Luận án Nghiên cứu điều chế cao từ cỏ sữa lá lớn (euphorbia hirta l.) và ứng dụng chế biến thực phẩm dinh dưỡng kiểm soát glucose máu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
VIỆN DINH DƯỠNG QUỐC GIA 
NGUYỄN MẠNH THẮNG 
NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO TỪ CỎ SỮA 
LÁ LỚN (EUPHORBIA HIRTA L.) VÀ ỨNG DỤNG 
CHẾ BIẾN THỰC PHẨM DINH DƯỠNG 
KIỂM SOÁT GLUCOSE MÁU 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DINH DƯỠNG 
Hà Nội – 2020
 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
VIỆN DINH DƯỠNG QUỐC GIA 
NGUYỄN MẠNH THẮNG 
NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO TỪ CỎ SỮA 
LÁ LỚN (EUPHORBIA HIRTA L.) VÀ ỨNG DỤNG 
CHẾ BIẾN THỰC PHẨM DINH DƯỠNG 
KIỂM SOÁT GLUCOSE MÁU 
Chuyên ngành: Dinh dưỡng 
Mã số: 9720401 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DINH DƯỠNG 
Hướng dẫn khoa học 
1. GS.TS. Nguyễn Công Khẩn 
2. PGS.TS. Trương Tuyết Mai 
Hà Nội – 2020 
i 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện dưới 
sự hướng dẫn của GS.TS Nguyễn Công Khẩn và PGS.TS Trương Tuyết Mai. Các 
số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong 
bất kỳ công trình nào khác. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2020 
Tác giả 
Nguyễn Mạnh Thắng 
ii 
LỜI CẢM ƠN 
Trong quá trình thực hiện luận án tại Viện Dinh dưỡng Quốc gia, tôi đã 
nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy, cô, các nhà khoa học thuộc 
nhiều lĩnh vực cùng bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. 
Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Viện Dinh Dưỡng 
Quốc gia, Trung tâm Đào tạo Dinh dưỡng và Thực phẩm và các khoa, phòng 
thuộc Viện Dinh dưỡng Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi 
hoàn thành công trình này. 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS Nguyễn Công Khẩn và 
PGS.TS. Trương Tuyết Mai, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, hết lòng 
giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu 
thực hiện luận án. 
Xin trân trọng cảm ơn các đồng nghiệp, các kỹ thuật viên của Viện Dinh 
dưỡng Quốc gia; Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia; 
Trường Đại học Dược Hà Nội; Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương; Viện Dược 
liệu; Viện nghiên cứu Rau quả; Công ty TNHH Bia rượu nước giải khát 
AROMA đã nhiệt tình giúp đỡ và cộng tác để hoàn thành luận án. 
Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới các lãnh đạo và đồng 
nghiệp của tôi tại Bộ Công Thương, những người thân trong gia đình và bạn bè 
đã quan tâm, động viên, chia sẻ và luôn ủng hộ, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt 
nhất để tôi hoàn thành luận án này. 
Tôi xin chân thành cảm ơn! 
