Luận án Nghiên cứu biểu hiện microrna - 21, microrna - 122 huyết tương ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan nhiễm vi rút viêm gan B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y
ĐẶNG CHIỀU DƯƠNG
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN MICRORNA-21, MICRORNA-122 HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN 
NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN B
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
HÀ NỘI - 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
 BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y
ĐẶNG CHIỀU DƯƠNG
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN MICRORNA-21, MICRORNA-122 HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN
NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN B
Chuyên ngành: Nội khoa
Mã số: 9720107
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. GS.TS. NGUYỄN LĨNH TOÀN
2. TS. NGÔ TẤT TRUNG
HÀ NỘI - 2020
<<,,LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong đề tài này là trung thực, không sao chép và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nào khác.
 Tác giả luận án
Đặng Chiều Dương
LỜI CẢM ƠN
	Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám đốc Học Viện Quân Y, Phòng sau đại học, Bộ môn Nội tiêu hóa, đã tạo điều kiện hết sức thuận lợi cho tôi được học tập - nghiên cứu.
	Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám đốc, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Khoa Sinh học phân tử, Khoa Nội tiêu hóa, Khoa A4 Viện Lâm sàng các bệnh nhiệt đới Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành công trình luận án này.
	Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các Thầy trong Bộ môn - Khoa Nội tiêu hóa Học Viện Quân Y, các Thầy trong Hội đồng chấm luận án các cấp đã đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi hoàn thiện luận án.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS. Nguyễn Lĩnh Toàn và TS. Ngô Tất Trung là hai người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu và hoàn thiện luận án.
	Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám đốc Bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp, cùng tất cả các bạn bè đồng nghiệp, người thân, đã tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
	Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những người bệnh, những người tình nguyện hiến máu nhân đạo đã tin tưởng, hợp tác giúp tôi hoàn thành nghiên cứu này.
 Tác giả luận án
Đặng Chiều Dương
MỤC LỤC
Trang
TRANG PHỤ BÌA
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
STT
Phần viết tắt
Phần viết đầy đủ
1.
AASLD
American Association for the Study of Liver Diseases (Hội nghiên cứu bệnh gan Hoa Kỳ)
2.
AFB1
Aflatoxin B1 
3.
AFP
Alpha fetoprotein
4.
AFP-L3
Alpha fetoprotein-L3
5.
ALT
Alanin amino transferase
6.
APASL
Asian Pacific Association for the Study of the liver (Hội nghiên cứu gan Châu Á Thái Bình Dương)
7.
AST
Aspartate amino transferase
8.
AUC
Area under the curve (Diện tích dưới đường cong)
9.
BCLC
Barcelona clinic liver cancer (Viện ung thư lâm sàng gan Barcelona)
10.
BN
Bệnh nhân
11.
BV TƯQĐ 108
Bệnh viện Trung ương Quân đội 108
12.
CHT
Cộng hưởng từ
13.
CLVT
Cắt lớp vi tính
14.
CI
Confidence interval (khoảng tin cậy)
15.
Ct
Cycle threshold (Chu kỳ ngưỡng)
16.
DCP
Des - γ - carboxyprothrombin 
17.
DNA
Deoxyribonucleic acid
18.
ĐTNC
Đối tượng nghiên cứu
19.
EASL
European Association for the Study of the Liver (Hội nghiên cứu Gan Châu Âu)
20.
ELISA
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
STT
Phần viết tắt
Phần viết đầy đủ
21.
HBV
Hepatitis B virus (Vi rút viêm gan B)
22.
HBeAg
Hepatitis B e Antigen (Kháng nguyên e của vi rút viêm gan B
23.
HBsAg
Hepatitis B surface antigen (Kháng nguyên bề mặt của vi rút viêm gan B)
24.
HCV
Hepatitis C virus (Vi rút viêm gan C)
25.
HIV
Human Immunodeficiency Virus
26.
IgM
Immunoglobulin M
27.
mRNA
Messenger RNA (RNA thông tin)
28.
miRNA
MicroRNA
29.
miR-21
MicroRNA-21
30.
miR-122
MicroRNA-122
31.
NKM
Người khỏe mạnh
32.
NSAIDs
Nonsteroidal anti-inflammatory drugs (Thuốc chống viêm không steroid)
33.
PET/CT
Positron emission tomography/Computed Tomography
34.
