Luận án Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá chẽm con (lates calcarifer bloch 1790) đối với vi khuẩn streptococcus iniae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 
----------------------- 
TRẦN VĨ HÍCH 
NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA 
CÁ CHẼM CON (Lates calcarifer Bloch 1790) 
ĐỐI VỚI VI KHUẨN Streptococcus iniae 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 
NHA TRANG – 2014 
 1 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 
----------------------- 
TRẦN VĨ HÍCH 
NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA 
CÁ CHẼM CON (Lates calcarifer Bloch 1790) 
ĐỐI VỚI VI KHUẨN Streptococcus iniae 
Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản 
Mã số: 62 62 03 01 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Dũng 
NHA TRANG – 2014 
 2 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. các kết quả thu được 
trong luận án này là kết quả nghiên cứu của dự án Bệnh ở cá chẽm, thuộc hợp phần 
II dự án SRV-2701 do Na Uy tài trợ mà tôi là một thành viên tham gia thực hiện dự 
án với tư cách là một nghiên cứu sinh theo kế hoạch hoạt động đào tạo của dự án. 
Tôi đã được Chủ nhiệm dự án cho phép sử dụng tất cả số liệu nghiên cứu được cho 
luận án tiến sĩ của mình. 
Tôi xin cam đoan các kết quả, số liệu trong luận án là hoàn toàn trung thực 
và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào. 
NGHIÊN CỨU SINH 
 Trần Vĩ Hích 
 i
LỜI CẢM ƠN 
Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Khoa 
Nuôi trồng Thủy sản, Phòng Đào tạo Đại học và Sau Đại học, dự án SRV 2701 đã 
quan tâm giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu sinh. 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Tiến sĩ Nguyễn Hữu Dũng, người đã định 
hướng nghiên cứu và trực tiếp khuyên bảo và giúp đỡ, giải quyết những khó khăn 
cả về vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi hiểu rõ hơn 
về giá trị của nghiên cứu khoa học. 
Xin cám ơn Phó Giáo sư Tiến sĩ Đỗ Thị Hòa, người đã dìu dắt tôi từ những 
ngày đầu chập chững trên con đường nghiên cứu khoa học và không ngừng dõi theo 
từng bước chân của tôi. Chính Cô và Phó Giáo sư Tiến sĩ Nguyễn Đình Mão là 
những người đã tạo cơ hội cho tôi trở lại con đường nghiên cứu khoa học. 
Cho phép tôi kính gửi lòng biết ơn chân thành đến Giáo sư Heidrun Inger 
Wergeland, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong thời gian học tập phương pháp 
phân tích mẫu tại Na Uy và giúp đỡ tôi trong việc công bố công trình nghiên cứu 
trên tạp chí quốc tế. 
Xin cám ơn Tiến sĩ Lại Văn Hùng và Tiến sĩ Lục Minh Diệp, những người 
luôn tin tưởng và động viên tôi trong nghiên cứu khoa học cũng như giúp đỡ về vật 
chất trong thời gian đầu của quá trình nghiên cứu. 
Cám ơn Tiến sĩ Lê Minh Hoàng, Nghiên cứu sinh Đinh Văn Khương và 
Thạc sĩ Vũ Đặng Hạ Quyên luôn kịp thời cung cấp các bài báo khoa học trong quá 
trình nghiên cứu. 
Xin chân thành cám ơn sự động viên, khích lệ và giúp đỡ của các Thầy, Cô 
giáo trong Khoa Nuôi trồng Thủy sản, cảm ơn các em sinh viên ngành Bệnh học 
thủy sản các khóa từ 46BH đến 50BH đã cùng tôi thực hiện nghiên cứu này. 
Lời cảm ơn cuối cùng tôi xin được giành cho gia đình của tôi: Ba, má, các 
anh chị, vợ và con tôi, những người đã luôn yêu thương, nâng đỡ tôi về vật chất lẫn 
tinh thần mà từ bao lâu nay tôi vẫn chưa nói ra một lời cám ơn. 
