Luận án Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen rnai để tạo dòng Lan dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (cymbidium mosaic virus)

i 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
NGUYỄN XUÂN DŨNG 
ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi 
ĐỂ TẠO D NG N Dendrobium CÓ KHẢ N NG HÁNG 
VI U HẢ VÀNG Cymbidium mosaic virus) 
LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP 
TP. HỒ CHÍ MINH- 2017 
ii 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
NGUYỄN XUÂN DŨNG 
ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi 
 ĐỂ TẠO D NG N Dendrobium CÓ KHẢ N NG HÁNG 
VI U HẢ VÀNG Cymbidium mosaic virus) 
Chuyên ngành: D 
Mã số: 62.62.01.11 
LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP 
Người hướng dẫn khoa học: 
1. TS. Dươ Hoa Xô 
2. PGS. TS. C H H 
TP. HỒ CHÍ MINH- 2017 
i 
LỜI C ĐO N 
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Kết quả nghiên cứu hoàn 
toàn trung thực, khách quan. Các số liệu được trình bày trong công trình này một 
phần đã được công bố trên các Tạp chí Khoa học-công nghệ cùng các đồng tác giả, 
phần còn lại chưa được công bố bởi bất kỳ ai trong bất kỳ công trình nào. 
TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017 
Tác giả luận án 
 Nguyễn Xuân Dũng 
ii 
LỜI CẢ ƠN 
Để hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu của mình, tôi đã nhận được 
nhiều sự giúp đỡ từ gia đình, thầy cô, đồng nghiệp, bạn bè và sự ủng hộ, tạo điều 
kiện của các cơ quan và tổ chức. 
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Dương Hoa Xô - Giám 
đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh, là người hướng dẫn chính 
cho công trình nghiên cứu này. Thầy đã truyền đạt ý tưởng, định hướng nghiên cứu, 
cũng như kiến thức và kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và 
thực hiện luận án. Ngoài ra, với tư cách là thủ trưởng đơn vị, thầy đã chấp thuận và 
tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được tham gia chương trình đào tạo nghiên cứu 
sinh. 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS. TS. Chu Hoàng Hà - Viện trưởng Viện 
Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người 
hướng dẫn thứ hai cho công trình nghiên cứu này. Thầy đã hướng dẫn, truyền đạt 
kiến thức, tạo điều kiện hỗ trợ về mặt kỹ thuật cũng như đã đóng góp nhiều ý kiến 
quý báu trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án. 
Tôi xin trân trọng gởi lời cảm ơn đến: 
- Ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh đã chấp 
thuận, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập. 
- Ban lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Khoa học Kỹ 
thuật Nông nghiệp Miền Nam đã hết sức giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi 
trong quá trình học tập. 
- Ban lãnh đạo Sở Khoa học và Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ một 
phần kinh phí cho tôi để thực hiện công trình nghiên cứu này. 
- PGS.TS. Phạm Văn Toản và tất cả cán bộ thuộc Ban Đào tạo sau đại học - 
Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và Phòng Quản lý Khoa học và Hợp tác 
Quốc tế- Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, đã tận tình giúp đỡ, 
động viên tôi trong quá trình học tập. 
iii 
 - GS. TS. Bùi Chí Bửu và tất cả quý thầy cô (đã giảng dạy và tham gia Hội 
đồng đánh giá đề cương, chuyên đề nghiên cứu của nghiên cứu sinh) đã truyền đạt 
kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học 
tập và nghiên cứu. 
Những lời cảm ơn chân thành của tôi cũng xin được gởi đến: 
- Các cán bộ, sinh viên đã và đang làm việc trong nhóm nghiên cứu chuyển 
gen thực vật thuộc Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật, Trung tâm Công nghệ 
Sinh học TP. Hồ Chí Minh, đã nhiệt tình tham gia, giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt 
quá trình làm việc và thực hiện luận án. 
- Các cán bộ nghiên cứu thuộc phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện 
Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình 
giúp đỡ và hỗ trợ về mặt kỹ thuật trong quá trình thực hiện luận án. 
