Chuẩn hóa phương pháp xác định hàm lượng Vitamin D (D2 và D3) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Viện Dinh D−ỡng 
Trung tâm kiểm nghiệm vsATTP 
***************** 
Báo cáo kết quả nghiên cứu 
 Chuẩn hóa ph−ơng pháp xác định hàm 
l−ợng vitamin D (D2 và D3) trong thực 
phẩm bằng ph−ơng pháp sắc ký lỏng 
hiệu năng cao (HPLC) 
Chủ nhiệm đề tài : Ks. Đoàn Thị H−ờng 
6544
20/9/2007 
Hà nội, 2007 
Viện Dinh D−ỡng 
Trung tâm kiểm nghiệm vsATTP 
***************** 
Báo cáo kết quả nghiên cứu 
 Chuẩn hóa ph−ơng pháp xác định hàm 
l−ợng vitamin D (D2 và D3) trong thực 
phẩm bằng ph−ơng pháp sắc ký lỏng 
hiệu năng cao (HPLC) 
Chủ nhiệm đề tài: Ks. Đoàn Thị H−ờng 
Các cán bộ tham gia: C n. Nguyễn Thu Hằng 
Cơ quan chủ trì: Trung tâm kiểm nghiệm VSATTP 
Cơ quan chủ quản: Viện dinh d−ỡng 
Kinh phí: 20 triệu đồng (Nguồn NNS) 
Hà nôi, 2007 
Mục lục 
TT Nội dung Trang
1 Danh mục các chữ viết tắt 
2 Danh mục các bảng 
3 Danh mục các hình 
4 Phần 1: Mở đầu 1 
5 Phần 2: Tổng quan 3 
6 Phần 3: Mục tiêu, đối t−ợng và ph−ơng pháp nghiên cứu 8 
 1. Mục tiêu 8 
 2. Đối t−ợng 8 
 3. Nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu 8 
 4. Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao áp 9 
 5. Các ph−ơng pháp định l−ợng bằng HPLC 11 
 6. Quy trình phân tích thử nghiệm 13 
7 Phần 4: Kết quả nghiên cứu 17 
 1. Khảo sát điều kiện chạy sắc ký 17 
 2. Xác định LOD 28 
 3. Xác định LOQ 28 
 4. Xác định khoảng tuyến tính 29 
 5. Xác định độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên 32 
 6. Xác định độ thu hồi 35 
 7. Một số sắc đồ chạy sắc ký của mẫu phân tích 37 
8 Phần 5: Nhận xét và bàn luận kết quả 39 
9 Phần 6: Quy trình phân tích xác định hàm l−ợng vitamin D 
trong thực phẩm bằng ph−ơng pháp HPLC 
41 
10 Phần 7: Tài liệu tham khảo 45 
11 Phần phụ lục: Các sắc đồ của dung dịch chuẩn vitamin D2 
và D3 xây dựng khoảng tuyến tính 
các chữ viết tắt 
TT Các chữ viết tắt 
Nghĩa tiếng Việt 
1 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao 
2 DAD Detector mảng diôt 
3 UV-VIS Quang phổ tử ngoại - khả kiến 
4 RDA Nhu cầu ăn khuyến cáo 
5 TCVN Tiêu chuẩn Việt nam 
6 AOAC Hiệp hội phân tích hoá học 
7 LOD Giới hạn phát hiện 
8 LOQ Giới hạn định l−ợng 
9 SD Độ lệch chuẩn 
10 Cv Hệ số biến thiên 
11 MeOH Methanol 
12 THF Tetra hydrofuran 
13 ACN Acetonitril 
14 SPE Cột chiết pha rắn 
15 TBHQ Tert butyl hydroquinol 
Danh mục các bảng 
TT Nội dung bảng 
Bảng 1 Thời gian l−u của vitamin D2 và D3 đối với điều kiện chạy cột 
Waters RP- 18, detector DAD, b−ớc sóng 265nm, pha động 
MeOH: H2O = 98: 2, tốc độ dòng 1ml/phút 
Bảng 2 Thời gian l−u của vitamin D2 chạy cột Inertsil ODS 3 và cột 
Waters RP18, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN : 
MeOH =75:25, tốc độ dòng 1ml/phút. 
Bảng 3 Nhận xét các sắc đồ của hai chất chuẩn đối với cột Inertsil ODS 3 
detector DAD b−ớc sóng 265nm, Pha động ACN : H2O =75:25, 
tốc độ dòng 1ml/phút 
Bảng 4 Nhận xét kết quả chạy sắc ký hai chuẩn trên cột Inertsil ODS 3 
pha động ACN : MeOH = 50: 50, detector DAD b−ớc sóng 
265nm, tốc độ dòng 1ml/phút. 
