Luận án Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh lở mồm long móng và đánh giá hiệu quả kinh tế một số biện pháp phòng chống tại Việt Nam

Bệnh Lở mồm long móng (LMLM) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm

của động vật móng guốc chẵn như: trâu, bò, lợn, dê, cừu, hươu, nai,. Bệnh

có khả năng lây lan nhanh, ở phạm vi rộng, không chỉ do tiếp xúc giữa động

vật khỏe với động vật mắc bệnh mà còn qua nhiều đường khác nhau, kể cả

qua không khí. Vì vậy, bệnh thường phát thành dịch và gây thiệt hại lớn cho

ngành chăn nuôi, ảnh hưởng đến kinh tế xã hội, môi trường của nhiều nước

trên thế giới.

Do tính chất nguy hiểm nên bệnh LMLM được Tổ chức Thú y thế giới

- OIE đưa vào danh mục các bệnh truyền nhiễm ở nhiều loài động vật, có tầm

quan trọng đối với thương mại quốc tế và bắt buộc các nước thành viên phải

khai báo (OIE, 2011).

Tại Việt Nam, đến nay bệnh đã xuất hiện, lưu hành và gây bệnh ở gia súc

trên 100 năm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978). Giai đoạn đầu, bệnh xuất hiện và gây

dịch ở phạm vi nhỏ, nhưng sau đó lây rộng ra phạm vi cả nước. Bệnh do vi rút

type O gây ra, diễn biến có quy luật, thường 2-3 năm lập lại một lần. Từ cuối

năm 2003, vi rút LMLM type A xuất hiện ở Thuận Hải; từ năm 2005, vi rút

LMLM type Asia 1 đồng xuất hiện ở Lào Cai và Khánh Hòa, diễn biến dịch trở

lên phức tạp, giảm tính mùa vụ. Trong những năm trước đây, đã có nhiều công

trình nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ (Văn Đăng Kỳ, 2002; Trần Hữu Cổn, 1996;

Thái Thị Thủy Phượng, 2008), đặc điểm của vi rút LMLM (Phan et al., 2010a;

Phan et al., 2010b), sự phân bố và lưu hành của vi rút LMLM tại duyên hải miền

Trung (Nguyễn Văn Hưng, 2012), trong từng giai đoạn, đã góp phần vào việc đề

ra những giải pháp phòng chống bệnh LMLM ở nước ta.

179 trang dienloan 5100

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh lở mồm long móng và đánh giá hiệu quả kinh tế một số biện pháp phòng chống tại Việt Nam", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên

Tóm tắt nội dung tài liệu: Luận án Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh lở mồm long móng và đánh giá hiệu quả kinh tế một số biện pháp phòng chống tại Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
NGUYỄN THU THỦY
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC BỆNH LỞ MỒM
LONG MÓNG VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KINH TẾ
MỘT SỐ BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG
TẠI VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
NGUYỄN THU THỦY
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC BỆNH
LỞ MỒM LONG MÓNG VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ
KINH TẾ MỘT SỐ BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG
TẠI VIỆT NAM
Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y
Mã số: 9.64.01.08
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Bá Hiên
TS. Nguyễn Văn Cảm
HÀ NỘI - 2018
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ
lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cảm
ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Tác giả luận án
Nguyễn Thu Thủy
ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận được
sự quan tâm giúp đỡ của các tổ chức, cơ quan, các nhà khoa học, các thầy cô giáo, bạn
bè đồng nghiệp và những người thân trong gia đình.
Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Cục Thú y và Tổ chức Thú y thế giới
(OIE), đã cho phép tôi tham gia triển khai và sử dụng số liệu, kết quả của các dự án có
liên quan.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự hướng dẫn, giúp đỡ chân tình, đầy trách
nhiệm và hết lòng vì khoa học của thầy giáo PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên và TS. Nguyễn
Văn Cảm.
Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của Ban Quản lý đào tạo và Bộ môn Vi
sinh vật Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án tại Học viện.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới Quý thầy cô, các cơ quan,
nhà khoa học cùng các đồng nghiệp và UBND, Sở Nông nghiệp & PTNT, Chi cục Thú
y các tỉnh đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình đã luôn quan tâm,
động viên giúp tôi hoàn thành luận án này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Tác giả luận án
Nguyễn Thu Thủy
iii
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii
Mục lục ............................................................................................................................ iii
Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................................ vi
Danh mục bảng ............................................................................................................... vii
Danh mục hình ................................................................................................................. ix
Trích yếu luận án .............................................................................................................. x
Thesis abstract ................................................................................................................. xii
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài ....................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................... 2
1.3. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................. 2
1.4. Những đóng góp mới của đề tài ........................................................................... 2
1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................. 3
Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4
2.1. Giới thiệu về bệnh LMLM ................................................................................... 4
2.2. Lịch sử bệnh LMLM ............................................................................................ 4
2.2.1. Tình hình dịch LMLM trên thế giới ............................................................................. 4