- Quý thầy cô giáo đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi qua các giai 
đoạn học tập, các anh chị em đồng nghiệp và bạn bè thân hữu đã cùng cộng tác và 
hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu. 
Cuối cùng, xin gởi lời tri ân sâu sắc và những tình cảm ấm áp nhất đến Ba, 
Mạ (người mẹ đã khuất) và tất cả những người thân yêu trong gia đình đã hết lòng 
động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình trưởng 
thành, học tập và nghiên cứu. 
TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017 
Tác giả luận án 
 Nguyễn Xuân Dũng 
iv 
MỤC LỤC 
 Trang 
LỜI C ĐO N ...................................................................................................... i 
LỜI CẢ ƠN ........................................................................................................... ii 
MỤC LỤC ................................................................................................................ iv 
DANH SÁCH BẢNG .............................................................................................. xi 
DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................. xiii 
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 
1. Tính cấp thiết ............................................................................................................... 1 
2. Mục tiêu và yêu cầu .................................................................................................... 3 
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .............................................................................. 3 
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................................... 3 
5. Đóng góp mới của luận án .......................................................................................... 4 
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 5 
1.1. Sơ lược về hoa lan .................................................................................................... 5 
1.1.1. Giới thiệu về họ hoa lan .................................................................................... 5 
1.1.2. Giống lan Dendrobium ...................................................................................... 5 
1.1.3. Sơ lược về PLBs (Protocorm like bodies) ........................................................ 6 
1.2. Sơ lược về Cymbidium mosaic virus ....................................................................... 7 
1.2.1. Phân loại, hình dạng phân tử và cấu trúc bộ gen .............................................. 7 
1.2.2. Sự lây nhiễm và di chuyển của virus CyMV trong cây .................................... 9 
1.2.3. Triệu chứng bệnh do virus CyMV gây ra ......................................................... 9 
1.2.4. Tình hình bệnh do virus CyMV gây ra trên các giống lan ở Việt Nam .......... 10 
1.3. Phương pháp chọn giống hoa lan........................................................................... 11 
1.3.1. Chọn giống bằng phương pháp cổ điển .......................................................... 11 
1.3.2. Chọn giống bằng phương pháp chuyển gen .................................................... 11 
1.3.3. Phương pháp chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens .......... 11 
1.3.3.1. Sơ lược về phương pháp .............................................................................. 11 
1.3.3.2. Các dạng Agrobacterium tumefaciens dùng cho chuyển gen ...................... 13 
v 
1.3.3.3. Cơ chế chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens ................ 13 
1.3.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự chuyển gen qua trung gian vi khuẩn 
Agrobacterium tumefaciens ở hoa lan .......................................................... 14 
1.4. Sự can thiệp RNA (RNAi) và vai trò của nó trong chọn giống cây trồng ........... 19 
1.4.1. Lịch sử phát hiện RNAi .................................................................................. 20 
1.4.2. Cơ chế của RNAi ............................................................................................ 23 
1.4.3. Sự khởi đầu và khuếch đại tín hiệu RNAi ...................................................... 25 
1.4.4. Sự di chuyển của các tín hiệu RNAi ............................................................... 27 
1.4.5. Mối liên hệ giữa virus gây bệnh cây trồng và RNAi ...................................... 29 
1.4.6. Vai trò của RNAi trong chọn giống cây trồng kháng virus ............................ 30 
CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 36 
2.1. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 36 
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 36 
2.1.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 39 
2.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................ 40 
2.2.1. Xây dựng quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia .......................... 40 
2.2.1.1. Xác định các điều kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen .... 40 
2.2.1.2. Xác định nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS), thời gian đồng nuôi 
cấy và chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs ................ 41 
2.2.1.3. Xác định điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn và sàng lọc PLBs chuyển gen .... 42 
2.2.2. Phân lập và xác định trình tự gen CP của virus CyMV .................................. 43 
2.2.2.1. Thu thập mẫu lan nhiễm virus ...................................................................... 43 
