Luận án Nghiên cứu đột biến gen trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 	 	 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ THƠM
NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN 
TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO 
THẦN KINH ĐỆM 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
HÀ NỘI - 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 	 	 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ THƠM
NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN 
TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO 
THẦN KINH ĐỆM 
	Chuyên ngành : Hóa sinh
	Mã số	 : 62720112
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
 PGS.TS. ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG
HÀ NỘI - 2019
LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Nguyễn Thị Thơm, nghiên cứu sinh khoá 34 Trường Đại học Y Hà Nội, Chuyên ngành Hoá sinh Y học, xin cam đoan:
1. 	Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của Cô Đặng Thị Ngọc Dung.
2. 	Công trình này không trùng lặp với bất kỳ một nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam.
3. 	Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.
Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2019
Người viết cam đoan
Nguyễn Thị Thơm
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Bp
Base pair 
Cặp base nitơ
CBTRUS 
DNA
Central Brain Tumor Registry of the United States
Deoxyribonucleic Acid
Trung tâm quản lý u não Hoa Kỳ
Axit Deoxyribonucleic
dNTP
Deoxynucleoside triphosphate
Nucleotid tự do 
EGFR 
FGFR
IDH
MGMT
MLPA
mRNA
Epidermal Growth Factor Receptor
Fibroblast Growth Factor Receptor 
Isocitrate dehydrogenase
Methylguanine DNA methyltransferase
Multiplex Ligation - dependent Probe Amplifcation
RNA messenger 
Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì
Thụ thể yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi
Enzym Isocitrate dehydrogenase
Enzym Methylguanine DNA methyltransferase
Khuếch đại DNA đầu dò đa mồi
RNA thông tin
PCR
Polymerase Chain Reaction 
Chuỗi phản ứng enzym
TACC 
TP53
RNA
RTK
UNBTKĐ
Transforming, Acidic Coiled-Coil Containing Protein 
Tumor protein 53 
Ribonucleic Acid
Receptor tyrosin kinase
Gen mã hoá Protein Acidic Coiled-Coil Containing
Gen ức chế khối u TP53
Axit Ribonucleic
Thụ thể nội bào
U nguyên bào thần kinh đệm
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. 	Đặc điểm 2 thể bệnh UNBTKĐ nguyên phát và thứ phát	36
Bảng 2.1. 	Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu	56
Bảng 3.1. 	Đặc điểm về tuổi của người bệnh trong nghiên cứu	63
Bảng 3.2. 	Kết quả phát hiện đột biến điểm trên exon 2,3,7 gen EGFR	69
Bảng 3.3. 	Tỉ lệ các dạng đột biến trên gen EGFR	70
Bảng 3.4. 	Kiểu xóa đoạn từ exon 2 đến exon 7 gen EGFR	79
Bảng 3.5. 	Tổng hợp số lượng đột biến từ exon 2 đến exon 7 gen EGFR	80
Bảng 3.6. 	Kết quả phát hiện đột biến điểm trên gen FGFR	84
Bảng 3.7. 	Các đột biến kép trên 3 gen TP53, EGFR, FGFR	85
Bảng 3.8. 	Tuổi trung bình của người bệnh phát hiện thấy đột biến gen	86
Bảng 3.9. 	Tuổi trung bình của hai giới nam và nữ	87
Bảng 3.10. 	Đặc điểm về phân bố tuổi ở người bệnh đột biến gen EGFR	87
Bảng 3.11. 	Đặc điểm về tuổi của người bệnh UNBTKĐ đột biến 1 trong 3 gen nghiên cứu	88
Bảng 3.12. 	Đặc điểm về giới của người UNBTKĐ phát hiện thấy đột biến gen	88
Bảng 3.13. 	Phân bố kích thước khối u của người bệnh đột biến gen FGFR	89
Bảng 3.14. 	Phân bố kích thước khối u của người đột biến gen EGFR	89
Bảng 3.15. 	Phân bố kích thước khối u của người đột biến một trong 3 gen FGFR - EGFR - TP53	90
Bảng 3.16. 	Tỷ lệ thể bệnh nguyên phát và thứ phát	90
Bảng 3.17. 	Tuổi trung bình của hai thể nguyên phát và thứ phát	91
Bảng 3.18. 	Thời gian trung bình từ khi phát hiện bệnh đến khi phẫu thuật	91
Bảng 3.19. 	Phân bố thời gian từ khi phát hiện bệnh đến khi phẫu thuật của thể nguyên phát và thể thứ phát	92
Bảng 3.20. 	Phân bố thời gian sống sau phẫu thuật của thể nguyên phát
	và thể thứ phát	92
Bảng 3.21. 	Phân bố thời gian từ khi phát hiện bệnh đến khi chết của thể nguyên phát và thể thứ phát	93
Bảng 3.22. 	Tuổi trung bình của người bệnh đột biến gen.	94
Bảng 3.23. 	Phân bố thời gian sống sau phẫu thuật của thể nguyên phát và thể thứ phát có điều trị xạ trị, hóa chất	95
Bảng 3.24. 	Thời gian sống của người bệnh sau phẫu thuật có điều trị	95
Bảng 3.25. 	Thời gian sống của người bệnh đột biến gen FGFR sau phẫu thuật có điều trị xạ trị, hóa chất	96
Bảng 3.26. 	Thời gian sống của người bệnh đột biến gen EGFR sau phẫu thuật có điều trị xạ trị, hóa chất	97
Bảng 3.27. 	Thời gian sống của người bệnh sau phẫu thuật đột biến 1 trong 3 gen, có điều trị xạ trị, hóa chất	98
Bảng 3.28. 	Thời gian sống của người bệnh phát hiện thấy đột biến gen FGFR tính từ khi phát hiện mắc bệnh đến lúc chết có điều trị xạ trị, hóa chất	99
Bảng 3.29. 	Thời gian sống của người bệnh phát hiện thấy đột biến gen EGFR tính từ khi phát hiện mắc bệnh đến lúc chết có điều trị xạ trị, hóa chất	100
Bảng 3.30. 	Thời gian sống của người bệnh đột biến 1 trong 3 gen nghiên cứu tính từ khi phát hiện mắc bệnh đến lúc chết có điều trị	101
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. 	Các đặc điểm mô học của u tế bào hình hạt nhỏ	8
Hình 1.2. 	Ảnh chụp MRI và mô bệnh học của UNBTKĐ.	11
Hình 1.3. 	Hình ảnh minh hoạ sự phân bố và tần suất đột biến gen TP53 trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.	20
Hình 1.4. 	Vị trí gen EGFR trên NST số 7	21
Hình 1.5. 	Các cơ chế kích hoạt và các đường dẫn tín hiệu
	do EGFR thực hiện	22
Hình 1.6. 	Vị trí đột biến gen EGFR trên bệnh nhân
	u nguyên bào thần kinh đệm	24
Hình 1.7. 	Ảnh nhuộm miễn dịch học của EGFR trong mô UNBTKĐ	25
Hình 1.8. 	Thời gian sống còn của người bệnh UNBTKĐ	26
Hình 1.9. 	Vị trí của gen FGFR1 trên NST (A) 
	Vị trí của gen FGFR3 trên NST (B)	28
Hình 1.10. 	Cấu trúc, vị trí hoạt động và con đường tín hiệu thông qua thụ thể yếu tố phát triển nguyên bào sợi FGFRs.	29
Hình 1.11. 	Hình ảnh đột biến gen FGFRs trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.	30
Hình 1.12. 	Vị trí của TACC3 trên NST số 4	33
Hình 1.13. 	Kết quả thử nghiệm chất JNJ-42756493 trên chuột có UNBTKĐ.	33
Hình 1.14. 	Sự thay đổi kích thước khối u và thời gian sống kéo dài của bệnh nhân có đột biến gen FGFR sau điều trị bằng chất ức chế JNJ-42756493.	34
Hình 1.15. 	(A) So sánh tỷ lệ sống còn của người bệnh UNBTKĐ có đột biến gen dạng EGFRvIII và người không có đột biến	40
Hình 1.16. 	Phản ứng PCR (thành phần và sản phẩm)	44
Hình 1.17. 	Ảnh kết quả đột biến điểm gen EGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm	46
Hình 1.18. 	Hình ảnh probe và quy trình phản ứng MLPA	48
Hình 1.19. 	Hình ảnh điện di xác định đột biến gen dạng EGFRvIII
	bằng kỹ thuật MLPA	49
Hình 1.20. 	Ảnh kết quả giải trình tự xác định đột biến gen FGFR	51
Hình 2.1. 	Hình ảnh kết quả chạy điện di mao quản mẫu DNA chuẩn của người nam	58
Hình 3.1. 	Đặc điểm về giới của người bệnh trong nghiên cứu	64
Hình 3.2. 	Hình ảnh minh họa kết quả đo OD của mẫu DNA tách chiết bằng máy Nanodrop 1000	65
Hình 3.3. 	Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân bản các exon nghiên cứu	66
Hình 3.4. 	Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 8 gen TP53 có chứa đột biến điểm p.R282W	67
Hình 3.5. 	Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 8 gen TP53
	chứa đột biến điểm p.R306X	68
Hình 3.6. 	Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 2 gen EGFR
	chứa đột biến điểm p.G42D	71
Hình 3.7. 	Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 2 gen EGFR
	chứa đột biến điểm p.L62I	71
Hình 3.8. 	Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 3 gen EGFR
	chứa đột biến điểm p.G87D	72
Hình 3.9. 	Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 3 gen EGFR
	chứa đột biến điểm p.K129N	72
Hình 3.10. 	Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 7 gen EGFR
	chứa đột biến điểm p.T274M	73
Hình 3.11. 	Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 7 gen EGFR
	chứa đột biến điểm p.A289T	74
Hình 3.12. 	Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 7 gen EGFR
	chứa đột biến điểm p. K293X	75
Hình 3.13. 	Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 7 gen EGFR
	chứa đột biến điểm p.K284N	75
Hình 3.14. 	Hình ảnh điện di mao quản sản phẩm PCR xác định xóa đoạn từ exon 2 đến exon 7 gen EGFR	76
Hình 3.15. 	Hình ảnh kết quả phân tích xác định đột biến xóa đoạn
	từ exon 2 đến exon 7 gen EGFR	78
Hình 3.16. 	Hình ảnh kết quả giải trình tự đoạn exon 12 gen FGFR
	chứa đột biến điểm p.N546K	81
Hình 3.17. 	Hình ảnh kết quả giải trình tự đoạn exon 13 gen FGFR
	chứa đột biến điểm p.A575V	82
Hình 3.18. 	Hình ảnh giải trình tự đoạn exon 13 gen FGFR
	chứa đột biến điểm p.R576W	83
Hình 3.19. 	Tỉ lệ đột biến (A) và tỉ lệ các dạng đột biến (B) 
	trên exon 12, exon 13 của gen FGFR.	84
Hình 3.20. 	Tỷ lệ đột biến trên các gen nghiên cứu	85
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tế bào thần kinh đệm được xem như là mô liên kết của hệ thần kinh trung ương của con người, với số lượng nhiều gấp 10 đến 50 lần so với số lượng neuron thần kinh. Các tế bào thần kinh đệm được công nhận vai trò thông tin liên lạc trong hệ thần kinh trung ương khi hợp tác với các neuron [1]. U nguyên bào thần kinh đệm (UNBTKĐ) phát triển từ tế bào thần kinh đệm chưa biệt hóa hoặc biệt hóa thấp trong não [2], 100% là ác tính và được WHO xếp vào nhóm u ác tính độ IV [3]; tỷ lệ mắc mới hàng năm khoảng 3,2/100000 dân, chiếm tỷ lệ cao nhất trong các loại u não ác tính nguyên phát (46,6%), bệnh tiến triển rất nhanh, người bệnh UNBTKĐ có thời gian sống trung bình chỉ 6 tháng đến 1 năm mặc dù đã được điều trị rất tích cực, tỷ lệ sống sau 5 năm rất thấp chỉ khoảng 5,5% [4]. 
Cơ chế sinh bệnh UNBTKĐ được biết đến đa phần là do đột biến gen, gây rối loạn thông tin di truyền trong tế bào, tế bào tăng sinh, không ngừng phân chia phát sinh khối u, ung thư [5],[6],[7]. Một tế bào bình thường để chuyển dạng sang tế bào ung thư phải trải qua một vài đột biến ở một số gen nhất định. Quá trình này liên quan đến hệ thống gen sinh ung thư và gen kháng ung thư. Bình thường gen sinh ung thư kiểm soát hoạt động tế bào theo hướng tích cực, mã hóa protein truyền những tín hiệu phân bào, khi các gen này bị đột biến sẽ truyền tín hiệu phân bào sai lạc mà cơ thể không kiểm soát được dẫn đến sinh ung thư, ví dụ gen EGFR, FGFR, IDH... Các gen kháng ung thư trái lại mã hóa cho những protein kiểm soát phân bào theo hướng ức chế, làm chu kỳ phân bào dừng ở một pha, thường ở pha G1; các gen kháng ung thư còn có chức năng làm biệt hóa tế bào, hoặc mã hóa tế bào chết theo chương trình. Khi các gen kháng ung thư bị bất hoạt do đột biến sẽ làm biến đổi tế bào lành thành ác tính, ví dụ gen TP53, PTEN [5]. 
Các nghiên cứu đã chỉ ra sinh bệnh UNBTKĐ có liên quan đến nhiều gen: gen kháng ung thư như gen TP53, PTEN, gen sinh ung thư như: EGFR, FGFR, IDH, MGMT, ATRX, hoặc xóa 1p/19q [8] nhưng tập trung nghiên cứu đột biến một số gen như gen TP53, EGFR, FGFR, vì đột biến các gen TP53, EGFR, FGFR ngoài có tỷ lệ đột biến cao còn được chứng minh đóng vai trò quan trọng trong cơ chế sinh bệnh phân tử và định hướng điều trị của bệnh u nguyên bào thần kinh đệm [4],[9],[10],[11]. Gen TP53 có vai trò kiểm soát hoạt động sống và chết của tế bào theo chu trình. Đột biến TP53 liên quan chặt chẽ với một tiên lượng xấu cho sự sống còn tổng thể ở những bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, và đột biến TP53 còn làm tăng nhạy cảm với hóa chất temozolomide trong điều trị bệnh, làm tăng tỉ lệ sống còn so với điều trị bằng semustine ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm [12],[13]. Gen EGFR và gen FGFR mã hóa tổng hợp các thụ thể màng tế bào có tên gọi protein tyrosin kinase, các thụ thể này có vai trò tiếp nhận và truyền các tín hiệu nội bào theo cơ chế phosphoryl hóa, sản phẩm của chúng sẽ điều hòa sự tăng sinh, sự sống còn, sự biệt hóa và sự vận động tế bào. Hoạt động của các thụ thể được kiểm soát và điều hòa rất chặt chẽ. Sự rối loạn hoạt động của tyrosin kinase do đột biến hay do các biến đổi di truyền khác có thể gây ra mất điều hòa hoạt động của enzym này và hậu quả là tế bào trở nên ác tính [5],[6]. Một số chất ức chế hoạt động bất thường của tyrosin kinase đã được thử nghiệm thành công trong một số ung thư do đột biến gen EGFR, FGFR như: ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư vú, đại tràng...[14],[15],[16],[17]. Và các chất ức chế EGFR, FGFR hiện đang được thử nghiệm trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, để những thử nghiệm thành công nhất định cần phải xác định được những thay đổi trong cấu trúc phân tử gen EGFR, FGFR. Đây chính là hướng điều trị đích đang rất triển vọng trong điều trị ung thư [18]. Nghiên cứu đột biến gen TP53, EGFR, FGFR là một trong những cơ sở cho nghiên cứu điều trị đích của bệnh UNBTKĐ, và rất cần thiết với các thầy thuốc lâm sàng để đưa ra tiên lượng và hướng điều trị tốt nhất cho người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm. Tại Việt nam chưa thấy có nghiên cứu về vấn đề này.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: "Nghiên cứu đột biến gen trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm", với mục tiêu:
Xác định đột biến gen TP53, EGFR, FGFR trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.
Phân tích một số đặc điểm của người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm phát hiện thấy đột biến gen. 
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về u nguyên bào thần kinh đệm 
1.1.1. Tình hình mắc u nguyên bào thần kinh đệm trong nước và trên thế giới
Tổng thể về điều tra mắc UNBTKĐ trên thế giới chưa đồng đều, ví dụ ở Mỹ năm nào cũng có nghiên cứu báo cáo về tình hình mắc bệnh, hay ở Anh, Phần lan, Đan mạch thường 5 năm báo cáo một lần, song ở các châu lục khác, như châu Á hay châu Phi, thống kê về bệnh còn lẻ tẻ và rất ít. Qua các báo cáo cho thấy tỷ lệ mắc UNBTKĐ không giống nhau giữa các châu lục, ở các nước Châu Âu và Mỹ có tỷ lệ mắc cao hơn các nước châu Á, tại Mỹ tỉ lệ mắc mới hàng năm là 3,2/100000 dân [4], tỷ lệ mắc cao nhất là ở Anh (4,64/100.000 dân/năm) [19], và các nước Bắc Âu số người mắc bệnh giao động từ 3,3 - 5,1/100.000 đối với nam giới và 2,1-3,5/100.000 phụ nữ, tỷ lệ mắc bệnh gia tăng hàng năm, tăng trung bình hàng năm ở nam giới: 9,2% và phụ nữ: 8,8%, sự gia tăng cao nhất ở nhóm tuổi già nhất, nam là 12,4%, nữ là 10,5% [20], tỷ lệ mắc thấp hơn ở Phần Lan 2,0/100.000 người/năm [21]. Tại Ấn độ hàng năm có từ 5-10/100,000 dân mắc u não và thần kinh trung ương, trong đó tỷ lệ mắc UNBTKĐ chiếm 22,8% [22]. Tỷ lệ mắc bệnh rất thấp ở Hàn quốc 0,66/100000 dân/năm [23]. Nam giới thường mắc UNBTKĐ nhiều hơn nữ giới, và người da trắng có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn người da màu [4].
Tại Việt Nam chưa thấy có báo cáo về tỷ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đệm trong cả nước, một số các nghiên cứu đã đưa ra kết quả cho thấy tỉ lệ bệnh khá cao: theo thống kê của Lê Xuân Trung và Nguyễn Như Bằng năm 1975, u nguyên bào thần kinh đệm chiếm 18% trong 408 ca mổ u não tại bệnh viện Việt Đức [24]. Nghiên cứu của Kiều Đình Hùng (2006), trong các loại u thần kinh đệm ác tính thì UNBTKĐ chiểm tỷ lệ cao nhất 62,7% [25]. Nghiên cứu của Trần Chiến (2011) tỉ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đệm là 39,3% trong số các u thần kinh đệm hình sao, nam mắc bệnh cao hơn nữ, tuổi trung bình 43,03 ± 3,37, tuổi hay gặp nhất từ 51-60 tuổi, thấp nhất 13 tuổi, cao nhất 71 tuổi [26]. Theo Dương Đại Hà và Hà Kim Trung (2014), u nguyên bào thần kinh đệm chiếm 33,3%, có độ tuổi trung bình cao nhất trong các loại u thần kinh đệm [27]. Tất cả các nghiên cứu đều kết luận nam giới mắc bệnh UNBTKĐ cao hơn nữ giới, tỷ lệ mắc tăng theo lứa tuổi [4],[19],[20],[25]. Về độ tuổi mắc ở Việt nam trẻ hơn so với  ... PHb, Steven Brem, MDa* (2017). The molecular pathogenesis of glioblastoma. Glioblastoma, 21-31.
Sung T, Miller DC, Hayes RL, Alonso M, Yee H, Newcomb EW (2000). Preferential inactivation of the TP53 tumor suppressor pathway and lack of EGFR amplification distinguish de novo high grade pediatric astrocytomas from de novo adult astrocytomas. Brain Pathol, 10, 249-259.
Van Meir EG, Kikuchi T et al (1994). Analysis of the p53 Gene and Its Expression in Human Glioblastoma Cells. Cancer Research, 54, 649-652.
Shoji Shiraishi M.D, Kenji Tada M.D, Yukitaka Ushio M.D et al (2002). Influence of p53 mutations on prognosis of patients with glioblastoma. Cancer J, 95(2), 249-257.
Bernard Leroy, Jean Louis Fournier, Thierry Soussi et al (2013). The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Res, 41(Database issue), D962-D969. 
Linn Hjortsberg and Thierry Soussi (2008). MUT-TP53 2.0: A novel versatile matrix for statistical analysis of TP53 mutations in human cancer. Journal: Human Mutation , Manuscript ID 2010-0129. 
Carpenter G, King Jr, and Cohen S (1978). Epidemal growth factor atimulates phosphoryllation in membrane preparations in vitro. Nature, 276, 409-410. 
Petri E.T, Halmos B, Boggon T.J kuma A (2008). Structure and clinical relevance of the epidermal growth factor receptor in human cancer. J clin Oncol, 26(10), 1742-1751.
Sliwkowski MX, Yarden Y (2001). Untangling the ErbB signaling network. Nat Rev Nol cell biol, 2, 137-2001.
Marmor M.D, Skaria K.B and Yarden Y (2004). Signal trandution and oncogennesis by ErbB/HER receptors. J. Radiat, Oncol, Biol, Phy, 58, 903-913.
Thorpe LM, Yuzugullu H, Zhao JJ (2015). PI3K in cancer: divergent roles of isoforms, modes of activation and therapeutic targeting. Nature reviews Cancer, 15, 7-24.
Jeffrey C Lee et al (2006). Epidermal Growth Factor Receptor Activation in Glioblastoma through Novel Missense Mutations in the Extracellular Domain. Journal pmed, 3(12), e485. 
Frederick L, Wang XY, Eley G, James CD (2000). Diversity and frequency of epidermal growth factor receptor mutations in human glioblastomas. Cancer Res, 60, 1383-1387.
Nicola Montano, Tonia Cenci, Roberto Pallini et all (2011). Expression of EGFRvIII in Glioblastoma: Prognostic Significance Revisited. Neoplasia, 13(12), 1113-1121.
Shinojima Naoki, Tada K, et al (2003). Prognostic value of epidermal growth factor receptor in patients with glioblastoma multi1forme. Cancer Res, 63(20), 6962-6970.
Youngmin Choi, Young-Jin Song, Hyung-Sik Lee et al (2013). Epidermal Growth Factor Receptor Is Related to Poor Survival in Glioblastomas: Single-Institution Experience. Journal List Yonsei Med, 54(1), 101-107.
Eskilsson E, Rosland GV, Talasila KM, Knappskog S, Keunen O, Sottoriva A, et al (2016). EGFRvIII mutations can emerge as late and heterogenous events in glioblastoma development and promote angiogenesis through Src activation. Neuro-oncology, 18, 1644-1655.
Huang PH, Mukasa A et al (2007). Quantitative analysis of EGFRvIII cellular signaling networks reveals a combinatorial therapeutic strategy for glioblastoma. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 104(31), 12867-12872.
Tuner N. and Grose R. (2010). Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Rev Cancer, 10, 116-129.
Dienstmann R, Rodon J, Prat A et al (2014). Genomic aberrations in the FGFR pathway: opportunities for targeted therapies in solid tumors. Ann oncol, 25(3), 552-563.
Haugsten E.M, Wiedlocha A, Olsnes S. Ellen et al (2010). Roles of Fibroblast Growth Factor Receptors in Carcinogenesis. Mol Cancer Res, 10, 1158-1541.
Agarwala S.S, Kirkwood J.M (2000). Temozolomide, a novel alkylating agent with activity in the central nervous system, may improve the treatment of advanced metastatic melanoma. Oncologist, 5(2), 144-151.
Carrie Marquette, Lisle Nabell (2012). Chemotherapy-Resistant Metastatic. Breast Cancer, 13(2), 263-275.
Brittany C. Parker et al (2013). The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Invest, 123(2), 855-865.
Devendra Singh, Joseph Minhow Chan, Pietro Zoppoli (2012). Transforming Fusions of FGFR and TACC Genes in Human Glioblastoma. National Institutes of Health, US, 1231-1235. 
Anna Luisa Di Stefano, Alessandra Fucci, Veronique Frattini et al (2015). Detection, characterization and inhibition of FGFR-TACC fusions in IDH wild type glioma. Clin Cancer Res, 21(14), 3307-3317.
Gan HK, Kaye AH, Luwor RB (2009). The EGFRvIII variant in glioblastoma multiforme. J. Clin. Neurosci, 16(6), 748-754.
Wantanabe K, Tachibana O, Sata K, et al (1996). Overexpression of the EGF and p53 mutations are mutually exclusive in the evolution of primary and secondary glioblastomas. Brain pathol, 6(3), 217-23.
Quin T. Ostrom, MPH, MA, Peter Liao, BS, MD, Lindsay C.Stetson, Jill S.Barnholtz-Sloan, PhD (2017). Epidemiology of Glioblastoma and trend in Glioblastoma survivoship. Glioblastoma, Elsevier, 11-19.
Molenaar RJ, Verbaan D, Lamba S, et al (2014). The combination of IDH1 mutations and MGMT methylation status predicts survival in glioblastoma better than either IDH1 or MGMT alone. Neuro Oncol, 16(9), 1263-73.
Brannan CW, Verhaak RG, McKenna A, et al (2013). The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell, 155(2),462-77.
Suvi V, Jha P, Sharma MC, et al (2011). 06-methylguanine DNA methyltransferase gene promoter methylation in hight grade gliomas: a review of curent status. Neurol India, 59(2),229-35.
Beiko J, Suki D, HessKR, et al (2014). IDH1 mutant maligant astrocytoma are more amenable to surgical resection and have a survival benefit associated with maximal surgical resection. Neuro Oncol, 16, 81-91.
Auffinger B, Spencer D, Pytel P, et al (2015). The role of glioma stem cell in chemotherapy resistance and glioblastoma multiforme recurence. Expert rev neurother, 15, 741-52.
Eckel-Passow JE, Lachance DH, Molinaro AM, et al (2015). Glioma groups based on 1p/19q, IDH, and TERT promoter mutations in tumors. N Engl J Med, 372(26), 2499-508.
Tạ Thành Văn (2010). PCR và một số kỹ thuật sinh học phân tử, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
Mullis K.B and Faloona FA (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reation. Methods Enzymod, 155, 335-50.
Judith Jeuken (2009). Robust Detection of EGFR Copy Number Changes and EGFR Variant III: Technical Aspects and Relevance for Glioma Diagnostics. Brain Pathol, 19(4), 661-671.
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA, 74, 5463-7.
Zascavage RR, Shewale SJ, Planz JV (2013). Deep-sequencing technologies and potential applications in forensic DNA testing. Forensic Sci Rev, 25, 79-105.
Switzeny OJ, Christmann M, Renovanz M, Giese A, Sommer C, Kaina B (2016). MGMT promoter methylation determined by HRM in comparison to MSP and pyrosequencing for predicting high-grade glioma response. Clin Epigenetics, 8, 49. 
Cykowski MD, Allen RA, Fung KM, Harmon MA, Dunn ST (2016). Pyrosequencing of IDH1 and IDH2 mutations in brain tumors and non-neoplastic conditions. Diagn Mol Pathol, 21, 214-20.
Quillien V, Lavenu A, Ducray F et al (2016). Validation of the high-performance of pyrosequencing for clinical MGMT testing on a cohort of glioblastoma patients from a prospective dedicated multicentric trial. Oncotarget, 7, 61916-29.
Roger H. Frankel, William Bayona, Maxim Koslow, and Elizabeth W (1992). p53 Mutations in Human Malignant Gliomas: Comparison of Loss of Heterozygosity with Mutation Frequency. Cancer research, 52, 1427-1433.
Turner KM, Deshpande V, Beyter D, Koga T, Rusert J, Lee C, et al (2017). Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity. Nature, 543, 122-125.
Congdon KL, Gedeon PC, Suryadevara CM, Caruso HG, Cooper LJ, Heimberger AB, et al (2014). Epidermal growth factor receptor and variant III targeted immunotherapy. Neuro-oncology, 16(8), 20-25. 
Ohgaki H, Dessen P, Kleihues P et al (2004).`Genetic pathways to glioblastoma: a population-based study. Cancer Res, 64(19), 6892-9.
R.S Heymach, J.V Lipman, S.M Herbst (2008). Lung cancer. N Engl J Med, 354, 1367-1380.
Ohgaki H, Kleihues P (2013). The definition of primary and secondary glioblastoma. Clin Cancer Res, 19(4), 764-72.
Hou L.C, Veeravagu Anand, Hsu Andrew R (2006). Recurrent Glioblastoma multiforme: a revew of natural history and mannagement options. Neurosurg focus, 20(4): E3.
Bergern M.S, Prados M.D (2007). Text book of Neuro-Oncology. Elsevier saunders, 111-165.
Osborn Anne. G, Blaser Susan. I, Salzman Karen.L, Katzman Gregory L, et al (2007). Diagnostic imaging brain. Amyrsys, 16 (16), 16-41.
Nguyễn Quang Hiển, Trương Văn Việt (2002). Chuyên đề ngoại thần kinh, U sao bào. Nhà xuất bản Y học Hà Nội, 279-290.
Stupp Rmason, WPvan den, Bent MJ et al (2005). Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med, 352987- 996. 
Appelboom G, Detappe A, LoPresti M, Kunjachan S, Mitrasinovic S, Goldman S, et al (2016). Stereotactic modulation of blood-brain barrier permeability to enhance drug delivery. Neuro-oncology, 18, 1601-1609.
Singh B, Coffey RJ (2014). Trafficking of epidermal growth factor receptor ligands in polarized epithelial cells. Annual review of physiology. 76, 275-300.
PHỤ LỤC 1
QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA
1.1. Quy trình tách DNA từ mẫu mô paraffin:
- Cạo phần ung thư đã được khoanh vùng từ mô đúc paraffin, (khoảng 20mg mô) 
- Thêm 1ml Toluen, Vortex, Li tâm 15000 vòng/3-5 phút, loại bỏ dịch nổi
- Thêm 1ml Ethanol 100%, Vortex, Li tâm 15000 vòng/ 3-5 phút
- Loại bỏ dịch nổi. Để khô cặn 56 độ C
- Thêm 650 µl Lysis buffer HD + 5µl Protein K
- Ủ 56 độ C qua đêm
- Thêm 500 ml PCI (25:24:1).
- Vortex, ly tâm 15000 vòng/20 phút/4oC, sau đó thu lớp trên trong suốt.
- Thêm 500 ml CI (24:1).
- Vortex, ly tâm 15000 vòng/10 phút/4oC, sau đó thu lớp trên trong suốt.
- Thêm: 1000 ml ethanol 100% và 40 ml CH3COONa 3M, sau đó lắc đều và để ở -20oC trong 2 giờ.
- Ly tâm 15000 vòng/20 phút/4oC và thu tủa.
- Thêm 1ml cồn 70%, ly tâm 15000 vòng/20 phút/4oC.
- Thu tủa DNA và để khô, hòa tan trong 60 ml TE.
1.2. Đo mật độ quang học DNA sau tách chiết trên máy Nanodrop.
 - Trừ trắng bằng dung dịch pha DNA (TE hoặc nước cất): hút 1,5 µl TE nhỏ vào điểm đo mật độ quang, nhấn nút đo.
- Hút 1,5 µl DNA tổng số tách được nhỏ vào điểm đo trên máy, nhấn nút đo. 
PHỤ LỤC 2
QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR
2.1. Các bước của quy trình
- Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, hóa chất, mồi và mẫu DNA.
- Thành phần của mỗi ống chạy PCR bao gồm:
+ Nước cất: 3µl
+ Taq polymerase: 5 µl
+ Mồi xuôi: 0,5 µl
+ Mồi ngược: 0,5 µl
+ DNA: 1 µl
Tổng mỗi ống là 10 µl
- Trộn đều các thành phần, đưa vào máy chạy PCR
- Chu trình nhiệt PCR:
+ Biến tính: 	940C trong 5 phút
x 35 chu kỳ
+ Biến tính: 	950C trong 30 giây 
+ Gắn mồi:	570C trong 30 giây
+ Kéo dài:	720C trong 5 phút.
+ Kéo dài:	720C trong 5 phút
- Lấy kết quả sản phẩm DNA sau chạy PCR để kiểm tra kết quả.
2.2. Kiểm tra kết quả PCR.
 Điện di DNA kiểm tra kết quả PCR.
+ Tra mẫu và marker vào giếng:
- Tra 3 µl marker loại 100 bp vào 1 giếng.
- Với các giếng còn lại, mỗi giếng tra 3 µl sản phẩm DNA tương ứng.
+ Chạy điện di:
 - Cài đặt máy và tiến hành điện di với hiệu điện thế 120 V trong 30 phút.
+ Nhuộm bản gel:
- Ngâm bản gel trong dung dịch ethidium bromide 1 µg/ml trong 5'.
- Sau đó rửa bản gel 2 lần để loại bỏ phần ethidium bromide dư và tiến hành chụp ảnh.
+ Quan sát và chụp ảnh:
- Cho bản gel vào máy chụp ảnh tử ngoại tự động, quan sát các băng sáng của DNA xuất hiện trên bản gel và chụp hình lưu trữ kết quả.
PHỤ LỤC 3
QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ GEN
- Tinh sạch mẫu:
+ Thêm 60µL cồn 100% + 5µL EDTA vào mẫu cần tinh sạch.
+ Lắc mạnh, để trong phòng tối 15 phút, nhiệt độ phòng.
+ Lấy ra ly tâm 15.000 vòng/phút trong 20 phút.
+ Loại bỏ dịch nổi.
+ Thêm 200µL cồn 70%, ly tâm 15.000 vòng/phút trong 10 phút.
+ Loại bỏ dịch nổi, để khô.
+ Thêm 20µL Hi-di, ủ ở 95°C trong 5 phút.
+ Cho vào tủ lạnh khoảng 5 phút.
+ Lấy mẫu DNA đã tinh sạch sử dụng làm khuôn cho giải trình tự gen.
- Pha mẫu giải trình tự:
 Thành phần mẫu giải trình tự
Thành phần
Thể tích (µL)
H2O
6,5
Buffer Big dye 5X
1,5
Big dye Terminator v3.1
1
Mồi F hoặc R (10pmol/µL)
0,5
DNA (đã tinh sạch)
0,5
Tổng thể tích
10 µL
- Chu trình nhiệt:
96°C: 2 phút
x 25 chu kỳ
96°C: 10 giây
57°C: 5 giây
60°C: 4 phút
Bảo quản ở 15°C
- Đọc kết quả giải trình tự và lưu trên máy.
PHỤ LỤC 4
QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN BẢN DNA DÒ (MLPA)
(Sử dụng hóa chất kit SALSA MLPA P105-D2, hãng MRC- Hà Lan)
Bước 1: Biến tính DNA
Cho 5µl dung dịch DNA cần phân tích vào ống PCR 0,2ml. 
Biến tính ở 980C/5 phút, 
Giữ ở 250C.
Bước 2: Gắn dầu dò vào gen đích
+ Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng:
Thành phần
Thể tích (µl)
Đệm SALSA MLPA 
1,5
Hỗn hợp mồi P105
1,5
Tổng
3
+ Cho 3 µl hỗn hợp đã chuẩn bị ở trên vào mẫu DNA đã biến tính, nâng nhiệt độ 950C/1 phút để biến tính đầu dò, ủ ở 600C qua đêm (16h) để các đầu dò gắn đặc hiệu với đoạn gen đích.
Bước 3: Nối hai đầu dò
+ Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng:
Thành phần
Thể tích (µl)
Dung dịch đệm A 
3
Dung dịch đệm B
3
Nước cất
25
Dung dịch gắn 65
1
Tổng
32
+ Cho 32 µl dung dịch đã chuẩn bị ở trên vào hỗn hợp lai đã ủ qua đêm, tiếp tục chạy chu trình nhiệt: 540C/15 phút - 980C/5 phút - 40C
(sản phẩm lai có thể giữ được 1 tuần/ 40C hoặc lâu hơn ở -200C).
Bước 4: Nhân bản sản phẩm lai (PCR)
+ Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng:
Thành phần
Thể tích (µl)
Mồi có gắn huỳnh quang
2
Dung dịch đệm Enzyme 
2
Nước cất
5,5
DNA polymerase
0,5
Tổng
10 µl
 Cho 10 µl dung dịch đã chuẩn bị ở trên vào hỗn hợp đang ở trong máy và tiếp tục chạy chu trình nhiệt:
+ 95oC : 30 giây
+ 60oC : 30 giây x 30 chu kỳ
+ 72oC : 60 giây 
+ 72oC : 20 phút
+ 72oC : 5 phút 
+ Giữ ở 4oC
- Điện di mao quản trên hệ thống phân tích đoạn trên máy Beckman Coulter GeXP
+ Tra mẫu và marker vào giếng:
Tra 3 µl marker (mẫu đã kiểm tra chuẩn hóa các điều kiện) vào 1 giếng.
Với các giếng còn lại, mỗi giếng tra 3 µl sản phẩm DNA tương ứng.
+ Chạy điện di:
 Cài đặt máy và tiến hành điện di.
- Phân tích kết quả bằng công cụ Coffalyser chuyên biệt (được cung cấp bởi hãng MCR - Hà lan). 
PHỤ LỤC 5
BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU
1. Hành chính
Họ và tên ..
Tuổi Giới (nam/nữ).. 
Khoa/phòng...
Điện thoại liên hệ..
2. Mã vào viện...
3. Tiền sử bệnh tật.
Mổ u não: rồi/chưa; đã mổ với chẩn đoán: .; độ I /II /III /IV
Ngày năm mổ
Điều trị sau mổ: + xạ trị: không/có - mấy đợt 
 + hóa chất: không/có (tên hoá chất):..mấy đợt ....
Kết quả chụp lại phim sau mổ: không/ có ..
Phát hiện tái phát: ngày tháng năm..
4. Thời gian xuất hiện bệnh đến lúc vào viện..
5. Chẩn đoán bệnh ...
6. Ngày tháng năm mổ.....
7. Mã giải phẫu bệnh
8. Kết quả giải phẫu bệnh.
9. Kích thước khối u.
10. Thời gian sống sau mổ...
11. Điều trị sau mổ: + xạ trị: không/có - mấy đợt ...
 + hóa chất: không/có (tên hoá chất) mấy đợt .