Luận án Nâng cao năng suất sinh sản của lợn nái landrace và yorkshire thông qua chọn lọc bằng chỉ thị phân tử

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
NGUYỄN THỊ VINH 
NÂNG CAO NĂNG SUẤT SINH SẢN CỦA LỢN NÁI 
LANDRACE VÀ YORKSHIRE THÔNG QUA 
CHỌN LỌC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ 
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
NGUYỄN THỊ VINH 
NÂNG CAO NĂNG SUẤT SINH SẢN CỦA LỢN NÁI 
LANDRACE VÀ YORKSHIRE THÔNG QUA 
CHỌN LỌC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ 
Chuyên ngành : Chăn nuôi 
Mã số : 9 62 01 05 
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Vũ Đình Tôn 
HÀ NỘI, 2018
 i 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên 
cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng để bảo vệ 
lấy bất kỳ học vị nào. 
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn, 
các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2018 
Tác giả luận án 
Nguyễn Thị Vinh 
 ii 
LỜI CẢM ƠN 
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận đƣợc sự 
hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng 
nghiệp và gia đình. 
 Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết 
ơn sâu sắc PGS. TS. Vũ Đình Tôn đã tận tình hƣớng dẫn, đƣa ra nhiều ý kiến đóng góp 
quý báu, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học 
tập và thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn GS. Frederic Farnir – Đại học Liege, 
Vƣơng Quốc Bỉ đã có nhiều đóng góp ý kiến quý báu để tôi hoàn thành tốt luận án này. 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ 
môn Chăn nuôi chuyên khoa, Khoa Chăn nuôi- Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận 
tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. 
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ công nhân viên Công ty TNHH Lợn giống 
hạt nhân DABACO (Tỉnh Bắc Ninh) và Xí nghiệp Chăn nuôi lợn Đồng Hiệp (Thành phố 
Hải Phòng) đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất giúp tôi hoàn thành tốt luận án này. 
Xin chân thành cảm ơn dự án AI ARES – CCD (Dự án Việt Bỉ) đã tài trợ chuyến đi 
thực tập ngắn hạn tại Khoa Thú y, trƣờng đại học Liege, Vƣơng quốc Bỉ. 
Xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Bộ môn Sinh học động vật, 
Bộ môn Di truyền giống vật nuôi đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình 
thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo 
mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành 
luận án./. 
Xin trân trọng cảm ơn! 
Hà Nội, ngày... tháng... năm 2018 
Nghiên cứu sinh 
Nguyễn Thị Vinh 
 iii 
MỤC LỤC 
Lời cam đoan i 
Lời cảm ơn ii 
Mục lục iii 
Danh mục chữ viết tắt vi 
Danh mục bảng viii 
Danh mục hình x 
Trích yếu luận án xi 
Thesis abstract xiii 
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 
1.1. Tính cấp thiết của đề tài 1 
1.2. Mục tiêu của đề tài 2 
1.3. Phạm vi nghiên cứu 3 
1.4. Những đóng góp mới của đề tài 3 
1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 
2.1. Cơ sở khoa học của vấn đề nghiên cứu 5 
2.1.1. Giống và công tác giống lợn 5 
2.1.2. Tính trạng số lƣợng, sự di truyền của tính trạng số lƣợng và các yếu tố 
ảnh hƣởng đến tính trạng số lƣợng 8 
2.1.3. Các chỉ tiêu đánh giá năng suất sinh sản của lợn nái 10 
2.1.4. Những yếu tố ảnh hƣởng tới năng suất sinh sản 11 
2.1.5. Các phƣơng pháp chọn lọc ở lợn 15 
2.2. Áp dụng công nghệ sinh học trong công tác giống 17 
2.2.1. Tại sao phải sử dụng công nghệ gen trong chăn nuôi? 17 
2.2.2. Áp dụng công nghệ gen trong công tác chọn và nhân giống lợn 18 
2.2.3. Đặc điểm gen RNF4, RBP4 và IGF2 27 
2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 28 
2.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc 28 
2.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc 35 
 iv 
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu 44 
3.2. Địa điểm nghiên cứu 44 
3.3. Nội dung nghiên cứu 44 
3.3.1. Đánh giá thực trạng về năng suất sinh sản và các yếu tố ảnh hƣởng đến 
năng suất sinh sản của đàn lợn nái Landrace và Yorkshire nuôi tại các cơ 
sở nghiên cứu 44 
3.3.2. Xác định tính đa hình (tần số alen và tần số kiểu gen) gen RNF4, RBP4 
và IGF2 trên lợn nái Landrace và Yorkshire 45 
3.3.3. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4, RBP4 và IGF2 với năng suất sinh 
sản của lợn nái Landrace và Yorkshire 45 
3.3.4. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4, RBP4 với sinh trƣởng và năng 
