Tóm tắt Luận án Nghiên cứu độc tính và tác dụng trên chức năng sinh sản của OS35 trong thực nghiệm

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
ĐẶT VẤN ĐỀ
Suy giảm chức năng sinh dục nam là một tình trạng bệnh lý bao gồm rối loạn cương dương, rối loạn xuất tinh, giảm khoái cảm và rối loạn ham muốn tình dục, có thể kèm theo mất khả năng xìu của dương vật. Hiện nay, một xu hướng phổ biến là phát hiện và nghiên cứu các thuốc điều trị có nguồn gốc từ dược liệu. Quả Xà sàng (tên khoa học là Cnidium monnieri (L.) Cuss.), là một dược liệu có sẵn ở Việt Nam được sử dụng từ lâu đời để điều trị suy giảm sinh dục ở nam giới. Tuy nhiên, ở nước ta và trên thế giới, cho đến nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về độc tính và tác dụng điều trị của quả Xà sàng. Vì vậy, đề tài Nghiên cứu độc tính và tác dụng trên chức năng sinh sản của OS35 trong thực nghiệm được thực hiện nhằm 3 mục tiêu:
1. Xác định độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của OS35 trên động vật thực nghiệm.
2. Đánh giá hoạt tính androgen, tác dụng trên chức năng cương dương và hành vi tình dục của OS35 trên động vật thực nghiệm.
3. Đánh giá tác dụng của OS35 trên chuột cống trắng gây suy giảm sinh sản bởi natri valproat.
Tính cấp thiết của luận án
	Suy giảm chức năng sinh dục ở nam giới là một tình trạng bệnh lý thường gặp và ngày càng tăng ở nam giới; ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng cuộc sống của người bệnh. Việc tìm kiếm các thuốc an toàn, hiệu quả có nguồn gốc dược liệu có tác dụng điều trị bệnh lý này là rất cần thiết, đặc biệt ở một nước có nguồn dược liệu dồi dào và nền y học cổ truyền lâu đời như ở Việt Nam. Quả Xà sàng là một dược liệu có sẵn ở Việt Nam, được ghi nhận trong các tài liệu y dược học cổ truyền có tác dụng cường dương, ích thận, chữa liệt dương. Cho đến nay, ở nước ta cũng như trên thế giới có ít nghiên cứu về an toàn và hiệu quả của dược liệu này. Bên cạnh đó, việc sử dụng nguyên liệu nghiên cứu là cao chiết cồn của quả Xà sàng (trong đó osthol chiếm 35%), một dạng bào chế hiện đại hóa thuốc y học cổ truyền, dẫn đến thuận lợi hơn cho người bệnh trong quá trình điều trị.
Những đóng góp mới của luận án
Luận án cung cấp những bằng chứng khoa học chứng minh tính an toàn và hiệu quả điều trị của chế phẩm OS35 (chiết xuất từ Quả Xà sàng). Bằng những thực nghiệm trên động vật (chuột nhắt, chuột cống, thỏ), luận án chứng minh OS35 tương đối an toàn; đồng thời đã khẳng định được tác dụng và định hướng được cơ chế tác dụng gây cương dương, tăng cường hành vi tình dục của OS35. Ngoài ra, OS35 còn được chứng minh có hoạt tính androgen, có tác dụng cải thiện chức năng sinh sản và hình thái cơ quan sinh dục trên chuột cống đực gây suy giảm sinh sản; từ đó, làm tăng thêm giá trị điều trị của Xà sàng và lưu ý các nhà lâm sàng trong sử dụng thuốc.
Luận án áp dụng 2 phương pháp mới để đánh giá ảnh hưởng của OS35 trên chức năng cương dương, bao gồm: đánh giá khả năng cương trên thỏ tỉnh theo phương pháp của Hans Gerhard Volgen và đo áp lực thể hang trên chuột cống gây mê theo phương pháp của Mehta.
Bố cục của luận án
	Luận án có 161 trang, bao gồm các phần: đặt vấn đề (2 trang), tổng quan (37 trang), đối tượng và phương pháp nghiên cứu (17 trang), kết quả (53 trang) bao gồm 37 bảng, 7 biểu đồ, 22 hình, bàn luận (49 trang), kết luận (2 trang), kiến nghị (1 trang). Luận án có 141 tài liệu tham khảo (tiếng Anh và tiếng Việt).
Chương 1. 
TỔNG QUAN 
1.1. Khái niệm suy sinh dục nam
Suy giảm chức năng sinh dục nam là một tình trạng bệnh lý bao gồm: giảm ham muốn tình dục, rối loạn cương dương, rối loạn xuất tinh, rối loạn cực khoái, giảm khả năng xìu của dương vật; các tình trạng này có thể đơn độc hoặc phối hợp.
1.2. Các thuốc điều trị suy giảm chức năng sinh dục nam theo y học hiện đại
Luận án này tổng quan các kiến thức về các thuốc thường được sử dụng để điều trị suy sinh dục nam, bao gồm: liệu pháp bổ sung hormon testosteron, các thuốc ức chế phosphodiesterase V điều trị rối loạn cương dương.