Bảng 5 Thời gian l−u của hai chất chuẩn t−ơng ứng với pha động khác 
nhau tốc độ 1ml/ phút, cột Inertsil ODS 3, detector DAD 265nm 
Bảng 6 Thời gian l−u của hai chất ứng với tốc độ dòng khác nhau trên hệ 
pha động MeOH: THF: H2O = 93:2:5, detector DAD 265nm, 
cột Inertsil ODS 3 
Bảng 7 Tổng kết điều kiện chạy HPLC phân tích vitamin D 
Bảng 8 T−ơng quan giữa diện tích pic và nồng độ chuẩn của vitamin D2 
Bảng 9 T−ơng quan giữa diện tích và nồng độ chuẩn vitamin D3 
Bảng 10 Xác định hàm l−ợng vitamin D2 mẫu sữa bột XO 
Bảng 11 Xác định hàm l−ợng vitamin D3 trong sữa Sunny grow baby 
Bảng 12 Xác định hàm l−ợng vitamin D trong sữa chua nestlé có đ−ờng 
Bảng 13 Xác định hàm l−ợng vitamin D3 trong sữa Kappi hộp 100ml 
Bảng 14 Xác định hàm l−ợng vitamin D3 trong sữa bột giầu năng l−ợng 
Bảng 15 Xác định hàm l−ợng vitamin D trong sữa đặc có đ−ờng 
Bảng 16 Kết quả hàm l−ợng vitamin D trong một số mẫu khác 
Bảng 17 Độ thu hồi của vitamin D3 
Bảng 18 Độ thu hồi của vitamin D2 
Bảng 19 Kết quả phân tích mẫu sữa bột mẫu DDP4 vật liệu chuẩn 
Bảng 20 Tổng hợp các thông số thẩm định 
Danh mục các hình 
TT Nội dung các hình 
 Phần tổng quan 
Hình 1 Công thức hoá học, công thức cấu tạo của vitamin D2 và D3 
Hình 2 Sơ đồ chuyển hoá của vitamin D trong cơ thể 
 Phần mục tiêu, đối t−ợng và ph−ơng pháp 
Hình 3 Mô tả quá trình chạy sắc ký 
Hình 4 Sơ đồ mô tả hệ thống HPLC 
Hình 5 Đồ thị phụ thuộc diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ 
 Phần kết quả nghiên cứu 
 * Khảo sát điều kiện chạy 
Hình 6 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,04ppm, cột Waters, detector 
DAD b−ớc sóng 265nm, pha động MeOH: H2O = 98:2, tốc độ 1ml/ phút
Hình 7 Dạng phổ hấp thụ của vitamin D2 
Hình 8 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,08ppm, cột Waters, detector 
DAD b−ớc sóng 265nm, pha động MeOH: H2O = 98:2, tốc độ 1ml/ 
phút 
Hình 9 Dạng phổ hấp thụ của vitamin D3 
Hình 10 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,04ppm, cột Waters, detector 
DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ 
dòng 1ml/ phút 
Hình 11 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,04ppm, cột Inertsil ODS 3, 
detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 75: 25, 
tốc độ 1ml/ phút 
Hình 12 Sắc đồ chuẩn vitamin D3, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc 
sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ 1ml/ phút 
Hình 13 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector 
DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ 1ml/ phút
Hình 14 Sắc đồ chuẩn vitamin D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc 
sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 50: 50, tốc độ 1ml/ phút 
Hình 15 Sắc đồ chuẩn vitamin D3, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc 
sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 50: 50, tốc độ 1ml/ phút 
Hình 16 Sắc đồ hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD 
b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 50:50, tốc độ 1ml/ phút 
Hình 17 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector 
DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 90:10, tốc độ 
1ml/ phút 
Hình 18 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector 
DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 90:10 tốc độ 
dòng 1,2 ml/ phút 
Hình 19 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector 
DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 90:10 tốc độ 
dòng 1,5 ml/ phút 
Hình 20 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector 
DAD b−ớc sóng 265nm, pha động MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tốc 
độ dòng 1 ml/ phút 
Hình 21 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector 
DAD b−ớc sóng 265nm, pha động MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tốc 
độ dòng 1,2 ml/ phút 
Hình 22 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD 
b−ớc sóng 265nm, pha động MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tốc độ dòng 1,5 
ml/ phút. 
