Luận án Đặc điểm dịch tễ, lâm sàng, yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do clostridium difficile ở người lớn tại bệnh viện bạch mai, 2013 – 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG 
-----------------*------------------- 
NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG 
ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ, LÂM SÀNG, 
YẾU TỐ NGUY CƠ MẮC TIÊU CHẢY 
DO CLOSTRIDIUM DIFFICILE Ở NGƯỜI LỚN 
TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI, 2013 – 2017 
LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC 
HÀ NỘI – 2020 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG 
-----------------*------------------- 
NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG 
ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ, LÂM SÀNG, 
YẾU TỐ NGUY CƠ MẮC TIÊU CHẢY 
DO CLOSTRIDIUM DIFFICILE Ở NGƯỜI LỚN 
TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI, 2013 – 2017 
Chuyên ngành: Dịch tễ học 
Mã số: 62.72.01.17 
LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC 
Người hướng dẫn khoa học: 
 1. PGS. TS. Trần Như Dương 
 2. TS. Phạm Thị Thanh Thủy 
HÀ NỘI – 2020 
LỜI CẢM ƠN 
Để hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu 
sắc tới: 
PGS.TS. Trần Như Dương, Phó Viện trưởng Viện Vệ sinh Dịch tễ 
Trung ương, người thầy đã hết lòng dìu dắt, tận tình chỉ bảo cho tôi các kiến 
thức và kỹ năng trong thực hành nghiên cứu của người làm khoa học, động 
viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và 
thực hiện đề tài, trực tiếp hướng dẫn giúp tôi hoàn thành luận án này. 
TS. Phạm Thị Thanh Thủy, nguyên Phó Trưởng khoa Truyền nhiễm – 
bệnh viện Bạch Mai, người thầy luôn luôn động viên, hướng dẫn, khích lệ tôi 
tích cực nghiên cứu ngay từ những bước đi đầu tiên, giúp tôi tiếp cận những 
kiến thức mới, tận tình hướng dẫn giúp tôi hoàn thành luận án này. 
TS. Vũ Thị Thu Hường, nguyên Trưởng phòng Vi khuẩn Kỵ khí, khoa 
Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, chủ nhiệm của đề tài: “Nghiên 
cứu vai trò gây bệnh và đặc điểm dịch tễ học phân tử của các vi khuẩn kỵ khí 
và hiếu khí gây hội chứng tiêu chảy liên quan đến kháng sinh ở một số bệnh 
viện ở Hà nội” do Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia tài trợ, mã 
số đề tài: 106.03-2012.65; và một số đề tài trong chương trình hợp tác của 
Nhật Bản với Viện VSDTTW, người đã cho phép tôi tham gia đề tài, sử dụng 
một phần số liệu trong đề tài vào luận án, tận tình chỉ bảo, chia sẻ kiến thức 
khoa học, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện luận án. 
Tôi xin trân trọng cám ơn: 
- Đảng Ủy, Ban Giám đốc và các khoa phòng của Viện Vệ sinh Dịch tễ 
Trung ương đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi học tập và hoàn thành luận án. 
- Đảng Ủy, Ban Giám đốc bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi 
cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. 
- Phòng Đào tạo sau đại học – Khoa Đào tạo và Quản lý Khoa học - Viện 
Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã luôn nhắc nhở, động viên khuyến khích, giúp 
đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên 
cứu và hoàn thành luận án. 
- Ban lãnh đạo Trung tâm Bệnh nhiệt đới – bệnh viện Bạch Mai đã ủng 
hộ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và 
nghiên cứu. 
- Các thầy cô trong bộ môn Dịch tễ học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 
đã nhiệt tình dạy bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. 
- Các cán bộ nhân viên phòng Vi khuẩn Kỵ khí, khoa Vi khuẩn, Viện 
VSDTTW đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài 
- Tập thể cán bộ nhân viên Trung tâm Bệnh nhiệt đới, khoa Hồi sức tích 
cực, bệnh viện Bạch Mai đã nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ tôi trong suốt quá trình 
thực hiện đề tài. 
Tôi xin gửi lời cám ơn tới chồng, các con và gia đình - những người 
thân yêu đã luôn động viên, chia sẻ, khích lệ tôi vượt qua khó khăn trong quá 
trình học tập và nghiên cứu. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2020 
Nghiên cứu sinh 
Nguyễn Thị Hương Giang 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện 
dưới sự hướng dẫn của tập thể hướng dẫn. 
