Tóm tắt Luận án Xác định thành phần loài và một số đặc điểm sinh học phân tử của sán lá gan lớn ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG 
ĐỖ NGỌC ÁNH 
XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI VÀ 
MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA 
SÁN LÁ GAN LỚN Ở VIỆT NAM 
Chuyên ngành: Ký sinh trùng Y học 
Mã số: 62 72 01 16 
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ 
HÀ NỘI - 2017 
 Công trình hoàn thành tại 
HỌC VIỆN QUÂN Y 
Cán bộ hƣớng dẫn khoa hoc: 
1. PGS.TS. Nguyễn Khắc Lực 
2. PGS.TS. Trần Thanh Dƣơng 
Phản biện 1: PGS.TS. Lê Thanh Hòa 
Cơ quan: Viện CNSH, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam 
Phản biện 2: PGS.TS. Đoàn Huy Hậu 
Cơ quan: Học viện Quân y, Bộ Quốc phòng 
Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp Viện, họp tại 
Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng vào hồi 
 ..giờ, ngày..thángnăm 
Có thể tìm thấy luận án tại: 
- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam 
- Thƣ viện Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng 
1 
MỞ ĐẦU 
1. Tính cấp thiết 
Bệnh do sán lá gan lớn (SLGL) ở người và động vật do Fasciola hepatica 
(Linnaeus, 1758) và Fasciola gigantica (Cobbold, 1885) gây ra. Đây là bệnh nhiệt 
đới bị lãng quên, lây truyền từ động vật sang người thông qua đường thực phẩm. 
Trong 25 năm qua, toàn thế giới có khoảng 17 triệu người mắc bệnh và 180 triệu 
người sống trong vùng nguy cơ nhiễm SLGL. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ít 
nhất 2,4 triệu người tại hơn 70 quốc gia bị ảnh hưởng bởi bệnh do SLGL. 
F. hepatica và F. gigantica có thể được phân biệt dựa vào hình thái nhưng 
phương pháp hình thái bộc lộ nhiều hạn chế. Dạng trung gian (Fasciola sp.) với 
hình thái và kiểu gen hỗn hợp của F. hepatica và F. gigantica, xuất hiện ở nhiều 
nơi trên thế giới bao gồm Việt Nam, rất khó xác định loài bằng hình thái. Vì vậy, 
ở những nơi tồn tại dạng trung gian, trong giám định loài SLGL, bên cạnh 
phương pháp hình thái học, ứng dụng sinh học phân tử là rất cần thiết. 
Hiện nay, dữ liệu hình thái và phân tử của SLGL ở Việt Nam còn rất hạn chế. 
Vì vậy, nghiên cứu về hình thái và phân tử của SLGL là rất cần thiết. Đó là lý do 
chúng tôi tiến hành đề tài “ t v t s s 
 t s t t . 
2. Mục tiêu nghiên cứu 
 1. Xác định một số chỉ số hình thái và phân loại sán lá gan lớn tại Việt Nam 
bằng phương pháp hình thái học. 
 2. Xác định thành phần loài và phân tích một số đặc điểm phân tử của sán lá 
gan lớn ở Việt Nam. 
3. Tính khoa học, tính mới và tính thực tiễn của đề tài 
- Bằng việc kết hợp hình thái học và sinh học phân tử với cả gen nhân và gen 
ty thể để nhận dạng, xác định loài SLGL thập tại các vùng địa lý khác nhau ở Việt 
Nam nên các kết quả giám định loài khách quan, chính xác, tin cậy. 
- Đề tài đã chỉ ra được SLGL ở Việt Nam có tính đa hình về hình thái và di 
truyền với F. gigantica và dạng trung gian Fasciola sp. cùng tồn tại ở cả 3 khu 
vực địa lý và các vật chủ khác nhau. 
- Bước đầu chỉ ra được tần suất của F. gigantica và dạng trung gian Fasciola 
sp. ở Việt Nam mà trước đó chưa nghiên cứu nào công bố. 
- Cung cấp dữ liệu ban đầu, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo tìm hiểu 
những khác biệt về bệnh học, đáp ứng miễn dịch ở vật chủ nhiễm F. gigantica 
và dạng trung gian Fasciola sp. 
4. Bố cục luận án 
Luận án gồm 151 trang, gồm: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan tài liệu (36 
trang); Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (29 trang); Kết quả nghiên cứu (43 
trang); Bàn luận (36 trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1 trang); 40 bảng số 
liệu, 29 hình và 146 tài liệu tham khảo. 
2 
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 
1.1. Sán lá gan lớn Fasciola spp. và bệnh do sán lá gan lớn (Fasciolosis) 
1.1.1. Đặc điểm sinh học của Fasciola spp. 
- Các loài sán lá gan lớn và phân bố của chúng 
Sán lá gan lớn (SLGL) thuộc ngành giun dẹt, lớp sán lá, giống Fasciola. Hiện 
tại, giống Fasciola gồm có 4 loài: F. hepatica (Linnaeus, 1758), F. gigantica 
(Cobbold, 1855), F. nyanzae (Leiper, 1910) và F. jacksoni (Cobbold, 1869). 
Trong đó, F. hepatica và F. gigantica là 2 loài gây bệnh chủ yếu ở người và động 
vật. F. hepatica phân bố rộng rãi trên khắp thế giới, trong khi F. gigantica phân 
bố chủ yếu ở khu vực có khí hậu nhiệt đới như Châu Á, Châu Phi. 
- Đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn 
Hì t sán trườ t : F. hepatica trưởng thành có kích thước 8 - 15 x 20 – 
30 mm. F. gigantica khá giống F. hepatica, tuy nhiên chiều dài có thể tới 75 mm. 
F. gigantica thường thon và dài, trong khi F. hepatica thường ngắn và rộng. 
Hì t trứ : Trứng F. hepatica rất giống với trứng của F. gigantica. Trứng F. 
hepatica (150 x 90 μm) nhỏ hơn trứng của F. gigantica (200 x 100 μm). 
- Vòng đời sinh học: Vòng đời của SLGL rất đặc biệt trong lớp sán lá. Chúng chỉ 
có 1 vật chủ phụ là ốc, sau đó hình thành nang ở thực vật thủy sinh trước khi 
nhiễm vào vật chủ theo con đường ăn uống. Trong khi đó, hầu hết các loại sán lá 
khác vòng đời qua 2 vật chủ phụ trước khi xâm nhập vào vật chủ chính. 
Hình 1.2. Vòng đời sinh học của sán lá gan lớn 
- Các yếu tố ảnh hƣởng tới vòng đời của sán lá gan lớn 
Sự phát triển các giai đoạn vòng đời của SLGL phù thuộc rất nhiều vào các 
điều kiện môi trường và vật chủ trung gian. Trung gian truyền bệnh SLGL là các 
loài ốc thuộc họ Lymnaeidae. Sự phân bố của các loài ốc là vật chủ trung gian 
hoàn toàn phù hợp với sự phân bố của SLGL. Ở Việt Nam, 2 loài ốc nước ngọt 
Lymaea viridis và Lymaea swinhoei được xác định là vật chủ trung gian chủ yếu 
của SLGL. 
3 
- Quá trình sinh sản, vấn đề lai và chuyển gen ở sán lá gan lớn 
Theo K. Cwilinski và CS (2016), SLGL 3 hình thức sinh sản: tự giao phối, 
giao phối chéo và sinh sản vô tính. Các hình thức sinh sản này gặp cả ở trong tự 
nhiên và trên thực nghiệm. Ở một số quốc gia như Nhật Bản, Việt Nam và Hàn 
Quốc, dạng trung gian Fasciola sp. với các các thể mang kiểu gen pha trộn của 2 
loài hoặc các cá thể lai với gen nhân của loài này còn gen ty thể của loài kia đã 
được xác định (còn gọi là các cá thể chuyển gen). Dạng trung gian cũng được ghi 
nhận gây bệnh ở cả người và động vật. 
1.1.2. Triệu chứng, chẩn đoán bệnh do Fasciola spp. 
- Triệu chứng lâm sàng: Các triệu chứng của bệnh do SLGL ở người thường xuất 
hiện sau khi bị nhiễm ấu trùng 2 tuần và phụ thuộc vào số lượng sán ký sinh. Bệnh 
được chia làm 4 thời kỳ: ủ bệnh, toàn phát, tiềm tàng và mạn tính. Thời kỳ toàn phát 
với những biểu hiện rõ ràng nên bệnh nhân thường đi khám và được phát hiện 
bệnh. Thời kỳ này kéo dài 2 - 4 tháng với các triệu chứng cơ năng thường gặp là: 
sốt, đau bụng vùng hạ sườn phải, rối loạn tiêu hóa, nổi mề đay, gan lách to 
- Đặc điểm cận lâm sàng: Các xét nghiệm có giá trị chẩn đoán là: tăng bách cầu 
ái toan trên 5 %, có khi lên đến 83 %; Siêu âm gan thấy tổn thương hình tổ ong. 
Xét nghiệm ELISA máu dương tính với kháng thể kháng sán lá gan; Tìm trứng có 
giá trị chẩn đoán quyết định nhưng tỷ lệ dương tính rất thấp (< 5 %). 
1.2. Tỷ lệ nhiễm SLGL ở ngƣời và động vật 
- Trên thế giới: Nhiễm SLGL ở động vật ăn cỏ rất phổ biến trên toàn thế giới, tỷ 
lệ nhiễm trung bình từ 30 % đến 50 %. Ở người, theo Mas-Coma S. và CS (2004), 
trên toàn thế giới có khoảng 2,4 đến 17 triệu người có nguy cơ nhiễm SLGL, tập 
trung chủ yếu ở Châu Á và Châu Phi. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ít nhất 
2,4 triệu người tại hơn 70 quốc gia bị ảnh hưởng bởi bệnh do SLGL. 
- Ở Việt Nam: Theo một số nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu, bò 
dao động trong khoảng từ 30 đến 60%. Tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu thường cao hơn 
ở bò và mùa mưa tỷ lệ nhiễm thường cao hơn mùa khô. Ở người, theo Đặng Thị 
Cẩm Thạch (2008), tính đến tháng 3 năm 2008 số bệnh nhân nhiễm SLGL là > 5.000 
người. Còn theo Nguyễn Văn Đề và CS (2012), tính đến năm 2012, bệnh SLGL ở 
Việt Nam lưu hành ở ít nhất 52 tỉnh/thành với số người mắc > 20.000 người. 
1.3. Các phƣơng pháp xác định loài Fasciola spp. 
1.3.1. Các phƣơng pháp xác định loài Fasciola sp. 
2 phương pháp xác định loài chủ yếu được sử dụng là hình thái học và sinh học 
phân tử dựa trên các chỉ thị phân tử gen ty thể và gen nhân tế bào. 