Hình 23 Sắc đồ vitamin D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 
265nm, pha động MeOH: THF: H2O = 92:3:5, tốc độ dòng 1,5 ml/ phút 
Hình 24 Sắc đồ vitamin D3, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 
265nm, pha động MeOH: THF: H2O = 92:3:5, tốc độ dòng 1,5 ml/ phút 
 * Xác định khoảng tuyến tính 
Hình 25 Đ−ờng chuẩn vitamin D2 
Hình 26 Đ−ờng chuẩn vitamin D3 
 * Sắc đồ chạy mẫu 
Hình 27 Sắc đồ xác định hàm l−ợng vitamin D trong sữa tuơi Kapi 
Hình 28 Sắc đồ chạy mẫu sữa t−ơi xác định hàm l−ợng vitamin D2 
Hình 29 Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D3 
Hình 30 Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D3 
 Phần phụ lục: 
Các sắc đồ dung dịch chuẩn xây dựng khoảng tuyến tính 
Hình 31 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,0022ppm 
Hình 32 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,02ppm 
Hình 33 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,041ppm 
Hình 34 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,082ppm 
Hình 35 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,165ppm 
Hình 36 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,33ppm 
Hình 37 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,0068ppm 
Hình 38 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,068ppm 
Hình 39 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,137ppm 
Hình 40 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,274ppm 
Hình 41 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,392ppm 
Hình 42 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,5ppm 
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 
Trang 1/46 
Phần 1: Mở đầu 
Để tồn tại, phát triển và cải thiện nòi giống, cơ thể chúng ta luôn cần 
đ−ợc cung cấp đủ các chất dinh d−ỡng, nguồn cung cấp các chất này có 
nhiều trong thực phẩm ăn vào hàng ngày. Các chất dinh d−ỡng chính là các 
nhóm cung cấp năng l−ợng cho cơ thể nh− glucid, lipid, protein, nhóm cung 
cấp muối khoáng, nhóm cung cấp các loại vitamin và n−ớc. Theo quan 
điểm của các chuyên gia dinh d−ỡng hiện nay trên thế giới mà chúng ta 
đang sống tồn tại hai thái cực khác nhau, một bên là vực thẳm của sự thiếu 
ăn và một bên là vực thẳm của sự thừa ăn. Sự thiếu ăn đã dẫn đến tình trạng 
suy dinh d−ỡng do thiếu năng l−ợng protein, tuy nhiên với sự phát triển của 
nền khoa học tiến tiến trên thế giới đời sống của ng−ời dân ở hầu hết các 
n−ớc đã đ−ợc cải thiện, không ngừng nâng cao. ở Việt nam với sự hỗ trợ 
của các ch−ơng trình phòng chống suy dinh d−ỡng, ch−ơng trình VAC và 
cuộc cách mạng xanh trong ngành nông nghiệp đã góp phần to lớn trong 
việc tăng c−ờng an ninh thực phẩm quốc gia, vấn đề đói ăn không còn là 
điều bức xúc. Hàng năm tỷ lệ suy dinh d−ỡng đã giảm đi một cách đáng 
kể..... Tuy nhiên vấn đề dinh d−ỡng mới nảy sinh đó là các bệnh mãn tính 
liên quan đến dinh d−ỡng đang là mối quan tâm của nhiều ng−ời. Khái 
niệm thực phẩm chức năng (thực phẩm chữa bệnh) đã trở nên quen thuộc 
dần với mọi ng−ời dân. Hiện nay để giải quyết vấn đề này trên thế giới cũng 
nh− trong n−ớc đã xuất hiện nhiều loại thực phẩm chữa bệnh, thực phẩm bổ 
sung vi chất dinh d−ỡng phục vụ cho bệnh nhân liên quan. Có thể coi thực 
phẩm chức năng, vai trò của thực phẩm đối với bệnh mãn tính là h−ớng tiếp 
cận rất mới trong ngành dinh d−ỡng, thức ăn là thuốc, thuốc là thức ăn [16]. 
ở Nhật bản cho đến nay đã có khoảng hơn 192 sản phẩm đ−ợc gọi là thực 
phẩm chức năng nhằm góp phần vào duy trì, cải thiện chế độ ăn và sức 
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 
Trang 2/46 
khoẻ [16]. Một trong số các vi chất rất quan trọng đã đ−ợc bổ sung vào thực 
phẩm đó là các loại vitamin. 
 Vitamin là những chất không sinh năng l−ợng nh−ng không thể thiếu 
đ−ợc đối với sự tồn tại, phát triển của mỗi cơ thể sống. Vitamin có vai trò 
tạo ra các coenzim cần thiết trong các phản ứng chuyển hoá khác nhau. Tất 
cả các quá trình sống gắn liền với sự trao đổi chất trong cơ thể đều có sự 
tham gia trực tiếp của vitamin [14]. Nguồn cung cấp vitamin chủ yếu là từ 
thức ăn. Khi thiếu vitamin cơ thể sẽ mắc phải một số bệnh lý, nh− thiếu 
vitamin A dễ dẫn tới bệnh mù loà, thiếu vitamin B1 dễ bị bệnh tê phù, thiếu 
vitamin PP bị bệnh pellagra, thiếu vitamin D bị bệnh về x−ơng [17]. Hiện 
nay một thực tế khắc nghiệt đã xảy ra ở các n−ớc đang phát triển là phải 
đ−ơng đầu với gánh nặng kép gi−ã bệnh nhiễm trùng, tử vong trẻ em và 
thiếu dinh d−ỡng với các bệnh mãn tính không lây liên quan đến dinh 
d−ỡng [16]. Thực tế đã cho thấy thiếu vi chất dinh d−ỡng đã góp phần 
không ít trong gánh nặng kép này. Vì vậy vai trò thực phẩm đ−ợc đánh giá 
vô cùng quan trọng, việc nghiên cứu ứng dụng thực phẩm chức năng đã 
đang trở thành trào l−u mang tính toàn cầu. Nói đến thực phẩm chức năng 
chúng ta không thể nói đến thực phẩm bổ sung vitamin D, một loại vitamin 
khá quan trọng để phòng chống bệnh còi x−ơng ở trẻ em, loãng x−ơng ở 
ng−ời lớn, hạ calci máu và một số bệnh ngoài da... 
Hiện nay trên thị tr−ờng có rất nhiều loại sữa, bột dinh d−ỡng, bánh 
quy... có bổ sung viatmin D. Với lý do trên, đề tài này chúng tôi hy vọng 
chuẩn hoá ph−ơng pháp xác định hàm l−ợng vitamin D bằng ph−ơng pháp 
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong một số loại thực phẩm nh− sữa 
chua, sữa bột, sữa n−ớc, bánh quy, bột dinh d−ỡng để đ−a ra quy trình phân 
tích phù hợp, nhằm đánh giá đúng chất l−ợng, giá trị dinh d−ỡng thực của 
các sản phẩm thực phẩm. 