 ii
MỤC LỤC 
 Trang 
LỜI CAM ĐOAN i 
LỜI CÁM ƠN ii 
MỤC LỤC iii 
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v 
DANH MỤC CÁC BẢNG vii 
DANH MỤC CÁC HÌNH viii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG LUẬN 4
1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌNH HÌNH NUÔI CÁ CHẼM 4
1.1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm. 4
1.1.2 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới 5
1.1.2.1 Sản lượng cá chẽm nuôi trên thế giới 5
1.1.2.2 Các hình thức nuôi cá chẽm thương phẩm 6
1.1.3 Tình hình nuôi cá chẽm tại Việt Nam 7
1.1.4 Các bệnh thường gặp ở cá chẽm nuôi 7
1.1.4.1 Bệnh do virus 7
1.1.4.2 Bệnh do vi khuẩn 8
1.1.4.3 Bệnh do kí sinh trùng 10
1.2 BỆNH DO Streptococcus iniae TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 11
1.2.1 Tình hình dịch bệnh Streptococcus iniae trong nuôi trồng thủy sản 11
1.2.2 Dấu hiệu bên ngoài của bệnh do Streptococcus inae 13
1.2.3 Giải phẫu bệnh lý cá nhiễm Streptococcus iniae 13
1.2.4 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn S. iniae 14
1.2.5 Biện pháp phòng và trị bệnh do Streptococcus iniae 16
1.3 HỆ THỐNG MIỄN DỊCH Ở CÁ XƯƠNG 20
1.3.1 Miễn dịch tự nhiên 20
1.3.1.1 Hàng rào vật lý và hóa học 20
 iii
1.3.1.2 Hàng rào tế bào 21
1.3.1.3 Hàng rào thể dịch 22
1.3.2 Đáp ứng miễn dịch thích ứng 24
1.3.2.1 Hàng rào tế bào trong đáp ứng miễn dịch thích ứng 24
1.3.2.2 Hàng rào thể dịch trong đáp ứng miễn dịch thích ứng 25
1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của cá 27
1.3.3.1 Các yếu tố ngoại cảnh 27
1.3.3.2 Các yếu tố nội tại 28
1.3.3.3 Các yếu tố phái sinh 28
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34
2.1 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 34
2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. 34
2.3 SƠ ĐỒ KHỐI NỘI DUNG NGHIÊN CỨU (Hình 2.1) 34
2.4 PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ PHÂN TÍCH MẪU 34
2.4.1 Phân lập và xác định đặc điểm vi khuẩn Streptococcus iniae. 34
2.4.1.1 Phân lập vi khuẩn S. iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 34
2.4.1.2 Xác định độc lực của vi khuẩn phân lập 37
2.4.1.3 Kiểm tra độ nhạy kháng sinh của các chủng S. iniae phân lập 38
2.4.1.4 Nghiên cứu phương thức xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae 
vào cá chẽm 38
2.4.1.5 Tính tương đồng kháng nguyên của các chủng phân lập 39
2.4.2 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của các chẽm đối với vi khuẩn S. iniae 41
2.4.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. 
iniae và ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch này. 41
2.4.2.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với tế bào vi khuẩn S. 
iniae bất hoạt bằng formalin (Formalin Killed Cell - FKC) 43
2.4.3 Nghiên cứu sự hình thành và phát triển tuyến ức của cá chẽm 49
2.4.4 Phương pháp phân tích số liệu 49
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50
 iv
3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN 
Streptococcus iniae PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM 50
3.1.1 Phân lập vi khuẩn S. iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 50
3.1.1.1 Tình hình dịch bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 50
3.1.1.2 Đặc điểm phân loại của các chủng vi khuẩn phân lập 52
3.1.2 Độc lực của vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá bệnh 54
3.1.3 Độ nhạy của S. iniae với các loại kháng sinh 57
3.1.4 Con đường cảm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm 59
3.1.5 Tính tương đồng kháng nguyên của các chủng vi khuẩn gây bệnh đã 
phân lập 62
3.2 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM ĐỐI VỚI VI KHUẨN S. iniae 64
3.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. 
iniae bất hoạt và ảnh hưởng của β-glucan đến đáp ứng này 64
3.2.1.1 Hoạt tính thực bào và chỉ số thực bào 64
3.2.1.2 Nồng độ lysozyme trong huyết thanh của cá chẽm 66
3.2.1.3 Khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá chẽm 67
3.2.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với tế bào vi khuẩn S. 
iniae bất hoạt bằng formalin (FKC) 70
3.2.2.1 Biến động hàm lượng kháng thể đặc hiệu trong máu cá thí nghiệm 
sau khi tiêm FKC 70
3.2.2.2 Đặc điểm protein kháng nguyên của vi khuẩn S. iniae 74
3.2.2.3 Hiệu quả bảo vệ của tế bào vi khuẩn bất hoạt (FKC) đối với bệnh do 
Streptococcus iniae gây ra ở cá chẽm 76
3.3 SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA TUYẾN ỨC 80
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 85
TÀI LIỆU THAM KHẢO 87
 v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 
Viết tắt Viết đầy đủ Tiếng Việt 
BA Blood Agar Môi trường thạch máu 
CFU Colony Forming Unit Đơn vị khuẩn lạc 
FKC Formalin-Killed Cells Tế bào vi khuẩn bất hoạt bằng formalin
IP Intraperitoneal Injection Tiêm vào xoang bụng 
kDa Kilo Dalton Đơn vị tính khối lượng phân tử protein
KF KF-Streptococcus Agar Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 
L-15 Leibovitz Môi trường nuôi cấy tế bào 
LD50 Lethal Dose 50% Liều gây chết 50% 
OD Optical Density Mật độ quang 
PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch muối sinh lý đệm Phosphate
RPP Relative Percent Protection Hệ số bảo vệ tương đối 
SDS-
PAGE 
Sodium Dodecyl Sulfate - 
Polyacrylamide Gel Electrophoresis
Điện di trên gel polyacrylamide có 
SDS 
TSA Tryptic Soy Agar Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 
TSB Tryptic Soy Broth Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 
xg Gravity Đơn vị tính lực ly tâm 
 vi
DANH MỤC CÁC BẢNG 
Tên bảng Trang
Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus iniae. 15 
Bảng 1.2. Hiệu quả bảo vệ của các loại vaccine phòng bệnh do vi khuẩn S. 
iniae sau bốn tuần tiêm chủng. 