* Phƣơng pháp hình thái học 
Theo Periago và CS (2008), dựa vào tỷ số chiều dài/chiều rộng (BL/BW), 
SLGL được phân loại thành: nhóm giống với F. hepatica (1,65 - 2,76), nhóm 
giống F. gigantica (3,43 - 5,50) và nhóm Fasciola sp. (2,77 - 3,42). 
Theo Srimuzipo P. và CS (2000), dựa vào chiều dài SLGL được chia làm 3 nhóm: 
nhóm nhỏ ( 35 mm). 
4 
* Phƣơng pháp sinh học phân tử 
 RFLP-PCR và giải trình tự là các công cụ thường được lựa chọn. Các chỉ thị 
cox1, nad1 thuộc hệ gen ty thể, các vùng giao gen ITS1, ITS2 và 28S thuộc hệ 
gen nhân thường được sử dụng. Simsek và CS (2011) đã sử dụng gen cox1 và các 
enzyme RsaI và AluI để phân biệt F. gigantica và F. hepatica. Ichikawa M và CS 
(2010) sử dụng vùng gen chứa đoạn giao gen ITS1 và enzyme RsaI để phân biệt 
F. hepatica, F. gigantica và dạng trung gian. Dạng trung gian được xác định có 
nhiều bất thường cả về hình thái và phân tử theo hướng phù hợp với cả 2 loài nên 
khó có thể xếp loại là F. hepatica hay F. gigantica. Vì thế, Mas-Coma và CS 
(2009) cho rằng, nếu chỉ dựa vào một trong 2 hệ gen nhân hoặc hệ gen ty thể để 
giám định loài SLGL sẽ không chính xác mà cần kết hợp cả 2 hệ gen. 
1.3.2. Tính đa hình di truyền di truyền ở sán lá gan lớn 
- Tính đa hình của một số gen thuộc hệ gen ty thể: Tính đến hết năm 2016, đã 
có 5 hệ gen ty thể hoàn thiện của SLGL được giải mã và công bố trên ngân hàng 
gen. Chiều dài toàn bộ hệ gen ty thể của Fasciola sp. là 14453 bp, F. hepatica 
14462 bp và F. gigantica 14478 bp, bao gồm 12 gen, 2 vùng mã hóa rRNA, 22 
vùng mã hóa tRNA, một vùng không mã hóa và một số tiểu phần khác. 
- Tính đa hình của một số gen thuộc hệ gen nhân tế bào: Các vùng giao gen 
ITS-1 (khoảng 430 bp) và ITS2 (khoảng 360 bp) là những chỉ thị phân tử quan 
trọng để xác định loài SLGL. Trên đoạn ITS-2, F. hepatica và F. gigantica có 6 vị 
trí khác biệt và một trong số đó bị khuyết ở F. gigantica. Trên đoạn ITS-1, F. 
gigantica có 5 vị trí khác biệt so với F. hepatica. Dạng trung gian của SLGL có 
trình tự ITS-1, ITS-2 giao thoa, pha trộn của cả F. hepatica và F. gigantica. 
1.3.3. Tình hình nghiên cứu xác định loài sán lá gan lớn ở Việt Nam 
 Trước đây, bằng phương pháp giám định hình thái học, một số tác giả cho 
rằng F. hepatica và F. gigantica đều có mặt ở Viêt Nam. Tuy nhiên, với sự hỗ trợ 
của sinh học phân tử hầu hết các nghiên cứu sau này cho rằng SLGL ở Việt Nam là 
F. gigantica và dạng trung gian. Các nghiên cứu sinh học phân tử chủ yếu lựa chọn 
gen nad1 hoặc cox1 thuộc hệ gen ty thể và ITS1, ITS2 thuộc hệ gen nhân. Do ở Việt 
Nam tồn tại các cá thể dạng trung gian (bao gồm các cá thể lai) nên một số nghiên 
cứu chỉ sử dụng đơn thuần hệ gen ty thể hoặc hệ gen nhân có thể đã kết luận chưa 
thực sự đầy đủ, cụ thể về thành phần loài của SLGL. 
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 
- Nghiên cứu hình thái: 316 cá thể SLGL trưởng thành thu từ trâu, bò, dê, cừu và 
01 cá thể SLGL thu từ người. 
- Nghiên cứu xác định loài và phân tích đặc điểm phân tử: gen cox1, nad1 thuộc 
hệ gen ty thể và các vùng giao gen ITS-1, ITS-2 thuộc hệ gen nhân. 
5 
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 
* Địa điểm thu thập mẫu: Miền Bắc (4 tỉnh): Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, 
Điện Biên; Miền Trung-Tây Nguyên (gọi tắt là Miền Trung, 6 tỉnh): Nghệ An, 
Quảng Nam, ĐắkLắk, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận; Miền Nam (4 tỉnh): Tây 
Ninh, Bình Phước, Đồng Tháp, Cần Thơ; 
* Địa điểm phân tích hình thái và phân tử: Học viện Quân y, Hà Nội; 
2.1.3. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2013 đến 1/2017 
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả có phân tích dựa trên kết quả các 
đặc điểm hình thái và phân tử của SLGL. 
2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu 
2.2.2.1. Cỡ mẫu xác định các chỉ số hình thái 
- Cỡ mẫu xác định các chỉ số hình thái được tính theo công thức 
2 2.
1 /2
2( )
Z SD
n 

 , tham khảo giá trị tỷ số chiều dài/chiều rộng trong nghiên cứu của 
Wannasan A và CS (2014) ở quần thể SLGL tại Thái Lan tính được n = 211. Thực 
tế, tổng số 317 cá thể SLGL toàn vẹn được đo đạc các chỉ số hình thái. 
- Chọn mẫu và thu thập mẫu SLGL: mỗi cá thể vật chủ trâu, bò, dê, cừu thu 
thập ngẫu nhiên từ 2 đến 20 con SLGL. Các mẫu sán được thu thập là các cá thể 
sán có hình thái toàn vẹn. Trong đó, Miền Bắc 121 cá thể, Miền Trung 137 cá thể 
và Miền Nam 59 cá thể; 126 cá thể sán thu từ 15 cá thể bò, 178 sán từ 16 cá thể 
trâu, 6 sán từ 2 cá thể dê, 6 sán từ 2 cá thể cừu và 1 cá thể sán thu từ người. 
- Ghi nhãn mẫu SLGL: mẫu sán được dán nhãn và ký hiệu với 4 thông tin: 
năm thu thập, vật chủ, địa điểm thu thập và thứ tự mẫu ở địa điểm đó. Ví dụ: mẫu 
15Tr-HN1, thu thập năm 2015 từ trâu (Tr = trâu; B = Bò; C = cừu; D = Dê) tại Hà 
Nội. Đây là cá thể SLGL đầu tiên được ghi mẫu năm 2015 tại Hà Nội. 
2.2.2.2. Cỡ mẫu giám định loài và phân tích đặc điểm sinh học phân tử 
- Cỡ mẫu giám định loài 
+ Số lượng SLGL: 224 cá thể sán ở động vật và 01 ở người. SLGL ở động vật 
được lựa chọn sao cho thuộc cả 3 khu vực địa lý và ở các vật chủ khác nhau. 
+ Chọn mẫu giám định loài bằng sinh học phân tử: Mỗi cá thể vật chủ tiến hành 
giám định loài không quá 10 con sán. Số lượng sán ở mỗi loại vật chủ như sau: bò 
106 cá thể, trâu 108 cá thể sán, dê 6 cá thể, cừu 4 cá thể và người 1 cá thể. 
- Cỡ mẫu xác định các đặc điểm phân tử: 17 trình tự gen cox1, 8 trình tự 
gen nad1, 16 trình tự ITS1 và 16 trình tự ITS2. Cụ thể trong Bảng 2.1: 
Bảng 2.1. Danh sách các mẫu và gen đích giải trình tự 
TT Ký hiệu 
Năm 
thu thập 
Nơi thu 
thập 
Vật 
chủ 
Gen đƣợc giải trình tự 
cox1 nad1 ITS1 ITS2 
1 15Tr-HN1 2015 Hà Nội Trâu X X X X 
2 15Tr-VP1 2015 Vĩnh Phúc Trâu X X X X 
3 SLGL-N 2010 Hà Nội Ngƣời X X X X 
6 
4 10B-HN1.8 2010 Hà Nội Bò X X X X 
5 10B-HN1.9 2010 Hà Nội Bò X X X X 
6 15Tr-NA5 2015 Nghệ An Trâu X X X X 
7 10B-NA1.2 2010 Nghệ An Bò X X X 
8 09B-QN1.1 2009 Quảng Nam Bò X X X 
9 15Tr-KH1 2015 Khánh Hòa Trâu X 
10 16D-NT1 2016 Ninh Thuận Dê X X X X 
11 16D-NT2 2016 Ninh Thuận Dê X X X 
12 16C-NT1 2016 Ninh Thuận Cừu X X X X 
13 16C-NT2 2016 Ninh Thuận Cừu X X X 
14 09B-TN1.1 2009 Tây Ninh Bò X X X 
15 14B-CT2 2014 Cần Thơ Bò X X X 
16 15Tr-ĐT1 2015 Đồng Tháp Trâu X X X 
17 15Tr-ĐT2 2015 Đồng Tháp Trâu X X X 
2.2.3. Các phƣơng pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu hình thái 
- Các chỉ số/chỉ tiêu hình thái được khảo sát, xác định: chiều dài cơ thể (BL), 
chiều rộng cơ thể (BW), tỷ số chiều dài/chiều rộng (BL/BW), khoảng cách từ giác 
bụng tới cuối thân (VS-P) 
- Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: Vật liệu bảo quản và làm 
tiêu bản sán, vật liệu đo đạc kích thước sán. 
- Các phương pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu: Kỹ thuật làm tiêu 
bản sán lá gan lớn bằng thuốc nhuộm Carmin; Xác định các chỉ số hình thái theo 
phương pháp của Periago và CS (2006, 2008). 
- Phân nhóm sán lá gan lớn theo hình thái: theo Srimuzipo và CS (2000) dựa 
vào chiều dài và  ...  dao động từ 1,58 - 6,57, trung bình 2,97 ± 
0,68. So sánh với các quần thể SLGL thuần chủng ở Iran, chỉ số này lớn hơn của 
F. hepatica (2,97 ± 0,68 so với 2,24 ± 0,03; p < 0,05) nhưng nhỏ hơn của F. 
gigantica (2,97 ± 0,68 so với 5,74 ± 0,07; p < 0,05). Kết quả này cũng tương tự 
khi so sánh chỉ số BL/BW ở nghiên cứu này với chỉ số BL/BW ở một số quần thể 
F. hepatica và F. gigantica thuần chủng trong nghiên cứu của Periago và CS 
(2006, 2008). Riêng mẫu SLGL ở người trong nghiên cứu này, mặc dù hình thái 
20 
ngoài rất điển hình của F. gigantica nhưng chỉ số BL/BW là 3,21 nằm ở vị trí 
trung gian giữa F. hepatica và F. gigantica. Tuy nhiên, do mẫu SLGL thu từ 
người là cá thể lạc chỗ ký sinh, chưa trưởng thành nên các so sánh hay phân nhóm 
mẫu sán này có phần chưa thực sự chính xác. 