1.2.1. Liệu pháp bổ sung hormon testosteron
1.2.1.1. Chỉ định
Chỉ định của testosteron là điều trị bổ sung cho tình trạng suy tuyến sinh dục nam (male hypogonadism), khi tình trạng suy giảm testosteron được xác định bằng triệu chứng lâm sàng và xét nghiệm sinh hóa. Mục đích của liệu pháp bổ sung testosteron là phục hồi nồng độ testosteron về giới hạn sinh lý bình thường ở bệnh nhân nam có nồng độ testosteron thấp kèm theo các triệu chứng suy giảm testosteron; từ đó, nâng cao chất lượng cuộc sống, trạng thái sung mãn, chức năng sinh dục, sức mạnh cơ và mật độ khoáng của xương.
1.2.1.2. Chống chỉ định
- Quá mẫn với thuốc.
- Tiền sử hoặc hiện tại có khối u ở gan.
- Ung thư phụ thuộc androgen: ung thư biểu mô tuyến tiền liệt, ung thư vú ở nam.
- Bệnh nhân mắc chứng ngừng thở khi ngủ nặng.
- Hematocrit > 54%.
- Rối loạn đường tiết niệu dưới nặng do phì đại lành tính tuyến tiền liệt.
- Suy tim mạn tính nặng (độ IV theo phân loại NYHA). 
1.2.2. Thuốc điều trị rối loạn cương dương: Thuốc ức chế phosphodiesterase V
1.2.2.1. Cơ chế tác dụng thuốc ức chế PDEV
	PDEV là enzym phân hủy GMP vòng ở thể hang. Nhóm thuốc này không có tác dụng làm giãn trực tiếp trên thể hang phân lập ở người nhưng nó làm tăng tác dụng của NO bằng cách ức chế PDEV. Khi kích thích tình dục gây ra sự giải phóng NO tại chỗ, thì sự ức chế PDEV làm tăng nồng độ GMP vòng trong thể hang, từ đó làm giãn cơ trơn và tăng dòng máu tới thể hang. Ở liều khuyến cáo, thuốc ức chế PDEV không có tác dụng nếu không có kích thích tình dục kèm theo.
1.2.2.2. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc ức chế PDEV
- Chỉ định: Điều trị các rối loạn cương dương, là tình trạng không có khả năng đạt được hoặc duy trì cương cứng đủ để thoả mãn hoạt động tình dục.
- Chống chỉ định: 
+ Quá mẫn với các thành phần nào của thuốc.
+ Dùng cùng các nitrat và các chất cho NO.
+ Bệnh nhân nam mà hoạt động tình dục không được khuyến khích (như bệnh nhân bệnh tim mạch nặng như đau thắt ngực không ổn định, suy tim nặng).
+ Bệnh nhân mất thị lực một bên do bệnh lý thần kinh thị giác do thiếu máu cục bộ vùng trước không do nguyên nhân động mạch có liên quan đến việc dùng thuốc ức chế PDEV trước đó hay không.
+ Suy gan nặng, hạ huyết áp (huyết áp < 90/50 mmHg), tiền sử đột quỵ hoặc nhồi máu cơ tim.
+ Rối loạn võng mạc thoái hóa di truyền (như viêm võng mạch sắc tố do rối loạn PDEV võng mạc di truyền).
1.3. Tổng quan về Xà sàng 
1.3.1. Xà sàng
	Xà sàng có tên khoa học là Cnidium monnieri (L.) Cuss., thuộc họ Hoa tán Umbelliferae. Thành phần chính trong quả Xà sàng là osthol. Theo Đỗ Tất Lợi, quả Xà sàng có vị cay đắng, tính bình, hơi có độc, vào 2 kinh thận và tam tiêu. Tác dụng cường dương, ích thận, khử phong táo thấp, dùng chữa liệt dương. Liều dùng 4 đến 12 g dưới dạng thuốc sắc uống riêng hoặc phối hợp với các vị thuốc khác.
1.3.2. Các nghiên cứu về quả Xà sàng liên quan đến sinh dục, sinh sản
	James Chen và cs. (2000): osthol làm giãn cơ trơn thể hang, có thể do cơ chế làm tăng giải phóng NO từ nội mạc hoặc do ức chế PDE. Yuan J. và cs (2004): osthol làm tăng nồng độ testosteron, LH, FSH và hoạt độ NOS trên chuột cống đực non thiến. Xie Jin-xian (2007): osthol làm tăng nồng độ testosteron trong máu và tăng biểu hiện của receptor androgen ở tinh hoàn trên chuột gây suy giảm sinh sản bằng cyclophosphamid.
Chương 2. 
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu: Chế phẩm OS35 là cao chiết cồn của quả Xà sàng; do Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam cung cấp, đạt TCCS, chứa osthol chiếm 35% với hệ suất chiết là 3%. Dung môi pha thuốc là dung dịch CMC 0,5%. 