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 
Trang 3/46 
Phần 2: Tổng quan 
1. Nguồn gốc và tính chất của vitamin D 
VitaminD là chất tinh thể hình kim không màu, không mùi, không 
tan trong n−ớc, hoà tan trong dầu mỡ, tan trong dung môi hữu cơ nh− 
ethanol, chlorofoc, methanol. Tên gọi khác của vitamin D là calciferol. 
Vitamin D là một nhóm gồm từ D2 đến D7 song có hai hoạt tính mạnh nhất 
là vitamin D2 còn gọi Ergocalciferol và vitamin D3 còn gọi Cholecalciferol. 
Cholecalciferol - C27H44O Ergocalciferol - C28H44O 
 Vitamin D3 
Vitamin D2 
Hình 1: Công thức hoá học, công thức cấu tạo của vitamin D2 và D3 
Vitamin D có chủ yếu trong thức ăn nguồn gốc động vật nh− trứng, 
cá, đặc biệt dịch chiết từ gan cá, bơ, sữa, thịt... 
Trong cơ thể ng−ời vitamin D3 (Cholecalciferol) đ−ợc tổng hợp từ 7 
dehydrocholesterol ở d−ới da nhờ ánh sáng tử ngoại. 
Vitamin D2(Ergocalciferol) đ−ợc tổng hợp từ ergosterol có trong nấm và 
men bia. 
 Nói chung, hoạt tính sinh học của hai loại vitamin D2 và vitamin D3 
không có sự khác nhau nhiều. Trong cơ thể vitamin D chuyển hoá ở gan và 
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 
Trang 4/46 
thận tạo ra chất chuyển hoá có hoạt tính là 1,25- dihydroxycholecalciferol 
nhờ enzim hydroxylase [14]. 
Hình 2: Sơ đồ chuyển hoá của vitamin D trong cơ thể ng−ời 
Trong da
Trong gan
Trong thận
Dạng hoạt động
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 
Trang 5/46 
2. Tác dụng của vitamin D 
- Vitamin D tham gia vào quá trình tạo x−ơng nhờ tác dụng chuyển hoá các 
chất vô cơ chủ yếu là calci và phosphat, làm tăng hấp thu calci và phosphat 
ở ruột, tham gia vào quá trình calci hoá sụn nên nó rất cần cho sự phát triển 
x−ơng ở trẻ em. 
- Làm điều hoà calci trong máu, ức chế tế bào sinh ung th−. 
- Khi thiếu vitamin D ruột không hấp thu đủ calci và phospho làm calci 
máu giảm gây hậu quả trẻ em chậm lớn, còi x−ơng chân vòng kiềng, chậm 
biết đi, chậm kín thóp, nguời lớn bị loãng x−ơng, xốp x−ơng, x−ơng th−a dễ 
gẫy, phụ nữ có thai thiếu vitamin D dễ sinh ra trẻ khuyết tật ở x−ơng [14]. 
- Nguyên nhân của sự thiếu vitamin D là do cơ thể hấp thu thức ăn kém, do 
ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, do rối loạn chuyển hoá, do nhu cầu cao ở 
phụ nữ có thai và cho con bú... 
-Tuy nhiên dùng vitamin D quá liều cũng gây ra chứng tăng calci máu, tăng 
calci niệu, đau nhức x−ơng khớp, tạo sỏi thận, tăng huyết áp, có thể gây suy 
nh−ợc, mệt mỏi, đau đầu, buồn nôn, tiêu chảy, giòn x−ơng... [14]. 
Theo công trình nghiên cứu khảo sát tác dụng của vitamin D đối với 
bệnh ung th− ở bang Chicago trong 19 năm các tác giả nhận thấy tỷ lệ ung 
th− kết tràng ở nam giảm 55% nếu hàng ngày đ−ợc bổ sung vitamin D là 
3,75mcg [18]. Theo nghiên cứu của Danson - Hughes và các cộng sự tiến 
hành trên đối t−ợng phụ nữ đ−ợc bổ sung vitamin D 400 IU/ ngày và nhóm 
phụ nữ khác không đ−ợc bổ sung, cả hai nhóm đều có l−ợng vitamin D ăn 
vào hàng ngày là 100 IU. Nhận thấy nhóm đối chứng bị giảm đáng kể mật 
độ khoáng trong x−ơng so với nhóm đ−ợc bổ sung [18]. Năm 1989 theo 
khuyến cáo của uỷ ban dinh d−ỡng Hoa kỳ (R ... 
m
AU
0
20
40
m
AU
0
20
40
13
.3
83
81
56
94
V
it
am
in
 D
2
PDA-265nm
Vitamin D
K ap i 37,9303g .dat
Retention Time
Area
Name
Hình 27: Sắc đồ xác định hàm l−ợng vitamin D trong sữa tuơi Kappi 
Minutes
0 5 10 15 20 25 30
m
AU
0
25
50
75
100
m
AU
0
25
50
75
100
V
ita
m
in
 D
2 
 1
2.