Từ các kết quả phân tích ở trên đã chỉ ra rằng, một số chỉ số kích thước 
SLGL ở Việt Nam nằm ở khoảng giao thoa của 2 loài F. hepatica và F. 
gigantica. Mặc dù các quần thể SLGL đem so sánh không tương đồng về địa lý 
và vật chủ thu thập nhưng các đặc điểm hình thái của nhiều cá thể không điển 
hình, giống với cả F. hepatica và F. gigantica rõ ràng đã gợi ý về giả thuyết tồn 
tại dạng trung gian và/hoặc cả 2 loài SLGL ở Việt Nam. 
4.1.2. Về kết quả phân loại sán lá gan lớn dựa vào hình thái 
Về kết quả phân loại sán lá gan lớn 
Dựa trên các kết quả về chỉ số chiều dài, SLGL đã được phân làm 3 nhóm nhỏ, 
trung bình và lớn dựa theo công bố trước đó của Srimuzipo P. và CS (2000). Theo 
cách phân nhóm này, SLGL ở Việt Nam chủ yếu thuộc nhóm có kích thước nhỏ 
(29,43 %) và trung bình (62,34 %). Nhóm có kích thước lớn chỉ chiếm 8,23 %. 
Các nhóm hình thài đều thấy ở các vùng miền và các vật chủ khác nhau. Riêng 
mẫu SLGL ở người, kích thước chiều dài thuộc nhóm trung bình. Tỷ lệ các nhóm 
nhỏ, trung bình và lớn trong nghiên cứu này có sự khác biệt so với của Wannasan 
A và CS (2014) nghiên cứu trên quần thể SLGL ở Thái Lan. Sự khác biệt này có 
thể do việc thu thập mẫu trên các vật chủ và ở các vùng địa lý khác nhau. Mặt 
khác, cả 2 nghiên cứu chưa khảo sát hình thái trên các yếu tố tác động khác như 
dạng nhị bội hay tam bội, dinh dưỡng vật chủ, tuổi vật chủ 
SLGL còn được phân loại thành 3 nhóm: giống với F. hepatica (F. hepatica-
like), giống Fasciola sp. (Fasciola sp.-like) và giống với F. gigantica (F. gigantica-
like), dựa vào chỉ số chiều dài/chiều rộng theo Periago và CS (2008). Theo cách 
phân loại này, nhóm F. hepatica-like chiếm tỷ lệ cao nhất với 44,30 %, nhóm 
Fasciola sp.-like (dạng trung gian) chiếm tỷ lệ 38,61 % và nhóm F. gigantica-like 
chiếm tỷ lệ thấp nhất với 17,09 %. Theo các phân loại này, các nhóm hình thái 
cũng gặp ở tất cả các vùng miền và các vật chủ. Tuy nhiên, theo một số tác giả, 
phân loại SLGL theo theo phương pháp của Periago và CS (2006, 2008) không 
thực sự chính xác, nhất là ở các khu vực tồn tại các cá thể lai hoặc với sán ở vùng 
giao thoa, nơi cả 2 loài Fasciola cùng tồn tại song song. Nghiên cứu của Ghavami 
và CS (2009) tại Iran là một dẫn chứng. 
Phân tích, so sánh hình thái học của sán lá gan lớn trong nghiên cứu với một 
số nghiên cứu trƣớc đó tại Việt Nam 
Một số nghiên cứu khác ở Việt Nam cũng cho thấy có sự đa hình về hình thái ở 
SLGL. Kết quả giám định loài bằng sinh học phân tử phát hiện sự tồn tại của dạng 
trung gian Fasciola sp., thể tam bội trong các nghiên cứu trước đó đã góp phần giải 
thích tính đa dạng hình thái của SLGL tại Việt Nam. Điều này cũng một lần nữa 
chứng minh rằng ở những nơi tồn tại các cá thể SLGL dạng trung gian thì việc phân 
loại SLGL bằng hình thái gặp rất nhiều khó khăn. Ngoài ra, kích thước SLGL còn 
21 
phụ thuộc vào sán ở thể lưỡng bội, tam bội hay hỗn hợp, trong khi vấn đề này chưa 
phân tích nên các kết quả có những giới hạn nhất định. Mặc dù vậy, các kết quả này 
đã cung cấp những dữ liệu quan trọng về hình thái và cũng cho thấy hình thái 
SLGL ở Việt Nam có tính đa hình. 
4.2. Kết quả xác định thành phần loài và phân tích một số đặc điểm phân tử 
của sán lá gan lớn ở Việt Nam 
4.2.1. Về kết quả xác định thành phần loài sán lá gan lớn ở Việt Nam 
Để xác định loài SLGL, chúng tôi sử dụng PCR-RFLP trên cả hệ gen nhân 
(đoạn giao gen ITS1) và hệ gen ty thể (1 đoạn của gen cox1). 