2.2.2.2. Phân lập gen CP ........................................................................................... 44 
2.2.2.3. Nhân dòng gen CP ....................................................................................... 44 
2.2.2.4. Giải trình tự gen CP và phân tích sự tương đồng của các trình tự ............... 46 
2.2.3. Thiết kế vector chuyển gen RNAi và biến nạp vào A. tumefaciens ................ 46 
2.2.3.1. Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP hoặc ORF2-4+CP .......... 46 
2.2.3.2. Thiết kế vector chuyển gen RNAi mang đoạn gen CP và ORF2-4+CP bằng 
hệ thống Gateway ......................................................................................... 47 
vi 
2.2.3.3. Tạo chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi 
pK7GWIWG2(II)/CP hoặc pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP ........................ 48 
2.2.4. Tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen CP và ORF2-4+CP ....... 48 
2.2.4.1. Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn ......................................................................... 48 
2.2.4.2. Chuyển cấu trúc RNAi của đoạn gen CP hoặc ORF2-4+CP vào PLBs qua 
trung gian vi khuẩn A. tumefaciens ............................................................... 49 
2.2.4.3. Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển ................................................... 49 
2.2.4.4. Kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển trong PLBs giả định chuyển gen .... 50 
2.2.4.5. Thu nhận cây lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển và kiểm tra sự hiện 
diện của gen mục tiêu trong cây ................................................................... 50 
2.2.5. Đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan chuyển gen bằng lây 
nhiễm virus nhân tạo trong điều kiện in vitro .............................................. 51 
2.2.5.1. Lây nhiễm virus CyMV vào cây lan chuyển gen trong điều kiện in vitro ... 51 
2.2.5.2. Đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan chuyển gen ................. 52 
2.2.6. Phân tích và xử lý số liệu ................................................................................ 52 
2.2.7. Điều kiện nuôi cấy .......................................................................................... 53 
2.2.8. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................... 53 
CHƯƠNG 3. ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 54 
3.1. Xây dựng quy trình chuyển gen vào PLBs ............................................................ 54 
3.1.1. Các điều kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen ...................... 54 
3.1.1.1. Nồng độ chất khử trùng thích hợp để tạo mẫu cấy in vitro.......................... 54 
3.1.1.2. Môi trường thích hợp để tạo PLBs từ mô cấy in vitro ................................. 55 
3.1.1.3. Môi trường thích hợp cho sự tăng sinh và phát triển PLBs ......................... 57 
3.1.2. Nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi khuẩn thích 
hợp cho việc chuyển gen vào PLBs ............................................................. 58 
3.1.2.1. Trường hợp chủng C58 ................................................................................ 58 
3.1.2.2. Trường hợp chủng EHA105......................................................................... 59 
3.1.2.3. Trường hợp chủng LBA4404 ....................................................................... 60 
3.1.2.4. Về mức độ biểu hiện gen GUS .................................................................... 61 
vii 
3.1.3. Các điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn và sàng lọc PLBs chuyển gen........ 62 
3.1.3.1. Nồng độ cefotaxime thích hợp để loại vi khuẩn từ PLBs ............................ 62 
3.1.3.2. Nồng độ hygromycin và kanamycin thích hợp để sàng lọc PLBs chuyển gen ... 63 
3.2. Phân lập và xác định trình tự gen CP của virus CyMV ........................................ 66 
3.2.1. Phân lập gen CP .............................................................................................. 66 
3.2.2. Tạo dòng gen CP ............................................................................................. 67 
3.2.3. Giải trình tự gen CP và phân tích sự tương đồng của các trình tự .................. 69 
3.3. Thiết kế vector chuyển gen RNAi mang đoạn gen CP và CP + ORF2-4 ............ 71 
3.3.1. Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP hoặc ORF2-4+CP ..................... 72 
3.3.1.1. Khuếch đại gen CP từ vector nhân dòng và gen ORF2-4+CP từ vector 
pBSK/ORF2-4+CP ....................................................................................... 72 
3.3.1.2. Gắn đoạn gen CP và ORF2-4+CP vào vector pENTR ................................ 72 
3.3.1.3. Thiết kế vector chuyển gen RNAi bằng kỹ thuật Gatewway ....................... 76 
3.3.1.4. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi .......... 78 
3.4. Tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen CP và ORF2-4+CP ........... 79 
3.4.1. Chuyển cấu trúc RNAi của đoạn gen CP hoặc ORF2-4+CP vào PLBs qua 
trung gian vi khuẩn A. tumefaciens .............................................................. 79 
3.4.1.1. Giai đoạn đồng nuôi cấy .............................................................................. 79 
3.4 ... racterization of a 
Korean isolate of Cymbidium mosaic virus”, Molecular Cells, 30, pp. 
181-188. 
46. Koh K. W., Lu H., and Chan M. (2014), “Virus resistance in orchids”, Plan 
Science, 228, pp. 26-38. 
47. Lakatos L., Szittya G., Silhavy D. and Burgyan J. (2004), “Molecular 
mechanism of RNA silencing suppression mediated by p19 protein of 
tombusviruses”, EMBO Journal, 23, pp. 876-884. 
48. Lee Y. I., Hsu S. T. and Yeung E. C. (2013), “Orchid protocorm like bodies are 
somatic embryos”, American Journal of Botany, 100 (11), pp. 2121-2131. 
49. Makeyev, E. V. and Bamford, D. H. (2002), “Cellular RNA-dependent RNA 
polymerase involved in posttranscriptional gene silencing has two 
distinct activity modes”, Molecular. Cell, 10, pp.1417-1427. 
50. Mallory A. C., Reinhart B. J., Bartel D., Vance V. B. and Bowman, L. H. 
(2002), “A viral suppressor of RNA silencing differentially regulates the 
accumulation of short interfering RNAs and microRNAs in tobacco”, 
Procedure National Academy Science USA, 99, pp. 15228-15233. 
51. Mallory, A. C., Eli L., Smith T. H., Marathe R., Anandalakshmi R., Fagard M., 
Vaucheret H., Pruss G., Bowman L. and Vance V. B. (2001), “HC-Pro 
suppression of transgene silencing eliminates the small RNAs but not 
transgene methylation or the mobile signal”, Plant Cell, 13, pp. 571-583. 
52. Marais F. (2000), Virus diseases, Orchid Society of Northern Transvaal, 
53. Mehrotra S. and Goyal V. (2012), “Agrobacterium-mediated gene transfer in 
plants and biosafety consideration”, Appl Biochem Biotechnol, 168, pp. 
1953–1975. 
54. Men S., Ming X., Liu R., Wei C. and Li Y. (2003), “Agrobacterium - 
 104 
mediated genetic transformation of a Dendrobium orchid”, Plant Cell 
Tisue and Organ culture, 75, pp. 63-71. 
55. Moissiard G. and Voinnet O. (2004), “Viral suppression of RNA silencing in 
plants”, Molecular Plant Patholog, 5, pp. 71-82. 
56. Moran J. and Knoxfield (1999), Virus diseases of orchids, 
57. Murashige T. and Skoog F. (1962), “A revised medium for rapid growth and 
bioassays with tobacco cultures, Physiologia Plantarum, 15, pp. 473-497. 
58. Napoli C., Lemieux C. and Jorgensen R. (1990), “Introduction of a chimeric 
chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-Suppression 
of homologous genes in trans”, Plant Cell, 2, pp. 279-289. 
59. Navalinskiene, Raugalas J. and Samuitiene M. (2005), “Viral diseases of 
flower plants 16. Identification of viruses affecting orchids (Cymbidium 
Sw.), Biologija, 2. pp. 29-34. 
60. Palauqui J. C., Elmayan T., Pollien J. M. and Vaucheret H. (1997), “Systemic 
acquired silencing: transgenespecific post-transcriptional silencing is 
transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions”, 
EMBO Journal 16, pp. 4738-4745. 
61. Petchthai U. and Chuphrom A. (2014), “Recovery of virus-infected 
Dendrobium orchids by constitutive expression of the cymbidium 
mosaic virus coat protein gene”, Plant Cell Tisue and Organ culture, 120, 
pp. 597-606. 
62. Ratcliff F., Harrison B. D. and Baulcombe D. C. (1997), “A similarity 
between viral defense and gene silencing in plants”, Science, 276, pp. 
1558-1560. 
63. Reddy D. V. R., Sudarshana M. R., Fuchs M., Rao N. C. and Thottappilly G. 
(2009), “Genetically engineered virus-resistant plants in developing 
countries: current status and future prospects”, Advances in Virus 
 105 
Research, 75, pp. 185-220. 
64. Schiebel W., Haas B., Marinkovic S., Klanner A. and Sanger, H. L. (1993), 
“RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. II. Catalytic in 
vitro properties”, Journal of Biological Chemistry, 268, pp. 11858-11867. 
65. Shrestha B.R., Chin D.P., Tokuhara K. and Mii M. (2010), “Agrobacterium-
mediate transformation of Vanda using protocorm-like bodies”, Asia-
Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 18 (1), pp. 
225-228. 
66. Sijen, T., Fleenor J., Simmer F., Thijssen K. L., Parrish S., Timmons L., 
Plasterk R. H. A., and Fire A. (2001), “On the role of RNA amplification 
in dsRNA-triggered gene silencing”, Cell, 107, pp. 465-476. 
67. Sudarshana M. R, Gourgopal R., and Bryce W. F. (2007), Methods for 
engineering resistance to plant viruses. Plant-pathogen interactions. PC 
Ronald, Humana Press, 354, pp. 183-195. 
68. Swarnapiria R. (2009), “Genetic transformation in ornametals-a review”. 
Agric. Rev., 30 (2), pp. 120-131. 
69. Tennant P., Fermin G., Fitch M. M., Manshardt R.M., Slightom J. L. and 
Gonsalves D. (2001), “Papaya ringspot virus resistance of transgenic 
rainbow and sunup is affected by gene dosage, plant development, and 
coat protein homology”. European Journal of Plant Pathology, 107, pp. 
645-653. 
70. Teixeira da Silva J. A., Dobra´nszki J., Cardoso J. C., Chandler S. F., and 
Zeng S. (2016), “Methods for genetic transformation in Dendrobium”, 
Plant Cell Reports, 35, 483-504. 
71. Truniger V. and Aranda M. A. (2009), “Recessive resistance to plant viruses”, 
Advances in Virus Research, 75, pp. 119-159. 
72. University of Illinois Extention (1990), Common virus diseases of orchids, 
Report on plant diseases, Department of crop sciences, University of 
 106 
Illinois at Urbana Champaign, 
73. Vaistij F. E., Jones L. and Baulcombe D. C. (2002), “Spreading of RNA 
targeting and DNA methylation in RNA silencing requires transcription 
of the target gene and a put’ative RNA-dependent RNA polymerase”, 
Plant Cell, 14, pp. 857-867. 
74. Van Blokland R., Van der Geest N., Mol J. N. M. and Kooter J. M., 1994. 
Transgene-mediated suppression of chalcone synthase expression in 
Petunia hybrida results from an increase in RNA turnover. Plant J. 6, pp. 
861-77. 
75. Van der Krol A. R., Mur L. A., Beld M., Mol J. N. and Stuitje A. R. (1990), 
“Flavonoid genes in petunia: addition of a limited number of gene copies 
may lead to a suppression of gene expression”, Plant Cell, 2, pp. 291-299. 
76. Vargason J. M., Szittya G., Burgyan J. and Tanaka Hall, T. M. (2003), “Size 
selective recognition of siRNA by an RNA silencing suppressor”, Cell, 
115, pp. 799-811. 
77. Verchot-Lubicz J. (2005), “A new cell to cell transport model for 
potexviruses” Molecular Plant-Microbe Interactions, 18, pp. 283-290. 
78. Voinnet O. and Baulcombe D. C. (1997), “Systemic signalling in gene 
silencing”. Nature, 389, pp. 553. 
79. Voinnet O., Lederer C. and Baulcombe D. C. (2000), “A viral movement 
protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana 
benthamiana, Cell, 103, pp. 157-167. 
80. Watanabe Y. (2011), “Overview of plant RNAi”, Methods In Molecular 
Biology, 744, pp. 1-11. 
81. Winston W. M., Molodowitch C. and Hunter C. P. (2002), “Systemic RNAi in 
C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1”, Science, 
295, pp. 2456-2459. 
