các công thức khác từ 15 – 18%. Đường kính gốc cây Thông nhựa tại công thức 1 (đối chứng) sau 8 tháng đạt 2,95 mm, trong khi tại công thức 3 (bón 2g) chế phẩm đa chủng vi sinh vật cho kết quả là 4,12 mm (tăng 28% so với đối chứng, tăng 24% so với công thức 2). Cây Thông nhựa được bón 2g chế phẩm sau 8 tháng có kết quả chiều cao và đường kính gốc là cao nhất.
3.4.1.2. Hiệu quả của chế phẩm vi sinh vật đa chủng tới cây Thông nhựa ở rừng trồng.
	Số liệu đo đếm chiều cao, đường kính gốc, tỷ lệ sống cây Thông nhựa sau các thời gian rừng 1 tuổi và 1,5 tuổi được sử lý qua phần mềm Genstat 5, qua phân tích sử lý số liệu kết quả cho thấy có sự khác nhau đáng kể ở các công thức thí nghiệm, kết quả được trình bày tại Bảng 3.9.
Bảng 3.9: Hiệu quả của CP VSV đến sinh trưởng của Thông nhựa ở rừng trồng.
STT
Công thức thí nghiệm
Sau 1 năm tuổi
Sau 1,5 năm tuổi
Tỷ lệ sống trung bình (%)
Hvn (cm)
Dg (mm)
Hvn (cm)
Dg (mm)
1
CT1
24,29
8,48
29,18
11,41
90,0
2
CT 2
25,46
8,80
30,54
13,11
94,4
3
CT 3
28,89
11,39
34,62
13,92
98,9
4
CT 4
27,38
10,37
32,43
14,55
95,6
5
CT5
21,80
8,76
27,37
10,08
80,0
6
TB
25,51
9,66
30,83
12,61
91,8
7
Lsd
1,50
2,08
2,00
2,07
14,91
8
Fpr
0,001
0,013
< 0,001
 0,001
0,05
	Nhìn vào Bảng 3.25 trên cho thấy, ở công thức 3 bón 40 gam chế phẩm đa chủng vi sinh vật còn có kết quả lớn hơn nhiều tăng 32,5 % so với công thức đối chứng không bón gì chiều cao chỉ đạt là 21,8 cm và tăng so với công thức đối chứng bón NPK là 19%. Đường kính gốc của cây Thông nhựa lớn nhất cũng tại công thức 3 đạt 1,14 cm (tăng từ 10 – 30 %) so với công thức đối chứng và các công thức khác) chỉ đạt từ 0,85 đến 1 cm.
	Khi cây đạt 1,5 tuổi sự sai khác về tỷ lệ bón chế phẩm giữa các công thức thể hiện rõ ràng ở cả về chiều cao vút ngọn và đường kính gốc của cây. Với chỉ số Fpr < 0,001 và khoảng sai dị Lsd= 2 cm chỉ số về chiều cao vượt trội cũng ở công thức 3, bón 40 g chế phẩm đa chủng VSV đạt 34,62 cm (tăng 26% so với đối chứng không bón gì, tăng 19% so với công thức bón 1 đối chứng bón NPK, , tăng 15% so với công thức 2, bón 20 g chế phẩm đa chủng VSV, tăng 7% so với công thức 4 bón 60g chế phẩm đa chủng VSV). Đường kính gốc của cây Thông nhựa sau 1.5 tuổi tại công thức 4 (bón 60 g chế phẩm đa chủng vi sinh vật) cho kết quả lớn nhất gần đạt 1,5 cm (tăng 44% so với đối chứng không bón gì, tăng 27% so với công thức 1, đối chứng bón NPK, tăng 10% so với công thức 2, bón 20 g chế phẩm đa chủng VSV, 4% so với công thức 3 bón 40g chế phẩm đa chủng VSV).
	Tỷ lệ sống của cây thông nhựa sau các thời gian thí nghiệm có sự khác nhau khá rõ. Công thức đối chứng tỷ lệ sống đạt 80%. Trong khi các công thức khác được bón chế phẩm vi sinh vật đa chủng tỷ lệ sống đều đạt cao hơn đạt từ 90 đến 98%. Cao nhất là công thức 3 bón 40g chế phẩm đa chủng vi sinh vật có tỷ lệ sống cao nhất đạt 99%.