2.2. Đối tượng nghiên cứu: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, chuột cống trắng chủng Wistar, thỏ chủng Newzealand White.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của OS35 
2.3.1.1. Độc tính cấp của OS35 theo đường uống trên chuột nhắt trắng: 
Chuột nhắt trắng trọng lượng 20 ± 2g được chia thành từng lô, mỗi lô 10 con. Cho từng lô chuột uống thuốc thử OS35 với liều từ liều cao nhất không gây chết tới liều thấp nhất gây chết 100% chuột. Chuột được nhịn ăn 12 giờ trước khi uống thuốc, vẫn uống nước đầy đủ. Theo dõi số chuột chết trong 72 giờ đầu và tình trạng chung của chuột trong 7 ngày sau khi uống thuốc. Nếu chuột chết, mổ chuột để đánh giá đại thể các tổn thương của các cơ quan. Xác định LD50 theo phương pháp Litchfield-Wilcoxon theo tỷ lệ chuột chết trong vòng 72 giờ đầu.
2.3.1.2. Độc tính bán trường diễn của OS35 theo đường uống trên chuột cống trắng: 
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên làm 3 lô, uống thuốc trong 4 tuần:
- Lô chứng: uống dung môi pha thuốc 10 ml/kg thể trọng/ngày
- Lô trị 1: uống chế phẩm OS35 liều 150 mg/kg thể trọng/ngày
- Lô trị 2: uống chế phẩm OS35 liều 450 mg/kg thể trọng/ngày 
 	Các chỉ tiêu theo dõi vào các thời điểm trước khi uống thuốc (N0), sau khi uống thuốc 2 tuần (N14) và 4 tuần (N28), bao gồm: Tình trạng chung, thể trọng của chuột. Các chỉ số đánh giá chức phận tạo máu (số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu). Đánh giá chức năng gan (albumin và cholesterol toàn phần). Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan ( ALT, AST). Đánh giá chức năng lọc cầu thận (creatinin). Sau 4 tuần, chuột được mổ để quan sát đại thể toàn bộ các cơ quan. Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận của 30% số chuột mỗi lô.
2.3.2. Nghiên cứu hoạt tính androgen của OS35 trên chuột cống đực non thiến: Áp dụng mô hình Hershberger trên chuột cống đực non
	Chuột cống đực non 42 - 50 ngày tuổi. Thiến chuột, cắt 2 tinh hoàn; nghỉ ngơi 7 ngày. Sau đó, chia chuột ngẫu nhiên vào 5 lô, mỗi lô 10 con, như sau, uống thuốc trong vòng 10 ngày:
	+ Lô 1: uống dung môi pha thuốc, với thể tích 10ml/kg/ngày
	+ Lô 2: tiêm dưới da testosteron với liều 0,4 mg/kg/ngày
+ Lô 3: uống OS35 liều 50 mg/kg/ngày
+ Lô 4: uống OS35 liều 150 mg/kg/ngày
+ Lô 5: uống OS35 liều 250mg/kg/ngày 
	- Đến ngày thứ 11 (24 giờ sau khi uống liều thuốc cuối cùng), cân trọng lượng, mổ chuột. Các chỉ số nghiên cứu: Trọng lượng chuột, trọng lượng cơ quan sinh dục phụ (túi tinh, tuyến tiền liệt, tuyến Cowper, cơ nâng hậu môn-hành hang, đầu dương vật), nồng độ testosteron máu.
2.3.3. Nghiên cứu tác dụng của OS35 trên chức năng cương dương 
2.3.3.1. Tác dụng của OS35 trên khả năng cương dương ở thỏ: theo Hans Gerard Volgen
- Thỏ được chia ngẫu nhiên thành 2 lô:
+ Lô 1: uống sildenafil liều 4,5 mg/kg với thể tích 1 ml/kg
+ Lô 2: uống OS35 liều 60mg/kg với thể tích 1 ml/kg
- Sau khi uống thuốc, bắt đầu quan sát thỏ để đánh giá các chỉ số nghiên cứu:
	+ Chiều dài dương vật 5 phút 1 lần tại các thời điểm từ 0 phút (khi uống thuốc) cho đến khi dương vật hết cương. Nghiên cứu viên không trực tiếp đo chiều dài dương vật thỏ mà chụp ảnh, sau đó, sử dụng phần mềm Image J để đo.
	+ Thời gian dương vật trở lại bình thường.
2.3.3.2. Ảnh hưởng của OS35 lên áp lực thể hang (ICP: theo phương pháp Mehta.
- Chuột cống đực, trưởng thành được chia ngẫu nhiên thành 2 lô, uống thuốc 1 lần:
+ Lô 1 (n = 8): uống sildenafil liều 10 mg/kg.
+ Lô 2 (n = 7): uống OS35 liều 150 mg/kg.
- Chuột được gây mê bằng dung dịch ketamin liều 25 mg/kg, kết nối hệ thống Powerlab, điện cực kích thích, đầu đo áp lực, phần mềm Labchart.
- Tiến hành:
+ Bước 1: Bộc lộ động mạch cảnh, đặt catheter đo huyết áp động mạch.
+ Bước 2: Bộc lộ dây thần kinh hang. 