 107 
82. Wisler G. C. (1989), How to control orchid viruses: The complete guidebook, 
Maupin House Publishers. 
83. Wong S. M., Mahtani P. H., Lee K. C., Yu H. H., Tan Y., Neo K. K., Chan Y., 
Wu M. and Chng C. G. (1997), “Cymbidium mosaic potexvirus RNA: 
complete nucleotide sequence and phylogenetic analysis”, Archives of 
Virology, 142, pp. 383-391. 
84. Yamada O., Ikeda R., Ohkita I., Hayashi R., Sakamoto K., and Akita O. 
(2007), “Gene silencing by RNA interference in the Koji Mold 
Aspergillus oryzae”, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 71(1), 
pp. 138-144. 
85. Ye K., Malinina L. and Patel, D. J. (2003), “Recognition of small interfering 
RNA by a viral suppressor of RNA silencing”, Nature, 426, pp. 874-878. 
86. Yoo B.C., Kragler F., Gasic E. V., Haywood V., Evans S. A., Lee E. M., 
Lough T. J. and Lucas W. (2004), “A systemic small RNA signaling 
system in plants”, Plant Cell, pp. 1979-2000. 
87. Yu H., Yang S.H. and Goh C.J. (2001), “Agrobacterium-mediated 
transformation of a Dendrobium orchid with the class 1 knox gene 
DOH1”, Plant Cell Reports, 20, pp. 301-305. 
88. Zettler F. W., Ko N. J., Wisler G. C., Elliott M.S. and Wong S. M. (1990), 
“Viruses of orchid and their control”, Plant Disease, 74(9), pp. 621-626. 
 PHỤ ỤC 
Phụ lục 1. Mô ường nuôi cấy thực vật và vi khuẩn 
1. ô ường khoán MS dùng cho nuôi cấy mô thực vật 
Tê á ấ lượ /l) 
Đa lượ 
KNO3 1,90 
NH4NO3 1,65 
KH2PO4 0,17 
MgSO4.7H2O 0,37 
CaCl2.2H2O 0,44 
V lượ 
MnSO4.4H2O 0,0223 
H3BO3 0,0062 
ZnSO4.7H2O 0,0086 
KI 0,00083 
Na2MoO4.2H2O 0,00025 
CuSO4.5H2O 0,000025 
CoCl2.6H2O 0,000025 
Fe_ EDTA 
Na2EDTA 0,0373 
FeSO4.7H2O 0,0278 
Vitamin (Morel) lượ m /l) 
Pirydoxine ( B6 ) 1 ,00 
 Biotin ( H ) 0,01 
Nicotinic acid (p.p) 1,00 
Thiamin - HCl 1,00 
Pantotheate - Ca 1,00 
Meso - inositol 100 
Agar 8 
pH 5,8 
2. ô ường LB dùng cho nuôi cấy vi khuẩn 
H a ấ lượ /l) 
Bacto peptone 10 
NaCl 10 
Yeast extract 5 
Bacto agar 16 
pH 7,0 
 Phụ lục 2. Một s triệu chứng nghi nhiễm virus trên các mẫu lan thu thập 
Ghi chú: A, B: Khảm vàng đi kèm hoại tử lá; C, D; Khảm vàng lá; E: Khảm màu nụ 
hoa; F: Khảm màu đi kèm với biến dạng hoa. 
A B 
C D 
E F 
 Phụ lục 3. Quy trình chuyển gen vào PLBs của lan Dendrobium Sonia qua 
trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 
1. Vật liệu 
- PLBs (Protocorm like bodies) tái sinh từ cây lan Dendrobium Sonia in vitro. 
- Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen mục tiêu (chùng C58, 
mang vector (pK7GWIWG2(II)/CP hoặc pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP). 
2. Thiết bị và dụng cụ 
- Tủ cấy vô trùng. 
- Nồi hấp tiệt trùng. 
- Máy lắc. 
- Tủ ủ nhiệt. 
- Máy ly tâm. 
- Máy PCR khuếch đại gen. 
- Pipetman (micropipet). 
- Bình tam giác, đĩa Petri thủy tinh. 