Các số liệu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai khác công bố. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2020 
Nghiên cứu sinh 
Nguyễn Thị Hương Giang 
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 
CA - 
CDI 
community associated 
C.difficile infection 
Tiêu chảy do C.difficile xuất hiện 
từ cộng đồng 
CCFA Cefoxitin-Cycloserine 
Fructose Agar 
Môi trường thạch kỵ khí chọn lọc 
CCFA 
CCMA cefoxitin-cycloserine 
mannitol agar 
Môi trường thạch kỵ khí chọn lọc 
CCMA 
CDC Centers for Disease Control 
and Prevention 
 Trung tâm kiểm soát và phòng 
ngừa dịch bệnh 
CDT Clostridium difficile 
transferase 
 Viết tắt độc tố kép của 
Clostridium difficile 
CI confidence interval khoảng tin cậy 
C.difficile Clostridium difficile 
CLSI 
Clinical and Laboratory 
Standards Institude 
 Tiêu chuẩn Lâm sàng và Phòng 
thí nghiệm, để xác định ngưỡng 
nhạy cảm của các kháng sinh 
CO - 
HCFA 
Community onset, healthcare 
facility associated C.difficile 
infection 
 Tiêu chảy do C.difficile có liên 
quan đến cơ sở y tế, xuất hiện 
trong cộng đồng 
CT scan Computed tomography scan Chụp cắt lớp vi tính 
DNA Deoxyribonucleic Axit 
EIAs Enzyme immunoassays Thử nghiệm miễn dịch gắn men 
EUCAST European Committee on 
Antimicrobial Susceptibility 
Testing 
Xét nghiệm độ nhạy cảm với 
kháng sinh của châu Âu 
FDA Food and Drug 
Administration 
 Cơ quan quản lý Thực phẩm và 
Dược phẩm 
G/L Giga/ litter =109 / lít 
HIV Human Immuno-deficiency 
Virus 
Virut gây suy giảm miễn dịch ở 
người 
HO - 
HCFA 
Hospital onset healthcare 
facility associated C.difficile 
infection 
 Tiêu chảy do C.difficile xuất hiện 
tại cơ sở y tế 
IDSA 
The infectious diseases 
society of America 
Hội các bệnh truyền nhiễm Hoa 
Kỳ 
IgG Immunoglobulin G kháng thể loại G 
MIC 
Minimal Inhibitory 
Concentration 
 Nồng độ ức chế tối thiểu 
NAP1 
North America pulsed field 
gel electrophoresis type 1 
 Tên 1 chủng Clostridium difficile 
được phát hiện ở Bắc Mỹ, typ 1 
khi dùng kỹ thuật điện di xung 
trường 
kD kilo Dalton 
OR Odd ratio tỉ suất chênh 
PCR Polymerase Chain Reaction phản ứng chuỗi polymerase 
REA Endonuclease Restriction 
Analysis 
Phân tích đoạn nhờ enzym giới 
hạn 
RNA Ribonucleic acid 
RR Relative Risk Nguy cơ tương đối 
SHEA The society for healthcare 
epidemiology of America 
Hội dịch tễ học các vấn đề về y tế 
Hoa Kỳ 
splaAST splA Sequence Typing Phương pháp phân loại giải trình 
tự gen splA 
tcdA Gen mã hóa tạo độc tố A của 
Clostridium difficile 
tcdB Gen mã hóa tạo độc tố B của 
Clostridium difficile 
tcdC Gen điều hòa âm quá trình sản 
xuất độc tố của Clostridium 
difficile 
tcdD Gen điều hòa dương quá trình sản 
xuất độc tố của Clostridium 
difficile 
tcdE 
 Gen mã hóa sản xuất một protein 
trên vùng gen gây bệnh PaLoc 
của Clostridium difficile 
tpi triose phosphate isomerase Gen đặc hiệu loài của Clostridium 
T/L Tera/ litter = 1012 / lít 
VSDTTW Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 
WHO World health organization Tổ chức Y tế Thế giới 
MỤC LỤC 
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................... 3 
1.1. Một số điểm đại cương về tiêu chảy do Clostridium difficile ................. 3 
1.1.1. Vi khuẩn Clostridium difficile............................................................ 3 
1.1.2. Tiêu chảy do Clostridium difficile ..................................................... 9 
1.2. Đặc điểm dịch tễ, lâm sàng của tiêu chảy do C.difficile ........................ 10 
1.2.1. Dịch tễ bệnh tiêu chảy do Clostridium difficile ............................... 10 
1.2.2. Lâm sàng bệnh do Clostridium difficile ........................................... 15 
1.3. Yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C.difficile .......................................... 23 
1.3.1. Yếu tố vật chủ .................................................................................. 23 
1.3.2. Yếu tố bên ngoài .............................................................................. 25 
1.4. Đặc điểm phân bố kiểu gen của Clostridium difficile............................ 29 
1.4.1. Cấu trúc phân tử của Clostridium difficile ....................................... 29 
1.4.2. Sự phân bố một số kiểu gen của C.difficile ...................................... 33 
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................ 38 
2.1. Đối tượng nghiên cứu: ........................................................................... 38 
2.2. Địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 39 
2.3. Thời gian nghiên cứu ............................................................................. 39 
2.4. Thiết kế nghiên cứu................................................................................ 39 
2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu và chọn mẫu........................................................... 40 
2.6. Thu thập đối tượng nghiên cứu .............................................................. 41 
2.7. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................... 43 
2.8. Vật liệu nghiên cứu: ............................................................................... 44 
2.9. Thu thập mẫu bệnh phẩm, kỹ thuật xét nghiệm ..................................... 44 
2.10. Các biến số và chỉ số trong nghiên cứu ............................................... 50 
2.11. Xử lý và phân tích số liệu: ................................................................... 55 
2.12. Khống chế sai số .................................................................................. 57 
2.13. Đạo đức nghiên cứu ............................................................................. 57 
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... 59 
3.1. Một số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng của tiêu chảy do C.difficile ở 
người lớn tại bệnh viện Bạch Mai, 2013 – 2017 ................................... 59 
3.1.1. Đặc điểm dịch tễ tiêu chảy do C.difficile ......................................... 59 
3.1.2. Đặc điểm lâm sàng tiêu chảy do C.difficile ..................................... 65 
3.2. Một số yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C.difficile ở người lớn tại 
bệnh viện Bạch Mai, 2013 - 2017 ......................................................... 74 
3.2.1. Các yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C.difficile qua phân tích đơn biến .. 75 
3.2.2. Yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C.difficile ở người lớn trong phân 
tích đa biến ...................................................................................... 84 
3.3. Một số đặc điểm phân bố kiểu gen của C.difficile gây tiêu chảy ở 
người lớn tại bệnh viện Bạch Mai, 2013 - 2017 ................................... 85 
3.3.1. Các gen sinh độc tố của C.difficile ................................................... 85 
3.3.2. Đặc điểm về kiểu gen ribotype của C.difficile ................................. 90 
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 97 
4.1. Đặc điểm dịch tễ, lâm sàng của tiêu chảy do C.difficile ở người lớn 
tại Bệnh viện Bạch Mai, 2013 – 2017 ................................................... 97 
4.1.1. Đặc điểm dịch tễ tiêu chảy do C.difficile ......................................... 97 
4.1.2. Đặc điểm lâm sàng tiêu chảy do C.difficile ................................... 102 
4.2. Một số yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C.difficile ở người lớn tại 
bệnh viện Bạch Mai, 2013 - 2017 ....................................................... 111 
4.3. Một số đặc điểm phân bố kiểu gen của C.difficile gây tiêu chảy ở 
người lớn tại bệnh viện Bạch Mai, 2013 - 2017. ................................ 124 
4.3.1. Đặc điểm về loại gen sinh độc tố của C.difficile ........................... 124 
4.3.2. Đặc điểm về kiểu gen ribotype của C.difficile ............................... 128 
MỘT SỐ HẠN CHẾ CỦA NGHIÊN CỨU .............................................. 134 
KẾT LUẬN .................................................................................................. 135 
KHUYẾN NGHỊ .......................................................................................... 137 
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ 
CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
PHỤ LỤC 
DANH MỤC BẢNG 
Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi trong phản ứng PCR đa mồi phát hiện gen 
sinh độc tố ................................................................................... 47 
Bảng 2.2: Trình tự cặp mồi trong phản ứng PCR ribotype ............................. 49 
Bảng 3.1. Triệu chứng lâm sàng bệnh nhân mắc tiêu chảy do C.difficile ...... 65 
Bảng 3.2. Đặc điểm của tiêu chảy do C.difficile trong nghiên cứu ................ 66 
Bảng 3.3. Xét nghiệm phản ứng viêm ở bệnh nhân tiêu chảy do C.difficile .. 67 
Bảng 3.4. Các xét nghiệm máu khác ............................................................... 67 
Bảng 3.5. Kết quả soi đại tràng của bệnh nhân tiêu chảy do C.difficile ......... 68 
Bảng 3.6. Điểm mức độ nặng của C.difficile theo diễn biến bệnh. ................ 69 
Bảng 3.7. Điểm mức độ nặng của C.difficile theo khoa ................................. 69 
Bảng 3.8. Can thiệp điều trị bệnh nhân tiêu chảy do C.difficile ..................... 70 
Bảng 3.9. Đề kháng kháng sinh của các chủng C.difficile .............................. 71 
Bảng 3.10. Diễn biến điều trị bệnh nhân tiêu chảy do C.difficile ................... 73 
Bảng 3.11. Phân bố diễn biến điều trị theo nhóm tuổi .................................... 74 
Bảng 3.12. Tuổi bệnh nhân và tiêu chảy do C.difficile ................................... 75 
Bảng 3.13. Mắc bệnh mạn tính và tiêu chảy do C.difficile ............................. 75 
Bảng 3.14. Loại bệnh mạn tính/ trạng thái sức khỏe và tiêu chảy do C.difficile ... 76 
Bảng 3.15. Nơi sống của bệnh nhân tiêu chảy ................................................ 77 
Bảng 3.16. Tiền sử nằm viện trong vòng 8 tuần trước tiêu chảy .................... 77 
Bảng 3.17. Tiền sử dùng kháng sinh trong 8 tuần trước tiêu chảy ................. 78 
Bảng 3.18. Nhóm kháng sinh sử dụng trong 8 tuần trước tiêu chảy .............. 79 
Bảng 3.19. Một số tiền sử can thiệp khác ....................................................... 80 
Bảng 3.20. Các triệu chứng lâm sàng ............................................................. 80 
Bảng 3.21. Số lần tiêu chảy trong ngày .......................................................... 81 
Bảng 3.22. Số ngày tiêu chảy .......................................................................... 82 
Bảng 3.23. Một số triệu chứng cận lâm sàng .................................................. 82 
Bảng 3.24. Tổng hợp các yếu tố liên quan có ý nghĩa trong phân tích đơn biến .. 83 
Bảng 3.25. Các yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C.difficile trong phân tích đa 
biến .............................................................................................. 84 
Bảng 3.26: Tỉ lệ các gen sinh độc tố của C.difficile ở bệnh nhân nghiên cứu ... ... . 
- Trách nhiệm: 
Những nhân viên của phòng thí nghiệm sử dụng thường quy này được đào 
tạo chuẩn thức trước khi làm. 
Ghi lại chính xác kết quả vào sổ nhật ký thí nghiệm. 
- Định nghĩa và các từ viết tắt: 
Mẫu: Mẫu bệnh phẩm ban đầu thu thập từ bệnh viện, phòng khám để làm xét 
nghiệm. 
Kỵ khí (Điều kiện kỵ khí hoặc môi trường kỵ khí): Khí trường hoàn toàn 
không chứa oxy (hỗn hợp khí gồm 80% N2, 10% CO2 và 10% H2). Sử dụng 
bình ủ kỵ khí hoặc túi ủ kỵ, túi tạo kỵ khí để tạo điều kiện kỵ khí. Chỉ thị màu 
kỵ khí được cho vào bình hoặc túi ủ khị khí để kiểm soát chất lượng hỗn hợp 
khí nuôi cấy. 
 Các từ viết tắt: 
CCMA (cefoxitin-cycloserine mannitol agar): Môi trường thạch CCMA 
GAM: Môi trường kỵ khí Gifu modiffied. 
BHI (Brain heart infusion): Canh thang não tim 
EYA (Eeg yolk agar): Thạch lòng đỏ trứng 
Vit K1: Vitamin K1 
Thioglycolate HK: Canh thang Thioglycolate có bổ xung Hemin và Vitamin K 
Thioglycolate thường: Canh thang Thioglycolate không bổ xung Hemin và 
Vitamin K 
- An toàn 
Thao tác với căn nguyên vi khuẩn đường ruột theo thường qui hướng dẫn an 
toàn phải làm việc trong phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2 
- Kiểm soát chất lượng 
Luôn sử dụng chủng chuẩn Clostridium difficile ATCC 700057 để kiểm soát 
chất lượng mỗi lô môi trường chọn lọc CCMA. Chất lượng môi trường được 
ghi vào sổ theo dõi kiểm soát chất lượng môi trường. Lô môi trường nào 
không đạt chất lượng, cần phải loại bỏ, không dùng cho xét nghiệm và được 
tìm hiểu nguyên nhân không đạt chất lượng để lưu ý cho lần pha chế sau. 
Luôn sử dụng chỉ thị kỵ khí cho mỗi hộp nuôi cấy kỵ khí 
- Nguyên vật liệu và trang thiết bị 
Nguyên vật liệu: Mẫu bệnh phẩm phân. 
Trang thiết bị: Máy trộn voltex. Kính hiển vi. Xylene (Biomerieux). Tủ kỵ 
khí BugBox Plus, Hãng Baker Ruskinn – Anh. Tủ an toàn sinh học cấp 2 code 
AC24E1, hãng ESCO – Singapore. Tủ ấm CO2 NU-5100E, NUAIRE – Mỹ. 
Máy ủ nhiệt Biosan PCH-100, BIOSAN, Hàn Quốc. Nồi hấp tiệt trùng HV-
50, Hirayama, Nhật Bản. 
 Vật tư tiêu hao: Tube Eppendorf. Đầu côn có fill lọc. Găng dùng 1 lần. Chỉ 
thị kỵ khí. Bộ nhuộm Gram. Túi ủ kỵ Gaspak – Mishumishi – Nhật Bản. Que 
trải bệnh phẩm inox – Việt Nam. Đầu tip – Corning, Mỹ 
Sinh phẩm: Canh thang BHI 0,05% cysteine. Cồn tuyệt đối. Môi trường 
Thioglycollate thường. Thạch kỵ khí chọn lọc và không chọn lọc (Thạch 
CCMA - PTN tự pha chế, Thạch GAM – hãng Nissui – Nhật Bản). Dung dịch 
skim milk 20%. 
- Các bước tiến hành 
Mẫu được vận chuyển đến phòng thí nghiệm sẽ được xét nghiệm ngay 
trong vòng 2 giờ sau khi thu thập. Nếu không làm xét nghiệm ngay, có thể 
bảo quản mẫu ở -800C. 
Phương pháp shock cồn: thuận lợi của phương pháp này để chọn lọc vi 
khuẩn C.difficile vì chỉ vi khuẩn sinh nha bào có thể sống sót, do đó loại bỏ 
được sự sinh trưởng của những vi sinh vật không sinh nha bào trong phân 
Cách làm: Pha loãng 1 phần thể tích phân với 1 phần thể tích canh thang BHI 
0.05% cystein. Sau đó trộn đều với 2 phần thể tích cồn tuyệt đối (hoặc cồn 
95%). Trộn đều bằng máy trộn voltex, để ở nhiệt độ phòng 1 giờ, cứ 10 phút 
voltex mẫu để làm đều mẫu. 
Nuôi cấy 
Môi trường dùng cho nuôi cấy: Môi trường chọn lọc CCMA, hoặc Môi 
trường không chọn lọc 
Kỹ thuật nuôi cấy 
- Lấy 100 µl hỗn dịch mẫu đã shock cồn, dùng que trải bênh phẩm trải đều 
bệnh phẩm trên đĩa thạch để tách khuẩn lạc rời trên môi trường chọn lọc 
CCMA đã khử oxy. 
 - Ủ đĩa môi trường đã cấy ở 370C/48h trong điều kiện môi trường kỵ khí, sử 
dụng bình ủ kỵ khí hoặc túi ủ kỵ khí. Chỉ thị kỵ khí được cho vào bình hoặc 
túi ủ khị khí để kiểm soát chất lượng hỗn hợp khí nuôi cấy. 
- Đĩa cấy có thể được kiểm tra sau khi ủ qua đêm nhưng không được bỏ ra 
khỏi môi trường kỵ khí bởi vì sự hình thành bào tử bị ức chế trên môi trường 
chọn lọc và những khuẩn lạc non dễ bị chết khi phơi nhiễm với không khí. 
- Đọc kết quả chỉ thị khí trước khi đọc kết quả bệnh phẩm. Điều kiện kỵ khí 
được đảm bảo mới tiếp tục đọc kết quả bệnh phẩm. 
- Đếm số khuẩn lạc nghi ngờ là CDF sau đó cấy chuyển. Khi cấy chuyển, 
chọn tối đa trên mỗi đĩa 5 khuẩn lạc nghi ngờ, cấy chuyển sang môi trường 
không chọn lọc để kiểm tra. 
Định danh 
Dựa vào hình thái khuẩn lạc: Khuẩn lạc C.difficile có thể thay đổi tuy thuộc 
loại môi trường nuôi cấy từ dạng nhẵn đến ghồ ghề, từ màu vàng nhạt đến 
trắng, từ tròn đến dẹt, có rễ giả hoặc bờ không đều. 
Khuẩn lạc điển hình của C.difficile trên môi trường CCMA là khuẩn lạc tròn 
với bờ không đều, dẹt, có kích thước khoảng 4mm, màu vàng. 
Có thể nhận biết khuẩn lạc C.difficile bằng các đặc tính sau: 
+ Mùi: Mùi riêng biệt giống mùi phân ngựa (dễ nhận ra mùi này từ đĩa cấy 
chủng thuần) 
+ Màu huỳnh quang dưới ánh sáng UV: Để mở đĩa khuẩn lạc để mở dưới ánh 
sáng tím bước sóng dài (365nm) trong phòng tối và nhìn bằng sự phản xạ thấy 
khuẩn lạc C.difficile bắt màu huỳnh quang. Sự bắt màu huỳnh quang của 
khuẩn lạc C.difficile khác nhau tùy thuộc mật độ huỳnh quang do vi khuẩn tiết 
ra nhưng thường có màu xanh vàng hoặc màu lục nhạt. Ánh sáng huỳnh 
quang yếu trên một số thạch cơ bản và mạnh nhất trên thạch CCMA hoặc 
thạch chứa máu. Khi làm thử nghiệm huỳnh quang trên khuẩn lạc phải có 
 chủng chứng để xác định rõ kết quả. Sự bắt màu huỳnh quang đối với khuẩn 
lạc già hơn 48h trên thạch không chọn lọc sẽ bị giảm đi do sự hình thành nha 
bào tăng lên. Đánh dấu tất cả khuẩn lạc nghi ngờ ở mặt dưới đĩa thạch bằng 
bút dạ. Cấy chuyển sang môi trường thạch GAM không chọn lọc và ủ ở điều 
kiện kỵ khí trong 48h để làm các test định danh khác. 