+ Bước 3: Bộc lộ thể hang, đưa kim 26G vào thể hang đo ICP.
+ Bước 4: Đo áp lực thể hang, huyết áp động mạch trước kích thích thần kinh hang.
+ Bước 5: Kích thích điện dây thần kinh. Đo áp lực thể hang, huyết áp động mạch sau khi kích thích. Số lần kích thích là 1 lần trước khi uống thuốc và 15 phút, 30 phút và 45 phút sau khi dùng thuốc, mỗi lần kích thích kéo dài 1 phút. Dòng điện kích thích dây thần kinh hang có cường độ 5V, tần số 20 Hz, độ rộng xung 2 ms.
+ Bước 6: Phân tích số liệu offline bằng phần mềm Labchart pro
- Chỉ số nghiên cứu: trước khi dùng thuốc, 15 phút, 30 phút và 45 phút sau khi dùng thuốc: ICP nền, ICP cực đại sau kích thích thần kinh hang, thời gian đáp ứng, huyết áp động mạch trung bình (MAP), ICP cực đại/MAP.
2.3.4. Tác dụng trên hành vi tình dục trên chuột cống đực trưởng thành: Theo của Agmo 
2.3.4.1. Giai đoạn thích nghi với chu kỳ sáng - tối đảo ngược
Chuột được nuôi ổn định trong chu kỳ sáng - tối đảo ngược trong 3 tuần.
2.3.4.2. Giai đoạn chuẩn bị chuột cái (gây động dục nhân tạo)
Chuột cái được mổ cắt buồng trứng, nghỉ ngơi 14 ngày. Trước khi tiến hành ghép đôi với chuột đực, chuột cái được tiêm hormon như sau: 52 giờ trước khi ghép đôi, tiêm dưới da estradiol benzoat 20 microgam/chuột. Sau đó 4 giờ (trước khi ghép đôi 48 giờ) tiêm dưới da progesteron 1000 microgam/chuột.
2.3.4.3. Giai đoạn huấn luyện (3 đợt)
- Nhốt mỗi chuột đực vào chuồng riêng. 5 phút sau, đưa 1 chuột cái gây động dục vào.
- Đánh giá các hành vi của chuột đực bao gồm: nhảy cái (mounting), thâm nhập âm đạo (intromission), xuất tinh (ejaculation).
- Trong quá trình ghép đôi đực - cái, quan sát và đánh giá các chỉ số sau: 
- MF (số lần nhảy - Mounting Frequency): là số lần con đực nhảy lên lưng con cái trong một loạt giao cấu.
- ML (thời gian nhảy - Mounting Latency): là khoảng thời gian từ khi con đực gặp con cái đến lần nhảy đầu tiên; 
- IF (số lần thâm nhập âm đạo- Intromission Frequency): là số lần dương vật con đực thâm nhập vào âm đạo con cái trong một loạt giao cấu; 
- IL (thời gian đạt đến thâm nhập- Intromission Latency): là khoảng thời gian từ khi con đực gặp con cái đến lần thâm nhập âm đạo đầu tiên; 
- EL (thời gian đạt đến xuất tinh- Ejaculation Latency): là khoảng thời gian từ lần nhảy đầu tiên (hoặc thâm nhập âm đạo đầu tiên- nếu không có nhảy) đến lần xuất tinh đầu tiên; 
- PEI (thời gian sau xuất tinh- Post Ejaculation Interval): là khoảng thời gian từ sau khi xuất tinh lần đầu đến lần nhảy hoặc thâm nhập âm đạo tiếp theo (nếu không có nhảy) để bắt đầu một loạt giao cấu mới;
Thử nghiệm kết thúc khi ghi được PEI, hoặc khi ML, IL > 15 phút; EL > 30 phút; PEI > 15 phút. Những chuột xác định được chỉ số PEI được xem là đã hoàn thành test hành vi. Quá trình quan sát được ghi lại bằng camera, sau đó sẽ được nghiên cứu viên đọc và xử lý kết quả, tính ra các chỉ số nghiên cứu.
2.3.4.4. Giai đoạn sàng lọc (4 đợt)
- Chuột được huấn luyện qua 3 đợt, sau đó tiến hành 4 test sàng lọc để phân loại thành những chuột đạt và không đạt. Những chuột không hoàn thành ít nhất 1 test sàng lọc được xếp vào nhóm chuột không đạt. 
2.3.4.5. Giai đoạn đánh giá tác dụng của thuốc thử
- Nhóm chuột không đạt được chia đều ngẫu nhiên như sau:
+ Lô 1 (n = 9): uống dung môi pha thuốc với thể tích 10ml/kg 
+ Lô 2 (n = 7): uống sildenafil liều 10 mg/kg 30 phút trước khi ghép với chuột cái
+ Lô 3 (n = 8): uống OS35 liều 150mg/kg/ngày 15 phút trước khi ghép 
Quan sát hành vi tình dục, ghi lại các chỉ số nghiên cứu và so sánh các lô với nhau.