- Một số thiết bị và dụng cụ cơ bản khác về công nghệ sinh học. 
3. Các bước thực hiện 
3.1. Chuẩn bị vi khuẩn cho lây nhiễm 
Tăng sinh vi khuẩn trên môi trường LB bổ sung 50 mg/l ampicilin, 100 mg/l 
spectinomicin và 50 mg/l rifampicin, ở 28°C, tốc độ lắc 200 vòng/ phút cho đến khi 
OD của dịch nuôi cấy đạt giá trị từ 0,6-1. Ly tâm (8000 vòng/phút) thu sinh khối vi 
khuẩn và pha loảng với môi trường MS lỏng (cùng thể tích tăng sinh) có bổ sung 
100 M AS để sử dụng cho lây nhiễm. 
3.2. Lây nhiễm vi khuẩn vào PLBs và thực hiện đồng nuôi cấy 
a. Tách riêng từng BLBs đơn lẻ từ cụm PLBs (quá trình tách được thực hiện 
trong môi trường MS lỏng). 
 b. Ngâm PLBs sau khi tách vào môi trường MS lỏng bổ sung 100M AS trong 
thời gian 15 phút ở nhiệt độ 25oC. 
c. Ngâm PLBs với dịch vi khuẩn đã được chuẩn bị ở bước 1 trong thời gian 30 
phút, ở nhiệt độ 25oC. 
d. Làm khô nhẹ PLBs trên giấy thấm, cấy vào môi trường MS rắn có bổ sung 
100 M AS, đặt nuôi trong tối ở nhiệt độ 25 2oC, ẩm độ 55 5% trong 4 ngày. 
3.3. Loại vi khuẩn khỏi PLBs sau khi lây nhiễm 
e. Cấy PLBs (sau khi được lây nhiễm với vi khuẩn) vào môi trường khử khuẩn 
(MS + 0,3 mg/l BA + 1 mg/l NAA + 300 mg/l cefotaxime) trong 21 ngày (thực hiện 
cấy chuyền sang môi trường mới sau mỗi 7 ngày). 
3.4. Sàng lọc và PLBs mang gen và thu nhận cây lan chuyển gen 
f. Cấy PLBs vào môi trường sàng lọc (MS + 0,3 mg/l BA + 1 mg/l NAA + 500 
mg/l kanamycin) trong thời gian 60 ngày. 
g. Sau khi sàng lọc, cô lập một phần mẫu từ các cụm PLBs, tiến hành ly trích 
DNA và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi của đoạn gen mục tiêu (cặp mồi F-
CCP1/R-CCP1 cho trường hợp gen CP hay cặp mồi Fi-CORF2-4/Ri-CCP cho 
trường hợp gen ORF2-4+CP) để kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu. 
f. Chuyển các cụm PLBs mang gen mục tiêu được nuôi cấy trên môi trường 
tăng sinh trong 1 tháng, sau đó chuyển sang nuôi cấy môi trường tăng trưởng cây 
(½MS) trong vòng 6 tháng để thu nhận cây hoàn chỉnh. 
 Phụ lục 4. Kết quả so sánh trình tự gen CP và gen ORF2-4 của CyMV 
1. So sánh giữa các trình tự gen CP phân lập tại Việt Nam 
* So sánh trình tự HaNoi với các trình tự còn lại 
* So sánh trình tự BacGiang với các trình tự còn lại 
 * So sánh trình tự ThaiNguyen với các trình tự còn lại 
 * So sánh trình tự DaLat với các trình tự còn lại 
 * So sánh trình tự HCM1 với các trình tự còn lại 
 * So sánh trình tự HCM2 với các trình tự còn lại 
Ghi chú: Lần lượt từng trình tự trong số 6 trình tự gen CP của CyMV phân lập được ở Việt Nam (HCM1, HCM2, 
DaLat, HaNoi, BacGiang, ThaiNguyen) được so sánh với các trình tự còn lại trong nhóm. 