suất thịt của lợn cái hậu bị Landrace và Yorkshire 45 
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 45 
3.4.1. Đánh giá thực trạng về năng suất sinh sản và các yếu tố ảnh hƣởng đến 
năng suất sinh sản của đàn lợn nái Landrace và Yorkshire nuôi tại các cơ 
sở nghiên cứu 45 
3.4.2. Xác định đa hình gen RNF4, RBP4 và IGF2 trên quần thể lợn nái 
Landrace và Yorkshire 48 
3.4.3. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4, RBP4 và IGF2 với năng suất sinh 
sản của lợn nái Landrace và Yorkshire 50 
3.4.4. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4, RBP4 với sinh trƣởng và năng 
suất thịt của lợn cái hậu bị Landrace và Yorkshire 51 
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 
4.1. Năng suất sinh sản và các yếu tố ảnh hƣởng đến năng suất sinh sản của 
đàn lợn nái Landrace và Yorkshire nuôi tại các cơ sở nghiên cứu 54 
4.1.1. Năng suất sinh sản của lợn nái Landrace và Yorkshire 54 
4.1.2. Ảnh hƣởng của các yếu tố đến năng suất sinh sản 55 
4.2. Đa hình gen RNF4, RBP4 và IGF2 của lợn nái Landrace và Yorkshire 66 
4.2.1. Đa hình gen RNF4 66 
4.2.2. Đa hình gen RBP4 68 
4.2.3. Đa hình gen IGF2 70 
 v 
4.3. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4, RBP4 và IGF2 với năng suất sinh 
sản của lợn nái Landrace và Yorkshire 72 
4.3.1. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4, RBP4 và IGF2 với năng suất 
sinh sản 72 
4.3.2. Tác động di truyền cộng gộp (a) và trội (d) của gen RNF4, RBP4 và 
IGF2 đến năng suất sinh sản 86 
4.3.3. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4 và RBP4 với năng suất sinh sản 
qua các lứa đẻ 93 
4.4. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4 và RBP4 với sinh trƣởng và năng 
suất thịt của lợn cái hậu bị Landrace và Yorkshire 104 
4.4.1. Mức độ ảnh hƣởng của các gen đến sinh trƣởng và năng suất thịt 104 
4.4.2. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4 với sinh trƣởng và năng suất thịt 105 
4.4.3. Mối liên quan giữa đa hình gen RBP4 với sinh trƣởng và năng suất thịt 106 
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 109 
5.1. Kết luận 109 
5.2. Đề nghị 110 
Danh mục các công trình công bố liên quan đến luận án 111 
Tài liệu tham khảo 112 
Phụ lục 129 
 vi 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 
Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt 
a Additive effect (ảnh hƣởng di truyền cộng gộp) 
ADN Axit deoxyribonucleic 
BF Backfat thickness (độ dày mỡ lƣng) 
cs. Cộng sự 
d Dominance effect (ảnh hƣởng trội) 
IGF2 Insulin – like growth factors 2 
GLM General Linear Model (mô hình tuyến tính tổng quát) 
KCLĐ Khoảng cách lứa đẻ 
KLSSO Khối lƣợng sơ sinh/ổ 
KLSSC Khối lƣợng sơ sinh/con 
KLCSO Khối lƣợng cai sữa/ổ 
KLCSC Khối lƣợng cai sữa/con 
LD Depth of longgissimus dorsal (độ dày cơ thăn) 
LM Lean meat percentage (tỷ lệ nạc) 
LSM Least Square Mean (trung bình bình phƣơng nhỏ nhất) 
NDTT Nồng độ tinh trùng 
PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại gen) 
PCR-RFLP 
Polymerase Chain Reaction - Restriction fragment length 
polymorphism (đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) 
QTL Quantitative Trait Loci (cụm gen tính trạng số lƣợng) 
RNF4 Ring finger protein 4 
RBP4 Retinol binding protein 4 
SCSS Số con sơ sinh/ổ 
SCSSS Số con sơ sinh sống/ổ 
SCCS Số con cai sữa/ổ 
SE Standard error: sai số chuẩn 
SNP Single nucleotide polymorphism (đa hình nucleotit đơn) 
TĐDLĐ Tuổi động dục lần đầu 
TĐLĐ Tuổi đẻ lứa đầu 
 vii 
TGCS Thời gian cai sữa 
TLSSS Tỷ lệ sơ sinh sống 
TLSĐCS Tỷ lệ sống đế cai sữa 
TLTR Tỷ lệ trứng rụng 
TLKĐDL Tỷ lệ không động dục lại 
TPGLĐ Tuổi phối giống lần đầu 
TLTTT Tỷ lệ tinh trùng bình thƣờng 
TTTD Thể tích tinh dịch 
 viii 
DANH MỤC BẢNG 
TT Tên bảng Trang 
2.1. Hệ số di truyền của một số tính trạng cơ bản của lợn 7 
2.2. Kỹ thuật chỉ thị ADN 23 
2.3. Marker liên quan đến sinh trƣởng và chất lƣợng thịt lợn 24 
2.4a. Marker liên quan đến năng suất sinh sản ở lợn 25 
2.4b. Marker liên quan đến năng suất sinh sản ở lợn 26 
3.1. Dung lƣợng mẫu đánh giá năng suất sinh sản 46 
3.2. Dung lƣợng mẫu phân tích kiểu gen 48 
3.3. Trình tự mồi, sản phẩm PCR, enzyme cắt giới hạn của gen RNF4, RBP4 
và IGF2 49 
4.1. Năng suất của lợn nái Landrace và Yorkshire 54 
4.2. Mức độ ảnh hƣởng của các yếu tố đến năng suất sinh sản 56 
4.3. Ảnh hƣởng của trại đến năng suất sinh sản của lợn nái Landrace 58 
4.4. Ảnh hƣởng của trại đến năng suất sinh sản của lợn nái Yorkshire 59 