Dựa trên chỉ thị gen cox1, toàn bộ 225 cá thể SLGL thuộc nhóm F. gigantica. 
Tuy nhiên, kết quả cắt giới hạn bằng RsaI có 10 chủng SLGL ở động vật không 
phù hợp với lý thuyết của F. gigantica (không bị cắt giới hạn làm 2 mảnh). Điều 
này được giải thích khi kết quả giải trình tự cho thấy trên đoạn ADN của gen cox1 
được phân tích, tại vị trí nhận dạng cắt giới hạn của enzyme RsaI (GT/AC) đã có 
1 nu bị biến đổi, A chuyển thành G. Chính sự thay đổi này đã làm cho enzyme 
RsaI không nhận diện được vị trí cắt nên sản phẩm PCR không bị cắt giới hạn và 
điều này cũng cho thấy gen cox1 của SLGL ở Việt Nam có tính đa hình di truyền. 
Dựa trên chỉ thị ITS1, phương pháp PCR-RFLP đã chỉ ra có 41 cá thể thuộc dạng 
trung gian, 184 mẫu là F. gigantica. Như vậy, bằng phương pháp PCR-RFLP dựa 
trên phân tích các chỉ thị gen nhân (ITS1) và gen ty thể (cox1), nghiên cứu này đã 
xác định được 2 kiểu gen của SLGL ở Việt Nam là F. gigantica và dạng trung 
gian (Fasciola sp.). 
4.2.2. Về một số đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn ở Việt Nam 
4.2.2.1. Một số đặc điểm phân tử của chỉ thị gen ty thể cox1 
Toàn bộ 17 trình tự chứa đoạn gen cox1 đều phù hợp với F. gigantia. Kết quả 
so sánh trình tự phù hợp với kết quả phân tích PCR-RFLP. Dựa vào số nucleotide 
sai khác với F. gigantica (KF543342.1, Trung Quốc), SLGL ở Việt Nam có 11 
điểm đa hình với tổng số nucleotide sai khác tối đa là 6 và có 5 kiểu gen đơn bội 
(haplotype). Cụ thể: 11 trình tự thuộc nhóm H8-CO1.FgVN là 15Tr-HN1, 15Tr-
VP1, 15Tr-DT2, 10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 10B-NA1.2, 16D-NT1, 16D-NT2, 
16C-NT1, 16C-NT2 và SLGL-N; mỗi nhóm H4-CO1.FgVN, H5-CO1.FgVN, H9-
CO1.FgVN có 1 trình tự, tương ứng là 15Tr-NA5, 09B-TN1.1, 15Tr-KH1; và có 
3 trình tự nhóm H3-CO1.FgVN là 15Tr-DT1, 14B-CT2 và 09B-QN1.1. 
4.2.2.2. Một số đặc điểm phân tử của chỉ thị gen ty thể nad1 
Đoạn gen nad1 được phân tích có kích thước 535 bp. Toàn bộ 8 trình tự được 
so sánh đều phù hợp với F. gigantica. Các chủng SLGL-N, 15Tr-VP1, 15Tr-HN1, 
10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 16D-NT1, 16C-NT1 có các vị trí sai khác giống nhau so 
với F. gigantica (AB385616.1, Việt Nam) được xếp vào nhóm haplotype H1-
ND1.FgVN, trong khi kiểu sai khác của chủng 15Tr-NA5 khác các chủng còn lại 
nên được xếp vào nhóm H2-ND1.FgVN. Như vậy, dựa vào trình tự đoạn gen 
nad1 này, ghi nhận có 2 haplotype ở SLGL Việt Nam. Các phân tích về gen nad1 
chỉ ra rằng, SLGL Việt Nam có quan hệ gần gũi với F. gigantica ở Châu Á hơn so 
22 
với F. gigantica ở Châu Âu, Châu Phi và xa hơn nữa so với F. hepatica. Một mặt 
cũng cho thấy tính đa hình di truyền trên gen nad1 của SLGL ở Việt Nam. 
4.2.2.3. Một số đặc điểm phân tử của chỉ thị gen nhân ITS1 
Một số nghiên cứu cho rằng trên đoạn 680 bp được khuếch đại bởi cặp mồi 
ITS1-F, ITS1-R có 6 điểm khác biệt giữa F. gigantica và F. hepatica. Đối với 
SLGL ở Việt Nam, cũng với đoạn gen 680 bp này, 2 các thể 10B-HN1.9 và 15Tr-
DT2 (trong số 16 cá thể được giải trình tự) có đoạn ITS1 tương đồng hoàn toàn 
với F. hepatica thuộc haplotype H1 (KF982049.1, Iran), Fasciola sp. 
(AB385611.1, Việt Nam; AB207145.1, Nhật Bản). Điều đáng nói là, 2 cá thể này 
lại có hệ gen ty thể phù hợp với F. gigantica. Như vậy, 2 cá thể này có gen nhân 
thuộc về F. hepatica còn gen ty thể thuộc về F. gigantica. Theo một số nghiên 
cứu, các cá thể này là các cá thể lai, kết quả lai giữa F. gigantica (dòng mẹ) và F. 
hepatica (dòng bố). Các cá thể dạng này đã từng được xác nhận ở SLGL tại Việt 
Nam và một số nước trong khu vực như Thái Lan, Hàn Quốc, Nhật Bản, cũng như 
trên thế giới. 