2.2.2. Tình hình bệnh LMLM ở Việt Nam ............................................................................ 6
2.3. Vi rút gây bệnh LMLM ..................................................................................... 10
2.3.1. Hình thái, cấu trúc vi rút LMLM ................................................................................ 10
2.3.2. Cấu trúc ........................................................................................................................ 10
2.3.3. Các serotype của vi rút LMLM .................................................................................. 11
2.3.4. Đặc tính nuôi cấy của vi rút LMLM .......................................................................... 12
2.3.5. Sức đề kháng của vi rút LMLM ................................................................................. 13
2.4. Một số đặc điểm cơ bản của bệnh LMLM ......................................................... 14
2.4.1. Loài vật mắc bệnh ....................................................................................................... 14
2.4.2. Triệu chứng - bệnh tích ............................................................................................... 15
2.4.3. Cơ chế sinh bệnh ......................................................................................................... 16
iv
2.4.4. Phương thức truyền lây ............................................................................................... 18
2.4.5. Đường xâm nhập ......................................................................................................... 19
2.4.6. Tình trạng mang trùng ................................................................................................. 20
2.4.7. Những thiệt hại do bệnh LMLM gây ra ..................................................................... 21
2.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh ..................................................................... 23
2.5.1. Chẩn đoán lâm sàng .................................................................................................... 23
2.5.2. Chẩn đoán phân lập vi rút ........................................................................................... 23
2.5.3. Chẩn đoán huyết thanh học ......................................................................................... 24
2.5.4. Chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR ............................................................................. 26
2.6. Một số phương pháp nghiên cứu dịch tễ học ..................................................... 26
2.6.1. Nghiên cứu cắt ngang (Cross-sectional study) .......................................................... 26
2.6.2. Nghiên cứu thuần tập (Cohort study) ......................................................................... 27
2.6.3. Nghiên cứu Bệnh - Chứng (Case – Control study) ................................................... 28
2.7. Các biện pháp phòng, chống bệnh LMLM ........................................................ 29
2.7.1. Phòng chống bệnh LMLM trên thế giới .................................................................... 29
2.7.2. Phòng chống bệnh LMLM trong khu vực Đông Nam Á ......................................... 31
2.7.3. Phòng chống bệnh LMLM tại Việt Nam ................................................................... 32
Phần 3. Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu ......................................... 34
3.1. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................... 34
3.2. Thời gian nghiên cứu ......................................................................................... 34
3.3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 34
3.3.1. Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học theo không gian và thời gian của bệnh
LMLM tại Việt Nam, giai đoạn 2006 – 2012 ............................................................ 34