RNA
Ribonucleic acid
35.
RT-PCR
Reverse transcription polymerase chain reaction
36.
TMC
Tĩnh mạch cửa
37.
TNF
Tumor necrosis factor (Yếu tố hoại tử u)
38.
UTTBG
Ung thư biểu mô tế bào gan
39.
VGBM
Viêm gan B mạn
DANH MỤC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
2.1. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA	47
2.2. Các mồi được sử dụng để tổng hợp và định lượng miRNA	48
2.3. Thành phần phản ứng Realtime PCR	50
2.4. Mức độ viêm gan mạn	52
2.5. Phân chia giai đoạn bệnh theo BCLC	53
2.6. Đánh giá chức năng gan theo Child - Pugh	53
3.1. Đặc điểm tuổi, giới	58
3.2. Một số triệu chứng thực thể của bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan	60
3.3. Xét nghiệm huyết học nhóm ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	61
3.4. Xét nghiệm sinh hóa, miễn dịch ở nhóm ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	61
3.5. Liên quan giữa AFP huyết thanh với đặc điểm khối u gan và giai đoạn bệnh theo phân loại BCLC	62
3.6. Phân loại mức độ viêm ở nhóm viêm gan B mạn theo điểm Knodell HAI	63
3.7. Phân loại Child - Pugh ở nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan	63
3.8. Số lượng khối u gan	64
3.9. Kích thước khối u gan	64
3.10. Huyết khối tĩnh mạch cửa	65
3.11. Độ biệt hóa tế bào khối u gan	65
3.12. Phân loại giai đoạn bệnh ung thư biểu mô tế bào gan theo BCLC	66
 Bảng
Tên bảng
Trang
3.13. Biểu hiện miR-21 huyết tương bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan, viêm gan B mạn và người khỏe mạnh	67
3.14. Biểu hiện miR-122 huyết tương bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan, viêm gan B mạn và người khỏe mạnh	67
3.15. Độ nhạy, độ đặc hiệu của miR-21, miR-122 trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	71
3.16. Diện tích dưới đường cong khi phối hợp miR-21, miR-122 trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	72
3.17. So sánh diện tích dưới đường cong của AFP, miR-21, miR-122 trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	73
3.18. Diện tích dưới đường cong khi phối hợp miR-21 với AFP trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	74
3.19. Diện tích dưới đường cong khi phối hợp miR-122 với AFP trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	75
3.20. Diện tích dưới đường cong khi phối hợp miR-21, miR-122 với AFP trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	76
3.21. Độ nhạy, độ đặc hiệu của miR-21, miR-122 trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan và người khỏe mạnh	78
3.22. Diện tích dưới đường cong của miR-21 phối hợp với miR-122 trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan và người khỏe mạnh	79
3.23. Độ nhạy, độ đặc hiệu của miR-21, miR-122 trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan có AFP ≤ 20ng/ml và viêm gan B mạn	81
3.24. Diện tích dưới đường cong khi phối hợp miR-21, miR-122 trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan có AFP ≤ 20ng/ml và viêm gan B mạn	82
 Bảng
Tên bảng
Trang
3.25. Độ nhạy, độ đặc hiệu của miR-21, miR-122 trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan có AFP ≤ 20ng/ml và người khỏe mạnh	84
3.26. Diện tích dưới đường cong khi phối hợp miR-21, miR-122 trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan có AFP ≤ 20ng/ml và người khỏe mạnh	85
3.27. Diện tích dưới đường cong của AFP, miR-21, miR-122 trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan giai đoạn sớm (BCLC: A) và viêm gan B mạn	87
3.28. Diện tích dưới đường cong của miR-21, miR-122 trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan giai đoạn sớm (BCLC: A) và người khỏe mạnh	89
3.29. Tương quan giữa miR-21, miR-122 với tuổi	90
3.30. Liên quan giữa miR-21, miR-122 với giới	90
3.31. Liên quan giữa miR-21 với một số triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan	91
3.32. Liên quan giữa miR-122 với một số triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan	91
3.33. Tương quan giữa miR-21 với một số chỉ số xét nghiệm ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan	92