Ngoài phân tích toàn bộ đoạn dài 680 bp, phần trình tự 432 bp hoàn chỉnh của 
đoạn ITS1 cũng được phân tích. Kết quả so sánh cho thấy, có không quá 5 vị trí 
nu sai khác giữa SLGL Việt Nam so với SLGL thế giới. Các sai khác này cũng 
nằm ở các vị trị số 24, 114, 208, 286 và 306 giống như Mas-Coma S. và CS 
(2014) đã thông báo. Có 5 kiểu gen đơn bội từ H0-ITS1FgVN đến H5-
ITS1FgVN, với 11 cá thể thuộc nhóm H0-ITS1.FgVN, 1 cá thể thuộc nhóm H1-
ITS1.FgVN, 1 cá thể thuộc nhóm H2-ITS1.FgVN, 1 cá thể thuộc nhóm H3-
ITS1.FgVN và 2 cá thể thuộc nhóm H5-ITS1.FgVN. 
4.2.2.4. Một số đặc điểm phân tử của chỉ thị gen nhân ITS2 
Đoạn ITS2 ở SLGL của Việt Nam và Thế giới được chia ra làm 2 nhóm, nhóm 
dài 361 bp (F. gigantica) và nhóm 362 bp (F. hepatica). So sánh trình tự của 2 
nhóm thấy có 7 vị trí xuất hiện sai khác tại các nu số 207 (C/T), 218 (T/C), 231 
(C/T), 270 (T/C), 276 (T/C), 327(-/T) và 334 (A/G). Đáng lưu ý, ở ví trí số 327 ở 
nhóm 361 bp là 1 vị trí khuyết, còn ở nhóm 362 bp là “T”. Theo một số tác giả, 
đặc điểm khác biệt nu trên đoạn giao gen ITS2 cũng như sự khác biết ở ví trí 327 
trên đoạn gen này có tính quyết định phân biệt F. gigantica và F. hepatica. Đặc 
điểm này cũng đã được một số tác giả sử dụng để xác định các cá thể lai ngoại 
loài hay lai chéo ngược trong quần thể SLGL. 
Trình tự ITS2 của SLGL ở Việt Nam có 3 kiểu gen đơn bội là H0-ITS2.FgVN, 
H1-ITS2.FgVN và H6-ITS2.FgVN. Trong số 13 trình tự ITS2 được phân tích, có 
2 trình tự thuộc nhóm H6-ITS2.FgVN là 10B-HN1.9 (Hà Nội) và 15Tr-DT2 
(Đồng Tháp) có kích thước 362 bp, 11 trình tự ITS2 còn lại 361 bp (H0-
ITS2.FgVN và H1-ITS2.FgVN). Kết quả so sánh trình tự cho thấy, nhóm H0-
ITS2.FgVN và H1-ITS2.FgVN phù hợp với SLGL F. gigantica, nhóm H6-
ITS2.FgVN phù hợp với F. hepatica. Trên cây phả hệ, nhóm H0-ITS2.FgVN và 
H1-ITS2.FgVN thuộc nhánh của F. gigantica, còn nhóm H6-ITS2.FgVN thuộc 
nhánh của F. hepatica. Điều này một lần nữa cho thấy 2 cá thể SLGL là 10B-
23 
HN1.9 (Hà Nội) và 15Tr-ĐT2 (Đồng Tháp) có gen nhân ITS2 phù hợp với F. 
hepatica giống như ở ITS1. Còn lại 3 trình tự không được phân tích kiểu gen đơn 
bội do xuất hiện lỗi từ vị trí 435. Theo Wannasan A và CS (2014), đây chính là 
hiện tượng pha trộn kiểu gen giữa 2 loài F. gigantica và F. hepatica. 
Riêng chủng SLGL duy nhất phân lập từ người có cả gen nhân và gen ty thể 
phù hợp với F. gigantica. Kết quả giám định loài cá thể sán này bằng PCR-RFLP 
dựa trên các chỉ thị cox1, ITS1 phù hợp với kết quả so sánh trình tự với ngân hàng 
gen. Từ kết các quả phân tích này cho thấy cá thể SLGL phân lập từ người là F. 
gigantica thuần chủng. 
KẾT LUẬN 
1. Về hình thái và phân loại sán lá gan lớn ở Việt Nam theo hình thái học 
Sán lá gan lớn ở Việt Nam có chiều dài dao động từ 13,00 đến 46,00 mm (trung 
bình 27,47 ± 5,27 mm), chiều rộng 5,00 - 15,00 mm (trung bình 9,43 ± 1,43 mm), 
tỷ số chiều dài/chiều rộng 1,58 - 6,57 (trung bình 2,97 ± 0,68), khoảng cách từ giác 
bụng đến cuối thân 12,00 - 43,50 (trung bình 24,61 ± 5,18 mm). Có sự đa hình về 
hình thái của sán lá gan lớn ở Việt Nam. Dựa theo chiều dài cơ thể, đa số sán lá 
gan lớn thuộc 2 nhóm nhỏ (29,43 %) và nhóm trung bình (62,34 %); nhóm kích 
thước lớn chỉ chiếm 8,23 %. Các kiểu hình thái đều gặp ở các khu vực địa lý và 
các vật chủ khác nhau. 
2. Về thành phần loài và một số đặc điểm sinh học phân tử của sán lá gan lớn 
ở Việt Nam 
2.1. Về thành phần loài 
Trong số 225 cá thể SLGL ở Việt Nam trong nghiên cứu này, có 81,78 % cá thể 
là F. gigantica và 18,22 % là các cá thể dạng trung gian Fasciola sp. (không xếp 
loại là F. gigantica hay F. hepatica). Cả F. gigantica và Fasciola sp. đều xuất hiện 
tại các vùng địa lý và ở các vật chủ khác nhau (trâu, bò, dê, cừu, người). 