3.3.2. Nghiên cứu mức độ phơi nhiễm và mang trùng vi rút LMLM tại một số tỉnh
trọng điểm từ tháng 10-12/2012 ................................................................................. 34
3.3.3. Nghiên cứu phân tích và đánh giá hiệu quả kinh tế của một số biện pháp
phòng chống bệnh LMLM .......................................................................................... 34
3.4. Đối tượng và vật liệu ......................................................................................... 35
3.4.1. Đối tượng ..................................................................................................................... 35
3.4.2. Vật liệu ......................................................................................................................... 35
3.5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 36
v
3.5.1. Phương pháp áp dụng để nghiên cứu đặc điểm dịch tễ theo không gian và
thời gian ........................................................................................................................ 36
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu mức độ lưu hành vi rút LMLM tại một số tỉnh
trọng điểm từ tháng 10-12/2012 ................................................................................ 39
3.5.3. Nghiên cứu phân tích và đánh giá hiệu quả kinh tế của một số biện pháp
phòng chống bệnh LMLM .......................................................................................... 44
3.5.4. Tính hiệu quả kinh tế của một số biện pháp phòng chống bệnh LMLM ................ 44
Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 47
4.1. Đặc điểm dịch tễ học theo không gian và thời gian của bệnh LMLM tại Việt
Nam, giai đoạn 2006 - 2012 ................................................................................. 47
4.1.1. Đặc điểm loài gia súc mắc bệnh LMLM ................................................................... 47
4.1.2. Đặc điểm loài gia súc chết vì bệnh LMLM ............................................................... 51
4.1.3. Đặc điểm thời gian của các ổ dịch LMLM giai đoạn 2006 – 2012 ......................... 52
4.1.4. Đặc điểm không gian các ổ dịch LMLM giai đoạn 2006 - 2012 ............................. 57
4.2. Mức độ lưu hành vi rút lmlm tại một số tỉnh trọng điểm từ tháng 10-
12/2012 .............................................................................................................. 80
4.2.1. Mức độ lưu hành vi rút LMLM .................................................................................. 81
4.2.2. Xác định chủng vi rút LMLM .................................................................................... 84
4.2.3. Xác định các yếu tố nguy cơ ....................................................................................... 88
4.3. Hiệu quả kinh tế của một số biện pháp phòng chống bệnh LMLM .................. 92
4.3.1. Kinh phí hoạt động của chương trình khống chế bệnh LMLM ................................. 92
4.3.2. Thiệt hại sản xuất do bệnh LMLM ở Việt Nam ........................................................ 94
4.3.3. Chi phí tổng thể do bệnh LMLM ở Việt Nam ........................................................... 97
Phần 5. Kết luận và kiến nghị .................................................................................... 100
5.1. Kết luận ............................................................................................................ 100
5.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 101
Các công trình khoa học đã công bố có liên quan đến luận án ..................................... 102
Tài liệu tham khảo ........................................................................................................ 103
Phụ lục ......................................................................................................................... 120
vi
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ
BHK Baby Hamster Kidney
CCU Carrying Capacity Unit
CI Confidence Interval
EDR Estimated Dissemination Ratio
ELISA Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations
FMD Foot and Mouth Disease
KHBT Kết hợp bổ thể
LMLM Lở Mồm Long Móng
LPB-ELISA Liquid Phase Blocking-ELISA
LPEC Livestock Production Efficiency Calculator
NN&PTNN Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
OIE World Organisation for Animal Health
OR Odds Ratio
PBS Phosphate Buffer Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
ROC Receiver Operating Characteristic Curve
SE Standard Error
SEACFMD RCU The Southeast Asia and China Foot and Mouth Disease Campaign
(SEACFMD) Regional Coordination Unit in Bangkok
USD United States Dollar
WRL World Reference Laboratory
WTO World Trade Organization
vii
DANH MỤC BẢNG
TT Tên bảng Trang
2.1. Tình hình dịch LMLM từ năm 2013 – 2015 .......................................................... 9
4.1. Phân loại ổ dịch LMLM theo từng loài gia súc, giai đoạn 2006 - 2012 .............. 48
4.2. Tỉ lệ loài gia súc mắc bệnh LMLM (năm 2006 – 2012) theo loài ....................... 50
4.3. Tỷ lệ các loài gia súc bị chết do bệnh LMLM giai đoạn 2006 – 2012 ................ 51
4.4. Nguy cơ xuất hiện dịch LMLM tại các tỉnh đồng bằng sông Hồng, Đông
Bắc bộ và Tây Bắc bộ, giai đoạn 2006 - 2009 ..................................................... 60
4.5. Nguy cơ xuất hiện dịch LMLM tại các tỉnh Bắc Trung Bộ và Nam Trung
Bộ, giai đoạn 2006 - 2009 .................................................................................... 61
4.6. Nguy cơ xuất hiện dịch LMLM tại các tỉnh Tây Nguyên, Đông Nam Bộ
và đồng bằng sông Cửu Long, giai đoạn 2006 - 2009 ......................................... 62
4.7. Nguy cơ xuất hiện dịch LMLM tại các tỉnh đồng bằng sông Hồng, Đông
Bắc Bộ và Tây Bắc Bộ, giai đoạn 2010 - 2012 .................................................... 70
4.8. Nguy cơ xuất hiện dịch LMLM tại các tỉnh Bắc Trung Bộ và Nam Trung
Bộ, giai đoạn 2010 - 2012 .................................................................................... 71
4. ... tại WRL-Pirbright (Anh quốc)
150
I. TRANG THIẾT BỊ CƠ BẢN
- Máy PCR (Bio-Rad-USA)
- NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, UK)
- Bồn ổn nhiệt
- Bộ điện di sản phẩm PCR
- Hệ thống bơm hút chân không
- Tủ lạnh âm (-20 oC) đến (-70 0C)
- Tủ lạnh âm (0 0C) đến (-20 0C)
- Tủ lạnh thường (20 0C) đến (80 0C)
- Máy ly tâm
- Máy IKA Turrax
- Máy votex
- Máy Spin
- Đế từ MPC
II. Primer đặc hiệu cho vi-rút Lở mồm long móng týp O và týp A
2.1. Týp O
Týp O Sequence (5’-3’) Vùng gen
O–1D293F TGGAYAACACCACYAAYCCAAC VP1
O–1D296F ACAACACCACCAACCCAAC VP1
O–1D296aF ATAACACCACTAATCCAAC VP1
O–1D296bF ACAACACCACCAATCCAAC VP1
O–1D296cF ATAACACCACCAATCCAAC VP1
O–1D628R GTTGGGTTGGTGGTGTTGT VP1
O–1D628aR GTTGGATTAGTGGTGTTAT VP1
O–1D628bR GTTGGGTTGGTGGTGTTTT VP1
151
2.1 Týp A
Serotype A Sequence (5’-3’) Vùng gen
A–1D202aF TCAGCCACCTACTATTTCTCTGA VP1
A–1D202bF GCAGCAACATACTACTTCTCTGA VP1
A–1D202cF GCAGCAACCTACTATTTCTCTGA VP1
A–1D202dF GCGGCCACTTACTACTTCTCTGA VP1
A–1D202eF GCGGCCACCTACTATTTTTCTGA VP1
A–1D202fF GCGGCCACCTACTACTTTTCTGA VP1
A–1D478aR CAGTGCTCCGTAGTTAAAGGATGA VP1
A–1D478bR AATTGCACCGTAATTGAAGGATGC VP1
A–1D478cR GAGTGCACCATAGTTGAAAGACGC VP1
A–1D478dR AATCGCACCAAAGTTGAAGGAAGT VP1
A–1D478eR AACTGCGCCGTAGTTGAAGGAGGC VP1
A–1D478fR AATTGCGCCGTAGTTGAAGGATGC VP1
III. CÁC GIAI ĐOẠN THỰC HIỆN
Giai đoạn 1: Chiết tách RNA vi-rút bằng Rneasy Spin-Columns
- Sử dụng 460 µl mẫu vi-rút LMLM trong ống tube 1.5ml
- Cho 460 µl dung dịch Lysis buffer RLT (đã có chứa 1% của 2-
mercaptoethanol) hòa cùng với mẫu vi-rút và vortex lắc đều.
- Cho 460 µl dung dịch ethanol 70% và vortex lắc đều thành hỗn hợp dịch đồng
nhất.
152
- Cho 700 µl hỗn hợp dịch và cột Rneasy.
- Ly tâm ở tốc độ 10.000rpm/15 giây
- Loại bỏ nước trong
- Rửa cột Rneasy bằng 700 µl dung dịch RW1 cung cấp theo kít.
- Loại bỏ nước trong
