Luận án Nghiên cứu đặc tính sinh học của vi khuẩn photobacterium damselae gây bệnh trên một số loài cá biển nuôi lồng tại Việt Nam và tạo chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT 
 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
--------------- 
LÊ MINH HẢI 
NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN 
Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ 
BIỂN NUÔI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN 
GIẢM ĐỘC LỰC PHỤC VỤ SẢN XUẤT 
VẮC XIN PHÒNG BỆNH 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 
Hà Nội, năm 2018 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT 
 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
--------------- 
LÊ MINH HẢI 
NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN 
Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ 
BIỂN NUÔI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN 
GIẢM ĐỘC LỰC PHỤC VỤ SẢN XUẤT 
VẮC XIN PHÒNG BỆNH 
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 
Mã số: 9 42 02 01 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Thị Tâm 
 PGS.TS. Tô Long Thành 
Hà Nội, năm 2018 
i 
LỜI CAM ĐOAN 
 Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện. Toàn 
bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng 
được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các 
thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. 
 Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018 
 Tác giả luận án 
 Lê Minh Hải 
ii 
LỜI CẢM ƠN 
 Để hoàn thành đề tài luận án này, ngoài sự lỗ lực của bản thân tôi đã 
nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các tổ chức và cá nhân. Trước hết tôi xin 
bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phạm Thị Tâm (Viện Đại học Mở 
Hà Nội), PGS. TS. Tô Long Thành (Trung tâm chuẩn đoán thú ý Trung ương) 
đã định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi 
hoàn thành công trình nghiên cứu này. 
 Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, kỹ thuật viên, học viên của Khoa Công 
nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội nơi tôi thực hiện các nội dung trong 
đề tài luận án, đã hỗ trợ về mọi mặt để tôi có thể hoàn thành luận án này. 
 Để hoàn thành luận án này, tôi còn nhận được sự động viên, khuyến 
khích giúp đỡ của các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tất cả những sự giúp 
đỡ và tình cảm quý báu đó là nguồn động lực lớn giúp tôi có thể hoàn thành 
công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những giúp đỡ 
quý báu đó! 
Xin chân thành cảm ơn! 
 Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018 
 Tác giả luận án 
 Lê Minh Hải 
iii 
MỤC LỤC 
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i 
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii 
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... vii 
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................viii 
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4 
1.1. Tình hình nuôi cá biển trên thế giới và ở Việt Nam .................................. 4 
1.1.1. Tình hình nuôi cá biển trên thế giới ........................................................ 4 
1.1.2. Tình hình nuôi cá biển ở Việt Nam ......................................................... 5 
1.2. Một số bệnh thường gặp trên cá biển nuôi lồng ........................................ 8 
1.3. Vi khuẩn Photobacterium damselae và bệnh do vi khuẩn P. damselae gây 
ra trên cá biển .................................................................................................. 10 
1.3.1.Vi khuẩn Photobacterium damselae ....................................................... 10 
1.3.2. Bệnh do vi khuẩn Photobacterium damselae gây ra trên cá biển ......... 15 
1.4. Tổng quan về tạo chủng vi khuẩn nhược độc .......................................... 19 
1.4.1. Phương pháp vật lý ............................................................................... 19 
1.4.2. Các phương pháp vi sinh vật học .......................................................... 21 
1.4.3. Đột biến bằng kháng sinh rifampicin .................................................... 22 
1.4.4. Giảm độc bằng kỹ thuật gen ................................................................. 24 
1.5. Đáp ứng miễn dịch của cá và vắc xin phòng bệnh .................................. 25 
1.5.1. Đáp ứng miễn dịch của cá ..................................................................... 25 
1.5.2. Vắc xin phòng bệnh cho cá ................................................................... 29 
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 42 
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 42 
2.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 42 
2.2.1. Động vật thí nghiệm .............................................................................. 42 
iv 
2.2.2. Hóa chất................................................................................................. 42 
2.2.3. Môi trường và dung dịch nuôi cấy vi khuẩn ......................................... 42 
2.2.4. Thiết bị .................................................................................................. 43 
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 43 
2.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 43 
2.4.1. Phương pháp thu mẫu cá bệnh .............................................................. 43 
2.4.2. Phương pháp mổ cá để lấy nội tạng ...................................................... 44 
2.4.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae ................. 44 
2.4.4. Phương pháp giữ giống các chủng vi khuẩn tuyển chọn ...................... 45 
2.4.5. Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn tuyển 
chọn ................................................................................................................. 45 
2.4.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả 
năng nhân lên và sinh độc tố gây dung huyết của vi khuẩn ............................ 46 
2.4.7. Phương pháp nghiên cứu đặc tính gây bệnh Photobacteriosis (xuất 
huyết nhiễm trùng) trên cá biển của vi khuẩn P. damselae ............................ 47 
2.4.8. Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm và xác định LD50 .......... 48 