4.5. Ảnh hƣởng của mùa vụ đến năng suất sinh sản của lợn nái Landrace 60 
4.6. Ảnh hƣởng của mùa vụ đến năng suất sinh sản của lợn nái Yorkshire 61 
4.7. Ảnh hƣởng của lứa đẻ đến năng suất sinh sản của lợn nái Landrace 64 
4.8. Ảnh hƣởng của lứa đẻ đến năng suất sinh sản của lợn nái Yorkshire 65 
4.9. Tần số alen và kiểu gen của gen RNF4 gene trong quần thể lợn nái 
Landrace và Yorkshire 68 
4.10. Tần số alen và kiểu gen của gen RBP4 gene trong quần thể lợn nái 
Landrace and Yorkshire 69 
4.11. Tần số alen và kiểu gen của gen IGF2 gene trong quần thể lợn nái 
Landrace and Yorkshire 71 
4.12. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4 với năng suất sinh sản của lợn nái 
Landrace 73 
4.13. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4 với năng suất sinh sản của lợn nái 
Yoskshire 74 
4.14. Mối liên quan giữa đa hình gen RBP4 với năng suất sinh sản của lợn nái 
Landrace 79 
4.15. Mối liên quan giữa đa hình gen RBP4 với năng suất sinh sản của lợn nái 
Yorkshire 80 
 ix 
4.16. Mối liên quan giữa đa hình gen IGF2 với năng suất sinh sản của lợn nái 
Landrace 84 
4.17. Mối liên quan giữa đa hình gen IGF2 với năng suất sinh sản của lợn nái 
Yorkshire 85 
4.18. Ảnh hƣởng di truyền cộng gộp (a) và trội (d) gen RNF4 đến năng suất 
sinh sản của lợn nái Landrace và Yorkshire 87 
4.19. Ảnh hƣởng của di tryền cộng gộp (a) và giá trị trội (d) gen RBP4 đến 
năng suất sinh sản của lợn nái Landrace và Yorkshire 90 
4.20. Ảnh hƣởng của di truyền cộng gộp (a) và trội (d) gen IGF2 đến năng suất 
sinh sản của lợn nái Landrace 92 
4.21. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4 với năng suất sinh sản của lợn nái 
Landrace qua các lứa đẻ 95 
4.21. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4 với năng suất sinh sản của lợn nái 
Landrace qua các lứa đẻ (tiếp) 96 
4.22. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4 với năng suất sinh sản của lợn nái 
Yorkshire qua các lứa đẻ 97 
4.22. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4 với năng suất sinh sản của lợn nái 
Yorkshire qua các lứa đẻ (tiếp) 98 
4.23. Mối liên quan giữa đa hình gen RBP4 với năng suất sinh sản của lợn nái 
Landrace qua các lứa đẻ 100 
4.23. Mối liên quan giữa đa hình gen RBP4 với năng suất sinh sản của lợn nái 
Landrace qua các lứa đẻ (tiếp) 101 
4.24. Mối liên quan giữa đa hình gen RBP4 với năng suất sinh sản của lợn nái 
Yorkshire qua các lứa đẻ 102 
4.24. Mối liên quan giữa đa hình gen RBP4 với năng suất sinh sản của lợn nái 
Yorkshire qua các lứa đẻ (tiếp) 103 
4.25. Mức độ ảnh hƣởng của các gen đến sinh trƣởng và năng suất thịt của lợn 
Landrace và Yorshire 104 
4.26. Mối liên quan giữa đa hình gen RNF4 với sinh trƣởng và năng suất thịt 
lợn nái Landrace và Yorkshire 105 
4.27. Mối liên quan giữa đa hình gen RBP4 đến sinh trƣởng và năng suất thịt 
của lợn Landrace và Yorkshire 107 
 x 
DANH MỤC HÌNH 
TT Tên hình Trang 
2.1. Sơ đồ phân bố tần số kiểu gen 9 
2.2. Những điểm “nóng” trên nhiễm sắc thể ảnh hƣởng đến năng suất của lợn 19 
2.3. Marker liên kết với loci quan tâm và khoảng cách từ marker đến các QTL 
quan tâm 20 
4.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR của gen RNF4 và RBP4 và IGF2 trên gel 
agarose (1,5%) 66 
4.2. Kết quả điện di sản phẩm cắt RNF4-SacII, RBP4-MspI và IGF2-NciI trên 
gel agarose (2,5%) 67 
4.3. Tần số kiểu gen của gen RNF4, RBP4 và IGF2 71 
4.4. Tần số alen của gen RNF4, RBP4 và IGF2 72 
4.5. Số con sơ sinh/ổ của các kiểu gen RNF4 76 
4.6. Số con sơ sinh sống/ổ của các kiểu gen RNF4 76 
4.7. Khối lƣợng sơ sinh/ổ của các kiểu gen RNF4 77 
4.8. Số con sơ sinh/ổ của các kiểu gen RBP4 của lợn nái Landrace 82 
4.9. Số con sơ sinh sống/ổ của các kiểu gen RBP4 của lợn nái Landrace 82 
4.10. Khối lƣợng sơ sinh/ổ của các kiểu gen RBP4 của lợn nái Landrace 82 
 xi 
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN 
Tên tác giả: Nguyễn Thị Vinh 
Tên Luận án: Nâng cao năng suất sinh sản của lợn nái Landrace và Yorkshire thông 
qua chọn lọc bằng chỉ thị phân tử 
Chuyên ngành: Chăn nuôi Mã số: 9 62 01 05 
Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam 
Mục đích nghiên cứu 
Mục tiêu chung: 
Đánh giá mối liên quan giữa đa hình gen RNF4, RBP4 và IGF2 với năng suất 
sinh sản của lợn nái Landrace và Yorkshire nhằm phục vụ cho công tác giống và định 
hƣớng chọn lọc theo kiểu gen để nâng cao năng suất sinh sản của 2 giống lợn này. 