- Rửa cột lần 1 RNeasy bằng 500 µl dung dịch RPE cung cấp theo kít.
- Loại bỏ nước trong
- Tiếp tục, rửa cột lần 2 RNeasy bằng 500 µl dung dịch RPE cung cấp theo kít.
- Ly tâm làm khô màng lọc của cột RNeasy.
- Hoàn nguyên thu hoạch RNA bằng 50 µl nước không chứa RNA được cung
cấp sẵn trong kít.
- Giữ ở nhiệt độ -200C.
Giai đoạn 1: Phiên mã ngược của RNA vi-rút (Reverse Transcription of RNA)
- Chuẩn bị nguyên liệu
Nguyên liệu Đơn vị (µl)
10 mM dNTPs 2.5
Dung dịch đệm RT nồng độ 5 lần 5
MMLV (200U/µl) 0.5
Rnasin (3.3U/ µl) 1
H2O 1
Primer (25pmol/ µl) 1
Tổng thể tích 11
153
- Lấy 14 µl RNA cho vào 11 µl của hỗn hợp nguyên liệu với tổng thể tích cuối
cùng là 25 µl
- Xử lý nhiệt ở 42 oC trong 60 phút và 94 0C trong 10 phút.
- Giữ âm -20oC
Giai đoạn 3: Khuyếch đại PCR của phiên mã ngược
- Chuẩn bị nguyên liệu
Nguyên liệu Nồng độ Đơn vị (µl)
25 mM MgCl2 1.5 mM 3
10 mM dNTPs 200 μM 1
Dung dịch đệm 10X 1X 5
Primer 1 (10-25 pmol/μl) 0.5 pmol/μl 1
primer 2 (10-25 pmol/μl) 0.5 pmol/μl 1
Taq DNA polymerase (5 U/μl) 2.5 U 0.5
Mẫu (sản phẩm phiên mã ngược) 5
H2O 33.5
Tổng thể tích 50
- Thực hiện chu kỳ nhiệt độ:
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
940C 4 phút 1
940C 60 giây
30 550C 60 giây
720C 90 giây
720C 5 phút 1
Sau đó lấy 5 μl của sản phẩm PCR và chạy điện di trên agarose gel
154
Giai đoạn 4: Phân tích sản phẩm PCR bằng Agarose Gel Electrophoresis
1. Chuẩn bị 60ml của thạch agarose 2% trong dung dịch đệm TBE 1X.
2. Đun nhiệt khoảng 2 phút trên microwave để thạch tan chảy đồng nhất.
3. Chuẩn bị bảng Gel agarose
4. Cho 6μl thang chuẩn (marker)
5. Cho 6μl sản phẩm PCR
6. Thực hiện điện di ở 100 Volts cho 20 phút
7. Bảng gel điện di được ghi nhận kết quả ( nhìn vạch sản phẩm) trên máy UV-
Transilluminator.
Giai đoạn 5: Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng kít Promega Wizard PrepsTM
- Cắt sản phẩm PCR cho vào ống tube loại 1.5ml.
- Cho 100 μl dung dịch tinh sạch (Purification Buffer).
- Trộn đều
- Cho 1ml của Resin
- Lắc đều 3 lần. Mỗi lần 1 phút
- Chuẩn bị Wizard Prep-mini-column cho mỗi sản phẩm PCR.
- Ly tâm 12.000 rpm trong 20 giây.
Giữ sản phẩm tinh sạch ở nhiệt độ âm-200C trong ống chứa 1ml.
Giai đoạn 6. Đánh dấu của vùng Oligonucleotide bằng kít T4 Polynucleotide
- Chuẩn bị hỗn hợp nguyên liệu trong tube eppendorf
Nguyên liệu Đơn vị (μl)
Primer (24 pmol/μl) 1
32P -ATP (1.85 MBq) 5
Dung dịch đệm PNK 10X 3
T4 polynucleotide kinase (10 2
155
U/μl)
H2O 19
Tổng thể tích 30
- Sau đó ủ ở nhiệt độ
Nhiệt độ Thời gian
370C 60 phút
900C 5 phút
- Sử dụng 1.2 pmol của Primer (1.5 μl) cho mỗi mẫu
Giai đoạn 7: Thực hiện chu trình của trình tự gen sử dụng Promega f-mol kit.
a) Chuẩn bị 4 ống đã đánh dấu T, C, G và A
b) Cho 1 μl của dd/dNTPs trong mỗi ống/giếng
c) Ly tâm nhẹ
d) Giữ ở nhiệt độ 40C
Mỗi ống của từng phản ứng được thực hiện trong tube có chứa các nguyên liệu
như sau:
Nguyên liệu Đơn vị (μl)
Mẫu DNA đã tinh sạch 3
Dung dịch đệm nồng độ 5X 4
32P -ATP 1.5
Taq polymerase (5U/ μl) 1
H2O 10.5
Tổng thể tích 20
156
- Lắc đều và ly tâm nhẹ
a) Cho 4 μl của hỗn hợp vào mỗi tube dd/dNTP/giếng
b) Ly tâm nhẹ tất cả các giếng đã thực hiện
Thực hiện chu trình nhiệt:
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
940C 2 phút 1
920C 1 phút
30 550C 1 phút
720C 1 phút và 30 giây
200C Giữ nhiệt 1
a) Cho 4 μl dung dịch dừng phản ứng cho mỗi tube trong giếng phản ứng
b) Ly tâm nhẹ
Đun nhiệt ở nhiệt độ 80-900C trong 5 phút trước khi chạy gel
Sử dụng 3.5 μl trong mỗi giếng.
Chuẩn bị dung dịch Fmol Sequencing
Nguyên liệu Nồng độ Đơn vị (μl)
Formamide 95% 950
NaOH 2M 10 mM 5
10% Bromophenol Blue 0.05% 5
10% Xylene Cyanol FF 0.05% 5
H2O 35
Tổng thể tích 1000
157
Giai đoạn 8: Polyacrylamide Gel Electrophoresis của sản phẩm chu trình-
trình tự gen
1. a)Cẩn thận làm sạch một bộ gel với một chất tẩy rửa.
b. Rửa lại bằng nước cất và sau đó làm sạch bằng ethanol.
2. Chuẩn bị dung dịch gel
- 125 ml của TBE 0.5X
- 250 μl TEMED
- 250 μl của ammonium persuphate (AMPS)