26
3 
 1
74
18
04
 7
46
81
13
.4
95
 7
05
04
 2
66
6
PDA-265nm
Vitamin D
Name
Retention Time
Area
Height
Hình28 : Sắc đồ chạy mẫu sữa xác định hàm l−ợng vitamin D2 
Minutes
0 5 10 15 20 25 30
m
AU
0
25
50
75
100
m
AU
0
25
50
75
100
12
.3
23
 3
62
56
 2
03
8
12
.5
03
 4
2 
 5
V
ita
m
in
 D
3 
 1
3.
36
2 
 1
07
80
34
 4
83
79
PD A-265n m
Vitam in D -
Nam e
R etention T im e
Area
Height
Hình 29 : Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D3 
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 
Trang 38/46 
Minutes
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0
m
AU
0
25
50
75
100
m
AU
0
25
50
75
100
0.
07
3 
 6
09
 1
71
11
.6
30
 1
04
48
0 
 5
66
3
12
.5
20
 2
00
77
 1
23
7
V
ita
m
in
 D
3 
 1
3.
37
2 
 5
83
39
7 
 2
27
66
PDA-265nm
Vitamin D
Name
Retention Time
Area
Height
Hình 30 : Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D3 
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 
Trang 39/46 
Phần 5: Nhận xét và bàn luận kết quả 
 Bảng 20: Tổng hợp các thông số thẩm định 
TT Các thông số Kết quả 
vitamin D2 
Kết quả 
vitamin D3 
1 Xác định giới hạn phát 
hiện (LOD) 
2,2 ppb 3,4ppb 
2 Xác định giới hạn định 
l−ợng (LOQ) 
7 ppb 11ppb 
3 Xác định khoảng tuyến 
tính 
0,0022-0,55 ppm 0,0034 - 0,5ppm 
4 Hệ số biến thiên (Cv %) 
trong sữa 
5,4 - 6,4 6,1- 7,3 
5 Xác định độ thu hồi (R 
%) 
75 - 81 75 - 90 
 Qua các thí nghiệm nghiên cứu trên chúng tôi có nhận xét nh− sau: 
1. Ph−ơng pháp phân tích hàm l−ợng vitamin D có giới hạn phát hiện của 
D2 là 2,2ppb và D3 là 3,4ppb, giới hạn định l−ợng vitamin D2 =7ppb và 
vitamin D3 là 11ppb. Kết quả này đáp ứng yêu cầu phân tích hàm l−ợng 
vitamin D trong thực phẩm. 
2. Qua khảo sát khoảng tuyến tính của viatmin D2 và D3 cho ta Ph−ơng 
trình hồi quy tuyến tính mà hệ số t−ơng quan r > 0,99 điều này chứng tỏ 
khoảng nồng độ đã khảo sát có giá trị diện tích pic phụ thuộc chặt chẽ với 
nồng độ. 
3. Hệ số biến thiên khảo sát đ−ợc nh− bảng kết quả trên cho thấy phù hợp 
với kỹ thuật phân tích ở mức phát hiện thấp ppb. 
4. Hệ số thu hồi đạt 75 - 90% ở các mức nồng độ từ 0,01-0,03 ppm điều này 
cũng phù hợp với thực tế là hàm l−ợng vitamin D là thấp. 
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 
Trang 40/46 
5. Nh− vậy ph−ơng pháp xác định vitamin D có độ nhạy khá tốt, độ chính 
xác (độ lặp lại và độ thu hồi) đạt yêu cầu có thể áp dụng đ−ợc phù hợp với 
điều kiện của phòng thí nghiệm. 
6. Tuy nhiên chúng tôi nhận thấy việc làm sạch dịch chiết tr−ớc khi chạy 
sắc ký là ch−a thực sự thoả mãn, còn nhiều tạp thể hiện ở sắc đồ. Song vì 
điều kiện kinh phí hạn chế chúng tôi ch−a thể tiến hành nghiên cứu khắc 
phục điều này trong đề tài. 
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 
Trang 41/46 
Phần 6 
Quy trình phân tích xác định hàm l−ợng vitamin D2 và D3 
trong thực phẩm bằng ph−ơng pháp HPLC 
1. Nguyên lý của ph−ơng pháp 
Mẫu đ−ợc xà phòng hoá bởi dung dịch kali hydroxid trong môi 
tr−ờng ethanol ở nhiệt độ phòng qua đêm hoặc ở nhiệt độ 75oC trong 1 giờ. 
Sau đó các chất không xà phòng hoá (trong đó có vitamin D2 và D3) đ−ợc 
chiết bằng ete dầu hoả. Vitamin D2 và D3 đ−ợc xác định bằng cách làm sạch 
dịch chiết rồi bơm vào cột sắc ký và phát hiện bằng detector DAD ở b−ớc 
sóng 265nm. 
2. Phạm vi áp dụng 
Quy trình này áp dụng cho các loại thực phẩm nh− sữa bột, sữa chua, bột 
dinh d−ỡng, bánh quy, n−ớc quả.... 
3. Chuẩn bị dung môi và hoá chất. 
- Dung môi methanol của Merck loại dùng cho HPLC. 
- Dung môi tetra hydrofuran THF của Merck. 
- Dung môi ethanol loại PA. 
- Dung môi ete dầu hoả loại PA (30-60). 
- Dung dịch muối natri clorid 5% loại PA. 
- Chuẩn cholecalciferol của Merck. 
- Chuẩn ergocalciferol của Merck. 
- Dung môi ethanol tuyệt đối của Merck. 
- Chất chống ô xi hoá Tert butyl hydroquinon (TBHQ) loại PA 
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 
Trang 42/46 
4. Thiết bị và dụng cụ 
- Hệ thống HPLC với detector DAD 
- Cột Inertsil ODS -3, 5àm, 250 x 4,0 mm 
- Cân phân tích XT 220 của Thuỵ sĩ độ chính xác 10- 5g 
- Máy quang phổ UV-VIS của Nhật 
- Máy cất quay chân không loại Eyela của Nhật. 
- Bộ phận hút chân không cho cột làm sạch SPE. 
- Máy siêu âm ultrasonic LC 30 của Nhật. 
- Bình định mức 100, 50, 25 ml 
- Pipet bầu 5, 2, 1 ml 
- Cốc có mỏ 500, 250, 100 ml 
- ống đong 100, 25 ml 
- Bình cầu cất quay chân không. 
5. Các b−ớc thực hiện 
5.1 Pha dung dịch chuẩn 
- Dung dịch chuẩn gốc vitamin D2 100 ppm: Cân trên cân phân tích 0,0100g 
vitamin D2 cho vào bình định mức 100ml và pha loãng đến vạch bằng dung 
môi ethanol của Merck. 
- Dung dịch chuẩn trung gian vitamin D2 1ppm: Lấy 1ml dung dịch chuẩn 
gốc vào bình định mức 100ml pha loãng bằng ethanol đến vạch. 
- Dung dịch chuẩn gốc vitamin D3 100 ppm: Cân trên cân phân tích 0,0100g 
vitamin D2 cho vào bình định mức 100ml và pha loãng đến vạch bằng dung 
môi ethanol của Merck. 
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 
Trang 43/46 
- Dung dịch chuẩn trung gian vitamin D3 1ppm: Lấy 1ml dung dịch chuẩn 
gốc vào bình định mức 100 ml pha loãng bằng ethanol đến vạch. 
- Xác định lại nồng độ các dung dịch chuẩn trung gian trên. 
Sử dụng máy quang phổ UV-VIS đo độ hấp thụ (Abs) của mỗi dung dịch 
chuẩn trung gian vitamin D2, D3 ở b−ớc sóng 265 nm. Tính nồng độ thực 
của dung dịch chuẩn (C) với hệ số ε = 18466 với vitamin D3 và ε = 18843 
với vitamin D2 
- Sau khi xác định nồng độ chính xác pha loãng các dung dịch chuẩn trung 
gian ở trên thành các dung dịch chuẩn làm việc với nồng độ khác nhau để 
xây dựng đ−ờng chuẩn 
5. 2 Chuẩn bị mẫu phân tích 
- Mẫu đ−ợc đồng nhất kỹ tr−ớc khi xử lý: Đối với mẫu rắn phải xay hoặc 
nghiền kỹ và trộn đều. Mẫu dạng bột, lỏng, sệt phải đ−ợc trộn khuấy kỹ. 
- Cân khoảng 0,5- 50 g mẫu độ chính xác 0,1g cho vào lọ nhựa (Tuỳ thuộc 
vào đối t−ợng mẫu). 
- Mẫu đ−ợc xà phòng hoá bằng cách cho thêm 40 ml ethanol, 25 ml KOH 
80 % , khoảng 0,1 g BHT khuấy trộn đều để ở 75 0C trong 1 giờ hoặc ở 
nhiệt độ phòng qua đêm. 
- Chiết các chất không xà phòng hoá bằng ete dầu hoả, hai lần mỗi lần 25 
ml. Tập hợp lớp ete vào phễu chiết khác 
- Rửa sạch lớp ete bằng dung dịch NaCl 5 % đến khi dung dịch trung tính. 
- Lớp ete cho vào bình cất quay và ch−ng cất đến còn khoảng 5ml. 
- Làm sạch qua cột SPE - Si loại 6ml: 
Các b−ớc làm sạch: 
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 
Trang 44/46 
+ Cột đ−ợc ổn định bằng 4 ml dung môi ethyl acetat: n-hexan =7:73. 
+ Sau đó nạp dung dịch chiết mẫu ở trên vào cột. 
+ Rửa giải bằng 20 ml dung dịch ethyl acetat : n-hexan = 7:73 . 
+ Dung dịch rửa giải đ−ợc cất quay đến cạn. 
+ Hoà cặn còn lại bằng 1ml pha động lấy dung dịch bơm vào cột HPLC 
5. 3 Điều kiện chạy sắc ký. 
- Cột tách chiết pha ng−ợc Inertsil ODS 3 
- Pha động (MeOH : THF : H2O) = ( 92:3: 5) 
- Detector DAD ở b−ớc sóng 265nm 
- Tốc độ dòng 1,5 ml/ phút 
- Nhiệt độ phòng 
6. Tính kết quả 
- Bơm các chuẩn làm việc vào cột HPLC xác định diện tích hay chiều cao 
pic của mỗi chất chuẩn, xây dựng đ−ờng chuẩn t−ơng quan giữa diện tích 
hoặc chiều cao pic với nồng độ dãy chuẩn. 
- Căn cứ vào đ−ờng chuẩn để tính hàm l−ợng vitamin D trong mẫu theo 
công thức sau. 
X (àg/g) = V x Cm/ m 
Trong đó: 
V: Thể tích dịch chiết cuối cùng để chạy sắc ký HPLC (ml) 
Cm: Nồng độ dung dịch chiết mẫu tính theo đ−ờng chuẩn (àg/ml). 
m: Khối l−ợng của mẫu phân tích (g) 
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 
Trang 45/46 
Phần 7: Tài liệu tham khảo 
1. G.Brubacher, w. Muller-Mulot and D.A.T. Southgate (1985) Methods 
for the determination of vitamins in food, Elsevier applied science 
publishers, London and New york. 
2. Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Nh− Thuận (1978) Kiểm Nghiệm L−ơng Thực 
Thực Phẩm, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật-Hà Nội. 
3. Ceirwyn s.James(1995) Analytical chemistry of foods, Blackie 
academic and professional, printed in Great Britain by the Alden 
press, Oxford 
4. Ronald S. Kirk and Ronald sawyer (1991) Pearson, s composition 
and analysis of foods, Longman scientific and technical. 
5. Official methods of analysis of AOAC international, Sixteenth 
edition, 3rd revision, (1997). 
6. Jette Jakobsen, Ina Clausen, Torben Leth, Lars Ovesen (23/10/2003) 
Journal of food composition and analysis 17 (2004) 777-787 
7. Jette jakobsen, Ina Clausen, Torben Leth, lars Ovesen (17/3/2003) 
Journal of food composition and analysis 16 (2003) 575-585 
8. Lan Ph−ơng (2001) bản dịch T150-161 Bách khoa th− về vitamin, 
muối khoáng và các yếu tố vi l−ợng, nhà xuất bản y học. 
9. Food chemistry vol 57 No1.pp.95-99, 1996, new analytical aspects of 
vitamin D in food 
10. LeoM.L.Nollet năm [1992], Food analysis by HPLC, p276-329. 
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 
Trang 46/46 
11. M.M. Delgado Zamarreno, A.Sanchez Peres, M. Sanchez Rodriguez 
(1996) determination of fat- solution vitamin in yogurt by HPLC with 
electrochemical detection, Talanta 43(1996), 1555-1563. 
12. Pirjo h.Mattila, Vieno I. Piironen. (1996) New analytical aspects of 
vitamin D in food. Food chemistry, pp 95-99 , Elesvier Science Ltd. 
13. H.Qian, M.Sheng (1998), Simultaneous determination of fat- soluble 
vitamin A, D, E and pro-vitamin D2 in animal feeds by one-step 
extraction and high per formance liquid chromatography analysis, 
Journal of chromatograyphy A825 (1998) 127-133 
14. Nguyễn Văn Thục, Trần Đức Hậu (2004), hoá d−ợc tập 2, Đại học 
D−ợc Hà nội, bộ môn d−ợc lý 
15. Mai Tất Tố (2004), D−ợc lý học tập 2. Đại học D−ợc Hà nội 
16. Hà Huy Khôi (2006), Những đ−ờng biên mới của dinh d−ỡng, nhà 
xuất bản y học Hà nội 
17. Tr−ờng đại học Y Hà nội (2004), Dinh d−ỡng và vệ sinh an toàn 
thực phẩm, nhà xuất bản y học Hà nội. 
18. Bùi Minh Đức, Phan Thị Kim (2002), Dinh d−ỡng bảo vệ bà mẹ thai 
nhi và phòng bệnh mãn tĩnh, nhà xuất bản y học Hà nội 
19. Department of Food and Nutrition,the University of Georgia, 
Athens, USA, Journal of Chromatography A, 825(1998) 127-133 
 Hà nội, ngày tháng 7 năm 2007 
Viện tr−ởng VDD Giám đốc TTKNVSATTP Chủ nhiệm đề tài 
Báo cáo đề tài nghiên cứu- Hà nội 2007 
Trang 1/4 
Phụ lục 
Các sắc đồ của dung dịch chuẩn vitamin D2 và D3 xây 
dựng khoảng tuyến tính 
Minutes
0 10 20 30
m
AU
0
20
40
m
AU
0
20
40
39
4 
 1
1.
55
3
24
73
 1
1.
76
0
Vi
ta
m
in
 D
2 
 5
34
34
 1
2.
57
8
55
7 
 1
3.
01
0
30
11
 1
3.
15
7
20
7 
 1
3.
60
0
21
1 
 1
3.
75
5
81
2 
 1
4.
15
0
60
1 
 1
4.
67
7
41
3 
 1
4.
81
7
13
6 
 1
4.
96
8
97
 1
5.
06
8
10
3 
 1
5.
15
5
Hình 31: Sắc đồ của chuẩn vitamin D2 với nồng độ 0,002ppm 
M inutes
0 10 20 30
m
AU
0
20
40
m
AU
0
20
40
27
71
 1
1.
75
7
Vi
ta
m
in
 D
2 
 2
85
31
7 
 1
2.
55
0
23
3 
 1
3.
11
5
12
1 
 1
3.
22
3
39
 1
3.
33
8
40
09
 1
3.
68
0
48
4 
 1
4.
05
0
43
9 
 1
4.
20
8
Hình 32: Sắc đồ của chuẩn vitamin D2 với nồng độ 0,02ppm 
Minutes
0 10 20 30
m
AU
0
20
40
m
AU
0
20
40
13
7 
 1
1.
09
7
83
93
 1
1.