Mục tiêu cụ thể: 
Đánh giá thực trạng năng suất sinh sản và các yếu tố ảnh hƣởng đến năng suất 
sinh sản của lợn nái Landrace và Yorkshire nuôi tại cơ sở nghiên cứu 
Xác định đƣợc đa hình các gen RNF4, RBP4 và IGF2; 
Đánh giá đƣợc mối liên quan giữa đa hình gen RNF4, RBP4 và IGF2 với các 
tính trạng năng suất sinh sản của lợn nái Landrace và Yorkshire; 
 Đánh giá đƣợc mối liên quan giữa đa hình gen RNF4, RBP4 với các tính trạng 
sinh trƣởng và năng suất thịt ở lợn cái hậu bị Landrace và Yokshire. 
Phƣơng pháp nghiên cứu 
 Phƣơng pháp thu thập số liệu: số liệu thứ cấp, sơ cấp các tính trạng sinh sản của 
lợn nái bao gồm tuổi phối giống lần đầu, tuổi đẻ lứa đầu, khoảng cách lứa đẻ, số con sơ 
sinh/ổ, số con sơ sinh sống/ổ, khối lƣợng sơ sinh/con, số con cai sữa/ổ, khối lƣợng cai 
sữa/con, các chỉ tiêu về sinh trƣởng của lợn từ giai đoạn 70-90 ngày tuổi và 130-160 
ngày tuổi, các chỉ tiêu về năng suất thịt gồm độ dày cơ thăn, độ dày mỡ lƣng, tỷ lệ nạc 
đƣợc thu thập từ cơ sở dữ liệu và cân đo, đếm trực tiếp tại các cơ sở giống. 
 Phƣơng pháp xác định kiểu gen: Mẫu tai lợn nái và đuôi lợn con đƣợc sử dụng để 
tách chiết ADN tổng số bằng KIT của hãng QIA gene. Các cặp mồi đặc hiệu đƣợc sử dụng 
để khuếch đại các đoạn gen đích bằng phƣơng pháp PCR. Đa hình gen RNF4, RBP4 và 
IGF2 đƣợc xác định bằng phƣơng pháp PCR-RFLP sử dụng các enzym cắt đặc hiệu. 
Phƣơng pháp xử lý số liệu: Tần số alen và kiểu gen đƣợc xác định. Phép thử khi 
bình phƣơng (Chi-square test) đƣợc sử dụng nhằm kiểm định mức độ phù hợp của tần 
số kiểu gen, tần số alen quan sát so với lý thuyết theo định luật Hardy-Weinberg. Phân 
tích mối liên quan giữa kiểu gen và các yếu tố đến tính trạng nghiên cứu sử mô hình 
tuyến tính GLM bằng phần mềm SAS 9.1 (2002). Các tham số thống kê bao gồm dung 
 xii 
lƣợng mẫu (n), trung bình bình phƣơng nhỏ nhất (LSM) và sai số tiêu chuẩn (SE). So 
sánh các giá trị LSM theo cặp bằng phép so sánh Tukey. Ảnh hƣởng của giá trị di 
truyền cộng gộp (a) và và giá trị trội (d) của  ... lerq, S. R. Shrestha, L. S. F. Wu, E. K. Pradhan, S. K. Khatry, J. 
Katz, R. Adhikari, and A. Sommer (1997). Effects of vitamin A on growth of vitamin 
A-deficient children: field studies in Nepal, J. Nutri., 127(10): 1957-1965. 
189. White B. R., J. Baknes, and M. B. Wheeler (1997). Reproductive physiology in 
Chinese Meishan pigs. A. University of Illinois perspective. Anim. Breed. 
Abstracts. 65(8): 4238. 
190. Whittemore C. T. and I. Kyriazakis (2008). Whittemore's science and practice of 
pig production, John Wiley & Sons. 
191. Wuensch U., G. Niter, U. Beryfelt, and L. Schueler (2000). Genetic and economic 
evaluation of genetic improvement schemes pigs, II: Comparison of selection strategies 
a three-way crossbreeding scheme, Anim. Breed. Abstracts, 68(8): 4708. 
192. Yen H. F., G. A. Isler, W. R. Harvey, and K. M. Irvin (1987). Factors affecting 
reproductive - performance in swine, J. Anim. Sci., 64(5): 1340-1348. 
193. Yonggang L. and X. Xueshan (2012). Molecular characterization, tissue 
expression, polymorphism and association of porcine LCK gene, Molecul. Biol. 
Report., 39(4): 4023-4028. 
 129 
PHỤ LỤC 1 
QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ACID DEOXYRIBONUCLEIC (ADN) 
TỔNG SỐ TỪ MẪU MÔ LỢN 
Sử dụng Kit QIAamp FOR TISSUE của hãng QIAGEN 
1. Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm, hóa chất và dụng cụ thí nghiệm: 
1.1. Vật liệu thí nghiệm: 
Mẫu đuôi hoặc tai lợn đựng trong ống chuyên dụng và đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 0-4oC 
trƣớc khi tiến hành tách chiết ADN. 