3. Đổ dung dịch gel giữa các tấm kính bằng một ống tiêm 50 ml.
4. Chuẩn bị 1000ml của TBE 1X.
5. Sử dụng 2 μl của thuốc nhuộm formamide vào các giếng.
6. Đun nhiệt mẫu ở nhiệt độ 95-1000C/2phút trước khi thực hiện các bước tiếp
theo.
7. Cho 3 μl mỗi mẫu trong giếng theo trình tự T, C,G,A
8. Chạy máy trong 2 giờ ở 70 Watts
9. Tháo các đĩa (plate) ở bể gel
10. Làm khô khoảng 45-60 phút trong 1.5 giờ và làm nóng ở nhiệt độ 80-850C
11. Đánh dấu một góc của gel khô,thời gian từ 18-48 giờ với một màn hình tăng
cường và 18-60 giờ tùy thuộc vào hoạt động của đồng vị phóng xạ.
12. Hiện thị hình ảnh tự động và gắn nhãn thứ tự (tức là TCGA) và đặt tên của mỗi
mẫu trên máy giải trình tự gen. Ví dụ
158
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
T C C T T G A T G T G G C C G A G G C G T G C C C C A C G T
64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
T T C T G C A C T T C G A A G G T G A C G T G C C A T A C G
64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64
61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90
T G A C C A C G A A G A C G G A C T C G G A C A G G G T T C
64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64
91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120
T C G C G C A A T T T G A C T T G T C T T T G G C A G C A A
64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64
121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150
A A C A C A T G T C A A A C A C C T T T C T T G C A G G T C
64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64
151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180
T T G C C C A G T A C T A C A C G C A G T A C A G C G G C A
64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64
181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210
C G A T C A A C C T G C A C T T C A T G T T C A C A G G T C
64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64
211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240
C C A C T G A C G C G A A A G C G C G T T A C A T G A T T G
64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64
241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270
C A T A C G C C C C A C C G G G T A T G G A G C C G C C T C
64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64
271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300
G C A C G C C T G A G G C C G C T G C C C A T T G C A T T C
159
Giai đoạn 9: Phân tích kết quả bằng phần mềm MEGA4
Kết quả giải mã gen sẽ được so sánh để tìm mối liên hệ với các trình tự gen của các
nhóm/dòng virus khác đã được công bố trên Ngân hàng gen (NCBI) để so sánh với các
chủng trên thế giới hoặc so sánh các chủng trong nước đã có kết quả trước đó bằng phần
mềm chuyên dụng (ví dụ phần mềm MEGA) để thể hiện cây phả hệ sinh dòng.
160
PHỤ LỤC 02
VACCINE MATCHING
(Xác định sự tương đồng kháng nguyên vi –rút LMLM-giá trị r1)
I. TRANG THIẾT BỊ
- Micropipettes một kênh lấy được thể tích từ 0.5-10µl; 10-100µl ; 100-
1000µl
- Multistepper 08 kênh lấy được thể tích từ 50-250µl
- Máy Vortex
- Máy Spin
- Kính hiển vi soi ngược
- Tủ an toàn sinh học cấp II
- Tủ lạnh + 40 0C, tủ lạnh –20 0C, tủ lạnh âm -80 0C
- Tủ ấm CO2
- Dụng cụ lọc vô trùng với đầu lọc 0,20 μm
- Syringe: 1, 3 hoặc 5ml
- Tips phù hợp với Micropipettes
- Ống Eppendorf 1.5ml
- Ống nhựa ly tâm 5ml, 15ml, 50ml
- Nồi ổn nhiệt: có nhiệt độ từ +35 0C đến 60 0C
- Điã đáy bằng triêṭ trùng 96 giếng dùng nuôi cấy tế bào
II. NGUYÊN LIỆU
- Thuốc khử trùng: Virkon,
- Phosphate Buffered Saline,
- Penicillin/Streptomycin
- Fungizone
- Eagle’s maintenance medium (EMEM)
- Basal medium Eagle (BME)
- Formal 10% pha trong PBS 1 lần
- Methyl blue 0,05% pha trong Formal 10%.
161
III. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN
3.1. Mẫu kháng huyết thanh Bò:
Được sử dụng để thực hiện phản ứng trung hòa vi-rút là mẫu huyết thanh đã
được tiêm vắc-xin LMLM típ O kháng lại kháng nguyên O1manisa và O3039)
và đã được tiêm vắc-xin LMLM típ A kháng lại kháng nguyên A22Iraq và