Hà Nội, ngày tháng năm 2020 
Tác giả 
Nguyễn Mạnh Thắng 
iii 
MỤC LỤC 
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i 
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii 
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................... vi 
DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... vii 
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ ix 
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 5 
1.1. Xu thế mô hình bệnh tật và thực trạng bệnh mạn tính không lây ................ 5 
1.1.1. Thực trạng về bệnh mạn tính không lây ....................................................... 5 
1.1.2. Bệnh đái tháo đường ..................................................................................... 8 
1.1.3. Dịch tễ học đái tháo đường ......................................................................... 10 
1.1.4. Các giải pháp can thiệp hỗ trợ phòng, điều trị đái tháo đường và rối loạn 
glucose máu .......................................................................................................... 15 
1.2. Polyphenol ......................................................................................................... 19 
1.2.1. Đặc điểm ..................................................................................................... 19 
1.2.2. Phân loại ..................................................................................................... 19 
1.2.3. Flavonoid .................................................................................................... 21 
1.3. Cỏ sữa lá lớn ..................................................................................................... 31 
1.3.1. Đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn ............... 31 
1.3.2. Các nghiên cứu đánh giá tính an toàn của cây cỏ sữa lá lớn ...................... 35 
1.3.3. Hiệu quả kiểm soát glucose máu của cây cỏ sữa lá lớn .............................. 36 
1.3.4. Một số chế phẩm từ cây cỏ sữa lá lớn ứng dụng trong kiểm soát glucose máu 39 
1.4. Quá trình tách chiết và điều chế cao chiết xuất từ thực vật ......................... 41 
1.4.1. Khái niệm cơ bản về quá trình chiết .......................................................... 41 
1.4.2. Điều chế cao chiết xuất từ thực vật ............................................................. 46 
iv 
1.5. Công nghệ sản xuất đồ uống từ thảo dược ứng dụng hỗ trợ phòng và kiểm 
soát glucose máu. ..................................................................................................... 48 
1.5.1. Công nghệ sản xuất đồ uống pha chế ......................................................... 48 
1.5.2. Một số sản phẩm đồ uống trong phòng và hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo 
đường .................................................................................................................... 50 
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 53 
2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ............................................................................. 53 
2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................................. 53 
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ ....................................................................................... 54 
2.1.3. Động vật thí nghiệm ................................................................................... 55 
2.1.4. Thiết bị ........................................................................................................ 56 
2.1.5. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................... 57 
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 57 
2.2.1. Khảo sát đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn ..... 57 
2.2.2. Điều chế cao cỏ sữa lá lớn, đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chế phẩm 
trong kiểm soát glucose máu ................................................................................ 64 
2.2.3. Ứng dụng cao cỏ sữa lá lớn thử nghiệm sản xuất đồ uống dinh dưỡng dùng 
trong kiểm soát glucose máu ................................................................................ 73 
2.3. Đạo đức nghiên cứu.......................................................................................... 78 
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................................................. 79 
3.1. Đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn ................ 79 
3.1.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật .................................................................... 79 
3.1.2. Xác định thành phần hóa học ...................................................................... 87 
3.2. Điều chế cao cỏ sữa lá lớn, đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chế phẩm 
trong kiểm soát glucose máu .................................................................................. 93 
3.2.1. Điều chế cao cỏ sữa lá lớn .......................................................................... 93 
3.2.2. Đánh giá tính an toàn của cao cỏ sữa lá lớn ............................................. 101 
3.2.3. Đánh giá hiệu quả của cao cỏ sữa lá lớn trong kiểm soát glucose máu ... 106 
v 
3.3. Ứng dụng cao cỏ sữa lá lớn để thử nghiệm sản xuất đồ uống dinh dưỡng 
dùng trong kiểm soát glucose máu ...................................................................... 110 
3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn công thức sản phẩm ................................................ 111 
3.3.2. Nghiên cứu bao bì sản phẩm và điều kiện thanh trùng sản phẩm ............ 112 
3.3.3. Xây dựng quy trình sản xuất đồ uống dinh dưỡng cỏ sữa lá lớn .............. 115 
3.3.4. Đánh giá chất lượng, an toàn thực phẩm .................................................. 116 
3.3.5. Đánh giá khả năng chấp nhận tại cộng đồng ............................................ 118 
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .................................................................................... 120 
4.1. Đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn .............. 120 
4.1.1. Đặc điểm thực vật ..................................................................................... 120 
4.1.2. Thành phần hóa học .................................................................................. 122 
4.2. Điều chế cao cỏ sữa lá lớn, đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chế phẩm 
trong kiểm soát glucose máu ................................................................................ 125 
4.2.1. Điều chế cao cỏ sữa lá lớn ........................................................................ 125 
4.2.2. Đánh giá tính an toàn của cao cỏ sữa lá lớn ............................................. 131 
4.2.3. Đánh giá tính hiệu quả của cao cỏ sữa lá lớn trong kiểm soát glucose máu133 
4.3. Ứng dụng cao cỏ sữa lá lớn để thử nghiệm sản xuất thực phẩm dinh dưỡng 
trong kiểm soát glucose máu ................................................................................ 139 
4.4. Những ưu điểm và tính mới của nghiên cứu ............................................... 143 
4.5. Những hạn chế của nghiên cứu ..................................................................... 144 
KẾT LUẬN ............................................................................................................ 145 
KHUYẾN NGHỊ .................................................................................................... 147 
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN 
LUẬN ÁN ............................................................................................................... 148 
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 149 
PHỤ LỤC 
vi 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 
ACE Association of Clinical 
Endocrinologist 
Hiệp hội các nhà lâm sàng nội tiết 
ADA: American diabetes association Hiệp hội đái tháo đường Hoa Kỳ 
CDA Canadian diabetes association Hiệp hội đái tháo đường Canada 
CSLL: Cỏ sữa lá lớn 
DALY: Disability adjusted life year Số năm sống hiệu chỉnh theo mức 
độ tàn tật 
ĐH Đường huyết 
ĐTĐ: Đái tháo đường 
IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% 
IDF: International Deabetes Federation Liên đoàn Đái tháo đường Quốc 
tế 
HbA1c: Hemoglobin A1c Hemoglobin dạng A1c 