64
7
Vi
ta
m
in
 D
2 
 5
61
89
8 
 1
2.
45
2
55
80
 1
3.
49
5
Hình 33: Sắc đồ của chuẩn vitamin D2 với nồng độ 0,041ppm 
Báo cáo đề tài nghiên cứu- Hà nội 2007 
Trang 2/4 
Minutes
0 10 20 30
m
AU
0
50
100
m
AU
0
50
100
56
67
 1
1.
69
5
Vi
ta
m
in
 D
2 
 1
13
71
68
 1
2.
53
2
11
48
8 
 1
3.
62
2
Hình 34: Sắc đồ của chuẩn vitamin D2 với nồng độ 0,082ppm 
Minutes
0 10 20 30
m
AU
0
50
100
m
AU
0
50
100
14
26
7 
 1
1.
62
8
Vi
ta
m
in
 D
2 
 2
21
74
93
 1
2.
45
2
21
99
6 
 1
3.
54
3
23
75
 1
4.
16
3
38
06
 1
4.
73
5
Hình 35: Sắc đồ của chuẩn vitamin D2 với nồng độ 0,165ppm 
Minutes
0 10 20 30
m
AU
0
100
200
m
AU
0
100
200
11
.6
43
 3
11
32
Vi
ta
m
in
 D
2 
 1
2.
44
0 
 4
35
39
66
13
.5
30
 7
29
98
14
.1
47
 3
69
63
14
.7
40
 7
58
08
Hình 36: Sắc đồ của chuẩn vitamin D2 với nồng độ 0,33ppm 
Báo cáo đề tài nghiên cứu- Hà nội 2007 
Trang 3/4 
M inutes
0 10 20 30
m
AU
-10
0
10
20
30
m
AU
-10
0
10
20
30
11
.7
90
 5
94
2
12
.4
27
 5
42
Vi
ta
m
in
 D
3 
 1
3.
11
7 
 3
30
81
14
.1
53
 7
92
7
14
.5
70
 1
15
6
14
.7
10
 1
23
1
14
.9
90
 3
10
15
.1
50
 7
06
15
.3
38
 1
83
15
.6
20
 3
20
15
.8
03
 3
40
16
.2
22
 2
20
0
16
.5
00
 6
43
16
.7
37
 1
98
2
16
.8
45
 3
36
16
.9
18
 3
97
17
.0
12
 3
16
17
.9
90
 2
68
19
.4
57
 1
70
19
.6
42
 3
63
20
.0
70
 4
1
20
.2
67
 2
65
20
.4
07
 8
8
20
.5
50
 3
49
20
.7
02
 6
09
20
.8
17
 5
28
20
.9
53
 3
90
Hình 37: Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,0068ppm 
M in u te s
0 1 0 2 0 3 0
m
AU
-1 0
0
1 0
2 0
3 0
m
AU
-1 0
0
1 0
2 0
3 0
11
.8
78
 1
95
10
Vi
ta
m
in
 D
3 
 1
3.
13
3 
 2
15
32
0
14
.1
10
 4
48
0
15
.6
68
 2
83
6
15
.9
08
 1
44
Hình 38: Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,068ppm 
M inutes
0 10 20 30
m
AU
-10
0
10
20
30
m
AU
-10
0
10
20
30
11
.5
17
 1
53
9
11
.6
43
 4
02
11
.7
30
 5
07
(V
ita
m
in
 D
3)
13
.4
07
 4
20
80
1
14
.4
13
 9
21
5
Hình 39: Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,137ppm 
Báo cáo đề tài nghiên cứu- Hà nội 2007 
Trang 4/4 
Minutes
0 10 20 30
m
AU
0
20
40
m
AU
0
20
40
Vi
ta
m
in
 D
3 
 1
3.
03
0 
 8
33
16
3
14
.0
10
 2
28
40
14
.3
42
 1
21
2
14
.5
80
 1
03
00
15
.5
83
 2
04
10
Hình 40: Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,274ppm 
Minutes
0 5 10 15 20 25 30
m
AU
0
25
50
m
AU
0
25
50
11
.3
00
 2
05
4
Vi
ta
m
in
 D
3 
 1
2.
99
8 
 1
18
39
37
13
.9
90
 4
86
84
14
.5
03
 2
75
31
15
.5
25
 3
82
75
16
.1
98
 2
24
16
.5
35
 1
49
16
.8
57
 1
85
17
.0
88
 6
4
17
.1
63
 5
6
Hình 41: Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,392ppm 
Minutes
0 10 20 30
m
AU
0
50
100
m
AU
0
50
100
11
.2
80
 2
56
4
11
.3
67
 3
15
7
11
.6
22
 1
14
0
11
.6
98
 7
01
11
.8
02
 7
53
11
.8
47
 7
00
Vi
ta
m
in
 D
3 
 1
3.
00
8 
 1
37
60
56
13
.9
90
 5
00
96
14
.5
20
 2
40
88
15
.5
32
 4
55
60
16
.1
18
 4
45
17
.7
32
 1
79
1
18
.1
28
 9
5
18
.7
23
 2
36
18
.9
47
 2
00
6
19
.3
10
 1
31
20
.0
23
 2
72
5
20
.1
85
 5
54
20
.2
97
 2
72
20
.3
77
 2
07
20
.5
58
 1
33
7
20
.7
83
 3
42
Hình 42: Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,5ppm