Amay97). Tất cả mẫu huyết thanh đã được biết trước hiệu giá kháng thể.
3.2. Mẫu vi-rút LMLM thực địa:
Pha loãng dung dic̣h vi rút sử dụng với 100TCID50/ 50 µl
3.3. Các bước thực hiện
Thưc̣ hiêṇ trên điã phản ứng: Huyết thanh pha loãng bắt đầu: 1/4 đến 1/512.
+ Mỗi độ pha loãng huyết thanh được cho vào 2 giếng, mỗi giếng 50 µl.
+ Cho 50 µl dung dic̣h vi rút với 100TCID50 /50 µl vào các giếng.
+ Ủ đĩa ở 370C/5% CO2/60 phút
+ Sau khi ủ xong, cho 50 µl tế bào BHK vào tất cả các giếng
+ Ủ đĩa ở 370C/5% CO2/48 giờ
Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi soi ngược để ghi nhận bệnh tích tế
bào.
- Thưc̣ hiêṇ trên điã đối chứng
Đối chứng huyết thanh:
Huyết thanh đối chứng âm và dương tính pha loãng bắt đầu: 1/4 đến 1/512.
+ Mỗi độ pha loãng huyết thanh được cho vào 2 giếng, mỗi giếng 50 µl.
+ Cho 50 µl dung dic̣h vi rút với 100TCID50 /50 µl vào các giếng.
+ Ủ đĩa ở 370C/5% CO2/60 phút
+ Sau khi ủ xong, cho 50 µl tế bào BHK vào tất cả các giếng
+ Ủ đĩa ở 370C/3 – 5% CO2/48 giờ
162
Đối chứng tế bào
+ Cho 100 µl môi trường vào giếng A6 đến D6 và A7 đến D7.
+ Ủ đĩa ở 370C/5% CO2/60 phút
Đối chứng môi trường
+ Cho 150 µl môi trường vào giếng E6 đến H6 và E7 đến H7.
+ Ủ đĩa ở 370C/ 5% CO2/60 phút
Chuẩn đô ̣laị vi rút sử duṇg
+ Pha loañg dung dic̣h vi rút sử duṇg: từ 10-1 đến 10-4
+ Cho 50 µl môi trường vào các giếng từ A9 đến H12.
+ Cho 50 µl vi rút pha loañg 10-1 và các giếng từ A9 đến H9.
+ Cho 50 µl vi rút pha loañg 10-2 và các giếng từ A10 đến H10.
+ Cho 50 µl vi rút pha loañg 10-3 và các giếng từ A11 đến H11.
+ Cho 50 µl vi rút pha loañg 10-4 và các giếng từ A12 đến H12.
+ Ủ đĩa ở 370C/5% CO2/ 60 phút
- Sau khi ủ xong, cho 50 µl tế bào BHK vào tất cả các giếng từ A1 đến H4, từ
A6 đến D6, từ A7 đến D7 và từ A9 đến H12
+ Ủ đĩa ở 370C/5% CO2/48 giờ
+ Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi soi ngược để ghi nhận bệnh tích
tế bào.
3.4. Kết quả
3.4.1 Tính hiêụ giá kháng thể trung hòa của mâũ huyết thanh:
- Đô ̣ pha loañg của huyết thanh phải chuyển về log10 (huyết thanh pha loañg
1/X, lấy log10 của X) để đưa vào công thức Karber (1931).
163
Hiêụ giá trung hòa 50% = a + 0,5 – 1/n x ∑rl
Với: a: độ pha loãng huyết thanh cao nhất có ít nhất môṭ giếng không có bệnh
tích tế bào
∑rl: tổng số giếng có bệnh tích tế bào trong các đô ̣pha loãng có ít nhất
môṭ giếng không có bêṇh tích tế bào.
n: số giếng sử dụng cho một độ pha loãng
3.4.2. Điều kiêṇ để chấp nhâṇ kết quả
- Đối chứng tế bào: bình thường
- Đối chứng môi trường: bình thường.
- Đối chứng môi trường và tế bào: bình thường
- Hiệu giá của mẫu đối chứng huyết thanh dương chuẩn chỉ chệnh lệch ± 1 độ
pha loañg bâc̣ 2 so với hiêụ giá đa ̃biết (log10 đô ̣pha loañg bâc̣ 2 của hiêụ giá đã
biết ± 0,3)
- Hiêụ giá chuẩn đô ̣laị của vi rút nằm trong khoảng log10 hiêụ giá vi rút đa ̃biết
± 0,5.
3.5. Kết luâṇ
+ Mẫu có hiêụ giá kháng thể trung hòa 50% ≥ 1,65 (1/45) đươc̣ xem là mâũ
dương tính.
+ Mẫu không có hiêụ kháng thể trung hòa 50% ≤ 1,2 (1/16) đươc̣ xem là mâũ
âm tính.
+ Mẫu có hiêụ giá kháng thể trung hòa từ 50% từ > 1,2 (1/16) đến < 1,65 (1/45)
đươc̣ xem là mâũ nghi ngờ. Nếu mẫu kiểm tra lại lần 2 có hiệu giá > 1,2 (1/16)
được xem là mẫu dương tính.
Mức tương đồng kháng nguyên được thể hiện qua giá trị r1, khi vi rút vắc xin có
giá trị r1 ≥ 0.3 đối với vi rút thực địa thì vi rút vắc xin có tương đồng kháng
164
nguyên với vi rút thực địa; giá trị r1 càng cao thì mức tương đồng càng cao cũng
đồng nghĩa là vắc xin càng có khả năng bảo hộ tốt với vi rút thực địa.
Giá trị r1 được tính theo công thức sau:
r1=
Trong đó:
Nếu r1<0,3. Vắc-xin không còn bảo hộ được với vi-rút LMLM thực địa
Nếu r1≥ 0,3. Vắc-xin còn bảo hộ với vi-rút LMLM thực địa

File đính kèm:

luan_an_nghien_cuu_dac_diem_dich_te_hoc_benh_lo_mom_long_mon.pdf
Tom tat luan an - Nguyen Thu Thuy - 12.01.2018.pdf
Trang thong tin LA tieng Anh - Nguyen Thu Thuy - 12.01.2018.doc
Trang thong tin LA tieng Viet - Nguyen Thu Thuy - 12.01.2018.doc