 2. So sánh giữa các trình tự gen CP của virus CyMVphân lập tại Việt Nam với các trình tự được công b ở một 
s khu vực trên thế giới 
* So sánh giữa trình tự HaNoi với các trình tự trên thế giới 
 * So sánh giữa trình tự BacGiang với các trình tự trên thế giới 
 * So sánh giữa trình tự ThaiNguyen với các trình tự trên thế giới 
 * So sánh giữa trình tự DaLat với các trình tự trên thế giới 
 * So sánh giữa trình tự HCM1 với các trình tự trên thế giới 
 * So sánh giữa trình tự HCM2 với các trình tự trên thế giới 
Ghi chú: Các trình tự phân lập được ở Việt Nam (HaNoi, BacGiang, ThaiNguyen, DaLat HCM1, HCM2) lần lược 
được so sánh với 6 trình tự ở các khu vực khác nhau trên thế giới. 
 3. So sánh chung giữa các trình tự gen CP được phân lập tại Việt Nam và công b trên thế giới 
Ghi chú: - Query: HaNoi, Query_62194-62205: tương ứng lần lượt với các trình tự: BacGiang, ThaiNguyen, DaLat, 
HCM1, HCM2, KF8532600-China, AY429021-Taiwan, AB693982-Indonesia, AF405728-Singapore, AB541560-Korea, 
EF125180-Hawai; Vùng gen được tô màu vàng là vùng được chọn để thiết kế vector. 
 4. So sánh các trình tự gen ORF2-4 được công b trên thế giới 
 Ghi chú: Query: AB197937.1-Japan, Query_26045: AM055720.1-India, Query_26046: U62963.1-Singapore, 
Query_26046: NC_001812.1-USA; Vùng gen được tô màu vàng là vùng được chọn để thiết kế vector.
 Phụ lục 5. Kết quả xử lý th ng kê 
1. Tỷ lệ mẫ đ ạn thân mang ch i ngủ s ng vô trùng 
 2. Tỷ lệ mẫu lát cắt mỏng mô thân cảm ứng vớ mô ường 
Số liệu được chuyển đổi theo phương thức (X+0,5)1/2, với X là số liệu thực 
3. Sự tha đổi tr lượng PLBs 
 4. Tỷ lệ mẫ dươ í sa k ộm GUS 
4.1. Trường hợp chủng C58 
4.1.1. Sau 1 ngày đồng nuôi cấy 
4.1.2. Sau 2 ngày đồng nuôi cấy 
 4.1.3. Sau 3 ngày đồng nuôi cấy 
4.1.4. Sau 4 ngày đồng nuôi cấy 
 4.1.5. Sau 5 ngày đồng nuôi cấy 
 4.2. Trường hợp chủng EHA105 
4.2.1. Sau 1 ngày đồng nuôi cấy 
4.2.2. Sau 2 ngày đồng nuôi cấy 
 4.2.3. Sau 3 ngày đồng nuôi cấy 
4.2.4. Sau 4 ngày đồng nuôi cấy 
 4.2.5. Sau 5 ngày đồng nuôi cấy 
 4.3. Trường hợp chủng LBA4404 
4.3.1. Sau 1 ngày đồng nuôi cấy 
* Sau 2 ngày đồng nuôi cấy 
 4.3.2. Sau 3 ngày đồng nuôi cấy 
 4.3.3. Sau 4 ngày đồng nuôi cấy 
 4.3.4. Sau 5 ngày đồng nuôi cấy 
 5. Tỷ lệ mẫu s ê mô ường cefotaxime 
Số liệu được chuyển đổi theo phương thức (X+0,5)1/2, với X là số liệu thực 
5.1. Sau 7 ngày nuôi cấy 
5.2. Sau 14 ngày nuôi cấy 
 6. Tỷ lệ mẫu chết ê mô ường hygromycin 
Số liệu được chuyển đổi theo phương thức (X+0,5)1/2, với X là số liệu thực. 
6.1. Sau 14 ngày nuôi cấy 
 6.2. Sau 28 ngày nuôi cấy 
 7. Tỷ lệ mẫu chế ê mô ường kanamycin 
Số liệu được chuyển đổi theo phương thức (X+0,5)1/2, với X là số liệu thực. 
7.1. Sau 20 ngày nuôi cấy 
 7.2. Sau 40 ngày nuôi cấy