1.2. Hóa chất: 
+ Bộ kit tách chiết ADN cho mô của hãng QIAgen. 100 phản ứng/bộ. Thành phần đƣợc 
sử dụng gồm có: 
STT Thành phần bộ kit1 Thể tích cung cấp Sử dụng cho mỗi phản ứng 2 
1 Cột SV3 100 cột 01 cột 
2 Ống thu dung dịch 300 ống 03 ống 
3 Dung dịch Buffer TL 30 ml 200 - 400 μl 
4 Dung dịch Buffer TB 50 ml 400 - 800 μl 
5 Dung dịch Buffer BW 80 ml 600 μl 
6 Dung dịch Buffer TW 100 ml 700 μl 
7 Dung dịch Buffer AE4 30 ml 200 - 400 μl 
8 Proteinase K (20 mg/ml) 2,4 ml 20 - 40 μl 
 Tổng số phản ứng 100 phản ứng 
+ Dung dịch cồn 70o 
+ Thuốc nhuộm DNA Runsafe. 1ml 
1 Các dung dịch đệm Buffer TL, TB, BW, TW trong bộ kit không đƣợc nhà sản xuất cung cấp thông tin 
chi tiết về thành phần. 
2 Thể tích các dụng dịch TL, TB và proteinase K sử dụng cho mỗi phản ứng phụ thuộc vào lƣợng mô sử 
dụng để tách chiết. Thể tích dung dịch AE đƣợc sử dụng ít hay nhiều cho phép thu ADN với nồng độ 
khác nhau. 
3 Cột SV: cột ly tâm silica cho phép gắn chọn lọc ADN 
4 Dung dịch Buffer AE có tác dụng hòa tan ADN, chứa 0.5 mM EDTA,10 mM Tris-HCl, pH9.0. Có thể 
thay thế dung dịch AE bằng nƣớc khử ion. 
 130 
+ Agarose Serva Wide Range molecular biology grade dạng bột 
+ Đệm TBE buffer (10X) Molecular biology grade 
+ Thang DNA ladder 1000 bp 
1.3. Thiết bị: 
+ Máy vortex mixer 
+ Máy li tâm tốc độ 12.000 vòng/phút 
+ Bộ cấp điện và bể điện di 
+ Tủ thao tác an toàn sinh học 
1.4. Dụng cụ và vật tư khác: 
+ Micropipet và đầu côn 10 μl, 200 μl, 1000 μl 
+ Ống Eppendorf 1.5 ml 
+ Găng tay và khẩu trang phòng thí nghiệm 
2. Các bƣớc tách chiết ADN từ mẫu mô lợn: 
Bƣớc 1: Loại bỏ phần lông và sụn của mẫu, nghiền nát 25 - 50 mg mô mềm từ tai hoặc 
đuôi lợn bằng lƣỡi dao hoặc dao mổ sắc và đƣa vào ống 1.5ml. Thêm 200 - 400 μl dung 
dịch đệm Buffer TL (tùy thuộc khối lƣợng mẫu) và trộn đều bằng máy vortex trong 15 
giây. 
Bƣớc 2: Tùy thuộc khối lƣợng mô, thêm 20 - 40 μl dung dịch Proteinase K nồng độ 600 
IU/ml vào ống đựng mô. Trộn đều bằng pipet hoặc máy vortex trƣớc khi ủ ở waterbath 
56
o
C trong 1-2 tiếng cho đến khi quan sát thấy mô đã bị phân giải hết và tạo thành 
huyền phù đặc trong ống. Trong thời gian ủ, có thể cần phải trộn dung dịch trong ống 
đựng mẫu bằng máy vortex từ 2-3 lần để tăng hiệu quả phân giải. 
Bƣớc 3: Kiểm tra dung dịch đệm Buffer TB. nếu thấy có kết tủa thì cần nâng nhiệt độ 
lên 37
oC để kết tủa tan hoàn toàn. Sử dụng dung dịch đệm có kết tủa sẽ làm giảm mạnh 
hiệu suất tách chiết. 
Bƣớc 4: Quay li tâm ở tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 giây để thu hết các giọt dung 
dịch bám trên thành ống đựng mẫu. 
Bƣớc 5: Tùy thuộc vào lƣợng mẫu ban đầu, thêm 400 - 800 μl dung dịch đệm Buffer 
TB vào ống đựng mẫu và trộn đều dung dịch bằng máy vortex. Quay li tâm ở tốc độ 
6.000 vòng/phút trong 10 giây để thu hết các giọt dung dịch bám trên thành ống đựng 
mẫu. 
Bƣớc 6: Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột SV đƣợc cung cấp kèm bộ kit, mỗi mẫu sử 
dụng 01 cột, đánh số thứ tự hoặc ghi tên mẫu trên thành hoặc miệng ống đựng cột. Quay 
 131 
li tâm tốc độ 13.000 vòng trong 1 phút. Loại bỏ các ống đã thu dung dịch và chuyển cột 
lên những ống thu dung dịch mới. Nếu lƣợng dung dịch trong ống đựng mẫu nhiều hơn 
700 μl, có thể chia đôi lƣợng dung dịch và đổ lên cột 02 lần, sau mỗi lần loại bỏ dung 
dịch đã lọc và tái sử dụng ống đó để ly tâm các lần sau cho đến khi toàn bộ dung dịch 
trong ống đựng mẫu đều đƣợc lọc qua cột SV. 