18 
Bảng 1.3 Nguồn gốc và tác dụng của cytokin ở cá 29 
Bảng 1.4 Sự hình thành các cơ quan và mô lympho ở một số loài cá 32 
Bảng 3.1 Nguồn phân lập các chủng S. iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 50 
Bảng 3.2 Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá 
chẽm nuôi tại Khánh Hòa 
53 
Bảng 3.3 Độ nhạy cảm của các chủng vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá chẽm 
nuôi tại Khánh Hòa đối với 12 loại kháng sinh phổ biến trong nuôi trồng 
thủy sản. 
58 
Bảng 3.4 Thời điểm phát hiện vi khuẩn S. iniae ở các cơ quan của cá chẽm 59 
 vii
DANH MỤC CÁC HÌNH 
Tên hình Trang
Hình 1.1 Sản lượng và giá trị cá chẽm nuôi của thế giới từ năm 1959 – 2009 5 
Hình 1.2 Tỉ lệ sản lượng cá chẽm nuôi của các nước với tổng sản lượng cá 
chẽm nuôi trên thế giới từ năm 1959-2009 
6 
Hình 1.3 Một số bệnh thường gặp ở cá chẽm nuôi 10 
Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 35 
Hình 2.2 Phương pháp xác định kháng thể kháng S. iniae trong huyết thanh 
cá chẽm 
45 
Hình 3.1 Cá chẽm mắc nhiễm Streptococcus iniae nuôi tại Khánh Hòa 51 
Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào các chủng vi khuẩn S. iniae phân 
lập từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa. 
52 
Hình 3.3 Tỉ lệ chết tích lũy ở các nhóm cá chẽm thí nghiệm sau khi tiêm S. 
iniae vào xoang bụng với các nồng độ khác nhau. 
55 
Hình 3.4 Tương quan giữa nồng độ vi khuẩn S. iniae tiêm vào xoang bụng 
và tỉ lệ chết tích lũy của các nhóm cá chẽm thí nghiệm. 
56 
Hình 3.5 Mang cá chẽm nhuộm mô hóa miễn dịch với vi khuẩn ở mang sơ 
cấp, mang thứ cấp và xoang tĩnh mạch mang 
59 
Hình 3.6 Thận cá chẽm nhiễm S. iniae nhuộm mô hóa miễn dịch 60 
Hình 3.7 Một số cơ quan cá chẽm nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae sau 
khi nhuộm mô hóa miễn dịch 
61 
Hình 3.8 Hiệu giá kháng thể của huyết thanh cá chẽm đối với các chủng S. 
iniae khác nhau 
63 
Hình 3.9 Hoạt tính thực bào của đại thực bào cá chẽm trước và sau khi tiêm 
vi khuẩn S. iniae. 
64 
Hình 3.10 Các tế bào nấm men bị thực bào bởi các đại thực bào phân lập từ 
tiền thận cá chẽm 
65 
Hình 3.11 Chỉ số thực bào của đại thực bào cá chẽm trước và sau khi tiêm 65 
 viii
 ix
vi khuẩn S. iniae 
Hình 3.12 Nồng độ lyzozyme của huyết thanh cá chẽm trước và sau khi 
tiêm vi khuẩn S. iniae 
66 
Hình 3.13 Tỉ lệ (%) vi khuẩn S. iniae bị ức chế bởi huyết thanh cá chẽm.
67 
Hình 3.14 Tỉ lệ cá chẽm có kháng thể đặc hiệu kháng lại S. iniae trong 
huyết thanh cá chẽm đã được gây miễn dịch 
71 
Hình 3.15 Biến động hàm lượng kháng thể đặc hiệu kháng vi khuẩn S. 
iniae trong huyết thanh của cá chẽm được tiêm vaccine thử nghiệm so với 
cá đối chứng (OD492 nm) 
72 
Hình 3.16 Tương quan giữa mật độ quang và độ pha loãng của huyết thanh 
cá chẽm 
73 
Hình 3.17 SDS-PAGE protein profile của tế bào vi khuẩn S. iniae xử lý 
bằng mutanolysin 
74 
Hình 3.18 Phân tích western blot của các chủng vi khuẩn S. iniae. 75 
Hình 3.19 Tỷ lệ chết tích lũy ở các nhóm cá thí nghiệm trong thời gian theo 
dõi sau khi công cường độc bằng vi khuẩn S. iniae chủng VN091211R 
78 
Hình 3.20 Mầm tuyến ức cá chẽm 10 ngày sau khi nở. 80 
Hình 3.21 Tuyến ức cá chẽm 12 và 14 ngày sau khi nở. 81 
Hình 3.22 Tuyến ức cá chẽm 30 ngày sau khi nở 82 
 MỞ ĐẦU 
Trong những năm gần đây, thành công của những mô hình thử nghiệm nuôi 
cá chẽm ở các ao nuôi tôm hoang hóa đã khẳng định cá chẽm là đối tượng có hiệu 
quả kinh tế cao. Đặc biệt từ năm 2005, khi đã tìm được thị trường xuất khẩu sản 
phẩm cá chẽm phi lê đông lạnh, nghề nuôi cá chẽm thương phẩm phát triển nhanh 
chóng ở một số tỉnh như Bến Tre, Cà Mau, Bạc Liêu, Khánh Hòa Cùng với sự 
phát triển về diện tích và mức độ thâm canh của nghề nuôi cá chẽm, dịch bệnh trên 
đối tượng nuôi mới này bắt đầu xuất hiện, gây thiệt hại ở một số cơ sở nuôi cá 
thương phẩm. Trong đó, bệnh truyền nhiễm đóng một vai trò hết sức quan trọng. 
Nghiên cứu của Wendover (2010) về các bệnh quan trọng ở cá chẽm nuôi tại 
Châu Á cho biết trong tất cả các bệnh thường gặp ở cá chẽm, bệnh do vi khuẩn 
Streptococcus iniae gây ra là bệnh phổ biến nhất [190]. 
Streptococcus iniae lần đầu tiên được biết đến vào năm 1976, khi Pier và 
Madin công bố kết quả định danh chủng vi khuẩn đã được phân lập từ ổ viêm dưới 
da cá heo nước ngọt sông Amazon nuôi tại San Francisco từ năm 1972 [137], từ đó 
đến nay, dịch bệnh cứ liên tục xảy ra trên khắp các vùng nuôi trên thế giới và ở hầu 
hết cá loài cá nuôi như cá bơn Paralichthys olivaceus, cá thơm Plecoglossus 
altivelis, cá hồi Oncorhynchus rhodurus, cá dìa xám Siganus fuscescens, cá chẽm 
Lates calcarifer, cá điêu hồng Oreochromis sp., cá chẽm châu Âu Dicentrarchus 
labrax [121, 122, 127, 173]... gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế cho người nuôi. 
Sử dụng kháng sinh là một trong những biện pháp có hiệu quả trong việc trị 
bệnh do S. iniae gây ra. Tuy nhiên, việc sử dụng thường xuyên kháng sinh sẽ làm 
gia tăng các dòng vi khuẩn kháng thuốc. Nghiên cứu của Aoki và các cộng sự đã 
chứng minh sự gia tăng các dòng liên cầu khuẩn kháng thuốc [13]. Probiotic hay 
một số chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu như inositol, levalmisole hay β-
glucan cũng đã được sử dụng trong việc phòng trị bệnh do S. iniae gây ra ở cá. Tuy 
nhiên, hiệu quả của việc phòng trị bệnh bằng các phương pháp này không cao và rất 
khác nhau ở các nghiên cứu khác nhau [101, 136, 145, 149, 191]. 
 1
Vaccine là sự lựa chọn tốt nhất trong việc kiểm soát bệnh do S. iniae gây ra. 
Tuy nhiên, đôi khi việc sử dụng vaccine không mang lại hiệu quả như mong muốn 
do những thay đổi mạnh mẽ của vi khuẩn nhằm thích nghi với điều kiện môi trường 
cho phép chúng thay đổi cấu trúc protein kháng nguyên. Do đó, mặc dù đã có một 
số loại vaccine phòng bệnh do S. iniae gây ra nhưng những nghiên cứu để tạo ra 
những loại vaccine có hiệu lực cao vẫn hết sức cần thiết. Mặt khác, khả năng tiếp 
nhận vaccine và chất kích thích miễn dịch còn phụ thuộc vào từng loài cá, thời điểm 
sử dụng và phương pháp dẫn truyền. Nếu cá giống bị phơi nhiễm với một loại 
kháng nguyên nào đó quá sớm thì thay vì kích thích hệ thống miễn dịch sinh kháng 
thể, hiện tượng vô cảm miễn dịch xuất hiện và việc sản sinh kháng thể không xảy ra 
khi cá tiếp xúc lại với kháng nguyên này. Vì vậy việc chủng vaccine quá sớm cho 
cá giống có thể gây ra những hậu quả nghiêm trọng. 
Từ thực tiễn nêu trên, đề tài: ”Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá chẽm 
con (Lates calcarifer Bloch 1790) đối với vi khuẩn Streptococcus iniae” được 
thực hiện. 
Mục tiêu của đề tài: 
Cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng các biện pháp phòng bệnh sớm 
cho cá chẽm bằng phương pháp miễn dịch học 
Các nội dung  ... , Okamoto, N. and Ykeda, Y. (1994), 
"Characteristics of natural killer cells in Carp", Fish Pathology. 29, pp. 199-
203. 
175. Sveinbjornsson, B., Olsen, R. and Paulsen, S. (1996), "Immunocytochemical 
localization of lysozyme in intestinal eosinophilic granule cells (EGCs) of 
Atlantic salmon, Salmo salar L.", Journal of Fish Diseases. 19, pp. 349-355. 
176. Tafalla, C., Figueras, A. and Novoa, B. (2001), "Viral hemorrhagic 
septicemia virus alters turbot Scophthalmus maximus macrophage nitric 
oxide production", Disease of Aquatic Organism. 47, pp. 101-107. 
 107
177. Tanaka, S., Takagi, M. and Miyazaki, T. (2004), "Histopathological studies 
on viral nervous necrosis of sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus 
Thunberng, at the grow-out stage", Journal of fish diseases. 27, pp. 385-399. 
178. Tatner, M.F. (1996), "Natural changes in the immune system of fish", in 
Iwama, G. and Nakanishi, T., Editors, The fish immune system Organism, 
Pathogen, and Environment Academic press, pp. 255-288. 
179. Tendencia, E.A. (2002), "Vibrio harveyi isolated from cage-cultured seabass 
Lates calcarifer Bloch in the Philippines", Aquaculture research. 33, pp. 455-
458. 
180. Tsujii, T. and Seno, S. (1990), "Melano-macrophage centers in the 
aglomerular kidney of the sea horse (Teleost): morphologic studies on its 
formation and possible function", Anatomical Record. 226, pp. 460-470. 
181. Tucker, J.W., Russel, D.J. and Rimmer, M.A. (2002), "Barramundi culture: 
A success story for aquaculture in Asia and Australia", World Aquaculture 
Society. 33(4), pp. 67-72. 
182. Turker, J.W. (2000), Marine fish culture, Kluwer Academic Publishers. 
Boston/ Dordrecht/ London, 750. 
183. Uchida, D., Hirose, H., Chang, P.K., Aranishi, F., Hirayabu, E., Mano, N., 
Mitsuya, T., Prayitno, S.B. and Natori, M. (2000), "Characterization of 
Japanese eel immunoglobulin M and its level in serum", Comparative 
Biochemestry and Physiology. 127, pp. 525-532. 
184. Ugajin, M. (1981), "Studies on Streptococcus sp. as a causative agent of an 
epizootic among the cultured Ayu (Plecoglossus altivelis) in Tochigi 
Prefecture, Japan, 1980", Fish Pathology 16(3), pp. 119-127. 
185. Verlhac, V., Obach, A., Gabaudan, J., Schuep, W. and Hole, R. (1998), 
"Immunomodulation by dietary vitamin C and β-glucan in rainbowtrout 
(Oncorhynchus mykiss)", Fish Shellfish Immunology. 8, pp. 409-424. 
186. Vilain, C., Wetzel, M.C., Du Pasquier, L. and Charlemagne, J. (1984), 
"Structural and functional analysis of spontaneous antinitrophenyl antibodies 
 108
in three cyprinid fish species: carp (Cyrinus carpio), goldfish (Carassius 
auratus) and tench (Tinca tinca)", Developmental and Comparative 
immunology. 8, pp. 611-622. 
187. Voss, E.W. and Sigel, M.M. (1972), "Valence and temporal change in 
affinity of purified 7s and 18s nurse shark anti-2,4-dinitrophenyl 
antibodies", Journal of Immunology. 109, pp. 665-673. 
188. Watts, M., Munday, B.L. and Burke, C.M. (2001), "Immune responses of 
teleost fish", Australian Veterinary Journal. 79, pp. 570-574. 
189. Welker, T.L., Lim, C., Yildrim-Aksoy, M., Shelby, R. and Klesius, P.H. 
(2007), "Immune response and resistance to stress and Edwardsiella ictaluri 
challenge in channel catfish, Ictalurus punctatus, fed diets containing 
commercial whole-cell or yeast subcomponents", Journal of World 
Aquaculture Society. 38, pp. 24-35. 
190. Wendover, N. (2010), "Important disease of farmed barramundi in asia", 
aquaculture asia paciffic. 6(2), pp. 26-29. 
191. Whittington, R., Lim, C. and Klesius, P.H. (2005), "Effect of dietary beta-
glucan levels on the growth response and efficacy of Streptococcus iniae 
vaccine in Nile tilapia, Oreochromis niloticus", Aquaculture. 248, pp. 217-
225. 
192. Whittington, R.J., Munday, B.L., Akhlaghi, M., Reddacliff, G.L. and Carson, 
J. (1994), "Humoral and peritoneal cell responses of rainbow trout 
(Oncorhynchus mykiss) to ovalbumin, Vibrio anguillarum and Freund’s 
complete adjuvant following intraperitoneal and bath immunisation", Fish 
and Shellfish Immunology. 4, pp. 475-488. 
193. Whyte, S.K. (2007), "The innate immune response of finfish: A review of 
current knowledge", Fish and Shellfish Immunology. 23, pp. 1127-1151. 
194. Wilson, M.R., Bengten, E., Miller, N., Clem, L.W., Du Pasquier, L. and 
Warr, G.W. (1997), A novel chimeric Ig heavy chain from a teleost fish 
 109
 110
shares similarities to IgD, Proceedings of the National Academy of Sciences 
of the United States of America, pp. 4593-4597. 
195. Wilson, M.R. and Warr, G.W. (1992), "Fish immunoglobulins and the genes 
that encode them", Annual Review of Fish Disease. 2, pp. 201-221. 
196. Xie, H.X., Nie, P., Zhang, Y.A., Sun, B.J., Sun, J., Yao, W.J. and Gao, Q. 
(2006), "Histological and cytological studies on the developing thymus of 
mandarin fish Siniperca chuatsi (Perciformes: Teleostei)", J. Appl. Ichthyol. 
22, pp. 125-131. 
197. Yano, T. (1996), "The nonspecific immune system: Humoral defence", in 
Iwama, G. and Nakanishi, T., Editors, The Fish Immune System: Organism, 
Pathogen and Environment, Academic Press, San Diego, pp. 105-157. 
198. Yanong, R.P.E., Curtis, E.W., Simmons, R., Bhattaram, V.A., 
Gopalakrishnan, M., Ketabi, N., Nagaraja, N.V. and Derendorf, H. (2005), 
"Pharmacokinetic studies of florfenicol in koi carp and threespot gourami 
Trichogaster trichopterus after oral and intramuscular treatment", Journal of 
Aquatic Animal Health. 17, pp. 129-137. 
199. Yuasa, K., Kitancharoen, N., Kataoka, Y. and Al-Murbaty, F. A. (1999), 
"Streptococcus iniae, the Causative Agent of Mass Mortality in Rabbitfish 
Siganus canaliculatus in Bahrain", Journal of Aquatic Animal Health(1), pp. 
87-93. 
200. Z., Yin, Lam, T.L. and Sin, Y.M. (1997), "Cytokine-mediated antimicrobial 
immune response of catfish, Clarias gariepinus, as a defence against 
Aeromonas hydrophila", Fish and Shellfish Immunology. 7, pp. 93-104. 
201. Zhang, X.H. and Austin, B. (2000), "Pathogenicity of Vibrio harveyi to 
salmonids", Journal of Fish Diseases. 23, pp. 93-102. 
PHỤ LỤC 
Phụ lục1 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG LIÊN CẦU KHUẨN PHÂN LẬP 
TỪ CÁ CHẼM BỆNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S 
1.1 Kết quả giải trình tự gen 16S vi khuẩn VN091208R 
TAATCCAAAGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAG
CGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACACTAGAGTACAC
ATGTACTTAAGTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTG
TATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGAC
CTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG
GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACG
CCGCGTGAGTGAAAAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAA
CGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGTGACGGT 
 111
 112
1.2 Kết quả giải trình tự gen 16S vi khuẩn VN091211R 
CGTTCTTCTCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCG
GCGTTGCTCGGTCAGACTTCCGTCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCC
CGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGT
CGGCTATGTATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATACAA
CGCAGGTCCATCTCATAGTGAAGCAATTGCTCCTTTTAACTTAAGTACATGTGT
ACTCTAGTGTCATGCGGTATTAGCTATCGTTTCCAATAGTTATCCCCCGCTATG
AGGTAGGTTACCTACGCGTTACTCACCCGTTCGCAACTCTTTGGATTAATGCAA
GCACCAATCCTCAGCGTTCTACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGT
CCTGAGCCAGGATCAAACTCTCCAA 
 113
 114
1.3 Kết quả giải trình tự gen 16S vi khuẩn NT090612C 
 115
 116
1.4 Kết quả giải trình tự gen 16S vi khuẩn CR090722P 
 117
 118
1.5 Kết quả giải trình tự gen 16S vi khuẩn NH081011P 
 119
 120
1.6 Kết quả giải trình tự gen 16S vi khuẩn NH081107P 
 121
 122
1.7 Kết quả giải trình tự gen 16S vi khuẩn CR091016P 
 123
 124
1.8 Kết quả giải trình tự gen 16S vi khuẩn CR091122P 
 125
 126
Phụ lục 2 Bảng thông số đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu 
Bảng 1. pl2 Chỉ số thực bào của đại thực bào cá chẽm trước và sau khi tiêm vi khuẩn Streptococcus iniae 
Đơn vị tính: Số lượng tế bào nấm men bị bắt giữ bởi một đại thực bào 
Nghiệm Chỉ số thực bào của đại thực bào cá chẽm tại thời điểm (giờ) 
thức 0 12 24 36 48 60 72 84 96 
Glucan 
+ FKC 2,14 ± 0,29 3,24 ± 0,26 2,86 ± 0,11 2,03 ± 0,32 2,15 ± 0,12 1,87 ± 0,29 2,16 ± 0,14 1,90 ± 0,19 2,02 ± 0.25
FKC 1,95 ± 0,27 3,25 ± 0,3 3,16 ± 0,29 2,06 ± 0,12 2,09 ± 0,2 2,19 ± 0,14 1,88 ± 0,1 1,95 ± 0,25 2,07 ± 0,3 
Đối chứng 1,97 ± 0,04 2,00 ± 0,19 2,06 ± 0,14 2,05 ± 0,09 2,03 ± 0,16 2,06 ± 0,04 1,99 ± 0,13 1,93 ± 0,12 2,11 ± 0,11
Số liệu được trình bày: trung bình ± độ lệch chuẩn 
Bảng 2.pl2 Hoạt tính thực bào của đại thực bào cá chẽm trước và sau khi tiêm vi khuẩn Streptococcus iniae 
Đơn vị tính: Số lượng tế bào thực bào trong 100 đại thực bào 
Nghiệm Hoạt tính thực bào (%) của đại thực bào cá chẽm tại thời điểm (giờ) 
thức 0 12 24 36 48 60 72 84 96 
Glucan 
+ FKC 79,83 ± 4,73 80,44 ± 6,0878,35 ± 5,3949,42 ± 4,0148,71 ± 8,17 49,53 ± 2,9452,54 ± 13,3650,35 ± 8,0547,39 ± 6,17
FKC 46,77 ± 10,31 78,36 ± 6,3374,92 ± 5,78 53,69 ± 3,2 49,87 ± 7,07 53,24 ± 4,64 50,22 ± 9,95 40,4 ± 5,69 44,88 ± 0,83
Đối chứng 48,02 ± 4,93 51,28 ± 5,83 50,51 ± 3,20 48,16 ± 3,25 51,84 ± 5,81 51,61 ± 4,63 47,04 ± 6,31 48,08 ± 6,41 46,38 ± 8,25
Số liệu được trình bày: trung bình ± độ lệch chuẩn 
 127
 128
Bảng 3.pl2 Nồng độ lysozyme của huyết thanh của cá chẽm trước và sau khi tiêm vi khuẩn Streptococcus iniae 
Nghiệm Nồng độ lysozyme (µg/mL) của huyết thanh cá chẽm tại thời điểm (giờ) 
thức 0 12 24 36 48 60 72 84 96 
Glucan 
+ FKC 
11,84 ± 
1,70 
11,47 ± 
1,42 
13,46 ± 
1,07 
14,78 ± 
0,74 
15,05 ± 
1,05 
16,05 ± 
0,38 
18,48 ± 
0,22 
21,72 ± 
1,65 
20,96 ± 
1,63 
FKC 
6,38 ± 
1,57 
9,56 ± 
0,55 
9,42 ± 
0,90 
10,2 ± 
0,98 
12,34 ± 
0,52 
12,41 ± 
0,41 
14,97 ± 
0,45 
16,07 ± 
1,45 
19,27 ± 
1,68 
Đối chứng 
6,64 ± 
1,62 
7,15 ± 
1,63 
6,99 ± 
0,93 
6,40 ± 
1,43 
7,27 ± 
1,16 
7,21 ± 
1,60 
6,74 ± 
0,66 
7,11 ± 
0,98 
7,28 ± 
0,84 
Số liệu được trình bày: trung bình ± độ lệch chuẩn 
Bảng 4. pl2 Tỉ lệ (%) vi khuẩn bị ức chế bởi huyết thanh của cá chẽm sau khi tiêm vi khuẩn Streptococcus iniae 
Nghiệm Tỉ lệ vi khuẩn S. iniae (%) bị ức chế bởi huyết thanh của cá chẽm tại thời điểm (giờ) 
thức 0 12 24 36 48 60 72 84 96 
Glucan 
+ FKC 
38,41 ± 
0,74 
43,47 ± 
1,68 
56,17 ± 
2,44 
60,86 ± 
3,09 
63,08 ± 
5,1 
67,07 ± 
5,24 
74,83 ± 
5,94 
73,09 ± 
2,17 
76,42 ± 
2,8 
FKC 
26,77 ± 
2,09 
39,49 ± 
2,75 
47,22 ± 
3,69 
52,43 ± 
4,6 
53,26 ± 
5,7 
57,67 ± 
5,58 
58,38 ± 
2,22 
61,36 ± 
4,8 
Số liệu được trình bày: trung bình ± độ lệch chuẩn 
Phụ lục 3 Biến động hàm lượng kháng thể đặc hiệu kháng vi khuẩn S. iniae 
trong huyết thanh của cá chẽm. 
Đơn vị tính: mật độ quang ở bước sóng 492nm khi thực hiện ELISA với độ pha 
loãng huyết thanh 1:100. 
Nghiệm cá Hàm lượng kháng thể đặc hiệu kháng vi khuẩn S. iniae trong 
thức thứ 
huyết thanh của cá chẽm tại thời điểm (ngày) sau khi tiêm 
vaccine 
 7 14 21 28 35 42 49 56 
 1 0.09 0.09 0.03 0.03 0.06 0.06 0.08 0.03
 2 0.13 0.12 0.04 0.04 0.02 0.03 0.06 0.05
 3 0.04 0.01 0.09 0.05 0.01 0.02 0.25 0.08
 4 0.01 0.08 0.07 0.09 0.12 0.21 0.01 0.06
Đối 5 0.15 0.07 0.14 0.04 0.23 0.1 0.04 0.07
chứng 6 0.09 0.07 0.13 0.11 0.07 0.04 0.04 0.07
 7 0.12 0.12 0.08 0.08 0.06 0.14 0.04 0.21
 8 0.05 0.08 0.13 0.04 0.13 0.03 0.06 0.01
 9 0.11 0.09 0.09 0.08 0.09 0.09 0.08 0.01
 10 0.08 0.12 0.12 0.05 0.12 0.12 0.12 0.01
 Trung bình 0.09 0.09 0.09 0.06 0.09 0.08 0.08 0.06
1 0.1 0.23 0.34 0.22 0.62 0.63 1.21 0.74
2 0.02 0.33 0.46 0.33 0.5 1.24 0.92 0.32
3 0.14 0.12 0.26 0.49 0.56 0.69 0.56 0.15
4 0.04 0.5 0.29 0.09 0.33 0.53 0.88 0.69
5 0.32 0.34 0.32 0.1 0.53 1.34 0.68 0.57
6 0.34 0.6 0.19 0.08 0.52 1.4 0.9 0.51
7 0.16 0.45 0.32 0.27 0.79 1.1 1.1 0.37
8 0.22 0.07 0.24 0.16 0.36 0.61 0.67 0.67
9 0.19 0.46 0.38 0.14 0.82 0.7 0.72 0.3
10 0.1 0.6 0.6 0.31 0.31 1.2 0.94 0.45
Vaccine 
Trung bình 0.16 0.37 0.34 0.22 0.53 0.94 0.86 0.48
 129
Phụ lục 4. Xử lý số liệu về khối lượng trung bình của cá thí nghiệm đánh giá 
tính an toàn của vi khuẩn bất hoạt (FKC) 
t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances 
 cá tiêm FKC cá đối chứng 
Khối lượng trung bình (g) 14.693333 14.36 
Variance 5.1158161 6.535586207 
Observations 30 30 
Pooled Variance 5.8257011 
Hypothesized Mean Difference 0 
df 58 
t Stat 0.5348725 
P(T<=t) one-tail 0.2973914 
t Critical one-tail 1.6715528 
P(T<=t) two-tail 0.5947828 
t Critical two-tail 2.0017175 
Phụ lục 5 Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu mô hóa miễn dịch 
Phosphate Buffered Saline (PBS) 
Na2HPO4.2H2O 0.72g 
KH2PO4 0.27g 
NaCl 8.5g 
nước cất 1000ml 
Tris buffered saline (TBS) 
Trisma base 2.42g 
NaCl 29.24g 
nước cất 1000ml 
Điều chỉnh pH ở mức 7,2 bằng HCl 
 130
3,3’-Diaminobenzidinetetrahydrochloride (DAB) 
Hòa một viên DAB (10 mg) trong 6.67 ml TBS 
Cho dung dịch trên vào các ống eppendorf (0,5 ml/ống). Lưu giữ ở -20oC 
Khi dùng cho 5 ml TSB và 0,1 ml 1% H2O2 vào 0,5 ml dung dịch DAB 
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu 
 0,1M phosphate/citrate buffer với 0,09% NaCl pH 5.8 
Tạo 2 dung dịch gốc phosphate buffer và acid citric buffer 
Phosphate buffer gốc: Hòa 8.903g Na2HPO4, trong 500 ml nước cất. 
Citric Acid buffer gốc: Hòa.1.1 g citric acid trong 100 ml nước cất. 
Lấy 70 ml phosphate buffer, thêm citric acid buffer cho đến khi pH đạt giá trị 
5,8 (bổ sung nước cất để thể tích dung dịch là 100ml). Thêm 0,09 g NaCl 
Tế bào nấm men 
Cho 0,22g nấm men vào 24ml PBS, nhuộm với 1ml Congo red ủ trong 5 
phút và bất hoạt bằng cách hấp tiệt trùng. Sau đó rửa 3 lần bằng PBS và điều chỉnh 
mật độ khoảng 108 tế bào/ml. 
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu 
PBS-Tween (PBS-T) 
Tween 20 50µl 
PBS 100ml 
Block skim milk 
Skim Milk Powder 3g 
PBS-T 100ml 
Phosphate-citrate buffer, pH5.0 
0.1M citric acid 24,3ml 
0.2M Na2HPO4x2H2O 25.7ml 
nước cất 50.0ml 
Peroxidase substrate solution (0-Phenyleneidamine, OPD) 
0-Phenyleneidamine (P-4664, Sigma) 15mg (1 viên) 
Phosphate-citrate buffer 37.5ml 
 131
30% H2O2 (cho vào trước khi dùng) 15µl 
SDS PAGE 
Sample buffer (SDS reducing buffer) 
deionized water 3.55ml 
0.5M Tris-HCl, pH6.8 1.25ml 
glycerol 2.5ml 
10% (w/v) SDS 2.0ml 
0.5%(w/v) Bromophenol blue 0.2ml 
(Giữ ở nhiệt độ phòng) 
Resolving gel buffer 
Water 4.4ml 
Acrylamide (40%) 3.0ml 
Gel buffer 2.5ml 
10%(w/v) SDS 0.1ml 
10% APS 50µl 
TEMED 5µl 
Stacking gel buffer : 1.5M tris-HCl, PH6.8, percent gel 5% 
Water 6.2ml 
Acrylamide (40%) 1.3ml 
Gel buffer 2.5ml 
10%(w/v) SDS 0.1ml 
10% APS 50µl 
 TEMED 5µl 
WESTERN BLOT 
Stock solution 
10x blotting buffer 
Tris (Trizma base) 7.57g 
Glycin 36g 
 132
 133
nước cất 250ml 
10x TBS 
Tris 12.11g 
NaCl 146.1g 
nước cất 500ml 
Using solution 
blotting buffer 
(10xblotting buffer) 100ml 
methanol 200ml 
nước cất 700ml 
TTBS 
Tween-20 350µl 
TBS 700ml 
Blocking solution (3%milk in TBS) 
Milk powder 3.0g 
TBS 100ml