2.4.9. Phương pháp tách chiết DNA ................................................................. 48 
2.4.10. Phương pháp Multiplex PCR phát hiện phân biệt P.damselae subsp. 
Damselae và P. damselae subsp. piscicida ..................................................... 49 
2.4.11. Phương pháp PCR phát hiện gen dly và hlyA .................................... 49 
2.4.12. Phương pháp điện di trên agarose ....................................................... 50 
2.4.13. Phương pháp tạo chủng nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực 
nghiệm ............................................................................................................. 50 
2.4.14. Đánh giá khả năng gây dung huyết của các dòng vi khuẩn đột biến giảm 
độc lực .............................................................................................................. 51 
2.4.15. Phương pháp mô bệnh học .................................................................. 52 
2.4.16. Giải trình tự DNA, xử lý và phân tích số liệu trình tự các gen ........... 53 
v 
2.4.17. Phương pháp xác định khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ ở cá 
của dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực ....................................................... 53 
2.4.18. Phương pháp ELISA xác định kháng thể đặc hiệu ............................. 53 
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 55 
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn P. damselae ................................................... 55 
3.1.1. Đặc điểm mẫu cá bệnh .......................................................................... 55 
3.1.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên cá biển 
nuôi lồng .......................................................................................................... 57 
3.1.3. Xác định phân loài P. damselase gây bệnh trên cá biển nuôi lồng bằng 
phương pháp sinh học phân tử ........................................................................ 61 
3.1.4. Nghiên cứu độc lực của các chủng P. damselae phân lập .................... 63 
3.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn P. damselae phân 
lập được ............................................................................................................ 65 
3.2.1. Ảnh hưởng nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và 
gây dung huyết của vi khuẩn P. damselae ...................................................... 65 
3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi 
khuẩn P. damselae .......................................................................................... 69 
3.2.3. Ảnh hưởng của độ mặn (NaCl) đến khả năng sinh trưởng và gây dung 
huyết của vi khuẩn P. damselae ...................................................................... 71 
3.3. Kết quả tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến giảm độc 
lực .................................................................................................................... 73 
3.3.1. Kết quả tạo và lựa chọn các dòng vi khuẩn Photobacterium damselae 
đột biến ............................................................................................................ 73 
3.3.2. Kết quả đánh giá mức độ giảm độc lực của các dòng vi khuẩn 
Photobacterium damselae đột biến ................................................................. 76 
3.3.3. Kết quả đánh giá mức độ an toàn của vi khuẩn P. damselae đột biến 
giảm độc lực trên cá mú .................................................................................. 81 
vi 
3.3.4. Kết quả phân tích kiểm tra đột biến của các chủng vi khuẩn 
Photobacterium damselae nhược độc ............................................................. 88 
3.4. Nghiên cứu mức độ tạo đáp ứng miễn dịch của dòng vi khuẩn 
Photobacterium damsalae đột biến giảm độc lực ......................................... 104 
3.4.1. Kết quả xác định khả năng tạo kháng thể đặc hiệu ............................. 104 
3.4.2. Kết quả xác định khả năng tạo kháng thể bảo hộ ............................... 106 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................... 111 
Kết luận ......................................................................................................... 111 
Kiến nghị ....................................................................................................... 111 
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ............................................................................ 112 