2.2. Về đặc điểm phân tử 
 Nghiên cứu của chúng tôi bước đầu cho thấy: 
- SLGL ở Việt Nam có tính đa hình về di truyền, bao gồm 2 loại: 
+ F. gigantica chiếm 81,78 %: những cá thể này có cả gen ty thể và gen nhân 
phù hợp với F. gigantica thuần chủng trên ngân hàng gen. 
+ Dạng trung gian Fasciola sp. (không xếp loại là F. gigantica hay F. 
hepatica) chiếm 18,22 %, các cá thể này được chia làm 2 nhóm: 
. Nhóm các cá thể có kiểu gen nhân hỗn hợp của 2 loài sán F. gigantica và F. 
hepatica; 
. Nhóm các cá thể lai với gen ty thể phù hợp với F. gigantica còn hệ gen nhân 
phù hợp với F. hepatica. 
- Đối với đoạn gen cox1: Đoạn nucleotide chứa 1 phần gen cox1 của tất cả các 
mẫu SLGL được phân tích phù hợp với F. gigantica. Trên đoạn nucleotide kích 
24 
thước 450 bp chứa 1 phần đoạn gen cox1 có 5 kiểu gen đơn bội (haplotype), với 
kiểu H8-CO1.FgVN gặp phổ biến hơn cả. 
- Đối với đoạn gen nad1: Đoạn gen nad1 của các mẫu SLGL được phân tích có 
trình tự phù hợp với F. gigantica. Trên đoạn gen được phân tích ghi nhận có 2 
kiểu gen đơn bội, với kiểu H1-CO1.FgVN gặp phổ biến hơn cả. 
- Đối với đoạn giao gen ITS1 
 Đoạn ITS1 có 3 kiểu gen: kiểu phù hợp với F. gigantica, kiểu phù hợp F. 
hepatica và kiểu hỗn hợp. Trên đoạn gen được phân tích có 5 kiểu gen đơn bội. 
Trong đó kiểu H0-ITS1.FgVN phù hợp hoàn toàn với F. gigantica thuần chủng 
gặp phổ biến hơn cả (11/16). Kiểu H5-ITS1.FgVN phù hợp với F. hepatica, gặp ở 
2/16 trình tự được phân tích. 
- Đối với đoạn giao gen ITS2 
 Đoạn ITS2 này có 3 kiểu: kiểu phù hợp với F. gigantica, kiểu phù hợp F. 
hepatica và kiểu hỗn hợp. Trên đoạn gen được phân tích có 3 kiểu gen đơn bội 
H0-ITS2.FgVN, H1-ITS2.FgVN (phù hợp với F. gigantica) và H6-ITS2.FgVN 
(phù hợp với F. hepatica). 
KIẾN NGHỊ 
 - Khi phân loại sán lá gan lớn ở Việt Nam không nên chỉ dựa vào đặc điểm 
hình thái mà cần phối hợp với khảo sát đồng thời gen nhân và gen ty thể để kết 
quả thẩm định loài sán lá gan lớn được chính xác. 
 - Tiếp tục phân tích, so sánh những biến đổi di truyền, sự khác biệt về đáp ứng 
miễn dịch ở vật chủ nhiễm các cá thể sán lá gan lớn dạng trung gian Fasciola sp 
so với nhiễm các cá thể sán lá gan lớn thuần F. gigantica. 
 - Tiếp tục thu thập thêm và phân tích đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn gây 
bệnh ở người để thấy được tính đa hình, những biến đổi di truyền của sán lá gan 
lớn gây bệnh ở người và động vật. 
DANH SÁCH CÁC BÀI BÁO KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 
ĐÃ CÔNG BỐ 
1. Đỗ Ngọc Ánh, Nguyễn Duy Bắc, Hà Huỳnh Hồng Vũ, Huỳnh Hồng Quang, 
Trần Thanh Dương, Nguyễn Khắc Lực (2016), Đặc điểm một số chỉ số hình thái 
của sán lá gan lớn thu thập ở Việt Nam, Tạp chí Y học Việt Nam, Tập 446, Tháng 
9, Số 1, tr: 5-9. 
2. Đỗ Ngọc Ánh, Lê Trần Anh, Phạm Văn Minh, Trần Thanh Dương, Nguyễn 
Khắc Lực (2016), So sánh hình thái của sán lá gan lớn trưởng thành thu thập ở 
trâu và bò tại Việt Nam, Tạp chí phòng chống Sốt rét và các bệnh Ký sinh trùng, 
Số 4 (93), tr: 78-83. 
3. Đỗ Ngọc Ánh, Bùi Văn Tuấn, Nguyễn Thu Hương, Trần Thanh Dương, Đặng Thị 
Cẩm Thạch, Nguyễn Văn Thoại, Nguyễn Đức Tân, Nguyễn Hữu Hưng, Nguyễn 
Khắc Lực (2016), Xác định loài sán lá gan lớn phân lập từ động vật tại Việt Nam 
bằng kỹ thuật PCR-RFLP dựa trên chỉ thị gen ty thể COI và gen nhân ITS2, Tạp chí 
phòng chống Sốt rét và các bệnh Ký sinh trùng, Số 5 (94), tr: 23-30.