Bƣớc 7: Thêm 600 μl dung dịch đệm Buffer BW lên cột SV, chú ý không nhả dung 
dịch với áp lực mạnh trực tiếp lên lớp silica của cột SV. Quay li tâm tốc độ 13.000 vòng 
trong 30 giây. Tƣơng tự nhƣ bƣớc trên, loại bỏ các ống đã thu dụng dịch và đƣa cột lên 
các ống thu dung dịch mới. 
Bƣớc 8: Thêm 700 μl dung dịch đệm Buffer TW lên cột SV, chú ý không nhả dung dịch 
với áp lực mạnh trực tiếp lên lớp silica của cột SV. Quay li tâm tốc độ 13.000 vòng 
trong 30 giây. Lần này, loại bỏ dung dịch lọc và đƣa cột SV trở lại lên ống thu dung 
dịch cũ. 
Bƣớc 9: Quay ly tâm tốc độ 13.000 vòng trong 1 phút để loại bỏ các dung dịch đệm rửa 
còn sót lại. Nếu quan sát thấy vẫn còn dung dịch đệm TW trên cột SV, có thể quay li 
tâm thêm 1 phút để loại bỏ hoàn toàn. Sau đó đặt cột SV lên ống eppendorf 1,5 ml sạch. 
Bƣớc 10: Thêm 200 μl dung dịch đệm AE hoặc nƣớc khử ion lên cột SV và ủ ở nhiệt độ 
phòng trong 2 phút. Quay li tâm trong 1 phút. Sau đó thêm 200 μl dung dịch AE hoặc 
nƣớc khử trùng lên cột SV và để trong 30 giây để tráng toàn bộ ADN còn sót lại trong 
cột. Cuối cùng, quay ly tâm trong 1 phút để thu toàn bộ dung dịch chứa ADN vào ống 
eppendorf 1,5ml. 
3. Kiểm tra và bảo quản ADN tổng số 
3.1. Kiểm tra ADN tổng số 
Bước 1: Kiểm tra sản phẩm ADN tổng số đã đƣợc tách chiết bằng phƣơng pháp điện di 
trên gel agarose 1%, hiệu điện thế 110V, cƣờng độ dòng điện 91mA trong 15-20 phút. 
Mỗi giếng điện di chứa 5 µl sản phẩm PCR trộn đều với 1 µl loading dye 6X. Một giếng 
chứa thang ADN 1000 bp. Gel agarose đƣợc trộn đều với 2 µl thuốc nhuộm huỳnh 
quang Red Safe. Kết quả đƣợc đọc dƣới tia UV trong buồng đọc IGenius3. Sản phẩm 
ADN tổng số mong muốn đƣợc thể hiện ở Hình 1. 
Các mẫu mô khác nhau cho sản phẩm tách chiết ADN có nồng độ khác nhau. Các mẫu 
ADN cho vạch rõ và sáng là vật liệu tốt cho các thí nghiệm tiếp theo. Ngƣợc lại các 
mẫu ADN cho vạch mảnh và mờ có thể cho kết quả không rõ ràng hoặc không cho kết 
quả trong các phân tích tiếp theo. 
Bước 2: Kiểm tra bằng phƣơng pháp đo nồng độ tƣơng đối bằng quang phổ kế (phƣơng 
pháp đo OD). Sản phẩm tách chiết ADN lý tƣởng có chỉ số OD đạt trên 100 ng/μl với 
 132 
độ tinh sạch (tỷ lệ A260/A280) đạt 1,8 ~ 2,2. 
Hình 1: Kết quả kiểm tra điện di sau khi tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô đuôi lợn 
con (sử dụng thang ADN 1000bp) 
c. Bảo quản ADN 
Sau khi tách chiết, ADN đƣợc bảo quản trong ống eppendorf 1,5ml. Chất lƣợng ADN 
đƣợc duy trì nhƣ lúc mới tách chiết trong 1 - 2 năm nếu bảo quản ở nhiệt độ -80oC, 6 - 8 
tháng nếu bảo quản ở -20oC hoặc 1 -3 tháng nếu bảo quản ở 4oC. Nếu cần tiến hành 
nhiều đợt thí nghiệm khác nhau. nên chia nhỏ lƣợng ADN vào từng ống để dễ dàng sử 
dụng và tránh rã đông nhiều lần để giảm thiểu nguy cơ làm đứt gãy ADN. 
 133 
PHỤ LỤC 2 
QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH KIỂU GEN RNF4, RBP4 VÀ IGF2 SỬ DỤNG 
PHƢƠNG PHÁP PCR - RFLP 
A. ĐỐI TƢỢNG, MỤC TIÊU VÀ PHẠM VI ÁP DỤNG 
1. ĐỐI TƢỢNG: 
Toàn bộ Acid Deoxyribonucleic (ADN) genome tinh sạch của lợn. 
2. MỤC TIÊU: 
- Nhân đƣợc đoạn các đoạn gen mong muốn bằng phƣơng pháp khuếch đại gen PCR 
(Polymerase Chain Reaction). 
- Xác định đƣợc kiểu gen của lợn bằng phƣơng pháp đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn 
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). 