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................... 113 
PHỤ LỤC 
vii 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 
Chữ viết tắt Giải thích 
AFLP Amplified fragment length polymorphism 
BFNNV Barfin flounder nervous necrosis virus 
BHI Brain heart infusion 
CFU Colony forming units - đơn vị khuẩn lạc 
cs Cộng sự 
Da Dalton 
DNA Deoxyribonucleic acid 
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay 
FA Fluorescent antibody - Kháng thể huỳnh quang 
GS Grouper spleen – tế bào lách cá mú 
IgM Immunoglobulin M - globulin miễn dịch lớp M 
LD50 Lethal dose 50 - liều gây chết 50% 
nt Nucleotide 
OD Optical density - mật độ quang 
ORF Open reading frame -khung đọc mở 
PCR Polymerase chain reaction - Polymerase chain reaction 
RNA Ribonucleic acid 
TCBS Thiosulphate citrate bile salt- môi trường nuôi cấy 
UV Ultra violet 
VNN Viral nervour necrosis 
viii 
DANH MỤC CÁC BẢNG 
Trang 
Bảng 1.1. Sản lượng đánh bắt và nuôi trồng thủy hải sản trên thế giới ........... 4 
Bảng 1.2. Các loài cá biển nuôi chủ yếu ở Trung Quốc ................................... 5 
Bảng 1.3. Báo cáo quy hoạch nuôi cá biển ở Việt Nam ................................... 7 
Bảng 1.4. Một số vắc xin sản xuất từ vi khuẩn làm giảm độc lực ................. 37 
Bảng 2.1. Mồi khuếch đại các gen UreC và 16S RNA ................................... 49 
Bảng 2.2. Mồi khuếch đại các gen dly và hlyA .............................................. 49 
Bảng 3.1. Kết quả thu mẫu và mẫu bệnh phẩm .............................................. 56 
Bảng 3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn P. damsalae từ các mẫu cá biển nghi 
mắc Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) .............................. 58 
Bảng 3.3. Kết quả xác định liều LD50 của các chủng vi khuẩn P.damselae 
phân lập .......................................................................................... 64 
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng gây dung huyết 
của vi khuẩn P. damselae T1.7 và T4.3 ......................................... 69 
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của pH đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P. 
amselae T1.7 và T4.3 ..................................................................... 71 
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn 
P. damselae T1.7 và T4.3 .............................................................. 73 
Bảng 3.7. Kết quả tạo chủng vi khuẩn P. damselae nhược độc bằng tác nhân 
UV .................................................................................................. 74 
Bảng 3.8. Kết quả tạo chủng vi khuẩn P. damselae nhược độc bằng tác nhân 
kháng sinh Rifampicin ................................................................... 75 
Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra gây dung huyết của các dòng Photobacterium 
damsela đột biến ............................................................................ 77 
Bảng 3.10. Kết quả xác định liều LD50 của các dòng vi khuẩn P.damselae đột 
biến ................................................................................................. 80 
Bảng 3.11. Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của cá thí nghiệm ........... 81 
ix 
Bảng 3.12. Biểu hiện bệnh tích do P. damselae trên cá thí nghiệm ............... 83 
Bảng 3.13. Tần suất xuất hiện các tổn thương vi thể trong các tổ chức của cá 
thí nghiệm ...................................................................................... 85 
Bảng 3.14. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập lại từ cá gây nhiễm .... 87 
Bảng 3.15. So sánh độ tương đồng gen hlyA Genbank với chủng P.damselae 
T4.3 ................................................................................................ 92 
Bảng 3.16. So sánh độ ... 
2705-2711. 
155. Silerendrecht, W. J., N. Lorenzen, J. Glamann, C. Koch and J. H. W. M. 
Rombout (1995), “Immunocytochemical analysis of a monoclonal antibody 
specific for rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) granulocytes and 
thrombocytes”, Veterinary Immunology and Immunopathology, 46, pp. 349-
360. 
156. Smith, S.K., Sutton, D.C., Fuerst, J.A. and Reichelt, J.L. (1991), “Evaluation 
of the genus Listonella and reassignment of Listonella damsela (Love et al.) 
MacDonell and Colwell to the genus Photobacterium as Photobacterium 
damsela comb. nov. with an emended description”. International Journal of 
Systematic Bacteriology 41 (4), pp. 529– 534. 
