Luận án Nghiên cứu chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang naja atra bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG 
HỌC VIỆN QUÂN Y 
NGUYỄN NGỌC TUẤN 
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KÍT PHÁT HIỆN NHANH 
NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA BẰNG KỸ THUẬT 
SẮC KÝ MIỄN DỊCH 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC 
NĂM 2017
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG 
HỌC VIỆN QUÂN Y 
NGUYỄN NGỌC TUẤN 
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KÍT PHÁT HIỆN NHANH 
NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA BẰNG KỸ THUẬT 
SẮC KÝ MIỄN DỊCH 
Chuyên ngành: Dị ứng và Miễn dịch 
Mã số: 62.72.01.09 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC 
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN ĐẶNG DŨNG 
 TS. TRỊNH THANH HÙNG 
NĂM 2017 
LỜI CAM ĐOAN 
 Tôi xin cam đoan luận án này là của riêng tôi và có một phần số liệu 
trong đề tài (Nghị định thư) có tên: “Hợp tác nghiên cứu chế tạo test chẩn 
đoán rắn hổ mang cắn”. Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập 
thể mà tôi là một thành viên chính. Tôi đã được chủ nhiệm đề tài và toàn bộ 
các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng số liệu đề tài 
này vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ. Các số liệu, kết quả nêu 
trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công 
trình nào khác. 
 Tác giả luận án 
 Nguyễn Ngọc Tuấn 
 MỤC LỤC 
Trang phụ bìa 
Lời cam đoan 
Mục lục 
Danh mục các chữ viết tắt 
Danh mục các bảng 
Danh mục các biểu đồ 
Danh mục các sơ đồ 
Danh mục các hình 
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1 
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3 
 1.1. Tai nạn rắn cắn và chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt nam ................................ 3 
 1.1.1. Tai nạn rắn cắn ở Việt nam .................................................................... 3 
 1.1.2. Chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam ....................................................... 5 
 1.2. Rắn hổ mang Naja atra ................................................................................. 6 
 1.2.1. Đặc điểm sinh học và nọc độc ............................................................... 6 
 1.2.2. Tai nạn do rắn hổ mang Naja atra cắn ................................................... 9 
 1.3. Một số kỹ thuật miễn dịch phát hiện nọc rắn và kháng thể kháng 
nọc rắn ................................................................................................................. 12 
 1.3.1. Điện di miễn dịch ................................................................................. 13 
 1.3.2. Ngưng kết hồng cầu ............................................................................. 13 
 1.3.3. Ngưng kết miễn dịch ............................................................................ 14 
 1.3.4. Miễn dịch phóng xạ .............................................................................. 15 
 1.3.5. Miễn dịch huỳnh quang ........................................................................ 16 
 1.3.6. Miễn dịch quang ................................................................................... 16 
 1.3.7. Miễn dịch gắn enzym ........................................................................... 17 
 1.3.8. Kít phát hiện nhanh .............................................................................. 18 
 1.4. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch .......................................................................... 19 
 1.4.1. Lịch sử hình thành và phát triển ........................................................... 19 
 1.4.2. Nguyên lý hoạt động ............................................................................ 21 
 1.4.3. Chế tạo và tối ưu que thử .................................................................... 23 
 1.5. Kháng thể kháng nọc rắn........................................................................... 26 
 1.5.1. Công nghệ chế tạo kháng thể IgG kháng nọc rắn ................................ 26 
 1.5.2. Công nghệ chế tạo kháng thể IgY kháng nọc rắn ................................ 30 
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 33 
 2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ............................................................... 33 
 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 33 
 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 34 
 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 35 
 2.2.1. Thu thập và kiểm định chất lượng nọc rắn .......................................... 36 
 2.2.2. Chuẩn bị kháng nguyên và gây miễn dịch ........................................... 37 
 2.2.3. Phát hiện kháng thể kháng nọc rắn trong huyết thanh ......................... 39 
 2.2.4. Tách chiết và tinh sạch kháng thể ........................................................ 40 
 2.2.5. Kiểm tra độ đặc hiệu của các kháng thể với các kháng nguyên 
nọc rắn ................................................................................................................. 45 
 2.2.6. Hấp phụ miễn dịch ............................................................................... 45 
 2.2.7. Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể .................................................... 46 
 2.2.8. Tối ưu hóa phản ứng cộng hợp ............................................................ 49 
 2.2.9. Tối ưu hóa bộ xét nghiệm nhanh ......................................................... 50 
 2.2.10. Xác định thông số kỹ thuật của xét nghiệm ....................................... 55 
 2.2.11. Thử nghiệm bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn trên các mẫu 
bệnh phẩm ........................................................................................................... 55 
 2.3. Xử lý số liệu ............................................................................................... 56 
 2.4. Đạo đức nghiên cứu ................................................................................... 56 
 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 57 
 3.1. Kết quả nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra 
từ thỏ và gà .......................................................................................................... 57 
 3.1.1. Kết quả kiểm định chất lượng nọc rắn hổ mang Naja atra .................. 57 
 3.1.2. Biến động hiệu giá kháng thể trong quá trình gây miễn dịch .............. 58 
 3.1.3. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của các huyết thanh kháng 
nọc rắn ................................................................................................................. 60 
 3.1.4. Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn với kháng nguyên nọc 
rắn của các loài khác ........................................................................................... 61 
 3.2. Kết quả tách chiết và tinh sạch kháng thể IgG và IgY từ huyết thanh và 
trứng gà ................................................................................................................ 62 
 3.2.1. Sắc ký đồ tinh sạch kháng thể .............................................................. 62 
 3.2.2. Kết quả điện di kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh sạch ...... 63 
 3.2.3. Hoạt tính kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh sạch ................ 64 
 3.3. Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của kháng thể với các kháng 
nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra, hổ đất và hổ chúa ....................................... 65 
 3.3.1. Kiểm tra phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của các kháng thể 
bằng kỹ thuật Western blot ................................................................................. 65 
 3.3.2. Hoạt tính và phản ứng đặc hiệu của các kháng thể với kháng nguyên 
nọc rắn hổ mang Naja atra sau hấp phụ miễn dịch ............................................. 66 
 3.4. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể ................................................................. 68 
 3.4.1. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp ELISA ................ 68 
 3.4.2. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp nhúng 
trực tiếp ................................................................................................................ 69 
 3.5. Kết quả cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng ......................................... 70 
 3.5.1. Tối ưu hóa nồng độ kháng thể và pH dung dịch hạt nano vàng .......... 70 
 3.5.2. Kết quả cộng hợp và hoạt tính của kháng thể sau khi cộng hợp với 
hạt nano vàng ...................................................................................................... 71 
 3.6. Kết quả tối ưu xét nghiệm phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra .... 72 
 3.6.1. Hệ đệm ................................................................................................. 72 
 3.6.2. Nồng độ kháng thể ở vạch phát hiện .................................................... 73 
 3.6.3. Nồng độ kháng thể ở vạch chứng ........................................................ 74 
 3.6.4. Nồng độ kháng thể cộng hợp ............................................................... 74 
 3.7. Kết quả xác định các thông số kỹ thuật của xét nghiệm phát hiện 
nhanh ................................................................................................................... 75 
 3.7.1. Giới hạn phát hiện ................................................................................ 75 
 3.7.2. Phản ứng chéo ...................................................................................... 76 
 3.7.3. Độ ổn định của bộ kít xét nghiệm phát hiện nhanh ............................. 76 
 3.7.4. Bộ kít xét nghiệm phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang .......................... 77 
 3.8. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang của bộ kít trên 
lâm sàng ............................................................................................................... 77 
 3.8.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu ........................................................... 77 
 3.8.2. Kết quả định lượng và phát hiện nọc rắn hổ mang trên lâm sàng ....... 78 
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ................................................................................. 85 
 4.1. Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra từ 
thỏ và gà .............................................................................................................. 85 
 4.1.1. Kiểm định chất lượng nọc rắn hổ mang Naja atra ............................... 85 
 4.1.2. Lựa chọn loài gây miễn dịch ................................................................ 86 
 4.1.3. Tạo kháng nguyên và quy trình gây miễn dịch .................................... 87 
 4.1.4. Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của kháng thể với các kháng 
nguyên nọc rắn .................................................................................................... 88 
 4.1.5. Tách chiết và tinh sạch kháng thể IgG và IgY từ huyết thanh và 
trứng gà ................................................................................................................ 89 
 4.2. Lựa chọn nguồn kháng thể cho tối ưu bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn 
hổ mang Naja atra ............................................................................................... 91 
 4.3. Tối ưu hóa bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra .................. 93 
 4.3.1. Lựa chọn nguyên liệu cho bộ kít .......................................................... 93 
 4.3.2. Tối ưu hóa quy trình cộng hợp ............................................................. 94 
 4.3.3. Tối ưu hóa hệ đệm và các hóa chất xử lý màng ................................... 96 
 4.3.4. Tối ưu hóa nồng độ kháng thể ............................................................. 97 
 4.4. Thử nghiệm bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra trên 
in vitro ................................................................................................................. 99 
 4.5. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang trên lâm sàng ................. 102 
 4.5.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu ......................................................... 102 
 4.5.2. Thử nghiệm khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang trên mẫu 
lâm sàng ............................................................................................................. 103 
KẾT LUẬN ...................................................................................................... 109 
KIẾN NGHỊ ..................................................................................................... 110 
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
CỦA LUẬN ÁN ............................................................................................... 111 
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 112 
PHỤ LỤC ......................................................................................................... 126 
 DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT 
TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ 
1 BSA Bovine Serum Albumin (Albumine huyết thanh bò) 
2 CFA Completed Freund's Adjuvant (Tá chất Freund hoàn chỉnh) 
3 CNBr Cyanogen Bromide 
4 ECVAM European Centre for the Validation of Alternative Methods 
5 EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide 
6 ECL Enhanced chemiluminescence 
7 ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Thử nghiệm miễn 
dịch hấp phụ gắn enzym) 
8 HRP Horseradish Peroxidase 
9 HTKNR Huyết thanh kháng nọc rắn 
10 ICA Immunochromatographic assay (Sắc ký miễn dịch) 
11 IFA Incompleted Freund's Adjuvant (Tá chất Freund không 
hoàn chỉnh) 
12 IgG Immunoglobulin G (Kháng thể lớp IgG) 
13 IgY Yolk Immunoglobulin (Kháng thể IgY) 
14 KN Kháng nguyên 
15 KT Kháng thể 
16 KTKNR Kháng thể kháng nọc rắn 
17 LD50 Lethal dose, 50% (Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) 
18 LFIA Lateral flow Immunoassay (Miễn dịch dòng chảy bên) 
19 NC Nitrocellulose (Màng Nitrocellulose) 
20 OIA Optical immunoassay (Miễn dịch quang) 
21 OPD O – phenylene diamine (Cơ chất) 
22 PBS Phosphat Buffer Salin (Dung dịch đệm phosphat) 
23 PEG Polyethylene Glycol 
24 PVA Polyvinyl Alcohol 
25 PVDF Polyvinylidene Fluoride (Màng PVDF) 
26 PVP Polyvinyl Pyrrolidone 
27 RIA Radioimmunoassay (Miễn dịch phóng xạ) 
28 TBS Tris-Buffered Saline 
29 TBS-T Tris-Buffered Saline + Tween 20 
30 TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine 
31 SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel 
Electrophoresis 
32 WHO World health oganization (Tổ chức y tế thế giới) 
DANH MỤC BẢNG 
Bảng Tên bảng Trang 
1.1. Ưu và nhược điểm của các vật liệu sử dụng làm màng cộng hợp 25 
2.1. Liều kháng nguyên sử dụng gây miễn dịch cho thỏ và gà 37 
3.1. LD0 và LD100 của nọc rắn hổ mang Naja atra 57 
3.2. Tỷ lệ tử vong của chuột sau 24 giờ tiêm nọc rắn hổ mang Naja 
atra 57 
3.3. Tính kết quả LD50 theo phương pháp Karber-Behrens 57 
3.4. Kết quả thử nghiệm ... aphy” Journal of biochemical and 
biophysical methods, 51(3), pp. 217-231. 
62. Ijeh M. (2011), Covalent gold nanoparticle—antibody conjugates for 
sensitivity improvement in LFIA, Hamburg University. 
63. Inada Y., Kamiyama M., Kanemitsu T., et al. (1981), “Detection of 
circulating immune complexes: A new application of immune 
adherence haemagglutination”, Annales de l'Institut Pasteur / 
Immunologie, 132, pp. 181-190. 
119 
64. Javois L. C. (1999), Immunocytochemical methods and protocols, 115, 
Totowa: Humana Press. 
65. Ji X., Li P. (2014), Naja atra, The IUCN Red List of Threatened 
Species 2014: e. T192109A2040894. 
66. Jiang W. J., Liang Y. X., Han L. P., et al. (2008), “Purification and 
characterization of a novel antinociceptive toxin from cobra venom 
(Naja naja atra)”, Toxicon, 52(5), pp. 638-646. 
67. Jiann R. O., Hon P. M., Tzong L. W. (2004), “Snake Bites”, Ann 
Disaster Med, 2, pp. 80-88. 
68. Place J. F., Sutherland R. M., Dähne C. (1985), “Opto-electronic 
immunosensors: A review of optical immunoassay at continuous 
surfaces”, Biosensors, 1, pp. 321-353. 
69. Juan C. W. (2012), “Venomous snake bites in Taiwan”, J Emerg Crit 
Care Med, 23(3), pp. 93-108. 
70. Karakus C., Salih B. A. (2013), “Comparison of the lateral flow 
immunoassays (LFIA) for the diagnosis of Helicobacter pylori 
infection”, Journal of immunological methods, 396(1), pp. 8-14. 
71. Kasturiratne A., Wickremasinghe A. R., de Silva N., et al. (2008), 
“The global burden of snakebite: a literature analysis and modelling 
based on regional estimates of envenoming and deaths”, PLoS Med, 
5(11), pp. 1591-1604. 
72. Kaur J., Singh K. V., Boro R., et al. (2007), 
“Immunochromatographic dipstick assay format using gold 
nanoparticles labeled protein-hapten conjugate for the detection of 
atrazine”, Environmental science & technology, 41(14), pp. 5028-5036. 
73. Khow O., Wongtongkam N., Pakmanee N., et al. (1999), 
“Development of reversed passive latex agglutination for detection of 
Thai cobra (Naja kaouthia) venom”, J Nat Toxins, 8(2), pp. 213-220. 
120 
74. Kim M., Higashiguchi S., Iwamoto Y., et al. (2000), “Egg yolk 
antibody and its application”, Biotechnology and Bioprocess 
Engineering, 5(2), pp. 79-83. 
75. Kittigul L., Ratanabanangkoon K. (1993), “Reverse passive 
hemagglutination tests for rapid diagnosis of snake envenomation”, J. 
Immunoassay, 14, pp. 105-127. 
76. Kovacs-Nolan J., Mine Y. (2004), “Avian egg antibodies: basic and 
potential applications”, Avian and Poultry Biology Reviews, 15(1), pp. 
25-46. 
77. Li J., Zou M., Chen Y., et al. (2013), “Gold immunochromatographic 
strips for enhanced detection of Avian influenza and Newcastle disease 
viruses”, Analytica chimica acta, 782, pp. 54-58. 
78. Liu S., Dong W., Kong T. (2010), “Preparation and characterization of 
immunoglobulin yolk against the venom of Naja naja atra”, Indian 
Journal of Experimental Biology, 48, pp. 778-785. 
79. Mao X., Wang W., Du T. E. (2013), “Rapid quantitative 
immunochromatographic strip for multiple proteins test”, Sensors and 
Actuators B: Chemical, 186, pp. 315-320. 
80. Market F. C. (2013), “Lateral Flow Immunoassay Systems: 2.4 
Evolution from the Current State of the Art to the Next Generation of 
Highly Sensitive, Quantitative Rapid Assays”, The Immunoassay 
Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and 
related techniques, p. 89. 
81. Meenatchisundaram S., Selvakumaran R., Parameswari G., et al. 
(2009), Comparison of Antivenom potential of chicken Egg yolk 
Antibodies Generated against Bentonite and Adjuvant coated 
venoms of common poisonous snakes in India. Bangladesh Journal of 
Veterinary Medicine, 7(1), pp. 259-267. 
121 
82. Emmitt M., Crowle A. J. (1995), “Crossed immunoelectrophoresis: 
Qualitative and quantitative considerations”, Journal of Immunological 
Methods, 50, pp. 65-83. 
83. Michael A., Meenatchisundaram S., Parameswari G., et al. (2010), 
“Chicken egg yolk antibodies (IgY) as an alternative to mammalian 
antibodies”, Indian Journal of Science and Technology, 3(4), pp. 468-
474. 
84. Millipore Corporation (2002), Rapid Lateral Flow Test Strips 
Considerations for Product Development, Billerica, MA, U.S.A. 
85. Nara S., Tripathi V., Singh H., Shrivastav T. G. (2010), “Colloidal 
gold probe based rapid immunochromatographic strip assay for 
cortisol”, Analytica chimica acta, 682(1), pp. 66-71. 
86. Nobbmann U. (2013), Magnetic Gold, 
 truy 
cập ngày 23/4/2016. 
87. O’Leary M. A., Isbister G. K., Schneider J. J., et al. (2006), 
“Enzyme immunoassays in brown snake (Pseudonaja spp.) 
envenoming: detecting venom, antivenom and venom–antivenom 
complexes”, Toxicon, 48(1), pp. 4-11. 
88. Pukrittayakamee S., Ratcliffe P. J., McMichael A. J., et al. (1987), 
“A competitive radioimmunoassay using a monoclonal antibody to 
detect the factoractivator of Russell's viper venom”, Toxicon, 25, pp. 
721-729. 
89. Quyen L. K. (2004), Clinical evaluation of snakebites in Vietnam: A 
study from Cho Ray hospital, PhD Thesis, NUS. 
90. Richard C. B., Teresa K. D., Anna L. T., et al. (1982), 
“Determination of relative antigen-antibody affinities by reverse 
122 
quantitative immunoelectrophoresis”, Journal of Immunological 
Methods, 49, pp. 141-150. 
91. Ryu Y., Jin Z., Kang M. S., et al. (2011), “Increase in the detection 
sensitivity of a lateral flow assay for a cardiac marker by oriented 
immobilization of antibody”, BioChip Journal, 5(3), pp. 193-198. 
92. Sajid M., Kawde A. N., Daud M. (2014), “Designs, formats and 
applications of lateral flow assay: A literature review”, Journal of 
Saudi Chemical Society. 
93. Schade R., Staak C., Hendriksen C., et al. (1996), “The production of 
avian (egg yolk) antibodies: IgY”, Alta-nottingham, 24, pp. 925-934. 
94. Sells P. G. (2003), “Animal experimentation in snake venom research 
and in vitro alternatives”, Toxicon, 42(2), pp. 115-133. 
95. Selvanayagam Z. E., Gopalakrishnakone P. (1999), “Tests for 
detection of snake venoms, toxins and venom antibodies: review on 
recent trends (1987–1997)”, Toxicon, 37(4), pp. 565-586. 
96. Selvanayagam Z. E., Gnanavendhan S. G., Ganesh K. A., et al. 
(1999), “ELISA for the detection of venoms from four medically 
important snakes of India”, Toxicon, 37(5), pp. 757-770. 
97. Shek K. C., Tsui K. L., Lam K. K., et al. (2009), “Oral bacterial flora 
of the Chinese cobra (Naja atra) and bamboo pit viper (Trimeresurus 
albolabris) in Hong Kong SAR, China”, Hong Kong Med J, 15(3), pp. 
183-190. 
98. Siigur J., Arumäe U., Neuman T., et al. (1987), “Monoclonal 
antibody immunoaffinity chromatography of the nerve growth factor 
from snake venoms”, Comparative Biochemistry and Physiology Part 
B: Comparative Biochemistry, 87(2), pp. 329-334. 
123 
99. Silamut K., Ho M., Looareesuwan S., et al. (1987), “Detection of 
venom by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in patients 
bitten by snakes in Thailand”, BMJ, 294(6569), pp. 402-404. 
100. Singer J. M., Plotz C. M. (1956), “The latex fixation test: I. 
Application to the serologic diagnosis of rheumatoid arthritis”, The 
American Journal of Medicine, 21(6), pp. 888-892. 
101. Stábeli R. G., Magalhães L. M. P., Selistre-de-Araujo H. S., et al. 
(2005), “Antibodies to a fragment of the Bothrops moojenil-amino acid 
oxidase cross-react with snake venom components unrelated to the 
parent protein”, Toxicon, 46(3), pp. 308-317. 
102. Sutherland S. K. (1992), “Antivenom use in Australia. Premedication, 
adverse reactions and the use of venom detection kits”, Med. J. Aust, 
157, pp. 734–739. 
103. Sutherland S. K., Couter A. R., Broad A. J. (1975), “Human snake 
bite victims: the successful detection of circulating snake venom by 
radioimmunoassay”, Med. J. Aust, 1, pp. 27-29. 
104. Tan J. (2008), Analysis of Whole Blood Samples: Optimization of 
Sample Preparation for Rapid Assays, Master, Faculty of the Graduate 
School of Cornell University. 
105. The Convention on International Trade in Endangered Species of 
Wild Fauna and Flora (2000), Sixteenth meeting of the Animals 
Committee Shepherdstown (United States of America) 11-15 December 
2000, Washington, D.C. 
106. Theakston R. D. G., Laing G. D. (2014), “Diagnosis of Snakebite and 
the Importance of Immunological Tests in Venom 
Research”, Toxins, 6(5), pp. 1667-1695. 
124 
107. Theakston R. D. G., Jones M. J. L., Reid H. A. (1977), “Micro-
ELISA for detecting and assaying snake venom and venom antibody”, 
Lancet, 2, pp. 639-641. 
108. Tiru‐chelvam R. (1972), “Demonstration of sites of snake‐venom 
localisation by immunofluorescence techniques”, The Journal of 
pathology, 107(4), pp. 303-305. 
109. Tseng L. F., Chiu T. H., Lee C. Y. (1968), “Absorption and 
distribution of 131 I-labeled cobra venom and its purified 
toxins”, Toxicology and Applied Pharmacology, 12(3), pp. 526-535. 
110. Van Weemen B. K., Schuurs A. H. W. M. (1971), “Immunoassay 
using antigen-enzyme conjugates”, FEBS Letters, 15(3), pp. 232–236. 
111. Venkatesan C., Sarathi M., Balasubramanaiyan G., et al. (2014), 
“Neutralization of cobra venom by cocktail antiserum against venom 
proteins of cobra (Naja naja naja)”, Biologicals, 42(1), pp. 8-21. 
112. Viravan C., Veeravat U., Warrell M. J., et al. (1986), “ELISA 
confirmation of acute and past envenoming by the monocellate Thai 
cobra (Naja kaouthia)”, The American journal of tropical medicine and 
hygiene, 35(1), pp. 173-181. 
113. Virekunnas L. (2012), Colloidal Gold and Paramagnetic Labels in 
Lateral Flow Assay Detecting Ricin, Master of Science Thesis, 
Tampere University of Technology. 
114. Vithal K. G., Raymond N. H. (1974), “Quantitation of antigens by 
immunoelectrophoresis”, Immunochemistry, 11, pp. 305-308. 
115. Wagstaff S. C., Laing G. D., Theakston R. D. G., et al. (2006), 
“Bioinformatics and multiepitope DNA immunization to design 
rational snake antivenom”, PLoS Med, 3(6), pp. 832-844. 
116. Wallach V., Williams K. L., Boundy J. (2014), Snakes of the World: 
A catalogue of living and extinct species. CRC Press. 
125 
117. Wang J. D., Tsan Y. T., Yan-Chiao M., et al. (2009), “Venomous 
snakebites and antivenom treatment according to a protocol for 
pediatric patients in taiwan”, Journal of Venomous Animals and Toxins 
including Tropical Diseases, 15(4), pp. 667-679. 
118. Warrell D. A. (2010), “Snake bite”, The Lancet, 375(9708), pp. 77-88. 
119. Warrell D. A. (2010), Guidelines for the management of snake-bites 
WHO Library Cataloguing-in-Publication data, World Health 
Organization, Regional Office for South-East Asia, New Delhi, India. 
120. WHO Expert Committee (2010), Guidelines for the production, 
control and regulation of snake antivenom immunoglobulins. 
121. Wide L., Porath J. (1966), “Radioimmunoassay of proteins with the 
use of Sephadex-coupled antibodies”, Biochimica et Biophysica Acta 
(BBA)-General Subjects, 130(1), pp. 257-260. 
122. Wong O. F., Lam T. S., Fung H. T., et al. (2010), “Five-year 
experience with Chinese cobra (Naja atra)-related injuries in two acute 
hospitals in Hong Kong”, Hong Kong Med J. 16(1), pp. 36-43. 
123. Wong R. C., Harley Y. T. (2009), Lateral Flow Immunoassay, 
Springer, USA. 
124. World Health Organization (2005), “Guidelines for the clinical 
management of snake bite in the South-East Asia region”, New Delhi: 
WHO Regional Office for South-East Asia. 
125. Yalow R. S., Berson S. A. (1996), “Immunoassay of endogenous 
plasma insulin in man”, Obesity research, 4(6), pp. 583-600. 
126 
PHỤ LỤC 
- Bệnh án nghiên cứu 
- Danh sách bệnh nhân nghiên cứu 
- Hướng dẫn sử dụng bộ kít 
- Một số hình ảnh nghiên cứu 
127 
 BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Mã số NC: 
Đề tài: “Nghiên cứu chế tạo kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra 
bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch” 
I. Hành chính: 
- Họ và tên Bệnh nhân: Tuổi: Giới: 
- Mã số bệnh án: Mã số lưu trữ: 
- Khoa: Phòng: 
- Nghề nghiệp: Địa chỉ: 
- Thời gian nhập viện: Thời gian ra viện: 
II. Các chỉ tiêu đánh giá: 
1. Khoảng thời gian nhập viện sau khi bị rắn cắn 
Trước 3 giờ: Từ 3 – 24 giờ: Sau 24 giờ: 
2. Liều huyết thanh kháng nọc rắn điều trị: 
Dưới 10 lọ: Từ 10 – 30 lọ: Trên 30 lọ: 
3. Kết quả xét nghiệm test VDK: 
Dịch vết cắn: Dương tính Âm tính 
Huyết thanh: Dương tính Âm tính 
Nước tiểu: Dương tính Âm tính 
4. Chẩn đoán xác định: 
128 
129 
130 
131 
132 
HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG BỘ KÍT 
1. Hướng dẫn sử dụng 
- Lấy bộ kít ra khỏi túi kín và sử dụng càng nhanh càng tốt. Để đạt kết quả tốt 
nhất, toàn bộ quá trình xét nghiệm phải được hoàn thành trong vòng một giờ kể 
từ khi mở túi đựng. 
- Đặt bộ kít trên một mặt phẳng nằm ngang sạch. Chuyển mẫu bằng ống hút nhỏ 
giọt hoặc pipette: 
+ Dùng pipette: hút 90µl mẫu bệnh phẩm (huyết thanh, nước tiểu hoặc 
dịch vết cắn) cho vào giếng (hình 1), bắt đầu tính thời gian. Tránh tạo bóng khí 
trong vùng nhỏ mẫu. 
+ Dùng ống hút nhỏ giọt: giữ ống nhỏ giọt theo phương thẳng đứng, hút 
mẫu bệnh phẩm rồi nhỏ vào giếng 3 giọt (~ 90 µl), bắt đầu tính thời gian. Tránh 
tạo bóng khí trong vùng nhỏ mẫu. 
- Chờ cho đến khi các vạch đỏ xuất hiện trên kit thử. Đọc kết quả trong vòng 15 
phút. Kết quả nên đọc trong vòng 10 – 20 phút. Không đọc kết quả sau 20 phút. 
2. Hướng dẫn đọc kết quả 
Hình 1. Hướng dẫn đọc kết quả 
C 
T 
C 
T 
C 
T 
C 
T 
C 
T 
Tra 
mẫu 
Âm tính Dương tính Test lỗi Dương tính 
133 
+ Dương tính: Xuất hiện hai vạch đỏ rõ rệt ở vạch chứng (C) và vạch 
phát hiện (T). (Lưu ý: độ đậm màu của vạch phát hiện (T) có thể sẽ khác nhau 
tùy theo nồng độ của nọc rắn có trong mẫu bệnh phẩm. Tuy nhiên, bất kỳ vạch 
mờ nào ở vùng phát hiện cũng đều được coi là dương tính. 
+ Âm tính: Chỉ xuất hiện một vạch chứng (C). Không thấy xuất hiện 
vạch phát hiện (T) dù đậm hay mờ. 
+ Kết quả không có giá trị: Không thấy xuất hiện vạch chứng (C) 
Nguyên nhân thường gặp là do lượng mẫu bệnh phẩm không đủ hoặc thao tác 
xét nghiệm sai. Đọc lại hướng dẫn và làm lại xét nghiệm bằng bộ kít thử mới 
khác. 
134 
MỘT SỐ HÌNH ẢNH NGHIÊN CỨU 
Hình 1: Thu thập nọc rắn 
Hình 2: Đông khô nọc rắn 
 Hình 3: Thử nghiệm LD50 
Hình 4: Gây miễn dịch trên thỏ 
 Hình 5: Gây miễn dịch trên gà Hình 6: Lựa chọn cặp kháng thể dựa 
trên kỹ thuật ELISA 
135 
Hình 7: Kết quả điện di nọc rắn 
(Hổ mang N.a Đài loan, N.a Việt 
nam, Hổ đất N.k, Hổ chúa O.h) 
Hình 8: Kết quả định lượng Kháng 
thể 
Hình 9: Kiểm tra tính đặc hiệu trên 
Western blot 
Hình 10: Ủ màng PVDF với các 
Kháng thể sau khi chuyển màng 
Hình 11: Dung dịch hạt nano vàng 
dùng thử nghiệm 
Hình 12: Gắn hạt nano vàng với 
kháng thể 
136 
Hình 13: Xử lý các màng Hình 14: Các loại màng sử dụng trên 
que thử 
Hình 15: Tối ưu nồng độ KT tại 
vạch phát hiện 
Hình 16: Tối ưu nồng độ KT tại 
vạch chứng 
Hình 17: Tối ưu nồng độ KT 
cộng hợp 
Hình 18: Kiểm tra ngưỡng phát hiện