3.34. Tương quan giữa miR-122 với một số chỉ số xét nghiệm ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan	93
3.35. Liên quan giữa miR-21 với chức năng gan theo phân loại Child-Pugh, đặc điểm khối u gan và giai đoạn bệnh theo BCLC	98
3.36. Liên quan giữa miR-122 với chức năng gan theo phân loại Child-Pugh, đặc điểm khối u gan và giai đoạn bệnh theo BCLC	102
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ
Tên biểu đồ
Trang
3.1. Phân bố tuổi của nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan	59
3.2. Một số triệu chứng cơ năng của bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan	59
3.3. AFP huyết thanh của nhóm ung thư biểu mô tế bào gan	62
3.4.a. Biểu hiện miR-21 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	70
3.4.b. Biểu hiện miR-122 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	70
3.5. Đường cong ROC của miR-21, miR-122 ở nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	71
3.6. Đường cong ROC khi phối hợp miR-21, miR-122 ở nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	72
3.7. Đường cong ROC của AFP, miR-21, miR-122 ở nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	73
3.8. Đường cong ROC khi phối hợp miR-21 với AFP ở nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	74
3.9. Đường cong ROC khi phối hợp miR-122 với AFP ở nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	75
3.10. Đường cong ROC khi phối hợp miR-21, miR-122, AFP ở nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan và viêm gan B mạn	76
3.11.a. Biểu hiện miR-21 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan và người khỏe mạnh	77
3.11.b. Biểu hiện miR-122 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan và người khỏe mạnh	77
Biểu đồ
Tên biểu đồ
Trang
3.12. Đường cong ROC của miR-21, miR-122 ở nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan và người khỏe mạnh	78
3.13. Đường cong ROC khi phối hợp miR-21, miR-122 ở nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan và người khỏe mạnh	79
3.14.a. Biểu hiện miR-21 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có AFP ≤ 20ng/ml và bệnh nhân viêm gan B mạn	80
3.14.b. Biểu hiện miR-122 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có AFP ≤ 20ng/ml và bệnh nhân viêm gan B mạn	80
3.15. Đường cong ROC của miR-21, miR-122 ở nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có AFP ≤ 20ng/ml và viêm gan B mạn	81
3.16. Đường cong ROC của miR-21, miR-122 ở nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có AFP ≤ 20ng/ml và viêm gan B mạn	82
3.17.a. Biểu hiện miR-21 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có AFP ≤ 20ng/ml và người khỏe mạnh	83
3.17.b. Biểu hiện miR-122 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có AFP ≤ 20ng/ml và người khỏe mạnh	83
3.18. Đường cong ROC của miR-21, miR-122 ở nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có AFP ≤ 20ng/ml và người khỏe mạnh	84
3.19. Đường cong ROC khi phối hợp miR-21, miR-122 ở nhóm ung thư biểu mô tế bào gan có AFP ≤ 20ng/ml và người khỏe mạnh	85
3.20.a. Biểu hiện miR-21 ở nhóm ung thư biểu mô tế bào gan giai đoạn sớm (BCLC: A) và viêm gan B mạn	86
3.20.b. Biểu hiện miR-122 ở nhóm ung thư biểu mô tế bào gan giai đoạn sớm (BCLC: A) và viêm gan B mạn	86
Biểu đồ
Tên biểu đồ
Trang
3.21. Đường cong ROC của AFP, miR-21, miR-122 trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan giai đoạn sớm (BCLC: A) và viêm gan B mạn	87
3.22.a. Biểu hiện miR-21 ở nhóm ung thư biểu mô tế bào gan giai đoạn sớm (BCLC: A) và người khỏe mạnh	88
3.22.b. Biểu hiện miR-122 ở nhóm ung thư biểu mô tế bào gan giai đoạn sớm (BCLC: A) và người khỏe mạnh	88
3.23. Đường cong ROC của miR-21, miR-122 trong chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan giai đoạn sớm (BCLC: A) và người khỏe mạnh	89
3.24.a. Tương quan giữa miR-21 với tải lượng vi rút viêm gan B ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan	94
3.24.b. Tương quan giữa miR-122 với tải lượng vi rút viêm gan B ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan	94
3.25. Biểu hiện miR-21 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan theo số lượng khối u	95
3.26. Biểu hiện miR-21 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan theo kích thước khối u	95
3.27. Biểu hiện miR-21 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có và không có huyết khối tĩnh mạch cửa	96
3.28. Biểu hiện miR-21 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan theo mức độ biệt hóa tế bào trên mô bệnh học	96
3.29. Biểu hiện miR-21 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan theo phân loại BCLC	97
3.30. Biểu hiện miR-122 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan theo số lượng khối u	99
Biểu đồ
Tên biểu đồ
Trang
3.31. Biểu hiện miR-122 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan theo kích thước khối u	99
3.32. Biểu hiện miR-122 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có và không có huyết khối tĩnh mạch cửa	100
3.33. Biểu hiện miR-122 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan theo mức độ biệt hóa tế bào trên mô bệnh học	100
3.34. Biểu hiện miR-122 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan theo phân loại BCLC	101
3.35. Tương quan giữa biểu hiện của miR-21 với miR-122 ở nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan	101
DANH MỤC HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1.1. Mối liên quan giữa tải lượng vi rút viêm gan B với ung thư biểu mô tế bào gan	7
1.2. Cơ chế bệnh sinh ung thư biểu mô tế bào gan	10
1.3. Quá trình sinh tổng hợp và chức năng miRNA	26
1.4. Nguyên lý của xét nghiệm stem-loop RT PCR	30
2.1. Máy PCR 9700 hãng Applied Biosystems	40
2.2. Máy Realtime PCR 7500 hãng Applied Biosystems	40
3.1. Kết quả Realtime PCR bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan	68
3.2. Kết quả Realtime PCR bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan	68
3.3. Kết quả Realtime PCR bệnh nhân viêm gan B mạn	69
3.4. Kết quả Realtime PCR của người khỏe mạnh	69
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư biểu mô tế bào gan (gọi tắt là ung thư tế bào gan - UTTBG) đại diện cho hơn 90% ung thư gan nguyên phát, là một vấn đề lớn về sức khỏe toàn cầu. Ung thư gan có tỷ lệ mắc đứng hàng thứ 6, tỷ lệ tử vong cao thứ 4 trong các loại ung thư phổ biến trên thế giới [1]. Theo thống kê của Globocan 2018, UTTBG là loại ung thư đứng hàng đầu về tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu trong nước cho thấy trên 80% bệnh nhân UTTBG có liên quan đến tình trạng nhiễm vi rút viêm gan B (HBV) [2], [3]. Phần lớn bệnh nhân UTTBG khi được phát hiện đã ở giai đoạn muộn, bệnh nhân không còn cơ hội điều trị phẫu thuật hay áp dụng các phương pháp trị liệu tích cực khác. Việc xác định được UTTBG ở giai đoạn sớm, khi khối u còn nhỏ có thể tiến hành phẫu thuật cắt bỏ khối u gan là một trong những sự lựa chọn hàng đầu đem lại hiệu quả tốt nhất [4]. Một chiến lược sàng lọc tốt sẽ giúp chẩn đoán sớm UTTBG, trong đó thường khuyến cáo phối hợp siêu âm bụng với Apha fetoprotein (AFP). Bên cạnh AFP cổ điển, một số dấu ấn sinh học khác cũng được nghiên cứu áp dụng như Alpha fetoprotein-L3 (AFP-L3), Des - γ - carboxyprothrombin (DCP) tuy nhiên độ nhạy độ đặc hiệu của các dấu ấn này trong chẩn đoán, nhất là chẩn đoán sớm UTTBG vẫn còn hạn chế. Các nghiên cứu cho thấy 40% bệnh nhân UTTBG có AFP trong giới hạn bình thường, trên 23% UTTBG hoàn toàn không biến đổi về cả 3 dấu ấn AFP, AFP-L3 và DCP [5]. Do đó, việc tìm kiếm thêm các dấu ấn sinh học mới có giá trị trong sàng lọc và chẩn đoán UTTBG là hết sức cần thiết.
MicroRNA (miRNA) là RNA nội sinh kích thước nhỏ, không mã hóa protein. MiRNA có vai trò then chốt trong điều hòa biểu hiện gen giai đoạn sau phiên mã, sửa đ ... a T. (2013). Roles of microRNAs in the hepatitis B virus infection and related diseases. Viruses, 5(11): 2690-703.
48.	Mahmoudian-Sani M.R., Asgharzade S., Alghasi A., et al. (2019). MicroRNA-122 in patients with hepatitis B and hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma. J Gastrointest Oncol, 10(4): 789-796.
49.	Zhang G., Wang Q., Xu R. (2010). Therapeutics Based on microRNA: A New Approach for Liver Cancer. Curr Genomics, 11(5): 311-25.
50.	Hayes C.N., Akamatsu S., Tsuge M., et al. (2012). Hepatitis B virus-specific miRNAs and Argonaute2 play a role in the viral life cycle. PLoS One, 7(10): e47490.
51.	Shwetha S., Gouthamchandra K., Chandra M., et al. (2013). Circulating miRNA profile in HCV infected serum: novel insight into pathogenesis. Sci Rep, 3: 1-7.
52.	Novellino L., Rossi R.L., Bonino F., et al. (2012). Circulating hepatitis B surface antigen particles carry hepatocellular microRNAs. PLoS One, 7(3): e31952.
53.	Liu A.M., Yao T.J., Wang W., et al. (2012). Circulating miR-15b and miR-130b in serum as potential markers for detecting hepatocellular carcinoma: a retrospective cohort study. BMJ Open, 2(2): e000825.
54.	Cortez M.A., Bueso-Ramos C., Ferdin J., et al. (2011). MicroRNAs in body fluids--the mix of hormones and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol, 8(8): 467-77.
55.	Lawrie C.H., Gal S., Dunlop H.M., et al. (2008). Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma. Br J Haematol, 141(5): 672-5.
56.	Varkonyi-Gasic E., Wu R., Wood M., et al. (2007). Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods, 3: 12.
57.	Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., et al. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem, 55(4): 611-22.
58.	Peltier H.J., Latham G.J. (2008). Normalization of microRNA expression levels in quantitative RT-PCR assays: identification of suitable reference RNA targets in normal and cancerous human solid tissues. RNA, 14(5): 844-52.
59.	Xu X., Tao Y., Shan L., et al. (2018). The Role of MicroRNAs in Hepatocellular Carcinoma. J Cancer, 9(19): 3557-3569.
60.	Zhou L., Yang Z.X., Song W.J., et al. (2013). MicroRNA-21 regulates the migration and invasion of a stem-like population in hepatocellular carcinoma. Int J Oncol, 43(2): 661-9.
61.	Karakatsanis A., Papaconstantinou I., Gazouli M., et al. (2013). Expression of microRNAs, miR-21, miR-31, miR-122, miR-145, miR-146a, miR-200c, miR-221, miR-222, and miR-223 in patients with hepatocellular carcinoma or intrahepatic cholangiocarcinoma and its prognostic significance. Mol Carcinog, 52(4): 297-303.
62.	Lee Y., Ahn C., Han J., et al. (2003). The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature, 425(6956): 415-9.
63.	Zeng Y., Yi R., Cullen B.R. (2005). Recognition and cleavage of primary microRNA precursors by the nuclear processing enzyme Drosha. EMBO J, 24(1): 138-48.
64.	Bao L., Yan Y., Xu C., et al. (2013). MicroRNA-21 suppresses PTEN and hSulf-1 expression and promotes hepatocellular carcinoma progression through AKT/ERK pathways. Cancer Lett, 337(2): 226-36.
65.	Zhu Q., Wang Z., Hu Y., et al. (2012). miR-21 promotes migration and invasion by the miR-21-PDCD4-AP-1 feedback loop in human hepatocellular carcinoma. Oncol Rep, 27(5): 1660-8.
66.	Yoon J.S., Kim G., Lee Y.R., et al. (2018). Clinical significance of microRNA-21 expression in disease progression of patients with hepatocellular carcinoma. Biomark Med, 12(10): 1105-1114.
67.	Xu G., Zhang Y., Wei J., et al. (2013). MicroRNA-21 promotes hepatocellular carcinoma HepG2 cell proliferation through repression of mitogen-activated protein kinase-kinase 3. BMC Cancer, 13: 1-9.
68.	Suehiro T., Miyaaki H., Kanda Y., et al. (2018). Serum exosomal microRNA-122 and microRNA-21 as predictive biomarkers in transarterial chemoembolization-treated hepatocellular carcinoma patients. Oncol Lett, 16(3): 3267-3273.
69.	Tomimaru Y., Eguchi H., Nagano H., et al. (2010). MicroRNA-21 induces resistance to the anti-tumour effect of interferon-alpha/5-fluorouracil in hepatocellular carcinoma cells. Br J Cancer, 103(10): 1617-26.
70.	Lagos-Quintana M., Rauhut R., Yalcin A., et al. (2002). Identification of tissue-specific microRNAs from mouse. Curr Biol, 12(9): 735-9.
71.	Wienholds E., Kloosterman W.P., Miska E., et al. (2005). MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science, 309(5732): 310-1.
72.	Fan C.G., Wang C.M., Tian C., et al. (2011). miR-122 inhibits viral replication and cell proliferation in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma and targets NDRG3. Oncol Rep, 26(5): 1281-6.
73.	Bai S., Nasser M.W., Wang B., et al. (2009). MicroRNA-122 inhibits tumorigenic properties of hepatocellular carcinoma cells and sensitizes these cells to sorafenib. J Biol Chem, 284(46): 32015-27.
74.	Fornari F., Gramantieri L., Giovannini C., et al. (2009). MiR-122/cyclin G1 interaction modulates p53 activity and affects doxorubicin sensitivity of human hepatocarcinoma cells. Cancer Res, 69(14): 5761-7.
75.	Lucanic M., Graham J., Scott G., et al. (2013). Age-related micro-RNA abundance in individual C. elegans. Aging (Albany NY), 5(6): 394-411.
76.	Rieger J.K., Klein K., Winter S., et al. (2013). Expression variability of absorption, distribution, metabolism, excretion-related microRNAs in human liver: influence of nongenetic factors and association with gene expression. Drug Metab Dispos, 41(10): 1752-62.
77.	Bihrer V., Friedrich-Rust M., Kronenberger B., et al. (2011). Serum miR-122 as a biomarker of necroinflammation in patients with chronic hepatitis C virus infection. Am J Gastroenterol, 106(9): 1663-9.
78.	Wang X., Zhang J., Zhou L., et al. (2015). Significance of serum microRNA-21 in diagnosis of hepatocellular carcinoma (HCC): clinical analyses of patients and an HCC rat model. Int J Clin Exp Pathol, 8(2): 1466-78.
79.	Qiao D.D., Yang J., Lei X.F., et al. (2017). Expression of microRNA-122 and microRNA-22 in HBV-related liver cancer and the correlation with clinical features. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 21(4): 742-747.
80.	Meng F., Henson R., Wehbe-Janek H., et al. (2007). MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer. Gastroenterology, 133(2): 647-58.
81.	Huang J.T., Liu S.M., Ma H., et al. (2016). Systematic Review and Meta-Analysis: Circulating miRNAs for Diagnosis of Hepatocellular Carcinoma. J Cell Physiol, 231(2): 328-35.
82.	Zhou J., Yu L., Gao X., et al. (2011). Plasma microRNA panel to diagnose hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma. J Clin Oncol, 29(36): 4781-8.
83.	Bharali D., Banerjee B.D., Bharadwaj M., et al. (2019). Expression Analysis of MicroRNA-21 and MicroRNA-122 in Hepatocellular Carcinoma. J Clin Exp Hepatol, 9(3): 294-301.
84.	Bộ Y tế (2014). Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh viêm gan vi rút B, Ban hành kèm theo Quyết định số: 5448/QĐ-BYT ngày 30 tháng 12 năm 2014 của Bộ trưởng Bộ Y tế.
85.	Bộ Y tế (2017). Siêu âm can thiệp - Sinh thiết nhu mô gan tổn thương u gan bằng súng Promag. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật nội khoa, chuyên ngành tiêu hóa, Nhà xuất bản Y học, 265-266.
86.	Bộ Y tế (2017). Siêu âm can thiệp - Chọc hút tế bào khối U gan, tụy, khối u ổ bụng bằng kim nhỏ. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật nội khoa, chuyên ngành tiêu hóa, Nhà xuất bản Y học, 242-244.
87.	Lardizabal M.N., Nocito A.L., Daniele S.M., et al. (2012). Reference genes for real-time PCR quantification of microRNAs and messenger RNAs in rat models of hepatotoxicity. PLoS One, 7(5): e36323.
88.	Matouskova P., Bartikova H., Bousova I., et al. (2014). Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One, 9(1): e86033.
89.	Livak K.J., Schmittgen T.D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 25(4): 402-8.
90.	Zhu Z. (2016). Milan criteria and its expansions in liver transplantation for hepatocellular carcinoma. Hepatobiliary Surg Nutr, 5(6): 498-502.
91.	Okafor O., Ojo S. (2004). A comparative analysis of six current histological classification schemes and scoring systems used in chronic hepatitis reporting. Rev Esp Patol, 37(3): 269-277.
92.	Nguyễn Thị Vân Hồng (2015). Các bảng điểm ứng dụng trong thực hành tiêu hóa, Nhà xuất bản Y học.
93.	Nguyễn Tiến Thịnh (2011). Nghiên cứu hiệu quả điều trị ung thư biểu mô tế bào gan bằng phương pháp tắc mạch hóa dầu đơn thuần và tắc mạch hóa dầu kết hợp với đốt nhiệt sóng cao tần, Luận án Tiến sĩ Y học, Viện Nghiên cứu khoa học Y Dược lâm sàng 108.
94.	Thái Doãn Kỳ (2015). Nghiên cứu kết quả điều trị ung thư biểu mô tế bào gan bằng phương pháp tắc mạch hóa chất sử dụng hạt vi cầu DC BEADS, Luận án Tiến sĩ Y học, Viện Nghiên cứu khoa học Y Dược lâm sàng 108.
95.	El-Serag H.B., Mason A.C. (1999). Rising incidence of hepatocellular carcinoma in the United States. N Engl J Med, 340(10): 745-50.
96.	Webb G.J., Wright K.V., Harrod E.C., et al. (2015). Surveillance for hepatocellular carcinoma in a mixed-aetiology UK cohort with cirrhosis: does alpha-fetoprotein still have a role? Clin Med (Lond), 15(2): 139-44.
97.	Tanaka H., Imai Y., Hiramatsu N., et al. (2008). Declining incidence of hepatocellular carcinoma in Osaka, Japan, from 1990 to 2003. Ann Intern Med, 148(11): 820-6.
98.	Lu S.N., Su W.W., Yang S.S., et al. (2006). Secular trends and geographic variations of hepatitis B virus and hepatitis C virus-associated hepatocellular carcinoma in Taiwan. Int J Cancer, 119(8): 1946-52.
99.	Trần Hà Hiếu (2012). Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, độ biệt hóa tế bào u và đột biến gene HBx ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan nhiễm virus viêm gan B, Luận án Tiến sĩ Y học, Viện Nghiên cứu khoa học Y Dược lâm sàng 108.
100.	Đào Việt Hằng (2016). Đánh giá kết quả điều trị ung thư biểu mô tế bào gan bằng đốt nhiệt sóng cao tần với các loại kim lựa chọn theo kích thước khối u, Luận án Tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội.
101.	Yu M.W., Chen C.J. (1993). Elevated serum testosterone levels and risk of hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 53(4): 790-4.
102.	Yu M.W., Yang Y.C., Yang S.Y., et al. (2001). Hormonal markers and hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma risk: a nested case-control study among men. J Natl Cancer Inst, 93(21): 1644-51.
103.	Liu C., Xiao G.Q., Yan L.N., et al. (2013). Value of alpha-fetoprotein in association with clinicopathological features of hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol, 19(11): 1811-9.
104.	Abbasi A., Bhutto A.R., Butt N., et al. (2012). Corelation of serum alpha fetoprotein and tumor size in hepatocellular carcinoma. J Pak Med Assoc, 62(1): 33-6.
105.	Kim S.S., Nam J.S., Cho H.J., et al. (2017). Plasma micoRNA-122 as a predictive marker for treatment response following transarterial chemoembolization in patients with hepatocellular carcinoma. J Gastroenterol Hepatol, 32(1): 199-207.
106.	Guo X., Xiaohui L., Xing L., et al. (2017). Circulating miR-21 serves as a serum biomarker for hepatocellular carcinoma and correlated with distant metastasis. Oncotarget, 8(27): 44050-8.
107.	Lê Văn Trường (2006). Nghiên cứu điều trị ung thư biểu mô tế bào gan kích thước trên 5cm bằng phương pháp tắc mạch hoá dầu chọn lọc, Luận án Tiến sĩ Y học, Học viện Quân Y.
108.	Kojiro M. (2004). 'Nodule-in-nodule' appearance in hepatocellular carcinoma: its significance as a morphologic marker of dedifferentiation. Intervirology, 47(3-5): 179-83.