2.3.5. Nghiên cứu tác dụng của OS35 trên chuột cống trắng đực bị gây suy giảm sinh sản bởi natri valproat
2.3.5.1.Nghiên cứu tác dụng bảo vệ của OS35 trên chuột cống trắng đực gây suy giảm sinh sản b ... t, trong đó có chuyển hoá protein, lipid. Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt độ AST, ALT, nồng độ albumin và cholesterol trong huyết thanh ở 2 lô uống thuốc thử OS35 không thay đổi so với trước khi uống thuốc và so với lô chứng. Như vậy, OS35 liều 150mg/kg/ngày và 450mg/kg/ngày dùng trên chuột cống trắng theo đường uống trong 4 tuần liên tục chưa làm ảnh hưởng đến chỉ số đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan và chức năng chuyển hoá protein, lipid của gan.
Thận là cơ quan tiết niệu, có vai trò quan trọng bậc nhất để đảm bảo sự hằng định nội môi. Kết quả nghiên cứu cho thấy OS35 liều 150 mg/kg/ngày và 450 mg/kg/ngày chưa ảnh hưởng đến chỉ số đánh giá chức năng lọc của cầu thận .
Nghiên cứu cấu trúc vi thể gan ở lô 2 lô dùng OS35 cho thấy không có gì bất thường và khác biệt ở 2 lô dùng OS35 so với lô chứng sinh học. Kết quả này tương ứng với kết quả nghiên cứu về hoạt độ AST và ALT trong huyết thanh.
Nghiên cứu cấu trúc vi thể thận ở 2 lô dùng OS35 quan sát thấy trong mô đệm có các ổ xâm nhập viêm mạn tính (chủ yếu là lympho bào), tăng sinh xơ. Tuy nhiên, các cầu thận có hình thái, cấu trúc trong giới hạn bình thường, không xơ hóa, không tăng sinh tế bào. Đồng thời, xét nghiệm creatinin đánh giá chức năng thận vẫn trong giới hạn bình thường.
4.2. Nghiên cứu hoạt tính androgen của OS35 trên chuột cống đực non thiến
Theo OECD, khi khối lượng của ít nhất hai trong số năm cơ quan sinh dục phụ tăng có ý nghĩa thống kê so với chuột không dùng thuốc thì thuốc được coi là có hoạt tính androgen. 	Kết quả nghiên cứu cho thấy: khi dùng OS35 trong 10 ngày liên tục, liều 50 mg/kg/ngày chỉ làm tăng trọng lượng cơ nâng hậu môn – hành hang, liều 150 mg/kg/ngày làm tăng trọng lượng cơ nâng hậu môn – hành hang và đầu dương vật, còn liều 450 mg/kg/ngày làm tăng trong lượng cơ nâng hậu môn – hành hang, đầu dương vật và tuyến Cowper. Như vậy, OS35 liều 150 mg/kg và 250 mg/kg thể hiện hoạt tính androgen trên chuột cống đực non thiến và làm tăng nồng độ testosteron có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của Yuan J. (2004) cho thấy osthol làm tăng nồng độ testosteron trong máu trên chuột cống đực thiến.
4.3. Nghiên cứu tác dụng của OS35 trên chức năng cương dương
4.3.1. Tác dụng của OS35 trên khả năng cương dương ở thỏ đực trưởng thành
	Kết quả nghiên cứu cho thấy lô thỏ dùng thuốc thử OS35 và sildenafil có hiện tượng cương dương tại các thời điểm nghiên cứu từ 5 phút sau khi dùng thuốc. Chiều dài dương vật đo được và thời gian duy trì cương dương quan sát được không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô dùng sildenafil (p > 0,05). 
4.3.2. Tác dụng OS35 trên áp lực thể hang (ICP) ở chuột cống đực trưởng thành
4.3.2.1. Thay đổi ICP trước khi kích thích điện dây thần kinh hang
Lô chuột dùng sildenafil, ở thời điểm sau uống thuốc 15 phút, 30 phút và 45 phút, giá trị ICP nền tăng nhẹ so với thời điểm trước khi uống thuốc. Tác dụng làm tăng ICP nền khi chưa có kích thích tình dục này của sildenafil chỉ có thể giải thích được bằng nhận định của các nhà khoa học rằng bên cạnh cơ chế ức chế PDEV đã được chứng minh từ lâu, sildenafil còn có khả năng gây giãn cơ trơn thể hang theo cơ chế không phụ thuộc vào con đường NO/GMP vòng.
Lô chuột dùng thuốc thử OS35, ở thời điểm sau uống thuốc 30 phút và 45 phút, giá trị ICP nền cũng tăng nhẹ so với khi chưa uống thuốc. Theo nghiên cứu của James Chen (2000), tác dụng gây giãn cơ trơn thể hang của osthol khi có mặt L-NAME hoặc trên thể hang loại bỏ lớp nội mạc tuy có giảm đi đáng kể, nhưng vẫn còn chứ không mất đi hoàn toàn . Như vậy, ngoài cơ chế chính là tăng giải phóng NO từ nội mạc và tăng GMP vòng ở cơ trơn thể hang, osthol còn có thể tác động gây giãn trực tiếp cơ trơn thể hang theo cơ chế khác. Do đó, thuốc thử OS35 (chứa 35% osthol) có khả năng làm tăng nhẹ ICP nền so với khi chưa dùng thuốc.
4.3.2.2. Thay đổi ICP sau khi kích thích điện dây thần kinh hang
	Sildenafil làm tăng rõ rệt ICP cực đại sau khi kích thích điện dây thần kinh hang cũng như thời gian đáp ứng với kích thích. Điều này có thể dễ dàng giải thích vì cơ chế tác dụng của sildenafil là ức chế đặc hiệu enzym PDEV. Kết quả dẫn đến tích lũy GMP vòng trong cơ trơn thể hang, từ đó, tăng khả năng giãn cơ trơn thể hang, tăng ICP cực đại. Lô chuột dùng OS35 cũng có ICP cực đại, thời gian đáp ứng với kích thích tăng rõ rệt so với ICP nền. Như đã trình bày ở trên, kết quả nghiên cứu của James Chen và cs. (2000) cho thấy osthol có tác dụng làm tăng giải phóng NO từ nội mạc mạch máu ở thể hang. Do đó, làm tăng cường tác dụng khi kích thích điện dây thần kinh hang. Ngoài ra, osthol còn ức chế không đặc hiệu PDE, làm tăng lượng GMP vòng, AMP vòng; hoạt hóa adenyl cyclase làm tăng tổng hợp AMP vòng. Các cơ chế này dẫn đến tăng giãn cơ trơn thể hang, tăng ICP và kéo dài thời gian đáp ứng với kích thích điện của thể hang.
4.3.2.3. Thay đổi huyết áp động mạch trung bình và tỉ số ICP max/ MAP
	Một trong những tác dụng không mong muốn của các thuốc tác dụng tăng giải phóng NO hoặc tăng GMP vòng, AMP vòng là gây tình trạng hạ huyết áp. Do đó, bên cạnh việc đánh giá ảnh hưởng của sildenafil và OS35 trên giá trị ICP, nhóm nghiên cứu còn đánh giá ảnh hưởng của các thuốc thử này trên huyết áp động mạch trung bình và chỉ số ICP max/ MAP. Kết quả nghiên cứu cho thấy huyết áp động mạch trung bình ở các thời điểm sau khi uống sildenafil và OS35 đều không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với khi chưa uống thuốc (p > 0,05); trong khi giá trị ICP cực đại ở tăng rõ rệt so với khi chưa uống thuốc (p < 0,01). Do đó, tỉ số ICP max/ MAP ở các lô dùng sildenafil và OS35 tăng rõ rệt ở các thời điểm sau khi uống thuốc so với khi chưa uống thuốc (p < 0,01).
4.4. Tác dụng của OS35 trên hành vi tình dục ở chuột cống đực trưởng thành
	Nghiên cứu tác dụng của thuốc trên hành vi tình dục là một mô hình tổng hợp, không chỉ giúp phát hiện được các thuốc có tác dụng tăng cường chức năng sinh dục, mà còn định hướng được cơ chế tác dụng của thuốc. 
4.4.1. Ảnh hưởng trên hoạt động nhảy (mounting)
	Hoạt động nhảy phản ánh sự hoạt hóa tình dục hay sự thức tỉnh tình dục, gắn liền với khái niệm ham muốn tình dục (libido) ở người. Thông số đánh giá hoạt động nhảy là tỉ lệ chuột nhảy, số lần nhảy (MF) và ML (thời gian nhảy). Trong số đó, ML là chỉ số quan trọng đánh giá ham muốn tình dục. Kết quả nghiên cứu cho thấy sildenafil và thuốc thử OS35 làm tăng tỉ lệ chuột nhảy và rút ngắn thời gian nhảy có ý nghĩa thống kê so với lô chứng không dùng thuốc (p < 0,05). 
4.4.2. Ảnh hưởng trên hoạt động thâm nhập (intromission) 
	Hoạt động thâm nhập cần có sự cương dương. Quá trình cương dương cần có sự phối hợp của quá trình giãn mạch, các hormon và yếu tố thần kinh. Do đó, hoạt động thâm nhập đặc trưng cho sức mạnh tình dục (potency) hay hiệu quả giao cấu. Chỉ số IF không chỉ thể hiện khả năng cương dương mà còn thể hiện khả năng duy trì cương dương để tiến hành giao hợp và là tiền đề cho hiện tượng xuất tinh. Chỉ số IL (thời gian đạt đến thâm nhập) thì phản ánh ham muốn tình dục hơn là sức mạnh tình dục. Kết quả nghiên cứu cho thấy sildenafil làm tăng tỉ lệ chuột đực có hiện tượng thâm nhập, tăng số lần thâm nhập (IF) so với lô không dùng thuốc (p < 0,05). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với cơ chế tác dụng của sildenafil là ức chế PDEV, làm tăng lượng GMP vòng gây giãn mạch máu đến thể hang, tăng áp lực thể hang, tăng khả năng cương dương. 
Ở lô chuột dùng OS35 150 mg/kg, tỉ lệ chuột thâm nhập và số lần thâm nhập tăng có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05). Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu tác dụng của OS35 trên áp lực thể hang ở chuột đực. Như vậy, sau khi dùng thuốc, do tác dụng tăng giải phóng NO từ nội mạc, tăng lượng GMP vòng, AMP vòng của osthol ở cơ trơn thể hang, tăng lượng máu đến dương vật, tăng khả năng cương dương nên làm tăng khả năng và sức mạnh giao cấu của chuột cống đực. 
4.4.3. Ảnh hưởng trên hoạt động xuất tinh (ejaculation)
Thời gian sau xuất tinh (PEI) là khoảng thời gian để chuột hồi sức lại sau mỗi loạt giao cấu, và cũng là chỉ số đánh giá sự ham muốn tình dục. Có nhiều yếu tố chi phối quá trình xuất tinh. Kết quả nghiên cứu cho thấy liều đơn OS35 150 mg/kg chưa làm thay đổi thời gian xuất tinh ở chuột cống đực.
4.5. Nghiên cứu tác dụng của OS35 trên chuột cống trắng đực bị gây suy giảm sinh sản bằng natri valproat
4.5.1. Lí do lựa chọn natri valproat gây suy giảm sinh sản trên chuột cống đực
	Nghiên cứu của Nishimura và cs. (2000) cũng cho thấy với liều 500 mg/kg/ngày dùng trong 7 tuần, natri valproat làm giảm các chỉ số sinh sản, cũng như làm giảm số lượng tinh trùng, giảm tốc độ di động của tinh trùng, thay đổi hình thái và cấu trúc tinh hoàn của chuột cống đực trưởng thành. Vì vậy, trong luận án này, natri valproat liều 500 mg/kg/ngày được sử dụng như một tác nhân gây suy giảm sinh sản cho chuột thực nghiệm, trên cơ sở đó đánh giá tác dụng bảo vệ của OS35 trên cấu trúc và chức năng của cơ quan .
4.5.2. Nghiên cứu tác dụng bảo vệ của thuốc thử OS35 trên chuột cống trắng đực bị gây suy giảm sinh sản bằng natri valproat
4.5.2.1. Ảnh hưởng trên trọng lượng các cơ quan sinh dục
Trọng lượng các cơ quan sinh dục của chuột dùng OS35 ở cả mô hình bảo vệ và phục hồi đều không thay đổi có ý nghĩa thống kê so với lô gây suy giảm sinh sản. Chuột sử dụng để gây suy giảm sinh sản bằng natri valproat là chuột chuột đực trưởng thành, các cơ quan sinh dục đã phát triển hoàn thiện và ít bị ảnh hưởng bởi các thuốc tác động thông qua androgen hơn so với chuột cống non thiến. 
4.5.2.2. Ảnh hưởng mật độ và độ di động và hình thái tinh trùng
Số lượng tinh trùng, đánh giá gián tiếp qua mật độ tinh trùng, là một trong những chỉ số rất nhạy để đánh giá quá trình sinh tinh, bởi đó là kết quả tổng hợp của tất cả các giai đoạn sinh tinh trong tinh hoàn, bất cứ một sự bất thường nào trong quá trình sinh tinh đều có thể ảnh hưởng đến số lượng tinh trùng. Kết quả nghiên cứu cho thấy OS35 làm tăng rõ rệt mật độ tinh trùng ở mô hình và tỉ lệ tinh trùng sống ở mô hình bảo vệ; trong khi không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mô hình phục hồi. Sự khác biệt này có thể do khác nhau về thời gian dùng thuốc ở mô hình bảo vệ chỉ 7 ngày, trong khi 1 chu kỳ sinh tinh kéo dài khoảng 6- 8 tuần.
Ngoài ra, OS35 cải thiện rõ rệt độ di dộng tinh trùng và giảm rõ rệt tỉ lệ tinh trùng bình thường và tăng rõ rệt tỉ lệ tinh trùng bất thường (bao gồm cả bất thường ở đầu, cổ và đuôi) trên cả mô hình phục hồi và bảo vệ.
4.5.2.3. Ảnh hưởng lên nồng độ testosteron trong máu
	Ở lô chuột dùng OS35, nồng độ testosteron trong máu tăng có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình (p < 0,05). Điều này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu tác dụng của OS35 làm tăng mật độ tinh trùng, tăng tỉ lệ tinh trùng sống, tỉ lệ tinh trùng có tiến tới, tiến tới nhau và giảm tỉ lệ tinh trùng không tiến tới, không di động so với lô mô hình. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Xie Jin-xian (2007) trên chuột nhắt trắng gây suy sinh sản bằng cyclophosphamid, osthol có tác dụng làm tăng testosteron trong máu.
4.5.2.4. Ảnh hưởng lên hình thái mô học của tinh hoàn và kích thước ống sinh tinh
Kết quả mô học ở lô 3 cho thấy, OS35 có xu hướng duy trì sự toàn vẹn cấu trúc tinh hoàn, với biểu mô tinh dày, đủ các loại tế bào, các tế bào có cấu trúc bình thường và mô kẽ bình thường. Điều này cho thấy tác dụng làm tăng biệt hóa và trưởng thành của OS35 lên các tế bào tiền tinh trùng, có thể thông qua tác dụng làm tăng nồng độ testosteron trong máu. Kích thước ống sinh tinh cũng tăng rất rõ rệt so với lô mô hình (p < 0,001).
4.5.2.5. Ảnh hưởng lên các chỉ số nghiên cứu ở chuột cái
Trên cả mô hình bảo vệ và phục hồi, OS35 có tác dụng làm tăng tỉ lệ chuột cái có chửa, tăng số thai đậu, số thai phát triển bình thường, giảm tỉ lệ thai chết sớm/ chết muộn trên những chuột cái ghép với chuột đực gây suy giảm sinh sản bằng natri valproat.
KẾT LUẬN
1. Độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của OS35 trên động vật thực nghiệm
1.1. Độc tính cấp của OS35 trên chuột nhắt trắng theo đường uống
Ở những lô chuột uống OS35 liều từ 1,25 g/kg thể trọng chuột trở lên, xuất hiện chuột chết trong vòng 24 giờ sau khi uống. Xác định được LD50 của OS35 trên chuột nhắt trắng theo đường uống là: LD50 = 4,5 (2,8 - 7,1) g/kg với p = 0,05
1.2. Độc tính bán trường diễn của OS35 trên chuột cống trắng theo đường uống
	OS35 liều 150 mg/kg/ngày và 450 mg/kg/ngày uống trong 28 ngày liên tục không làm ảnh hưởng đến tình trạng chung, cân nặng, các chỉ số đánh giá chức năng tạo máu, chức năng gan, mức độ hủy hoại tế bào gan và chức năng lọc của thận, không ảnh hưởng đến giải phẫu bệnh gan. Tuy nhiên, trên hình ảnh mô bệnh học thận có hiện tượng viêm mạn tính.
2. Hoạt tính androgen, tác dụng trên chức năng cương dương và hành vi tình dục của OS35 trên động vật thực nghiệm
2.1. Hoạt tính androgen của OS35
	OS35 liều 150 mg/kg/ngày và 250 mg/kg/ngày có hoạt tính androgen trên chuột cống đực non thiến: OS35 liều 150 mg/kg/ngày có tác dụng làm tăng trọng lượng 2 cơ quan (đầu dương vật và cơ nâng hậu môn – hành hang); OS35 liều 250 mg/kg/ngày có tác dụng làm tăng trọng lượng 3 cơ quan (túi tinh, đầu dương vật và cơ nâng hậu môn – hành hang).
2.2. Tác dụng trên chức năng cương dương của OS35
	- Trên thỏ: Chiều dài dương vật ở các thời điểm 5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút và 30 phút sau khi uống OS35 liều 60 mg/kg và thời gian đáp ứng cương tương đương với lô dùng sildenafil liều 4,5 mg/kg.
	- Trên chuột cống đực: OS35 liều 150 mg/kg có tác dụng làm tăng ICP nền ở thời điểm 30 phút và 45 phút sau khi uống; làm tăng ICP cực đại, thời gian đáp ứng và chỉ số ICP/ huyết áp động mạch trung bình sau khi kích thích điện dây thần kinh hang ở thời điểm 15 phút, 30 phút và 45 phút sau khi uống so với khi chưa uống nhưng không ảnh hưởng đến huyết áp động mạch trung bình ở chuột.
	- Trên hành vi tình dục: OS35 liều 150 mg/kg uống 15 phút trước khi giao cấu có tác dụng làm tăng tỉ lệ chuột nhảy, tỉ lệ chuột thâm nhập, số lần thâm nhập và rút ngắn thời gian nhảy, thời gian thâm nhập so với lô chứng không dùng thuốc.
3. Tác dụng của OS35 trên chuột cống trắng gây suy giảm sinh sản bởi natri valproat
3.1. Tác dụng bảo vệ	
	OS35 liều 150 mg/kg/ngày uống trong 7 tuần liên tục có tác dụng làm tăng mật độ tinh trùng, tỉ lệ tinh trùng sống, tỉ lệ tinh trùng có tiến tới, tiến tới nhanh, giảm tỉ lệ tinh trùng không tiến tới, không di động, tăng nồng độ testosteron trong máu, tăng kích thước ống sinh tinh, cải thiện hình thái mô học tinh hoàn trên chuột cống đực gây suy giảm sinh sản bằng natri valproat 500 mg/kg/ngày trong 7 tuần; và tăng tỉ lệ thụ thai và sự phát triển phôi thai của chuột cái ghép với các chuột đực này so với lô mô hình.
3.2. Tác dụng phục hồi
	OS35 liều 150 mg/kg/ngày uống trong 10 ngày sau khi uống natri valproat 500 mg/kg/ngày trong 7 tuần có tác dụng cải thiện các chỉ số nghiên cứu trên chuột cống đực và chuột cống cái tương tự tác dụng bảo vệ, ngoại trừ mật độ tinh trùng và tỉ lệ tinh trùng sống không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình.