Luận án Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam (epinephelus coioides hamilton, 1822) nuôi tại Khánh hòa đối với vi khuẩn vibrio parahaemolyticus

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 
NGUYỄN THỊ THANH THÙY 
NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở 
CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides 
Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI 
VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus 
Chuyên ngành : Nuôi trồng Thủy sản 
 Mã ngành : 62 62 03 01 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 
 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 
1. TS. NGUYỄN HỮU DŨNG 
2. GS.TS. HEIDRUN I. WERGELAND 
KHÁNH HÒA - 2014 
 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 
NGUYỄN THỊ THANH THÙY 
NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở 
CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides 
Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI 
VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 
KHÁNH HÒA - 2014 
i 
LỜI CAM ĐOAN 
 Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “ Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở 
cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) đối với vi khuẩn Vibrio 
parahaemolyticus” là kết quả nghiên cứu nghiêm túc của bản thân tôi trong suốt 
thời gian từ năm 2007-2012 dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của Thầy Cô hƣớng dẫn. 
Tôi xin cam đoan các kết quả, số liệu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc 
ai công bố trong bất kỳ công trình nào. 
Khánh Hòa, năm 2014 
Nghiên cứu sinh 
Nguyễn Thị Thanh Thùy 
ii 
LỜI CẢM ƠN 
 Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu Trƣờng Đại học 
Nha Trang, Khoa Nuôi Trồng Thuỷ Sản, Khoa Sau Đại học đã tạo mọi điều kiện 
thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án. 
 Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu Nuôi 
trồng Thuỷ sản III, Dự án “Mô hình hóa ven biển và quản lý sức khỏe cá- 
NUFUPRO 2007/10086” đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thời gian và hỗ trợ toàn 
bộ kinh phí cho tôi thực hiện luận án. 
 Lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tôi muốn dành riêng cho hai Thầy Cô 
giáo hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Dũng và Giáo sƣ Heidrun I. Wergeland đã định 
hƣớng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện 
luận án. 
 Xin chân thành cảm ơn Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trƣờng và phòng 
ngừa dịch bệnh khu vực miền Bắc; Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trƣờng và 
phòng ngừa dịch bệnh khu vực miền Nam đã cung cấp chủng vi khuẩn sử dụng trong 
nghiên cứu này. 
 Xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS Đỗ Thị Hòa, TS. Lê Văn Bé, TS. Phạm 
Quốc Hùng, TS. Đặng Thúy Bình, ThS. Nguyễn Thị Thoa đã sẵn lòng giúp đỡ, 
đóng góp ý kiến quý báu, chia sẻ kinh nghiệm và động viên tinh thần trong quá 
trình thực hiện luận án. 
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các chuyên gia Phòng nghiên cứu miễn dịch 
- Khoa sinh học - Trƣờng đại học Bergen: TS. Ragnhild A. Jakobsen, TS. Gyri T. 
Haugland, TS. Eirin F. Pettersen, NCS Anita Ronneseth và KS. Paul H. Lovik đã 
tận tình hƣớng dẫn các kỹ thuật phân tích các thông số miễn dịch trong thời gian tôi 
thực hiện nghiên cứu tại Trƣờng Đại học Bergen, Nauy. 
 Cuối cùng, tự đáy lòng cho phép tôi đƣợc bày tỏ tình cảm, lòng biết ơn sâu 
sắc nhất đến những ngƣời thân yêu của tôi: Má, anh chị, chồng tôi Nguyễn Văn 
Hùng và con gái Nguyễn Anh Thi đã luôn bên cạnh động viên khích lệ tinh thần cho 
tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án. 
 Tôi xin trân trọng cảm ơn và tri ân tất cả tình cảm và sự giúp đỡ quý báu đó. 
 Khánh Hòa, năm 2014 
Nguyễn Thị Thanh Thùy 
iii 
MỤC LỤC 
 Trang 
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................................................... i 
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................................................ ii 
MỤC LỤC ..................................................................................................................................................... iii 
DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................... vi 
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................................................... viii 
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................................................... ix 
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................................ 1 
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................................ 4 
1.1. Vài nét về đối tƣợng cá mú chấm cam Epinephelus coioides .......................... 4 
1.1.1. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu ............................................................. 4 
1.1.2. Nghề nuôi cá mú trên thế giới và tại Việt Nam.......................................... 6 
1.1.3. Một số bệnh thƣờng gặp ở cá mú nuôi ....................................................... 8 
1.2. Vi khuẩn Vibrio và bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển ................... 10 
1.2.1. Vi khuẩn Vibrio ........................................................................................ 10 
1.2.2. Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển ............................................ 15 
1.3. Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xƣơng ................................................................ 17 
1.3.1. Miễn dịch tự nhiên ................................................................................... 18 
1.3.2. Miễn dịch đặc hiệu ................................................................................... 23 
1.3.3. Các nhân tố ảnh hƣởng đáp ứng miễn dịch ở cá ...................................... 27 
1.4. Sử dụng vaccine và các chất kích thích miễn dịch trong nghề nuôi cá ............. 29 
1.4.1. Nghiên cứu ứng dụng các chất kích thích miễn dịch ở cá nuôi ................. 29 
1.4.2. Nghiên cứu và sử dụng vaccine ở cá nuôi ................................................ 30 
1.5. Tình hình nghiên cứu miễn dịch và vaccine cho cá ở Việt Nam .................... 36 
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 40 
2.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................... 40 
2.1.1. Đối tƣợng .................................................................................................. 40 
2.1.2. Vật liệu ..................................................................................................... 40 
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 41 
2.1.4. Thời gian nghiên cứu ................................................................................ 41 
iv 
2.2. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu chính của luận án ........................................ 42 
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 42 
2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ................. 42 
2.3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của β-glucan đến đáp ứng miễn dịch không đặc 
hiệu ở cá mú chấm cam ............................................................................................. 45 
2.3.3. Nghiên cứu đặc điểm phân tử kháng thể của cá mú chấm cam ............... 50 
2.3.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi 
khuẩn Vibrio parahaemolyticus ................................................................................ 52 
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................................. 56 
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................................. 57 
3.1. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú chấm cam .. 57 
3.1.1. Bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm cam nuôi tại Khánh Hòa ............. 57 
3.1.2. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus .................................... 59 
3.1.3. Độc lực của các chủng Vibrio parahaemolyticus V1, V2, V3 và A đối với 
cá mú chấm cam ........................................................................................................ 67 
3.2. Ảnh hƣởng của β-glucan đến các thông số miễn dịch không đặc hiệu và khả 
năng kháng bệnh do Vibrio parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam ................ 70 
3.2.1. Thành phần, đặc điểm hình thái và kích thƣớc các loại tế bào máu của cá 
mú chấm cam ............................................................................................................ 71 
3.2.2. Ảnh hƣởng của β-glucan đến thành phần bạch cầu trong máu của cá mú 
chấm cam................................................................................................................... 74 
3.2.3. Ảnh hƣởng của β-glucan đến chỉ số thực bào của tế bào bạch cầu tiền 
thận cá mú chấm cam ................................................................................................ 77 
3.2.4. Ảnh hƣởng của β-glucan đến hoạt tính bùng nổ hô hấp của tế bào bạch 
cầu tiền thận cá mú chấm cam .................................................................................. 80 
3.2.5. Ảnh hƣởng của β-glucan đến khả năng kháng bệnh do vi khuẩn Vibrio 
parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam ............................................................ 83 
3.3. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio 
parahaemolyticus ....................................................................................................... 86 
3.3.1. Đặc điểm phân tử kháng thể IgM ở cá mú chấm cam .............................. 86 
3.3.2. Đáp ứng tạo kháng thể ở cá mú chấm cam đối với 4 chủng vi khuẩn 
Vibrio parahaemolyticus bất hoạt formalin không có FIA ....................................... 88 
v 
3.3.3. Đáp ứng miễn dịch dịch thể và khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam 
sau khi gây miễn dịch bằng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin 
có bổ sung chất bổ trợ FIA .......................................................................................... 89 
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .................................................................. 102 
Kết luận ................................................................................................................ 102 
Đề xuất ý kiến ...................................................................................................... 103 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................................... 104 
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 
PHỤ LỤC 
vi 
DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT 
Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Anh Viết đầy đủ tiếng Việt (Nếu có) 
BA 
BHI 
CFU 
CMI 
CRP 
DI 
ĐƢMD 
FCA 
FIA 
HGNNV 
HI 
HRP 
i-ELISA 
Ig 
IgM 
IL-1 
kDa 
LD50 
LPS 
MAC 
MAM 
MHC II 
NB 
NCC 
NK 
NTTS 
Blood agar base 
Brain Heart Infusion 
Colony Forming Unit 
Cell-Mediated Immunity 
C-reaction protein 
Direct Immersion 
Freund’s complete Adjuvant 
Freund’s Incomplete Adjuvant 
Humpback grouper nervous necrosis 
virus 
Hyperosmotic Immersion 
Horseradish peroxidase 
indirect Enzyne Linked 
Immunosorbent Assay 
Immunoglobulin 
Immunoglobulin M 
Interleukin 1 
Kilo Dalton 
Lethal dose 50 
Lipopolysacharides 
Membrane attacking complex 
Multivalent Adhesion Molecule 
Major histocompatibility complex 
Nutrient Broth 
Non-specific cytotoxic cell 
Natural killer cell 
Môi trƣờng thạch máu 
Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn 
Đơn vị tính khuẩn lạc vi khuẩn 
Miễn dịch qua trung gian tế bào 
Protein phản ứng C 
Ngâm trực tiếp 
Đáp ứng miễn dịch 
Chất bổ trợ toàn phần Freund 
Chất bổ trợ bán phần Freund 
Loại virus gây hoại tử thần kinh ở cá mú 
lƣng gù 
Ngâm trong dung dịch ƣu trƣơng 
Kiểm định hấp phụ miễn dịch liên kết 
enzyme gián tiếp 
globulin miễn dịch 
globulin miễn dịch lớp M 
Đơn vị tính khối lƣợng phân tử protein 
Liều gây chết 50% 
Phức hợp tấn công màng 
Phân tử gắn kết đa trị 
Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu lớp II 
Môi trƣờng dinh dƣỡng dạng lỏng 
Tế bào độc không đặc hiệu 
Tế bào diệt tự nhiên 
Nuôi trồng thủy sản 
vii 
OD 
OMP 
PA 
PBS 
RBA 
RPS 
RPP 
SAP 
SDS- 
PAGE 
sIg 
TCBS 
TDH 
TLH 
αTNF 
TNGB 
TSA 
TSB 
TRH 
Vibriosis 
VNN 
VSV 
Optical Density 
Outer Membrane Protein 
Phagocytosis activity 
Phosphate Buffered Saline 
Respiratory burst activity 
Relative Percent Survival 
Relative Percent Protection 
Serum Amyloid Protein 
Sodium Dodecyl Sulfate -
Polyacrylamide Gel Electrophoresis 
Surface immunoglobuline 
Thiosulphate citrate bile salt agar 
Thermostable direct haemolysin 
Thermolabile haemolysin 
alpha Tumor Necrosis Factor 
Trypticase Soya Agar 
Trypticase Soya Broth 
tdh-related hemolysin 
Viral Nervous Necrosis 
Mật độ quang 
Protein ngoại mạc 
Hoạt tính thực bào 
Dung dịch đệm muối photphat 
Hoạt tính bùng nổ hô hấp 
Hệ số sinh tồn tƣơng đối 
Hệ số bảo vệ tƣơng đối 
Protein huyết thanh dạng sợi 
Điện di trên gel polyacrylamide có SDS 
Phân tử globulin miễn dịch bề mặt 
Môi trƣờng phân lập vi khuẩn Vibrio 
Độc tố gây dung huyết bền nhiệt 
Độc tố gây dung huyết không bền nhiệt 
Yếu tố anpha gây hoại tử khối u 
Tác nhân gây bệnh 
Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng tổng hợp 
Môi trƣờng lỏng dinh dƣỡng tổng hợp 
Độc tố gây dung huyết liên quan tdh 
Bệnh do vi khuẩn Vibrio 
Bệnh hoại tử thần kinh do vi rút 
Vi sinh vật 
viii 
DANH MỤC BẢNG 
Bảng 1.1: Bệnh do vi khuẩn Vibrio trên cá mú nuôi................................................... 9 
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý của 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ... 60 
Bảng 3.2: Kích thƣớc của các loại tế bào máu ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides....... 72 
Bảng 3.3: Sự biến đổi tỷ lệ các loại bạch cầu trong máu ở cá mú chấm cam sau 
2 tuần đƣợc cho ăn β-glucan .................................................................................... 74 
Bảng 3.4: Hoạt tính thực bào của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam khi 
đƣợc bổ sung β-glucan vào thức ăn ở các nồng độ khác nhau .................................. 77 
Bảng 3.5: Tỷ lệ chết tích lũy và hệ số bảo hộ của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất 
hoạt bằng formalin đối với cá mú Epinephelus coioides .......................................... 99 
ix 
DANH MỤC HÌNH 
Hình 1.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides ...................................................... 4 
Hình 1.2: Xu hƣớng sản lƣợng và giá trị cá mú trên thế giới .................................... 6 
Hình 1.3: Sản lƣợng cá mú ở các quốc gia và vùng lãnh thổ nuôi chủ yếu ............... 7 
Hình 1.4: Đặc điểm cấu tạo màng tế bào vi khuẩn Vibrio ....................................... 11 
Hình 1.5: Vị trí và cấu tạo tuyến ức cá mú Epinephelus malabaricus .................... 26 
Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu ................................................................... ... n and Immunity, 60, pp. 
3539-3545. 
150. Nitzan, Y., Gribun, A. and Pechatnikov, I. (1983), "Isolation and 
characterization of the outer membrane from Vibrio parahaemolyticus", 
Journal of General Microbiology, 129(10), pp. 3185-3196. 
151. Ogier de Baulny, M., Quentel, C., Fournier, V., Lamour, F. and Gouvello, 
R.L. (1996), "Effect of long-term oral administration of P-glucan as an 
immunostimulant or an adjuvant on some non-specific parameters of the 
immune response of turbot Scophthalmus maximus", Disease of Aquatic 
Organisms, 26, pp. 139-147. 
152. Ong, B (1988), "Characteristics of bacteria isolated from diseased groupers, 
Epinephelus salmoides", Aquaculture, 73, pp. 7-17. 
153. Pacha, R. E. and Kiehn, E. D. (1969), "Characterization and relation of 
marine vibrios pathogenic to fish: physiology, serology, and 
epidemiology", J. Bacteriol.,100(3), pp. 1242-1247. 
154. Pakingking, Jr., Bautista, R., Jesus-Ayson, E.G. and Reyes, O. (2010), 
"Protective immunity against viral nervous necrosis (VNN) in brown-marbled 
grouper (Epinephelus fuscoguttatus) following vaccination with inactivated 
betanodavirus", Fish Shellfish Immunol., 28, pp. 525-533. 
121 
155. Palic, D., Andreasenb, C.B., Heroltc, D.M., Menzeld, B.W and Rothc, J.A. 
(2006), "Immunomodulatory effects of β-glucan on neutrophil function in 
fathead minnows (Pimephales promelas Rafinesque, 1820)", Dev. Comp. 
Immunol., 30, pp. 817-830. 
156. Papanastasiou, A.D. and Zarkadis, I.K. (2006), "Cloning and phylogenetic 
analysis of the alpha subunit of the eighth complement component (C8) in 
rainbow trout", Molecular Immunology, 43, pp. 2188-2194. 
157. Petersen, E. F. (2003), Monoclonal antibodies to leucocytes and 
immunoglobulin from Atlantic salmon ( Salmo salar L.) - Production, 
characterisation and application, Doctor science thesis, Department of 
Fisheries and Marine Biology, University of Bergen. 
158. Pierre, S., Gaillard, S. , Nathalieprevot-Dalvise, Aubert, J. , Odile, R. C. , 
Daniel, L. T. and Joel, P. G. (2007), Grouper aquaculture: Asian success and 
Mediterranean trials, Wiley InterScience. 
159. Plant, K. P. and LaPatra, S. E. (2011), " Advances in fish vaccine delivery", 
Developmental and Comparative Immunology, 35, pp. 1256–1262. 
160. Plumb, J. A. and Hanson, L. A. (2010), Health Maintenance and Principle 
Microbial Diseases of Cultured Fishes, Wiley-Blackwell. 
161. Pucci, B., Coscia, M.R. and Oreste, U. (2003), "Characterization of serum 
immunoglobulin M of the Antarctic teleost Trematomus bernacchii", Comp. 
Biochem. Physiol., 135(2), pp. 349–357. 
162. Quinones, R. E. I, Bonifacio, I. N. , Betancourt-Rule, M., Ramirez Vives, F. 
and Vázquez Salinas, C. (2010), "Putative virulence factors identified in 
Vibrio vulnificus strains isolated from oysters and seawater in Mexico", 
International Journal of Environmental Health Research, 20(6), pp. 395-405. 
163. Randall, J.E and Heemstra, P.C. (1991), Revision of Indo-Pacific groupers 
(Perciformes: Serranidae: Epinephelinae), with descriptions of five new 
species, Bernice Pauahi Bishop Museum, Honolulu, Hawaii, p. 332. 
122 
164. Reed, L.J. and Muench, H. (1938), "A simple method of estimating fifty 
percent endpoints", The American Journal of Hygiene, 27, pp. 493-497. 
165. Richter, R., Frenzel, E.M., Hadge, D., Kopperschlager, G. and Ambrosius, H. 
(1973), "Structure of Immunoglobulin on carp (Cyprinus carpio L.) ", Acta. 
biol. med. germ., 30, pp. 735-749. 
166. Robertsen, B., Bergan, V. , Roekenes, T. , Larsen, R. and Albuquerque, A 
(2003), "Atlantic salmon interferon genes: cloning, sequence analysis, 
expression, and biological activity", J Interferon Cytokine Res., 23, pp. 601 - 
612. 
167. Robertsen, B., Engstad, R.E. and Jørgensen, J.B. (1994), β-glucans as 
immunostimulants in fish., Modulators of Fish Immune Responses, Stolen, J.S. 
and Fletcher, T.C. eds, SOS Publications, pp. 83-99. 
168. Rodrıguez, A., Esteban, M.A. and Meseguer, J. (2003), "Phagocytosis and 
peroxidase release by seabream (Sparus aurata L.) leucocytes in response to 
yeast cells", The Anatomical Record, 272, pp. 415-423. 
169. Rombout, M., Huttenhuis, T. , Picchietti, S. and Scapigliati, G. (2005), 
"Phylogeny and ontogeny of fish leucocytes", Fish Shellfish Immunol., 19, pp. 
441-455. 
170. Ronneseth, A., Wergeland, H.I. and Pettersen, E.F. (1994) "Neutrophils and 
B-cells in Atlantic cod (Gadus morhua L.)", Fish Shellfish Immunol., 21, pp. 
331-342. 
171. Saeed, M.O. (1995), "Association of Vibrio harveyi with mortalities in 
cultured marine fish in Kuwait", Aquaculture, 136, pp. 21-29. 
172. Sahu, A. and Lambris, J.D. (2001), "Structure and biology of complement 
protein C3, a connecting link between innate and acquired immunity", 
Immunological Review, 180, pp. 35-48. 
173. Sakai, D.K. (1984), "Opsonization by fish antibody and complement in the 
immune phagocytosis by peritoneal exudate cells isolated from salmonid 
fishes", J. Fish Biol., 7, pp. 29-38. 
123 
174. Sarjito, O. , Radjasa, K., Sabdono, A, Prayitno, S.B. and Hutabarat, S (2009), 
"Phylogenetic diversity of the causative agent of Vibriosis associated with 
grouper fish from Karimunjawa Island, Indonesisa", Current research in 
bacteriology, 2, pp. 14-21. 
175. Saunders, D.C. (1966), "Differential blood cell counts of 121 species of 
marine fishes of Puerto Rico", Transactions of the American Microscopical 
Society, 85, pp. 427-449. 
176. Secombes, C.J. and Fletcher, T.C. (1992), "The role of phagocytes in the 
protective mechanisms of fish", Annu. Rev. Fish Dis., 2, pp. 53-71. 
177. Selvaraj, V, Sampath, K. and Sekar, V. (2006), "Adjuvant and 
immunostimulatory effects of β-glucan administration in combination with 
lipopolysaccharide enhances survival and some immune parameters in carp 
challenged with Aeromonas hydrophila", Vet. Immunol. Immunopathol., 114, 
pp. 15-24. 
178. Selvaraj, V., Sampath, K. and Sekar, V. (2005), "Administration of yeast 
glucan enhances survival and some non-specific and specific immune 
parameters in carp ( Cyprinys carpio) infected with Aeromonas hydrophila", 
Fish Shellfish Immunol., 19, pp. 293-306. 
179. Seng, L.T. (1998), Grouper Culture, Tropical mariculture, De Silva, S.S. eds, 
Academic Press, London, pp. 423– 448. 
180. Shelton, E. and Smith, M. (1970), "The ultrastructure of carp (Cyprinus 
carpio) Immonoglobulin: A Tetrameric Macroglobulin", J. Mol. Biol., 54, pp. 
615-617. 
181. Shen, L., Stuge, T.B. and Miller, N.W. (2002), "Channel catfish cytotoxic 
cells: a mini-review", Dev. Comp. Immunol., 26, pp. 141-149. 
182. Shyne, A. P. S., Sobbhana, K. S. , George, K. C. and Paul Rai, R. (2008), 
"Phenotypic characteristics and antibiotic sensitivity of Vibrio 
parahaemolyticus strains isolated from diseases grouper (Epinephelus spp.)", 
J. Mar. Biol. Ass., 50, pp. 1-6. 
124 
183. Smith, V.J., Fernandes, J.M.O., Jones, S.J., Kemp, G.D. and Tatner, M.F. 
(2000), "Antibacterial proteins in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss", Fish 
Shellfish Immunol., 10, pp. 243-260. 
184. Snoussi, M., Noumi, E. , Usai, D. , Sechi, L. A. , Zanetti, S. and Bakhrouf, A. 
(2008), "Distribution of some virulence related-properties of Vibrio 
alginolyticus strains isolated from Mediterranean seawater (Bay of Khenis, 
Tunisia): investigation of eight Vibrio cholerae virulence genes", World J 
Microbiol Biotechnol., 24, pp. 2133–2141. 
185. Solem, S.T., Hordvik, I., Killie, J.A., Warr, G.W. and Jorgensen, T.O. (2001), 
"Diversity of the immunoglobulin heavy chain in the Atlantic salmon ( Salmo 
salar L.) is contributed by genes from two parallel IgH isoloci", Dev. Comp. 
Immunol., 25(5-6), pp. 403–417. 
186. Sommerser, I., Krossoy, B., Biering, E. and Frost, P. (2005), "Review 
vaccines for fish in aquaculture", Expert Rev. Vaccines, 4(1), pp. 89 - 101. 
187. Stafford, J. L. and Belosevic, M. (2003), "Transferrin and the innate immune 
response of fish: Identification of a novel mechanism of macrophage 
activation", Dev. Comp. Immunol., 27, pp. 539 - 554. 
188. Stafford, J. L., Neumann, N. F. and Belosevic, M. (2001), "Products of 
proteolytic cleavage of transferrin induce nitric oxide response of goldfish 
macrophages", Dev. Comp. Immunol., 25, pp. 101 - 115. 
189. Stills, H.F. (2005), " Adjuvants and antibody production: dispelling the myths 
associated with Freund’s complete and other adjuvants", ILAR J., 46, pp. 80 -
93. 
190. Sun, Y., Liu, C.S. and Sun, L. (2011), "A multivalent killed whole-cell 
vaccine induces effective protection against Edwardsiella tarda and Vibrio 
anguillarum", Fish Shellfish Immunol., 31, pp. 595 -599. 
191. Sunyer, J.O., Tort, L. and Lambris, J.D. (1997), "Diversity of the third form of 
complement, C3, in fish: functional characterization of five forms of C3 in the 
diploid fish Sparus aurata", Biochemistry Journal., 326, pp. 877-881. 
125 
192. Sunyer, J.O., Zarkadis, I.K. and Lambris, J.D. (1998), "Complement diversity: 
a mechanism for generating immune diversity", Immunology Today, 19, pp. 
519-523. 
193. Swain, P., Dash, S., Sahoo, P.K., Routray, P., Sahoo, S.K., Gupta, S.D., 
Meher, P.K. and Sarangi, N. (2007), "Non-specific immune parameter of 
brood Indian major carp Labeo rohita and their seasonal variations", Fish 
Shellfish Immunol., 22, pp. 38-43. 
194. Takahashi, A., Sato, Y., Shiomi, Y., Cantarelli, V.V., Iida, T., Lee, M. and 
Honda, T. (2000), "Mechanisms of chloride secretion induced by thermostable 
direct haemolysin of Vibrio parahaemolyticus in human colonic tissue and a 
human intestinal epithelial cell line", J. Med. Microbiol., 49, pp. 801–810. 
195. Takeda, Y., Taga, S. and Miwatani, T. (1978), "Evidence that the thermostable 
direct hemolysin of Vibrio parahaemolyticus is composed of two subunits", 
FEMS Microbiol. Lett., 4, pp. 271–274. 
196. Tatner, M. F. (1996), Natural changes in the immune system of fish, The fish 
immune system: organism, pathogen and environment, Iwama G., Nakanishi 
T. eds, Academic Press, USA, pp. 255-287. 
197. Thanh, Bui Ngoc, Dalsgaard, A., Munangandu, H. and Evensen, O. (2009), 
Experimental infection and host response of tilapia Oreochromis niloticus to 
zoonotic metacercariae Haplorchis pumilio, Mahidol University, Thailand, 
accessed 29-5-2013, from 
present.htm. 
198. Thiery, R., Cozien, J. , Cabon, J. , Lamour, F. , Baud, M. and Schneemann, A. 
(2006), "Induction of a protective immune response against viral nervous 
necrosis in the European sea bass Dicentrarchus labrax by using 
betanodavirus virus-like particles", J. Virol., 80, pp. 10201 – 10207. 
199. Toranzo, A. E., Magarinos, B. and Romalde, J. L. (2005), "A review of main 
bacterial fish diseases in mariculture systems", Aquaculture, 246, pp. 37-61. 
126 
200. Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. (1979), "Electrophoretic transfer of 
proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and 
some applications", Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 76, pp. 4350-4354. 
201. Tsang, V. C. W., Peralta, J. M. and Simons, A. R. (1983), "Enzyme-Linked 
Immunoelectro transfer Blot Techniques (Eitb) for studying the specificities of 
antigens and antibodies separated by gel-electrophoresis", Methods in 
Enzymology, 92, pp. 377-391. 
202. Twedt, R.M., Novelli, R.E., Spaulding, P.L. and Hall, H.E. (1970), 
"Comparative hemolytic activity of Vibrio parahaemolyticus and related 
Vibrios", Infection and Immunity, 1, pp. 394-399. 
203. Uribe, C. , Folch, H. , Enriquez, R. and Moran, G. (2011), "Innate and 
adaptive immunity in teleost fish: a review", Veterinarni Medicina., 56(10), 
pp. 486–503. 
204. Van Muiswinkel, W.B. (2008), "A history of fish immunology and 
vaccination. The early days", Fish Shellfish Immunol., 25, pp. 397-408. 
205. Whitman, K.A. (2004), Finfish and shellfish Bacteriology Manual Techniques 
and Procedures, Iowa State Press, 272 p. 
206. Whyte, K. S. (2007), "The innate immune response of finfish - A review of 
current knowledge", Fish Shellfish Immunol., 23, pp. 1127 – 1151. 
207. Willett, C., Cortes, A., Zuasti, A. and Zapata, A. (1999), "Early hematopoiesis 
and developing lymphoid organs in the zebrafish", Developmental Dynamics, 
214, pp. 323-336. 
208. Wilson, M.R. and Warr, G.W. (1992), "Fish immunoglobulins and the genes 
that encode them", Annu. Rev. Fish Dis., 2, pp. 201–221. 
209. Wong, H.C. and Chen, Y.C. (2003), "Analysis of the envelope proteins of 
heat-shocked Vibrio parahaenolyticus cells by immunoblotting and biotin-
labeling method", Microbiol and Immunology, 47, pp. 313-319. 
210. Wong, S.K., Zhang, X.H. and Woo, N.Y.S. (2012), "Vibrio alginolyticus 
thermolabile hemolysin (TLH) induces apoptosis, membrane vesiculation and 
necrosis in sea bream erythrocytes", Aquaculture, 330-333, pp. 29-36. 
127 
211. Yambot, A.V. and Song, Y.L. (2006), "Immunization of grouper, Epinephelus 
coioides, confers protection against a protozoan parasite, Cryptocaryon 
irritans", Aquaculture, 260, pp. 1-9. 
212. Yeh, S.P., Chang, C.A., Chang, C.Y., Liu, C.H. and Cheng, W. (2008), 
"Dietary sodium alginate administration affects fingerling growth and 
resistance to Streptococcus sp. and iridovirus, and juvenile non-specific 
immune responses of the orange-spotted grouper, Epinephelus coioides", Fish 
Shellfish Immunol., 25, pp. 19-27. 
213. Yeung, P.S.M. and Boor, K.J. (2004), "Epidemiology, pathogenesis, and 
prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections", Foodborne 
pathogens and disease, 1(2), pp. 74-88. 
214. Yii, K.C., Yang, T.I. and Lee, K.K. (1997), "Isolation and characterization of 
Vibrio carchariae, a causative agent of gastroenteritis in the groupers, 
Epinephelus coioides.", Current Microbiology, 35, pp. 109-115. 
215. Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Gutierrez-De Frias, C. and Cortes, A. (2006), 
"Ontogeny of the immune system of fish", Fish Shellfish Immunol., 20, pp. 
126–136. 
216. Zexia, G., Weimin, W., Yi, Y., Abbas, K., Dapeng, L., Guiwei, Z. and Diana, 
J.S. (2007), "Morphological studies of peripheral blood cells of the Chinese 
sturgeon, Acipenser sinensis", Fish Physiol Biochem., 33, pp. 213-222. 
217. Zhang, X. H. and Austin, B. (2005), "A review haemolysins in Vibrio 
species", Journal of Applied Microbiology, 98, pp. 1011–1019. 
218. Zhou, Y. C., Wang, J. , Zhang, B. and Su, Y. Q. (2002), "Ultrasonic 
immunization of sea bream, Pagrus major (Temminck & Schlegel), with a 
mixed vaccine against Vibrio alginolyticus and V. anguillarum", J. Fish Dis., 
25, pp. 325–331. 
219. Zorrilla, I., Arijo, S., Chabrillon, M., Diaz, P., Martinez-Manzanares, E., 
Balebona, M.C. and Morinigo, M.A. (2003), "Vibrio species isolated from 
diseased farmed sole, Solea senegalensis (Kaup), and evaluation of the 
potential virulence role of their extracellular products", J. Fish Dis., 26, pp. 
103-108.