109.	Alvite-Canosa M., Pita-Fernandez S., Quintela-Fandino J., et al. (2010). Prognostic and developmental factors in patients receiving liver transplant due to hepatocellular carcinoma: one center's experience in the north of Spain. Transplant Proc, 42(10): 4578-81.
110.	Mitchell P.S., Parkin R.K., Kroh E.M., et al. (2008). Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A, 105(30): 10513-8.
111.	Kutay H., Bai S., Datta J., et al. (2006). Downregulation of miR-122 in the rodent and human hepatocellular carcinomas. J Cell Biochem, 99(3): 671-8.
112.	Coulouarn C., Factor V.M., Andersen J.B., et al. (2009). Loss of miR-122 expression in liver cancer correlates with suppression of the hepatic phenotype and gain of metastatic properties. Oncogene, 28(40): 3526-36.
113.	Qi P., Cheng S.Q., Wang H., et al. (2011). Serum microRNAs as biomarkers for hepatocellular carcinoma in Chinese patients with chronic hepatitis B virus infection. PLoS One, 6(12): 1-8.
114.	Xu J., Wu C., Che X., et al. (2011). Circulating microRNAs, miR-21, miR-122, and miR-223, in patients with hepatocellular carcinoma or chronic hepatitis. Mol Carcinog, 50(2): 136-42.
115.	Koberle V., Kronenberger B., Pleli T., et al. (2013). Serum microRNA-1 and microRNA-122 are prognostic markers in patients with hepatocellular carcinoma. Eur J Cancer, 49(16): 3442-9.
116.	Luo J., Chen M., Huang H., et al. (2013). Circulating microRNA-122a as a diagnostic marker for hepatocellular carcinoma. Onco Targets Ther, 6: 577-83.
117.	Chen C.J., Yang H.I., Iloeje U.H., et al. (2009). Hepatitis B virus DNA levels and outcomes in chronic hepatitis B. Hepatology, 49(5 Suppl): 72-84.
118.	Waidmann O., Bihrer V., Pleli T., et al. (2012). Serum microRNA-122 levels in different groups of patients with chronic hepatitis B virus infection. J Viral Hepat, 19(2): 58-65.
119.	Cho H.J., Kim J.K., Nam J.S., et al. (2015). High circulating microRNA-122 expression is a poor prognostic marker in patients with hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma who undergo radiofrequency ablation. Clin Biochem, 48(16-17): 1073-8.
120.	Ha S.Y., Yu J.I., Choi C., et al. (2019). Prognostic significance of miR-122 expression after curative resection in patients with hepatocellular carcinoma. Sci Rep, 9(1): 14738.
PHỤ LỤC
Số hồ sơ:  Phiếu theo dõi số: ............
SỐ BỆNH ÁN: .. Mã lưu huyết tương: ........
BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU
Họ và tên: 
Năm sinh: 
Giới:
Địa chỉ:
Điện thoại NR:
Điện thoại DĐ:
Ngày vào viện:
Ngày ra viện: 
Chẩn đoán:
 1. Tiền sử
Bản thân: .... Gia đình: .
 2. Triệu chứng lâm sàng
Triệu chứng
Có
Không
Triệu chứng
Có
Không
Mệt mỏi
Bàn tay son
Chán ăn, ăn kém
Sao mạch
Gầy sút cân (kg/tháng)
Xuất huyết dưới da
Đau, tức bụng - HSP
THBH
Sốt
Cổ trướng (ít, nhiều)
Vàng da, củng mạc
Gan to
Phù
Lách to (độ 1, 2, 3)
3. Cận lâm sàng
3.1. Xét nghiệm huyết học, sinh hóa
BC
HC
TC
PT%
GOT (AST)
GPT (ALT)
BilTP
BilTT
Pro
Albu
3.2. Xét nghiệm miễn dịch, sinh học phân tử
AFP
HBsAg
Anti-HCV
HIV
HBV-DNA
miR-21
miR-122
3.3. Siêu âm bụng
Số lượng U
Huyết khối TMC
Kích thước U (cm)
Hạch ổ bụng
Giãn TMC
Dịch ổ bụng
3.4. Chụp cắt lớp vi tính bụng
Số lượng U
Huyết khối TMC
Kích thước U (cm)
Hạch ổ bụng
Giãn TMC
Dịch ổ bụng
3.5. Xét nghiệm giải phẫu bệnh
 Người lập phiếu
 NCS. Đặng Chiều Dương