Dựa vào hình thể vi khuẩn trên kính hiển vi 
Nhuộn Gram khuẩn lạc nghi ngờ, xem HDKT-VKKK .. Hình ảnh nhuộm 
gram C.difficile là trực khuẩn gram dương, 2 bờ song song, rộng 0.5 µm, dài 
3-5 µm với nha bào hình oval ở gần đầu tận cùng. Nha bào vi khuẩn thường 
không nhìn thấy trực tiếp từ thạch chọn lọc nhưng rất điển hình khi cấy 
chuyển trên thạch không chọn lọc. 
2. Quy trình xét nghiệm PCR đa mồi phát hiện gen sinh độc tố của 
C.difficile 
- Tách chiết DNA: 
Mẫu phân được tiến hành xử lý cho tách chiết DNA sử dụng bộ sinh phẩm 
tách chiết QIAamp DNA tool mini kit của công ty Qiagen theo hướng dẫn của 
nhà sản xuất. 
- Kỹ thuật PCR: 
Kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện gen mã hoá cho độc tố A (tcdA) và 
độc tố B (tcdB) và thụ thể gắn độc tố CDT bằng các cặp mồi đặc hiệu. Các 
độc tố này là yếu tố độc lực vi khuẩn nhằm xác định vai trò gây bệnh của 
C.difficile. 
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR 
Thực hiện phản ứng PCR trên máy luân nhiệt 
Điện di và chụp ảnh sản phẩm PCR 
Phân tích kết quả 
Chứng dương phải rõ ràng 
 Có vạch trên gel và đúng kích thước khi so sánh với thang ADN chuẩn. 
Vạch có hình ảnh rõ nét 
Mỗi lần chạy PCR đều có các chứng dương A+B+, A-B+ và chứng âm là 
nước cất siêu sạch dùng cho PCR. 
Định danh xác định: Dựa vào đặc tính sinh hóa của chủng cùng với đặc điểm 
khuẩn lạc và hình thể vi khuẩn nhuộm gram hoặc giải trình tự gen 16S-rRNA. 
Bảng 1: Đặc tính sinh hóa của một số loài Clostridium 
Loài Thạch lòng đỏ trứng Genlatinase Tiêu 
hóa 
sữa 
Indole Sinh axit 
Lecithinase Lipase G M L S 
C.perfringens + - + - - + + + 
C.sordellii + - + + + + + - 
C.botulinumI - + + + - + + - 
C.botulinum II - + + - - + + - 
C.botulinum III - + + V - + V - 
C.septicum - - + - - + + + 
C.histolyticum - - + + - - - - 
C.tetani - - + - + - - - 
C.dificile - - + - - + - - 
3. Quy trình xác định genotype Clostridium difficile bằng phương pháp 
PCR ribotyping 
- Tách DNA từ khuẩn lạc C. difficile sinh độc tố bằng kit: 
Mẫu phân được tiến hành xử lý cho tách chiết DNA sử dụng bộ sinh phẩm 
tách chiết QIAamp DNA tool mini kit của công ty Qiagen theo hướng dẫn của 
nhà sản xuất. 
- Kiểm tra loại độc tố của chủng vừa tách DNA: 
 Bằng phương pháp PCR đa mồi cho vi khuẩn C.difficile (sử dụng 3 cặp mồi 
của 2 gen sinh độc tố TcdtA, TcdtB và gen đặc hiệu loài tpi) xác định gen 
đặc hiệu loài và gen sinh độc tố của vi khuẩn Clostridum difficile 
Chỉ có DNA của chủng vi khuẩn sinh độc tố A+B+ hoặc A-B + mới được 
dùng để phân loại typ ribotype 
- Chạy PCR khuếch đại vùng gen 16S và 23 S của C. difficile 
Chuẩn bị PCR reagent mix : Mỗi lần chạy PCR ribotype chạy với mấy 
chủng chuẩn, những chủng nào ? 
Nguyên liệu 1X (µl) 10X (µl) Nồng độ cuối 
Buffer 5X 4 40 1X 
MgCl2 25mM 2 20 2,5mM 
PCR nucleotide mix 10mM 0,4 4 0,2µM 
Primer 16S 10µM 1 10 0,4µM 
Primer 23S 10µM 1 10 0,4µM 
Tag polymerase 5U/µl 0,4 4 
Nước cất tinh sạch dùng cho 
PCR 
9,2 920 
Tổng phụ 18µl 18µl 
DNA template 2µl 2µl 
- Chạy PCR với chu trình nhiệt 
Chaỵ PCR với chu trình nhiệt như sau 
Bước Nhiệt độ Thời gian 
 94ᵒC 3 phút 
Biến tính 95ᵒC 20 giây 
35 chu kỳ 
 55ᵒC 2 phút 
Kéo dài 72ᵒC 10 phút 
 - Điện di và chụp ảnh sản phẩm PCR 
Chuẩn bị: Kích thước bản thạch, Thể tích và nồng độ gel, khối lượng gel cân 
cho một lần đổ? Các lưu ý khi đổ thạch (Low melting agarose) 
- Nhỏ mẫu chứng chứng ở những vị trí nào trong bản thạch ? Điện di : ? 
µl Sản phẩm PCR được trộn với ? µl Loading Dye và chạy trên thạch Low 
melting agarose 2,5%, hiệu điện thế 125V trong 5-6 giờ. Marker được nhỏ 
vào 2 giếng đầu mút của bản gel. 
- Bản thạch được ngâm với Ethyldium Bromide nồng độ 10µl/ml trong 
15 phút, rửa và lắc nhẹ trong nước cất 20 phút trước khi chụp chụp ảnh. 
- Phân tích và phiên giải kết quả 
Dựa vào hình ảnh chụp được dùng các phần mềm phân tích hoặc bằng mắt 
thường để so sánh các băng DNA giữa các chủng vi khuẩn và với chủng 
chuẩn từ đó xác định ribotype của từng chủng vi khuẩn. 
- Xử lý mẫu, dụng cụ, chất thải 
Các tuýp chứa DNA và đầu côn hút DNA sau khi sử dụng, cho vào túi 
đựng rác thải y tế và vận chuyển về Khoa An toàn sinh học và quản lý chất 
lượng để xử lý. 
Dung dịch nhuộm có chứa EtBr cũng như các vật dụng tiếp xúc với EtBr 
cần để riêng biệt và xử lý. 
4. Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC: 
- Mục đích: Nhằm xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của chủng 
C.difficile phân lập được. 
- Phạm vi áp dụng: Thường qui này dùng cho phòng thí nghiệm Vi 
khuẩn kỵ khí – Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 
 Kỹ thuật kháng sinh pha loãng trên thạch được thực hiện theo thường qui của 
CLSI 2010 sử dụng chủng quốc tế chuẩn C.difficile ATCC cho kiểm soát 
chất lượng. 
- Các từ viết tắt 
MIC : Minimum inhibitor Concentration 
PTN: Phòng thí nghiệm 
C.difficile: Vi khuẩn Clostridum difficile 
Brucella HK : Môi trường Brucella có thành phần Hemin và Vitamin K 
GAM HT : môi trường GAM có bổ xung 5% máu ngựa, hoặc máu cừu. 
Control trước : Đĩa môi trường kiểm soát chất lượng trước thí nghiệm 
Control sau : Đĩa kiểm soát chất lượng sau thí nghiệm 
Control trước và control sau là những đĩa môi trường dùng để nuôi cấy vi 
khuẩn trước khi bắt đầu và sau khi kết thúc quá trình nuôi cấy vi khuẩn trên 
các đĩa có kháng sinh. Đĩa này có thành phần và thể tích tương đương với các 
đĩa làm MIC chỉ khác là không có kháng sinh. 
- An toàn 
Quy trình được thực hiên ở phòng thí nghiệm an toàn cấp 2. Các bước của 
quy trình thực hiện trong tủ an toàn sinh học cấp 2 
- Tiêu chuẩn kỹ thuật 
Kết quả MIC chỉ được xác nhận khi: 
Giới hạn MIC của các chủng vi khuẩn chứng dương phải nằm trong khoảng 
cho phép theo tiêu chuẩn của CLSI 
Chủng vi khuẩn phải thuần, không bị nhiễm với vi khuẩn khác. 
Đĩa vi khuẩn kiểm soát chất lượng trước và sau thí nghiệm có nồng độ vi 
khuẩn tương đương nhau. 
Mỗi chân trong bộ chấm có thể tích 10µl canh khuẩn, tương đương 105 vi 
khuẩn/chủng. 
 Các chủng trên đĩa control có nồng độ tương đương 105 vi khuẩn. Chủng 
nào có nồng độ quá thấp sẽ không được ghi nhận kết quả và cần phải làm lại 
thí nghiệm. 
- Nguyên vật liệu và trang thiết bị 
Môi trường thịt chín (CMM) tham khảo quy trình HDKT  
Thạch GAM HT (Thạch GAM bổ xung 5% máu cừu hoặc máu ngựa và 5% 
SodiumTaurocholate) 
Canh thang GAM 
Thạch GAM H (Thạch GAM bổ xung 5% máu cừu hoặc máu ngựa ) 
Thạch Brucella HK 5% laked blood: Thạch Brucella bổ xung 5% máu cừu tan 
đông 
Đệm TES. Dung dịch NaCl 0.9%. 
Bột kháng sinh chuẩn 
Bộ cấy vi khuẩn 32 chân + Khay inox 32 giếng. 
Tủ an toàn sinh học cấp 2 
Que cấy, Tăm bông, Que tre sấy vô trùng 
Hộp ủ kỵ khí và tủi tạo kỵ khí, chỉ thị kỵ khí 
- Chọn chủng làm MIC 
Nếu chủng lưu giữ trong môi trường CMM ở nhiệt độ phòng. Dùng que tre vô 
trùng phá vỡ các hạt thịt. Sau đó cấy 20µl canh thang CMM lên ½ đĩa thạch 
GAM HT. Ủ kỵ khí 370C/48 giờ 
Nếu chủng lưu giữ -800C, dùng que cấy lấy môi trường giữ chủng cấy lên ½ 
đĩa thạch GAM HT. Ủ kỵ khí 370C/48 giờ 
- Thuần chủng và tăng sinh 
Kiểm tra các đĩa nuôi cấy ngày 1 xem vi khuẩn có thuần không? Có khuẩn lạc 
rời không? Sau đó chọn 1 khuẩn lạc rời và cấy chuyển lạc lên ¼ đĩa GAM. Ủ 
kỵ khí 370C/48 giờ 
 - Định danh xác định lại chủng vi khuẩn và độc tố 
Kiểm tra tính thuần của vi khuẩn trên các đĩa nuôi cấy ngày 2 (đĩa ¼ GAM), 
sau đó cấy chuyển vài khuẩn lạc lên 1 ống canh thang GAM 2 – 3ml. Ủ kỵ 
khí 370C/48 giờ. 
Đồng thời tách DNA bằng phương pháp nhiệt. Sau đó, định danh xác định lại 
vi khuẩn và độc tố bằng phương pháp PCR đa mồi cho vi khuẩn C.difficile 
với 2 gen sinh độc tố TcdtA, TcdtB và gen đặc hiệu loại tpi (tham khảo qui 
trình PCR đa mồi trong .). Chỉ có các chủng C.difficile sinh độc tố loại 
A+B+ hoặc A-B+ mới được chọn làm MIC. 
- Pha nồng độ kháng sinh gốc 
- Pha nồng độ kháng sinh trung gian: 
Sử dụng phiếu “Pha loãng kháng sinh” khi pha kháng sinh nồng độ trung 
gian và nồng độ cuối để kiểm soát số bậc kháng sinh, nồng độ trung gian, 
nồng độ cuối. 
- Pha kháng sinh nồng độ cuối (Chuyển kháng sinh ra đĩa và đổ thạch) 
Ghi tên kháng sinh và nồng độ viết tắt lên nắp đĩa petri theo thứ tự từ bậc 1 
đến bậc cuối cùng. 
- Xác định MIC bằng phương pháp trên thạch 
- Đọc kết quả và phân tích kết quả 
Đọc kết quả MIC sau 44– 48 giờ nuôi cấy kỵ khí ở 370C. 
Kết quả ghi vào “Phiếu đọc kết quả MIC” 
Kết quả MIC được đọc từ nồng độ thấp đến nồng độ cao. 
Ở nồng độ nào vi khuẩn còn mọc nồng độ tương đương 105 vi khuẩn thì đọc 
là dương, ghi dấu (+). 
Ở nồng độ nào, lượng vi khuẩn giảm rõ rệt so với control, đọc kết quả cộng 
trừ, ghi dấu (+/-). 
Ở nồng độ nào không còn vi khuẩn mọc đọc là âm, ghi dấu (-) 
Phân tích kết quả. 
 Phụ lục 4: 
Trang thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 
Trang thiết bị Hãng sản xuất 
Tủ an toàn sinh học cấp II Esco 
Tủ sạch Clean Beach Esco 
Tủ ấm Sanyo 
Máy khuếch đại gen ABI, Eppendorf 
Bể và nguồn điện di Enduro TM 
Máy soi chụp gel Eppendorf 
Hệ thống phân tích di truyền 3500 ABI, Eppendorf 
Máy đo mật độ AND Eppendorf 
Máy ly tâm Eppendorf 
Nồi hấp ướt tiệt trùng Hyrayama 
Kính hiển vi quang học Olympus 
Tủ lạnh 40C Panasonic 
Tủ lạnh -200C Sanyo 
Tủ lạnh -800C Hitachi 
Dụng cụ và vật tư tiêu hao: hộp đựng mẫu phân, tube Eppendorf, đầu côn 
có fill lọc, găng dùng 1 lần, giấy chỉ thị kỵ khí của hãng BD, túi ủ kỵ khí 
Gaspak EZ của hãng BD, que trải bệnh phẩm inox, pipet, bộ nhuộm Gram và 
các dụng cụ cần thiết khác