157. Snieszko, S.F., Bullock, G.L., Hollis, E. and Boone, J.G. (1964), “Pasteurella 
sp. from an epizootic of white perch (Roccus americanus) in Chesapeake Bay 
tidewater areas”. Journal of Bacteriology 88, pp.1814 - 1815. 
158. Somamoto T., Yoshiura Y., Nakanishi T., Ototake M. (2005), “Molecular 
cloning and characterization of two types of CD8a from ginbuna crucian 
carp, Carassius auratus langsdorfii”, Developmental & Comparative 
Immunology 29, pp. 693–702. 
159. Sommerser, I., Krossoy, B., Biering, E. and Frost, P. (2005), “Vaccines for 
Fish in Aquaculture”, Expert Review of Vaccines, 4(1), pp. 89 - 101. 
160. Silva AJ., Pham K., Benitez JA. (2003), “Haemogglutinin/protease 
expression and mucin gel penetration in El Tor biotype Vibrio cholerae”, 
Microbiology 149, pp. 1883–1891. 
161. Sylvia Rodriguez Saint-Jean, Sara I. Pérez-Prieto (2007), “Effects of 
salmonid fish viruses on Mx gene expression and resistance to single or dual 
viral infections”, Shellfish Immunology 23, pp. 390-400. 
162. Takemura, A. (1993), “A change in an immunoglobulin M (IgM)-like 
protein during larval stages in tilapia, Oreochromis mossambicus”, 
129 
Aquaculture, 115, pp. 233-241. 
163. The state of world fishries and aquaculture contributing to food security and 
nutrition for all. 2016. Food and Agriculture Organization of the United 
Nations. 
164. Thiery, R., Cozien, J. , Cabon, J. , Lamour, F. , Baud, M. and Schneemann, 
A. (2006), "Induction of a protective immune response against viral nervous 
necrosis in the European sea bass Dicentrarchus labrax by using 
betanodavirus virus-like particles", Journal of Virology, 80, pp. 10201 – 
10207. 
165. Thuy, N. T. T., Nguyen, D. H. and Wergel, H. I. (2013), “Specific humoral 
immune response and protection against Vibrio parahaemolyticus in orange 
spotted grouper Epinephelus coioides, International Journal of Aquatic 
Science,4(1), pp. 24-35. 
166. Thyssen, A., Van Eygen, S., Hauben, L., Goris, J., Swings, J. and Ollevier, 
F. (2000), “The applica- tion of AFLP for taxonomic and epidemiological 
studies of Photobacterium damselae subsp. piscicida”, International Journal 
of Systematic and Evolutionary Microbiology 50, pp.1013–1019. 
167. Toranzo, A. E., Barreiro, S., Casal, 1. F., Figueras, A., Magarifios, B. & 
Barja, J. (1991), “Pasteurellosis in cultured gilthead seabream (Sparus 
aurata): first report in Spain”, Aquaculture 99, pp. 1-15. 
168. Toranzo AE., Barja JL. (1993), “Virulence factors of bacteria pathogenic for 
coldwater fish”, Annual Review of Fish Diseases 3, pp.5–36. 
169. Urbanczyk H., Ast JC., Dunlap V.(2011),“Phylogeny, genomics and 
symbiosis of Photobacterium”, FEMS Microbiology Reviews, 35, pp.324-
342. 
170. Vaca Ruiz M. L., Silva P. G. and Laciar A. L. (2009), “Comparison of 
microplate, agar drop and well diffusion plate methods for evaluating 
hemolytic activity of Listeria monocytogenes”, African Journal of 
Microbiology Research Vol. 3(6) pp. 319-324 
171. Van Muiswinkel, W.B. (2008), “A history of fish immunology and 
vaccination. The early days”, Fish Shellfish Immunol, 25, pp. 397-408. 
172. Vera P., Navas J. I., Fouz B. (1991), “First isolation of Vibrio damselae from 
seabream (Sparus aurata)”, Bulletin of the European Association of Fish 
Pathologists,11, pp. 112–113. 
130 
173. Victoria M. Lo pez-Do riga, Andrew C. Barnes, Nuno M. S. dos Santos and 
Anthony E. (2000), “Ellis Invasion of fish epithelial cells by Photobacterium 
damselae subsp. piscicida: evidence for receptor specificity, and effect of 
capsule and serum”, Microbiology,146, pp. 21–30. 
174. Wang Yan, Han Yin, Li Yun, Chen Ji-xiang, Zhang Xiao-hua (2007), 
“Isolation of Photobacterium damselae subsp. piscicida from diseased tongue 
sole (Cynoglossus semilaevis Gunther) in China”, Acta Microbiologica Sinica. 
47(5), pp. 130-768. 
175. Yamane Kunikazu, Asato Jun, Kawade Naofumi, Takahashi 
Hajime, Kimura Bon and Arakawa Yoshichika (2004), “Two cases of fatal 
necrotizing fasciitis caused by Photobacterium damselae in Japan”, Journal 
of Clinical Microbiology. 42,pp.1370 -1372. 
176. Yambot, A.V. and Song, Y.L. (2006), "Immunization of grouper, 
Epinephelus coioides, confers protection against a protozoan parasite, 
Cryptocaryon irritans", Aquaculture, 260, pp. 1-9. 
177. Yashgin Hassanzadeh, Nima Bahador, Majid Baseri-Salehi (2015), “First 
time isolation of Photobacterium damselae subsp. damselae from Caranx 
sexfasciatus in Persian Gulf, Iran 184 IRAN”, Journal of Microbiology, 
Volume 7 Number 3, pp. 178-184. 
178. Young Ah Cho, Hyun-Ja Han, Hee Eun Mun, Sung Hee Jung, Myoung Ae 
Park and Jin Woo Kim (2013), “Characterization of Photobacterium 
damselae subsp. piscicida isolated from cultured starry flounder, Platichthys 
stellatus in Korea”, Journal of Fish Pathology, 26(2), pp.77-88. 
179. Yoshihito Kihiwaraki (2002), “Immunological Laboratory techniques”, 
Japan International Cooperation Agency. 
180. Yu-sin Kim, Fei Ke, Qi-Ya Zhang (2009), “Effect of b-glucan on activity of 
antioxidant enzymes and Mx gene expression in virus infected grass carp”, 
Fish and Shellfish Immunology 27 (2009), pp. 336–340. 
181. Zappulli V., Patarnello T., Patarnello P., Frassineti F., Franch R., Manfrin 
A., Castagnaro M., Bargelloni L. (2005),“Direct identification of 
Photobacterium damselae subspecies piscicida by PCR-RFLP analysis”, 
Diseases Of Aquatic Organisms 63, pp. 53 - 61. 
182. Zhao DH., Sun JJ., Liu L., Zhao HH., Wang HF., Liang LQ. (2009) 
“Characterization of two phenotypes of Photobacterium damselae subsp. 
damselae isolated from diseased juvenile Trachinotus ovatus reared in cage 
131 
mariculture”, Journal of the World Aquaculture Society, 40, pp. 281–289. 
183. Zhong, Y.B., Zhang, X.H., Chen, J.X., Chi, Z.H., Sun, B.G., Li, Y. & 
Austin, B. (2006), “Overexpression, purification, characterization and 
pathogenicity of Vibrio harveyi hemolysin VHH”, Infection and Immunity 
74, pp. 6001-6005. 
PL 1 
PHỤ LỤC 
Một số bảng số liệu 
Bảng 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khẳ năng sinh trưởng của P. damselae 
T4.3 (Lần 1) 
Thời gian 
Nhiệt độ (độ C) 
4 20 28 37 40 
1h 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 
6h 0,005 0,075 0,152 0,1 0,012 
12h 0,005 0,116 0,18 0,146 0,015 
18h 0,005 0,125 0,193 0,204 0,012 
24h 0,005 0,140 0,272 0,234 0,013 
36h 0,005 0,154 0,300 0,248 0,007 
48h 0,005 0,180 0,379 0,282 0,003 
60h 0,005 0,100 0,217 0,205 0,002 
Bảng 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khẳ năng sinh trưởng của P. damselae 
T4.3 (Lần 2) 
Thời gian 
Nhiệt độ (độ C) 
4 20 28 37 40 
1h 0,005 0,006 0,005 0,005 0,005 
6h 0,005 0,076 0,151 0,101 0,013 
12h 0,005 0,115 0,178 0,147 0,016 
18h 0,005 0,126 0,194 0,203 0,014 
24h 0,005 0,141 0,272 0,234 0,013 
36h 0,005 0,154 0,300 0,248 0,007 
48h 0,005 0,181 0,380 0,282 0,003 
60h 0,005 0,121 0,219 0,208 0,002 
PL 2 
Bảng 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khẳ năng sinh trưởng của P.damselae T1.7 
Thời gian 
Nhiệt độ (độ C) 
4 20 28 37 40 
1h 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 
6h 0,005 0,06 0,08 0,13 0,012 
12h 0,005 0,095 0,15 0,164 0,021 
18h 0,005 0,114 0,198 0,180 0,013 
24h 0,005 0,14 0,273 0,24 0,011 
36h 0,005 0,164 0,28 0,264 0,014 
48h 0,005 0,19 0,36 0,289 0,016 
60h 0,005 0,102 0,192 0,161 0,002 
Bảng 4. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh sản của vi khuẩn 
P. damselae T1.7 và T4.3 
pH 
Chỉ số OD 
T1.7 T4.3 
5 0.005 0.006 
5,5 0.068 0.055 
6 0.126 0.148 
6,5 0.238 0.262 
7 0.262 0.285 
7,5 0.305 0.312 
8 0.346 0.334 
8,5 0.425 0.284 
9 0.326 0.263 
PL 3 
Bảng 5. Ảnh hưởng của độ mặn đến sự sinh sản của vi khuẩn 
P. damselae T1.7 và T4.3 
Độ mặn (%) 
Chỉ số OD 
T1.7 T4.3 
1 0.345 0.356 
1,5 0.362 0.38 
2 0.408 0.423 
2,5 0.382 0.393 
3 0.294 0.313 
3,5 0.291 0.302 
4 0.256 0.269 
4,5 0.183 0.192 
5 0.134 0.125 
5,5 0.067 0.052 
6 0.006 0.004 
PL 4 
Bảng 6. Kết quả theo dõi các bệnh thường gặp trên cá biển nuôi lồng các tỉnh Quảng 
Ninh, Nam Định, Hải Phòng năm 2014 -2018 
TT Loại bệnh 
gặp 
Biện pháp trị bênh đã sử dụng Hiệu quả trị bệnh 
1 Bệnh mòn 
vây và đuôi 
- Dùng kháng sinh (65%) 
- Dùng hóa chất (iodine, KMnO4) để 
tắm cho cá bị bệnh kết hợp với cho 
ăn kháng sinh (25%) 
- Hiệu quả không cao 
2 Bệnh sán lá 
mang 
- Dùng formalin (38%) 
- Dùng Malachite green 25% 
- Dipterex (12%) 
- Thảo dược (15%) 
- Tắm nước ngọt (10%) 
-formalin, malachite 
green bệnh chỉ giảm 
- Dipterex cho hiệu 
quả 
- Thảo dược không 
hiệu quả 
- Tắm nước ngọt chỉ 
giảm một thời gian 
ngăn 
3 Bệnh rận cá - Dùng Malachite green 59% 
- Dipterex (31%) 
- Tắm nước ngọt (10%) 
- Dùng Malachite 
green chỉ giảm bênh 
- Dipterex cho hiệu 
quả cao 
4 Bệnh đỉa cá - Dùng Malachite green 53% 
- Dipterex (33%) 
-Không chữa (14%) 
- Dùng Malachite 
green chỉ giảm bênh 
- Dipterex cho hiệu 
quả tốt 
5 Bệnh hoại tử 
thần kinh 
-Không chữa (24%) 
- Sử dụng kháng sinh và tắm hóa 
chát (76%) 
- Không có hiệu quả 
6 Bệnh xuất 
huyết nhiễm 
trùng 
- Sử dụng kháng sinh (28%) 
- Dùng hóa chất (12%) 
Chưa có biện pháp chữa (70%) 
- Hiệu quả rất thấp, 
khi được khi không 
7 Bệnh xuất 
huyết lở loét 
- Không chữa (40%) 
- Sử dụng kháng sinh và tắm hóa 
chát (60%) 
- Hiệu quả rất thấp 
8 Bệnh u sần - Sử dụng kháng sinh và tắm hóa 
chát (100%) 
- Hiệu quả thấp 
PL 5 
 Bảng 7. Bảng số liệu xác định LD50 của các chủng vi khuẩn phân lập được 
Tên chủng/Chỉ tiêu 
theo dõi 
Mật độ vi khuẩn theo hệ số 10 
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 
T1.7 
Số chết 50 50 50 50 46 41 38 31 28 25 17 
Tỷ lệ chết 100 100 100 100 92 82 76 62 56 50 34 
Số sống 0 0 0 0 4 9 12 19 22 25 33 
Số chết cộng dồn 361 311 261 211 161 115 74 36 5 1 0 
Số sống cộng dồn 0 0 0 0 4 13 25 44 66 91 124 
Tỷ lệ chết cộng dồn 
100,00 
100,00 
100,00 
100,00 
97,58 
89,84 
74,75 
45,00 
7,04 
1,09 
- 
T4.3 
Số chết 50 50 50 50 43 35 32 28 25 19 11 
Tỷ lệ chết 100 100 100 100 86 70 64 56 50 38 22 
Số sống 0 0 0 0 7 15 18 22 25 31 39 
Số chết cộng dồn 343 293 243 193 143 100 65 33 5 1 0 
Số sống cộng dồn 0 0 0 0 7 22 40 62 87 118 157 
Tỷ lệ chết cộng dồn 
100,00 
100,00 
100,00 
100,00 
95,33 
81,97 
61,90 
34,74 
5,43 
0,84 
- 
T1.8 
Số chết 50 50 50 50 47 40 38 29 25 18 15 
Tỷ lệ chết 100 100 100 100 94 80 76 58 50 36 30 
Số sống 0 0 0 0 3 10 12 21 25 32 35 
Số chết cộng dồn 359 309 259 209 159 112 72 34 5 1 0 
Số sống cộng dồn 0 0 0 0 3 13 25 46 71 103 138 
Tỷ lệ chết cộng dồn 
100,00 
100,00 
100,00 
100,00 
98,15 
89,60 
74,23 
42,50 
6,58 
0,96 
- 
B5.22 
Số chết 50 50 47 41 35 28 25 19 13 9 2 
Tỷ lệ chết 100 100 94 82 70 56 50 38 26 18 4 
Số sống 0 0 3 9 15 22 25 31 37 41 48 
Số chết cộng dồn 300 250 200 153 112 77 49 24 5 1 0 
Số sống cộng dồn 0 0 3 12 27 49 74 105 142 183 231 
Tỷ lệ chết cộng dồn 
100,00 
100,00 
98,52 
92,73 
80,58 
61,11 
39,84 
18,60 
3,40 
0,54 
- 
T4.4 
Số chết 50 50 46 36 31 26 23 16 11 5 1 
Tỷ lệ chết 100 100 92 72 62 52 46 32 22 10 2 
Số sống 0 0 4 14 19 24 27 34 39 45 49 
Số chết cộng dồn 283 233 183 137 101 70 44 21 5 1 0 
Số sống cộng dồn 0 0 4 18 37 61 88 122 161 206 255 
Tỷ lệ chết cộng dồn 
100,00 
100,00 
97,86 
88,39 
73,19 
53,44 
33,33 
14,69 
3,01 
0,48 
- 
B10.25 
Số chết 50 36 29 25 19 12 9 5 1 1 0 
Tỷ lệ chết 100 72 58 50 38 24 18 10 2 2 0 
Số sống 0 14 21 25 31 38 41 45 49 49 50 
PL 6 
Số chết cộng dồn 190 140 104 75 50 31 19 10 5 1 0 
Số sống cộng dồn 0 14 35 60 91 129 170 215 264 313 363 
Tỷ lệ chết cộng dồn 
100,00 
90,91 
74,82 
55,56 
35,46 
19,38 
10,05 
4,44 
1,86 
0,32 
- 
T4.2 
Số chết 50 50 50 43 37 27 25 18 11 7 2 
Tỷ lệ chết 100 100 100 86 74 54 50 36 22 14 4 
Số sống 0 0 0 7 13 23 25 32 39 43 48 
Số chết cộng dồn 305 255 205 155 112 75 48 23 5 1 0 
Số sống cộng dồn 0 0 0 7 20 43 68 100 139 182 230 
Tỷ lệ chết cộng dồn 
100,00 
100,00 
100,00 
95,68 
84,85 
63,56 
41,38 
18,70 
3,47 
0,55 
- 
 Bảng 8. Bảng số liệu xác định LD50 của các dòng vi khuẩn đột biến không gây dung 
huyết hồng cầu 
Tên chủng/Chỉ tiêu 
theo dõi 
Mật độ vi khuẩn theo hệ số 10 
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 
T4.3K6 
Số chết 42 35 29 25 19 11 7 3 1 1 0 
Tỷ lệ chết 84 70 58 50 38 22 14 6 2 2 0 
Số sống 8 15 21 25 31 39 43 47 49 49 50 
Số chết cộng dồn 176 134 99 70 45 26 15 8 5 1 0 
Số sống cộng dồn 8 23 44 69 100 139 182 229 278 327 377 
Tỷ lệ chết cộng dồn 
95,65 
85,35 
69,23 
50,36 
31,03 
15,76 
7,61 
3,38 
1,77 
0,30 
- 
T4.3K7 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 
Số chết 48 41 39 33 29 25 17 11 8 2 1 
Tỷ lệ chết 96 82 78 66 58 50 34 22 16 4 2 
Số sống 2 9 11 17 21 25 33 39 42 48 49 
Số chết cộng dồn 248 200 159 120 87 58 33 16 5 1 0 
Số sống cộng dồn 2 11 22 39 60 85 118 157 199 247 296 
Tỷ lệ chết cộng dồn 
99,20 
94,79 
87,85 
75,47 
59,18 
40,56 
21,85 
9,25 
2,45 
0,40 
- 
T4.3K8.1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 
Số chết 40 37 31 25 15 9 4 1 1 1 0 
Tỷ lệ chết 80 74 62 50 30 18 8 2 2 2 0 
Số sống 10 13 19 25 35 41 46 49 49 49 50 
Số chết cộng dồn 167 127 90 59 34 19 10 6 5 1 0 
Số sống cộng dồn 2 15 34 59 94 135 181 230 279 328 378 
Tỷ lệ chết cộng dồn 
98,82 
89,44 
72,58 
50,00 
26,56 
12,34 
5,24 
2,54 
1,76 
0,30 
- 
T4.3K8.2 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 
Số chết 32 25 11 3 0 0 0 0 0 0 0 
Tỷ lệ chết 64 50 22 6 0 0 0 0 0 0 0 
Số sống 18 25 39 47 50 50 50 50 50 50 50 
Số chết cộng dồn 76 44 19 8 5 5 5 5 5 1 0 
Số sống cộng dồn 2 27 66 113 163 213 263 313 363 413 463 
Tỷ lệ chết cộng dồn 
97,44 
61,97 
22,35 
6,61 
2,98 
2,29 
1,87 
1,57 
1,36 
0,24 
- 
PL 7 
T4.3U4.5 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 
Số chết 42 39 26 21 12 8 3 1 1 1 0 
Tỷ lệ chết 84 78 52 42 24 16 6 2 2 2 0 
Số sống 8 11 24 29 38 42 47 49 49 49 50 
Số chết cộng dồn 157 115 76 50 29 17 9 6 5 1 0 
Số sống cộng dồn 2 13 37 66 104 146 193 242 291 340 390 
Tỷ lệ chết cộng dồn 
98,74 
89,84 
67,26 
43,10 
21,80 
10,43 
4,46 
2,42 
1,69 
0,29 
- 
T4.3U6 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 
Số chết 26 24 9 1 0 0 0 0 0 0 0 
Tỷ lệ chết 52 48 18 2 0 0 0 0 0 0 0 
Số sống 24 26 41 49 50 50 50 50 50 50 50 
Số chết cộng dồn 65 39 15 6 5 5 5 5 5 1 0 
Số sống cộng dồn 2 28 69 118 168 218 268 318 368 418 468 
Tỷ lệ chết cộng dồn 
97,01 
58,21 
17,86 
4,84 
2,89 
2,24 
1,83 
1,55 
1,34 
0,24 
-