HDL-C: High-density lipoprotein cholesterol Cholesterol có đậm độ lipoprotein 
cao 
OGTT: Oral glucose tolerance testing Nghiệm pháp dung nạp glucose 
qua đường uống 
LDL-C: Low-density lipoprotein cholesterol Cholesterol có đậm độ lipoprotein 
thấp 
LD50 Lethal Dose 50% Liều lượng gây chết 50% 
RLGM 
SKLM: 
Rối loại glucose máu 
Sắc ký lớp mỏng 
T2DM Đái tháo đường type 2 
WHO: World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới 
vii 
DANH MỤC CÁC BẢNG 
Bảng 1.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán đái tháo đường và tiền đái tháo đường dựa vào 
glucose máu theo Hiệp hội đái tháo đường Hoa Kỳ năm 2019 ............. 9 
Bảng 1.2. Quốc gia có số người mắc bệnh đái tháo đường cao nhất năm 2017 và 
ước tính năm 2045................................................................................. 11 
Bảng 1.3. Một số thực vật giàu flavonoid ............................................................ 23 
Bảng 1.4. Thành phần hóa học của cỏ sữa lá lớn Euphobia hirta L. .................... 34 
Bảng 2.1. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ quercitrin chuẩn ................... 62 
Bảng 2.2. Lựa chọn công thức phối trộn ....................................................................... 74 
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm hợp chất trong phần trên mặt đất cỏ sữa lá 
lớn.......................................................................................................... 88 
Bảng 3.2. Kết quả định tính phân đoạn dịch chiết n-hexan ................................... 89 
Bảng 3.3. Kết quả định tính phân đoạn dịch chiết chloroform ............................. 90 
Bảng 3.4. Kết quả định tính phân đoạn dịch chiết ethyl acetat ............................. 91 
Bảng 3.5. Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong cỏ sữa lá lớn ................ 92 
Bảng 3.6. Kết quả điều chế cao cỏ sữa lá lớn ở quy mô 1 kg nguyên liệu/mẻ ...... 99 
Bảng 3.7. Số liệu thử độc tính cấp của cao chiết nước cỏ sữa. ............................... 102 
Bảng 3.8. Trọng lượng chuột thí nghiệm ở các thời điểm theo dõi. ...................... 102 
Bảng 3.9. Các chỉ số huyết học của các lô chuột thí nghiệm .................................. 103 
Bảng 3.10. Các chỉ số sinh hóa của các lô chuột thí nghiệm .................................... 104 
Bảng 3.11. Tỷ lệ khối lượng các cơ quan so với khối lượng cơ thể chuột thí 
nghiệm ............................................................................................................ 105 
Bảng 3.12. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của mẫu cao cỏ sữa lá lớn ở các độ 
pha loãng khác nhau ..................................................................................... 106 
Bảng 3.13. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của mẫu cao cỏ sữa lá lớn ở các 
độ pha loãng khác nhau ....................................................................... 108 
Bảng 3.14. Sự thay đổi nồng độ glucose máu và HbA1c sau 8 tuần điều trị cao 
chiết cỏ sữa lá lớn................................................................................ 110 
viii 
Bảng 3.15. Một số chỉ tiêu hóa lý của các công thức phối chế đồ uống dinh dưỡng 
cao cỏ sữa lá lớn .................................................................................. 111 
Bảng 3.16. Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan của các công thức phối chế đồ 
uống dinh dưỡng cỏ sữa lá lớn ............................................................ 112 
Bảng 3.17. Chất lượng sản phẩm sau 6 tháng bảo quản với các bao bì khác nhau ..... 113 
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của điều kiện thanh trùng đến chất lượng đồ uống dinh 
dưỡng cỏ sữa lá lớn .................................... ... ẢN CÔNG BỐ SẢN PHẨM 
Số:01/2019/VDD 
I. Thông tin về tổ chức, cá nhân công bố sản phẩm 
Tên tổ chức: Viện Dinh dưỡng Quốc gia 
Địa chỉ: 48B - Tăng Bạt Hổ - Quận Hai Bà Trưng - Hà Nội 
Điện thoại: 02439.717.090 Fax: 02439.717.885 
E-mail: ninvietnam@viendinhduong.vn 
Mã số doanh nghiệp: 
Số Giấy chứng nhận cơ sở đủ điều kiện ATTP:  Ngày cấp/Nơi cấp: ......... 
(đối với cơ sở thuộc đối tượng phải cấp Giấy chứng nhận cơ sở đủ điều kiện an 
toàn thực phẩm theo quy định) 
II. Thông tin về sản phẩm 
1. Tên sản phẩm: Sản phẩm dinh dưỡng nước giải khát cỏ sữa thuộc nhóm Thực 
phẩm bảo vệ sức khỏe. 
2. Thành phần: Trong 100ml sản phẩm chứa các nguyên liệu: 
Cao chiết cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) : 2,5 g (tương đương 12,5 g cỏ sữa 
lá lớn khô) 
Mật ong (honey): 2,5 g 
Đường cỏ ngọt (stevia): 0,03 g 
Gừng (ginger): 1g 
Phụ liệu: Nước vừa đủ 100ml 
3. Chỉ tiêu chất lượng chủ yếu tạo nên công dụng của sản phẩm (đối với thực 
phẩm bảo vệ sức khỏe): 
STT 
Chỉ tiêu đánh giá Phương pháp thử Mức chất lượng 
1 
Flavonoid toàn phần 
(mg/L) 
NIN.G.01. M14 
(UV-VIS) 
≥ 550 
2 Quercitin 
NIN.G.01. M147 
(HPLC) 
 4. Chỉ tiêu chất lượng 
STT 
Chỉ tiêu đánh giá Phương pháp thử 
Mức chất 
lượng/ 
Mức tối đa 
1 Màu sắc TCVN 7041 : 2009 
Đặc trưng cho 
từng loại sản 
phẩm 
2 Mùi, Vị TCVN 7041 : 2009 
Đặc trưng cho 
từng loại sản 
phẩm, không có 
mùi, vị lạ 
3 Trạng thái TCVN 7041 : 2009 
Dạng lỏng, đồng 
nhất, không có 
cặn 
4 
Độ axit (theo acid 
citric) 
AOAC 950.15 
5 
Hàm lượng cacbon 
dioxit (CO2) 
TCVN 5563 : 2009 
6 
Hàm lượng đường 
tổng số 
TCVN 7044 : 2009 
5. Chỉ tiêu an toàn 
STT 
Chỉ tiêu đánh giá Phương pháp thử 
Mức chất 
lượng/ 
Mức tối đa 
I Kim loại nặng 
1 Pb (mg/L) TCVN 8126:2009 0,05 
2 Sn (mg/L) TCVN 7769:2007 150 
II Độc tố vi nấm 
Patulin (µg/L) TCVN 8161:2009 50 
III 
Dư lượng thuốc bảo 
vệ thực vật 
1 
Piperonyl butoxid, 
mg/l 
EN 12393:2013 0,05 
2 2-Phenylphenol, mg/l EN 12393:2013 0,5 
3 Propargit, mg/l EN 12393:2013 0,3 
STT 
Chỉ tiêu đánh giá Phương pháp thử 
Mức chất 
lượng/ 
Mức tối đa 
4 Diphenylamin, mg/l EN 12393:2013 0,5 
5 Carbaryl, mg/l BS EN 15662:2017 mod 3 
6 Malathion, mg/l BS EN 15662:2017 mod 0,01 
IV Vi Sinh 
1 
Tổng số vi sinh vật 
hiếu khí, CFU/ml 
TCVN 4884:2005 (ISO 
4833:2003) 
100 
2 Coliforms, CFU/ml 
TCVN 6848:2007 (ISO 
4832:2006) 
10 
3 E. coli, CFU/ml 
TCVN 7924-2:2008 (ISO 
16649-2:2001) 
Không được có 
4 
Streptococci faecal, 
CFU/ml 
TCVN 6189-2:2009 
ISO 7899-2:2000 
Không được có 
5 
Pseudomonas 
aeruginosa, CFU/ml 
TCVN 8881:2011 
(ISO 16266:2006) 
Không được có 
6 
Staphylococcus 
aureus, CFU/ml 
TCVN 4830-1:2005 (ISO 
6888-1:1999, With 
Amd.1:2003); 
2:2005 (ISO 6888-2:1999, 
With Amd. 1:2003); TCVN 
4830-3:2005 (ISO 6888-2: 
2003) 
Không được có 
7 
Clostridium 
perfringens, CFU/ml 
TCVN 4991:2005 (ISO 
7937:2004) 
Không được có 
8 
Tổng số nấm men và 
nấm mốc, CFU/ml 
TCVN 8275-1:2009 (ISO 
21527-1:2008) 
10 
9 
Salmonella spp 
(CFU/25 ml) 
TCVN 10780-1:2017 
(ISO 6579-1:2017) 
Không được có 
6. Thời hạn sử dụng sản phẩm: 6 tháng 
7. Quy cách đóng gói và chất liệu bao bì: Đóng gói trong lon nhôm, 200ml 
8. Tên và địa chỉ cơ sở sản xuất thử nghiệm sản phẩm: Viện nghiên cứu Rau quả. 
9. Địa chỉ: Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội 
 III. Mẫu nhãn sản phẩm (đính kèm mẫu nhãn sản phẩm hoặc mẫu nhãn sản 
phẩm dự kiến) 
IV. Yêu cầu về an toàn thực phẩm 
Tổ chức, cá nhân sản xuất, kinh doanh thực phẩm đạt yêu cầu an toàn thực 
phẩm theo: 
- Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản phẩm đồ uống không cồn 
QCVN 6-2:2010/BYT; 
- Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7041 : 2009 về dồ uống không cồn. 
Chúng tôi xin cam kết thực hiện đầy đủ các quy định của pháp luật về 
an toàn thực phẩm và hoàn toàn chịu trách nhiệm về tính pháp lý của hồ sơ 
công bố và chất lượng, an toàn thực phẩm đối với sản phẩm đã công bố và chỉ 
đưa sản phẩm vào sản xuất, kinh doanh khi đã được cấp Giấy tiếp nhận đăng 
ký bản công bố sản phẩm./. 
 Hà Nội, ngày. tháng. Năm 2019 
ĐẠI DIỆN TỔ CHỨC, CÁ NHÂN 
(Ký tên, đóng dấu) 
 4. Cách tiến hành định tính các hơp chất trong cỏ sữa lá lớn bằng 
phương pháp hóa học 
*Tiến hành chiết xuất dịch chiết cồn để định tính flavonoid, courmarin 
Cân 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml. Thêm 50 ml ethanol 
90%, đun sôi cách thuỷ sôi trong 10 phút, lọc nóng. Dịch lọc thu được đem cô cách 
thủy cho bay hết dung môi. Cắn thu được hòa trong 20 ml nước cất đun sôi, lọc 
nóng. Dịch lọc thu được đem cô cách thủy cho bay hơi hết nước, cắn còn lại được 
hòa tan trong 15 ml ethanol 90%. Dịch thu được đem định tính flavonoid, 
courmarin. 
1. Định tính flavonoid 
- Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda): 
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết cồn, thêm một ít bột magnesi kim loại 
(~10 mg). Nhỏ từng giọt HCl đặc (3-5 giọt). Để yên 1-2 phút. 
Hiện tượng: Dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ. Phản ứng dương tính (+). 
- Phản ứng với kiềm: 
+ Phản ứng với NH3: Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết cồn lên một mảnh giấy lọc. Hơ 
khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút.. 
Hiện tượng: Màu vàng của vết dịch chiết tăng lên. Phản ứng dương tính (+). 
+ Phản ứng với dung dịch NaOH: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết 
cồn. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%. Sau đó thêm 1 ml nước cất. 
Hiện tượng: Sau khi thêm NaOH dung dịch xuất hiện kết tủa vàng, thêm 1 ml nước 
cất thì kết tủa tan, màu vàng của dung dịch đậm lên. Phản ứng dương tính (+). 
- Phản ứng với dd FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết cồn. 
Thêm vào 2-3 giọt dd FeCl3 5%. 
Hiện tượng: Dung dịch xuất hiện tủa màu xanh đen. Phản ứng dương tính (+). 
Kết luận: Mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu có flavonoid. 
2. Định tính coumarin 
- Phản ứng mở, đóng vòng lacton 
Cho vào 2 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 ml dịch chiết cồn. 
 Ống 1: Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% 
 Ống 2: Để nguyên 
Đun cách thuỷ cả 2 ống đến sôi, để nguội, quan sát hiện tượng. 
Hiện tượng: 
Ống 1: Xuất hiện tủa đục màu vàng 
Ống 2: Trong (phản ứng dương tính). 
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát thấy: 
Ống 1: Dung dịch trong suốt có màu vàng đậm lên. 
 Ống 2: Trong (phản ứng âm tính). 
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc. Ống 1 vẫn trong suốt. (phản ứng âm 
tính). 
- Quan sát hiện tượng huỳnh quang 
Nhỏ lên một khoanh giấy thấm 2 vết dịch chiết cồn (mỗi vết 2-3 giọt dịch chiết). 
Nhỏ 2-3 giọt dung dịch NaOH 5% lên 2 vết dịch chiết. Sấy nhẹ. Che một vết dịch 
chiết trên giấy thấm bằng một miếng kim loại, rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút. 
Bỏ miếng kim loại ra, quan sát hiện tượng. 
Hiện tượng: Vết dịch chiết không bị che có huỳnh quang không sáng hơn vết dịch 
chiết bị che. 
Kết luận: Mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu không có coumarin. 
3. Định tính saponin 
- Quan sát hiện tượng tạo bọt 
Cho 5 g bột dược liệu vào bình định mức 250 ml, thêm 50 ml ethanol 70%. Đun 
cách thủy đến sôi trong 30 phút. Lọc nóng. Dịch lọc thu được đem cô cách thủy đến 
cắn. Hòa tan lượng cắn thu được trong 5 ml nước nóng. Lọc vào một ống nghiệm 1,6 
cm x 16 cm và để nguội, thêm nước cho đủ 10 ml, dung ngón tay cái bịt miệng ông 
nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 5 phút. Để yên ống nghiệm. 
Quan sát thấy cột bọt bền trong 15 phút. 
Kết luận: Mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu có saponin. 
4. Định tính glycosid tim 
Cân 10 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 200 ml. Thêm 100 ml ethanol 25 
% rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn lấy dịch chiết vào cốc có mỏ có dung tích 100 ml. 
Thêm vào dịch chiết 3 ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào 
một cốc có mỏ dung tích 100 ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống 
nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1 
ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại, và tiếp tục thử đến khi dịch lọc 
không còn tủa với chì acetat. Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn dung tích 125 
ml. Lắc kỹ 2 lần với hỗn hợp chloroform: ethanol (4:1), mỗi lần với 8 ml. Gạn dịch 
chiết chloroform vào cốc có mỏ, loại nước bằng natri sulfat khan. Chia đều dịch 
chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô và đem bốc hơi trên nồi cách thủy đến 
khô. Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau: 
- Phản ứng Liebermann- Burchard: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml anhydrid 
acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống nghiệm 45º. Cho từ từ theo thành ống 
0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Quan sát hiện tượng. 
Hiện tượng: Ở giữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng màu tím đỏ. Phản ứng 
dương tính (+). 
 - Phản ứng Legal: Hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 90%. Nhỏ 1 
giọt thuốc thử natri nitroprussinat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% . Lắc đều. 
Hiện tượng: Ống nghiệm không thấy xuất hiện màu đỏ cam. Phản ứng âm tính (-). 
- Phản ứng Baljet: Hoà tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 90%. Lắc 
đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (gồm 1 phần dung dịch acid 
picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) . 
Hiện tượng: Ống nghiệm không thấy xuất hiện màu đỏ cam. Phản ứng âm tính (-). 
- Phản ứng Keller- Kiliani: Hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 
90o. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ vài giọt dung dịch FeCl3 5% trong acid acetic, lắc 
đều. Nghiêng ống nghiệm 45o cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo 
trộn chất lỏng trong ống. 
Hiện tượng: Ở giữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng màu tím đỏ. Phản ứng 
dương tính (+). 
Kết luận: Mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu không có glycosid tim. 
5. Định tính alcaloid 
Cân 15 g bột dược liệu cho vào bình cầu dung tích 250 ml. Kiềm hóa bằng 
NH4OH 25%. Thêm 50 ml chloroform. Đun hồi lưu trong 2 giờ, lọc nóng vào cốc 
có mỏ 100 ml, để nguội. Chuyển toàn bộ dịch trên vào bình gạn dung tích 100 ml. 
Lắc kỹ 3 lần với dung dịch acid sulfuric 2%, mỗi lần 5 ml. Gộp các dịch chiết nước 
thu được cho vào 3 ống nghiệm: 
- Ống 1: 1 ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Mayer. 
Hiện tượng: Ống nghiệm xuất hiện tủa trắng. Phản ứng dương tính (+). 
- Ống 2: 1 ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Bouchardat. 
Hiện tượng: Ống nghiệm xuất hiện tủa nâu. Phản ứng dương tính (+). 
- Ống 3: 1 ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Dragendorff. 
Hiện tượng: Ống nghiệm xuất hiện tủa vàng. Phản ứng dương tính (+). 
Kết luận: Mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu có alcaloid. 
6. Định tính anthranoid 
Phản ứng Borntraeger: 
 Lấy 2 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml. Thêm 10 ml dung 
dịch H2SO4 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi khoảng 15 phút . Lọc dịch 
chiết còn nóng qua giấy lọc vào bình gạn dung tích 50 ml. Để nguội dịch lọc. Thêm 
5 ml chloroform, lắc nhẹ, gạn bỏ lớp nước, giữ lớp chloroform để làm phản ứng. 
Lấy 1 ml dịch chiết chloroform, cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1 ml dung dịch 
NaOH 10%. Lắc nhẹ. 
Hiện tượng: Lớp nước không chuyển sang màu đỏ sim. Phản ứng âm tính (-). 
Kết luận: Mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu không có anthranoid. 
 *Tiến hành chiết xuất dịch chiết nước để làm các phản ứng định tính tanin, 
acid hữu cơ, acid amin, polysaccharid, đường khử 
Cân 5 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml. Thêm 50 ml nước cất, 
đun sôi cách thuỷ 20 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc làm các phản ứng. 
7. Định tính tanin 
a. Định tính chung 
Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 ml dịch chiết nước, làm các phản ứng 
sau: 
- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: thêm 2-3 giọt dung dịch gelatin 1% mới pha 
vào ống nghiệm chứa dịch chiết nước. 
Hiện tượng: Xuất hiện tủa bông trắng. Phản ứng dương tính (+). 
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết nước 2-
3 giọt dd FeCl3 5%. 
Hiện tượng: Xuất hiện kết tủa màu xanh đen. Phản ứng dương tính (+). 
- Phản ứng với dung dịch chì acetat: cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết nước 2-
3 giọt dung dịch chì acetat 10%. 
Hiện tượng: Xuất hiện tủa bông trắng. Phản ứng dương tính (+). 
b. Định tính phân biệt 2 loại tanin: phản ứng Stiasny 
Lấy 20 ml dịch chiết nước cho vào cốc có mỏ dung tích 50 ml. Cho 5ml thuốc 
thử Stiasny (formol và HCl đặc tỷ lệ 2:1), đun nóng, khuấy đều. Thấy xuất hiện tủa 
màu đỏ gạch. Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 50 ml. nhỏ vài 
giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm một giọt thuốc thử Stiasny. Nếu xuất 
hiện tủa thì ngừng lọc, tiếp 1 ml thuốc thử Stiasny vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại 
và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với thuốc thử Stiasny. Thêm vào dịch 
lọc thu được natri acetat đến dư. Lấy 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm nhỏ. Nhỏ 2-
3 giọt dung dịch FeCl3 5% (TT) vào ống nghiệm. Xuất hiện tủa màu xanh đen. 
Kết luận: Mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu có cả hai loại tanin: tanin pyrogallic và 
tanin pyrocatechic. 
8. Định tính đường khử 
Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết nước. Thêm vào 0,5 ml thuốc thử 
Fehling A và 0,5 ml Fehling B, đun cách thuỷ 10 phút. Quan sát hiện tượng. 
Hiện tượng: Xuất hiện kết tủa đỏ gạch. Phản ứng dương tính (+). 
Kết luận: Mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu có chứa đường khử. 
9. Định tính polysaccharid 
Lấy 2 ống nghiệm lớn, cho vào mỗi ống: 
Ống 1: 3 ml dịch chiết nước và 5 giọt thuốc thử Lugol. 
Ống 2: 3 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol. 
 Ống 3: 3 ml dịch chiết nước. 
Hiện tượng: Ống 1 có màu xanh đậm hơn ống 2 và ống 3. Phản ứng dương tính (+). 
Kết luận: Mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu có polysaccharid. 
10. Định tính acid hữu cơ 
Cho vào ống nghiệm lớn 3 ml dịch chiết nước. Thêm 1 ít bột Na2CO3 vào ống 
nghiệm. Quan sát hiện tượng. 
Hiện tượng: Không xuất hiện bọt khí bay lên. Phản ứng âm tính (-). 
Kết luận: Mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu không có acid hữu cơ. 
* Tiến hành chiết xuất dịch chiết ether dầu hỏa để làm các phản ứng định tính 
sterol, chất béo, caroten như sau: 
Cân 5 g bột dược liệu cho vào bình nón 100 ml. Đổ ngập ether dầu hỏa, chiết hồi 
lưu trong 1 giờ. Lọc thu lấy dịch lọc để làm các phản ứng. 
11. Định tính chất béo 
Nhỏ 2 giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung 
môi. Quan sát. 
Hiện tượng: Không có vết mờ trên giấy lọc. Phản ứng âm tính (-). 
Kết luận: Mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu không có chất béo. 
12. Định tính sterol 
Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa, cô cách thuỷ bốc hơi 
dung môi đến khô. Thêm vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ. Để nghiêng 
ống nghiệm 45º, nhỏ từ từ 3 giọt acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm. Quan sát 
hiện tượng. 
Hiện tượng: Tại mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng tròn màu tím 
đỏ. Phản ứng dương tính (+). 
Kết luận: Mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu có sterol. 
13. Định tính caroten 
Cho vào chén sứ nhỏ 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa, cô cách thuỷ bốc hơi dung 
môi đến cắn. Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn. Quan sát hiện tượng. 
Hiện tượng: không thấy xuất hiện màu xanh lá. Phản ứng âm tính (-) 
Kết luận: Mẫu cỏ sữa lá lớn nghiên cứu không có chứa caroten.