3.4.2. Hiệu quả của chế phẩm vi sinh vật đa chủng đến đất thoái hoá bạc màu.
3.4.2.1. Sự thay đổi các chỉ tiêu lý hoá của đất trồng trước và sau khi thí nghiệm.
	Phân tích tính chất lý hóa của đất thoái hoá bạc màu được trồng rừng Thông nhựa và bón chế phẩm đa chủng VSV tính chất vật lý đã thay đổi đất trở nên tơi xốp hơn với hàm lượng mùn tăng 1,2 lần, hàm lượng lân tổng số tăng1,2 đến 1,3 lần, hàm lượng đạm tổng số tăng gần 1,5 lần so với trước khi thí nghiệm. Như vậy chất lượng chế phẩm đa chủng vi sinh vật mang lại lợi ích khá cao, làm thay đổi tích cực tính chất lý hóa của đất. 
3.4.2.2. Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh vật của đất thí nghiệm trồng Thông nhựa và bón chế phẩm đa chủng VSV.
+) Thành phần và mật độ tế bào của các chủng vi sinh vật tổng số của các mẫu đất rừng, trước và sau khi thí nghiệm.
	Trước khi trồng rừng thành phần và mật độ tế bào chủng cố định nitơ của các chủng/1g đất đạt được là rất thấp dao động trong khoảng từ 7,4 x 102 đến 3,2 x 103 CFU/1 gam đất. Thành phần các chủng cố định nitơ thu được 13 chủng chủng trong 5 mẫu đất. Sau 1,5 năm trồng cây Thông nhựa và bón chế phẩm đa chủng VSV đã thu được 18 chủng cố định nitơ với số lượng bào tử tăng đáng kể đạt mật độ tế bào VSV cao nhất là 7,9 x 104 CFU/1 gam đất ở công thức 2.
	Các chủng VSV phân giải lân được phân lập từ trong 5 mẫu đất chưa trồng rừng đưa vào phân tích chỉ thu được 14 chủng phân giải lân. Nhưng sự khác nhau khá rõ ở các công thức thí nghiệm bón các hàm lượng vi sinh khác nhau. Như ở công thức 5 (đối chứng) mật độ vi khuẩn khi được trồng cây che phủ có số lượng bào tử tăng không đáng kể từ 3,5 x103 đến 6,2 x 103 CFU/1 gam đất, trong khi ở công thức 3 khi được bón 40g chế phẩm đa chủng VSV mật độ vi khuẩn đã tăng nhiều so ban đầu, từ 3,5 x 103 đến 3,8 x 104 CFU/1 gam đất.
	Khi phân tích kết quả về mật độ tế bào vi nấm của các chủng/1g đất đạt được là rất thấp dao động trong khoảng từ 8,3 x 102 đến 5,6 x 103 CFU/1 gam đất, với 12 chủng trong 5 mẫu đất. Sau 18 tháng đã thu được 18 chủng vi nấm với số lượng bào tử tăng đáng kể. Ở công thức 3 khi được bón 40 g chế phẩm đa chủng vi sinh vật và trồng cây Thông nhựa mật độ vi nấm đã tăng gấp 100 lần so ban đầu, từ 4,1 x 103 đến 4,5 x 105 CFU/1 gam đất. Khi phân tích mật độ, thành phần của nấm tổng số ở hầu hết các công thức trước khi thí nghiệm trồng rừng đều thấy xuất hiện sự có mặt của nấm gây bệnh thối cổ rễ cây Thông nhựa Fusarium oxysporum, sau khi trồng rừng được bón chế phẩm VSV đa chủng ở các công thức 2, công thức 3 và công thức 4 không thấy xuất hiện sự có mặt loài nấm này. 
	Các chủng xạ khuẩn thu được với số lượng ít mật độ tế bào chỉ giao động 1,3 x 102 đến 7 x 103CFU/ 1gram đất. Sau 18 tháng các công thức được bón chế phẩm đa chủng VSV và trồng Thông nhựa thu được 10 chủng xạ khuẩn với số lượng bào tử tăng đáng kể. 
	Sau 18 tháng trồng rừng và bón chế phẩm đa chủng VSV tiến hành phân tích vi khuẩn của 13 công thức thí nghiệm cho thấy số lượng chủng VK đã tăng đáng kể từ 8 chủng trước khi thí nghiệm đã tăng lên 22 chủng.
+) Thành phần và mật độ tế bào của chủng nấm nội cộng sinh của các mẫu đất rừng.
	Khi được bón chế phẩm đa chủng VSV và trồng cây Thông nhựa tính chất của đất đã thay đổi khi có sự góp mặt của khá nhiều thành phần và chủng loại VSV có ích. Như vậy có thể kết luận rằng khi được bón chế phẩm đa chủng VSV thành phần và chủng loại nấm nội cộng sinh tăng lên rõ rệt, đó cũng là yếu tố cải thiện đất thoái hoá bạc màu. 
KẾT LUẬN 
1. Kết luận
1.1. Tuyển chọn vi sinh vật và đặc điểm sinh học của chúng.
Tuyển chọn được bộ chủng giống vi sinh vật có hoạt lực sinh học cao đó là: 
- Chủng Pt1 thuộc loài nấm Pisolithus tinctorius cộng sinh Thông nhựa cho chiều cao cây Thông nhựa 4.7 cm tăng 55% so với đối chứng
- Chủng QI1 là loài P. fluorescens có khả năng tổng hợp IAA đạt 11,872mg/l và ức chế nấm F. oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cây Thông nhựa với đường kính vòng ức chế là 20,1 mm. Nhân sinh khối chủng QI1 điều kiện tối ưu là môi trường gỉ đường, thời gian 120 giờ (5 ngày), nhiệt độ 250C, độ pH thích hợp 7- 7,5.
- Chủng QI24 được xác định là loài B. subtilis vừa có khả năng đối kháng nấm F. oxysporum gây bệnh thối cổ rễ Thông nhựa, sau 10 ngày có đường kính vòng ức chế nấm gây bệnh là 22 mm, vừa có khả năng sinh tổng hợp IAA đạt 5,312mg/l. Nhân sinh khối chủng QI24 với điều kiện tối ưu là môi trường PD, thời gian 72 giờ (3 ngày), nhiệt độ 270C, độ pH thích hợp 7.
- Chủng N2.1 là loài B. cenocepacia có khả năng phân giải phốt phát khó tan, đường kính vòng phân giải là 23,5mm, sinh nồng độ lân dễ tiêu là 420 ppm, vừa có khả năng cố định nitơ đạt 2,12 mg/ml NH4+. Nhân sinh khối chủng N2.1 với điều kiện tối ưu là môi trường Pikoskaya, thời gian 72 giờ (3 ngày), nhiệt độ 270C- 300C, độ pH thích hợp 6,5.
- Chủng V4.2 là loài A. beijerinskii có khả năng cố định nitơ đạt 4,18 mg/ml NH4+, vừa có khả năng phân giải phốt phát khó tan, đường kính vòng phân giải là 17,2mm, sinh nồng độ lân dễ tiêu 271,32 ppm. Nhân sinh khối chủng V4.2 với điều kiện tối ưu là môi trường nuôi cấy NFMN, thời gian 96 giờ (4 ngày), nhiệt độ 250C- 270C độ pH thích hợp 6,5 – 7.
1.2. Tạo chế phẩm vi sinh vật đa chủng. 
- Sản xuất được 2 chế phẩm vi sinh vật sử dụng cho vườn ươm và rừng trồng từ các chủng vi sinh vật tuyển chọn có hiệu quả cao bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 6 tháng. 
1.3. Tác dụng của chế phẩm VSV đa chủng đến cây Thông nhựa và đất thoái hoá, bạc màu.
- Xác định được công thức sử dụng chế phẩm vi sinh vật cho bầu ươm là 2g/bầu, chiều cao cây vườn ươm tăng 28% so với đối chứng không bón gì, tăng 24% so với đóng bầu thông thường có 1% lân, tỷ lệ bị bệnh giảm chỉ còn 3-5%.
- Xác định được công thức sử dụng chế phẩm vi sinh vật cho rừng trồng Thông nhựa là 40 g/cây, cho chiều cao cây Thông nhựa ở rừng trồng, đạt 34,62 cm tăng 26% so với đối chứng không bón phân, tăng 19% so với đối chứng bón phân NPK 20.20.15, đường kính gốc của cây Thông nhựa sau 1.5 tuổi đạt 1,5 cm tăng 44% so với đối chứng không bón phân, tăng 27% so với đối chứng bón phân NPK 20.20.15.
- Hiệu quả của chế phẩm vi sinh vật đa chủng đến đất thoái hoá bạc màu: Đất trở nên tơi xốp hơn với hàm lượng mùn tăng 1,2 lần, hàm lượng lân tổng số tăng 1,3 lần đất trở lại trung tính. Tất cả các chỉ tiêu về thành phần và mật độ vi sinh vật đều tăng lên rõ rệt và không thấy xuất hiện nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cây Thông nhựa.