3. PHẠM VI ÁP DỤNG 
Quy trình này áp dụng cho việc xác định kiểu gen RNF4, RBP4 và IGF2 bằng phƣơng 
pháp PCR - RFLP đối với ADN genome của lợn. 
C. NỘI DUNG QUY TRÌNH 
1. Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm. hóa chất và dụng cụ thí nghiệm: 
1.1. Vật liệu thí nghiệm: 
Mẫu ADN genome của lợn đã đƣợc tinh sạch, đựng trong ống chuyên dụng nồng độ từ 
10 - 30 ng/ml, hệ số A260/A280 từ 1,8 – 2,2. 
1.2. Hóa chất: 
STT Hóa chất Hãng sản xuất 
1 Bộ dNTP gồm 04 lọ dATP, dCTP, dGTP và 
dTTP, 100mM/lọ 
New England Biolabs 
2 Taq ADN Polymerase 2000U New England Biolabs 
3 Dung dịch đệm ThermoPol® Buffer 10X, thành 
phần gồm: 
- 200 mM Tris-HCl 
- 100 mM (NH4)2SO4 
- 100 mM KCl 
- 20 mM MgSO4 
New England Biolabs 
 134 
- 1% Triton® X-100 
- pH 8.8 ở 25°C 
3 Enzyme SacII 2000U New England Biolabs 
4 Enzyme Mspl 5000U New England Biolabs 
5 Enzyme NciI 2000U New England Biolabs 
6 Forward primer IGF2, 100 nM IDT 
7 Reverse primer IGF2, 100 nM IDT 
8 Forward primer RNF4, 100 nM IDT 
9 Reverse primer RNF4, 100 nM IDT 
10 Forward primer RBP4, 100 nM IDT 
11 Reverse primer RBP4, 100 nM IDT 
12 Dung dịch đệm Cut Smart Buffer 10X, thành phần 
gồm: 
- 500 mM Potassium Acetate 
- 200 mM Tris-acetate 
- 100 mM Magnesium Acetate 
- 1 mg/ml BSA 
- pH 7.9 ở 25°C 
New England Biolabs 
13 Thuốc nhuộm ADN Runsafe, 1ml Cleaver Scientific 
14 Gel loading dye tím 6X New England Biolabs 
15 De-ion ultrapure water Sigma-Aldrich 
16 Dung dịch cồn tuyệt đối Merck 
17 Agarose Serva Wide Range molecular biology 
grade dạng bột 
Serva 
18 Thang ADN ladder 100 bp New England Biolabs 
19 Đệm TBE buffer 10M (10X) Molecular biology 
grade 
Serva 
 135 
Trình tự các cặp mồi: 
Gen Mồi xuôi (5’-3’) Mồi ngƣợc (5’-3’) 
RNF4 CGAAATGCCAGGGAAGAG CCATGCAGATCGGACAACT 
RBP4 GAGCAAGATGGAATGGGTT CTCGGTGTCTGTAAAGGTG 
IGF2 CACAGCAGGTGCTCCATCGG GACAGGCTGTCATCCTGTGGG 
1.3. Thiết bị: 
+ Máy luân nhiệt dùng cho phản ứng PCR 
+ Máy vortex mixer 
+ Máy spinning hoặc máy ly tâm có chế độ spinning 
+ Bộ cấp điện và bể điện di. 
+ Tủ thao tác an toàn sinh học 
d. Dụng cụ và vật tƣ khác: 
+ Micropipet và đầu côn 10 μl, 200 μl, 1000 μl 
+ Ống Eppendorf 1,5 ml 
+ Găng tay và khẩu trang phòng thí nghiệm 
2. Các bƣớc xác định kiểu gen: 
Phần 1: Khuếch đại số lƣợng gen bằng phƣơng pháp PCR 
Bước 1: Thiết kế mồi 
- Cặp mồi phải có trình tự bổ sung với hai đầu của đoạn ADN cần khuếch đại. Đoạn 
ADN cần khuếch đại không quá dài, độ dài lý tƣởng là <1000 bp. 
- Trình tự của mồi đƣợc thiết kế sao cho không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi 
ngƣợc, kể cả cấu trúc kẹp tóc. Trình tự bắt cặp của mồi với ADN khuôn phải đảm bảo 
chính xác, hạn chế bắt cặp sai. 
- Tỷ lệ các loại nucleotide trong mồi không quá nhiều G hoặc C (30%< G+C<70% tổng 
số nucleotide tạo nên mồi) để đảm bảo nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngƣợc 
không đƣợc quá cao và quá cách xa nhau. 
Bước 2: Thiết lập chu trình nhiệt 
- Chu trình nhiệt gồm có 3 giai đoạn cơ bản: Tháo xoắn mạch kép AND, bắt cặp ADN 
với đoạn mồi đặc hiệu cho kiểu gen cần xác định và kéo dài mạch. Chu trình nhiệt đƣợc 
thiết lập tùy thuộc vào trình tự cặp mồi, độ dài đoạn gen mong muốn và loại enzyme 
 136 
Taq polimerase đƣợc sử dụng. 
- Cách tính nhiệt độ gắn mồi (Tm): 
 Tm = 4
o
 x (G+C) + 2
o x (A+T) (đơn vị: độ C) 
Nhiệt độ gắn mồi cần đƣợc lựa chọn để tối ƣu với cả mồi xuôi và mồi ngƣợc. 
- Theo đó các chu trình nhiệt đƣợc sử dụng để khuếch đại các gen RNF4, RBP4 và 
IGF2 đƣợc sử dụng nhƣ sau: 
STT Các bƣớc 
Gen RNF4 Gen RBP4 Gen IGF2 
Nhiệt 
độ (oC) 
Thời 
gian 
Nhiệt 
độ 
(
o
C) 
Thời 
gian 
Nhiệt 
độ 
(
o
C) 
Thời 
gian 
1 Biến tính ADN 
ban đầu 
94
o
C 4 phút 95
o
C 3 phút 95
o
C 2 phút 
2 Biến tính ADN 
từng chu kì 
94
o
C 45 giây 95
o
C 30 giây 95
o
C 20 giây 
3 Gắn mồi 53oC 45 giây 56oC 45 giây 55oC 30 giây 
4 Kéo dài mạch 72oC 2 phút 72oC 45 giây 72oC 60 giây 
5 Khuếch đại thêm 
n
35
 bản sao 
Lặp lại từ chu kỳ 2 
đến 4 thêm 35 lần 
Lặp lại từ chu kỳ 2 
đến 4 thêm 31 lần 
Lặp lại từ chu kỳ 2 
đến 4 thêm 35 lần 
6 Ổn định gen đã 
khuếch đại 
72
o
C 10 phút 72
o
C 5 phút 72
o
C 7 phút 
7 Hồi tính ADN 4oC ∞ 4oC ∞ 4oC ∞ 
Bước 3: Pha dung dịch chạy PCR 
Quá trình pha dung dịch chạy PCR đƣợc thao tác trong tủ an toàn sinh học. Các đầu hút 
pipet, ống đựng dung dịch chạy PCR, ống chạy phản ứng PCR đƣợc khử trùng bằng 
nhiệt để đảm bảo loại bỏ hoạt tính của các enzyme nội bào nếu có. Các hóa chất dùng 
cho phản ứng PCR đƣợc giữ lạnh bằng khay đựng chuyên dụng khi thao tác. Các thành 
phần của phản ứng PCR đƣợc pha theo công thức sau: 
 137 
Thành phần Thể tích mỗi phản 
ứng 
Nồng độ mỗi phản ứng 
Dung dịch đệm 10X ThermoPol 
Reaction Buffer 
2,5 µl 1X 
25 mM dNTPs 0,5 µl 0,25 mM 
100 µM Forward Primer 0,5 µl 0,2 nM 
100 µM Reverse Primer 0,5 µl 0,2 nM 
ADN khuôn 0,6 µl 30 ng/µl 
Taq ADN Polymerase 0,25 µl 1 IU/ 25µl PCR 
Nƣớc cất khử ion 20,15 µl 
Tổng thể tích 25 µl 
Bước 4: Các ống đựng phản ứng PCR đƣợc đƣa vào máy luân nhiệt và lựa chọn chu 
trình nhiệt thích hợp. 
Bước 5: Kiểm tra kết quả khuếch đại gen bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 
1,5%. hiệu điện thế 110V, cƣờng độ dòng điện 91mA trong 25 phút. Mỗi giếng điện di 
chứa 10 µl sản phẩm PCR trộn đều với 2 µl loading dye 6X. Một giếng chứa thang 
ADN 100bp. Gel agarose đƣợc trộn đều với 2 µl thuốc nhuộm huỳnh quang Red Safe. 
Kết quả đƣợc đọc dƣới tia UV trong buồng đọc IGenius3. Sản phẩm PCR mong muốn 
để xác định từng gen đƣợc thể hiện nhƣ sau: 
Phần 2: Xác định kiểu gen bằng cách quan sát các trình tự cắt giới hạn 
Bước 1: Chuẩn bị water bath ở nhiệt độ 37oC theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất enzyme 
cắt giới hạn. 
Bước 2: Pha dung dịch ủ cắt với enzyme cắt giới hạn đối với mỗi loại gen. Các enzyme 
cắt giới hạn tƣơng ứng của 3 gen RNF4, RBP4 và IGF2 lần lƣợt là SacII. Msp1 và NciI. 
Công thức: 
Thành phần RNF4 RBP4 IGF2 
Dung dịch đệm Cut Smart buffer 3 µl 3 µl 2 µl 
Enzyme cắt giới hạn 7 IU SacII 0,7 IU MspI 1,5 IU NciI 
Nƣớc cất khử ion 18,3 µl 18,3 µl 18 µl 
Sản phẩm PCR 8 µl 8 µl 8 µl 
Tổng thể tích 30 µl 30 µl 30 µl 
 138 
Bước 3: Các ống đựng phản ứng enzyme cắt giới hạn đƣợc đƣa vào water bath ở nhiệt 
độ 37oC để ủ trong thời gian từ 1 - 2 tiếng. 
Bước 4: Kiểm tra kết quả cắt emzyme bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 2,5%, 
hiệu điện thế 110V, cƣờng độ dòng điện 91mA trong 50 phút đối với gen RNF4 và 60 
phút đối với RBP4 hoặc IGF2. Mỗi giếng điện di chứa 10 µl sản phẩm cắt emzyme trộn 
đều với 2 µl loading dye 6X. Một giếng chứa thang ADN 100bp. Gel agarose đƣợc trộn 
đều với 2 µl thuốc nhuộm huỳnh quang Red Safe. Kết quả đƣợc đọc dƣới tia UV trong 
buồng đọc IGenius3. 
 139 
PHỤ LỤC 3 
MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI