Luận án Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do actinobacillus pleuropneumoniae, pasteurella multocida, streptococcus suis và sử dụng vacxin phòng bệnh

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ 
ĐỖ TẤT ĐẠT 
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC 
VIÊM PHỔI DO ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, 
PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS VÀ 
SỬ DỤNG VACXIN PHÒNG BỆNH 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ 
NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2021
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ 
ĐỖ TẤT ĐẠT 
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC 
VIÊM PHỔI DO ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, 
PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS VÀ 
SỬ DỤNG VACXIN PHÒNG BỆNH 
Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi 
Mã số: 9 64 01 02 
Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. NGUYỄN BÁ HIÊN 
2. PGS.TS. CÙ HỮU PHÚ 
HÀ NỘI, 2021
i 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên 
cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ 
lấy bất kỳ học vị nào. 
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám 
ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2021 
Tác giả luận án 
Đỗ Tất Đạt 
ii 
LỜI CẢM ƠN 
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được 
sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, 
đồng nghiệp và gia đình. 
Cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên và 
PGS.TS. Cù Hữu Phú đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện 
cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. 
Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ 
môn Vi sinh vật Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận 
tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành 
luận án. 
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ Bộ môn Vi trùng, Viện Thú 
y, Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, Công ty CP thuốc thú y 
Marphavet đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. 
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp và các cơ 
quan đoàn thể đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên tôi 
hoàn thành luận án./. 
 Hà Nội, ngày tháng năm 2021 
Tác giả luận án 
Đỗ Tất Đạt 
i 
MỤC LỤC 
Lời cam đoan ..................................................................................................................... i 
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii 
Mục lục .............................................................................................................................. i 
Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................................. v 
Danh mục bảng ............................................................................................................... vii 
Danh mục hình ................................................................................................................. ix 
Trích yếu luận án .............................................................................................................. x 
Thesis abstract ................................................................................................................. xii 
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 
1.1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................ 1 
1.2. Mục tiêu của đề tài ................................................................................................ 3 
1.2.1. Mục tiêu chung ..................................................................................................... 3 
1.2.2. Mục tiêu cụ thể ..................................................................................................... 3 
1.3. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 3 
1.3.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 3 
1.3.2. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 3 
1.4. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................ 4 
1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................. 4 
1.5.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................. 4 
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................... 4 
Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 5 
2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về bệnh viêm phổi ở lợn và vacxin 
phòng bệnh ............................................................................................................ 5 
2.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam về bệnh viêm phổi ở lợn và vacxin 
phòng bệnh .......................................................................................................... 12 
2.3. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi ở lợn ............... 14 
2.3.1. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae .......................................................................... 14 
2.3.2. Bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra ở lợn ....................... 17 
2.4. Vi khuẩn Pasteurella multocida và bệnh viêm phổi ở lợn ................................. 19 
2.4.1. Vi khuẩn P. multocida ........................................................................................ 19 
2.4.2. Bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn P. multocida gây ra ........................................ 21 
ii 
2.5. Vi khuẩn Streptococcus suis và bệnh do vi khuẩn gây ra ở lợn ......................... 25 
2.5.1. Vi khuẩn S. suis .................................................................................................. 25 
2.5.2. Bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn ................................................................. 29 
2.6. Các chất bổ trợ thường dùng trong sản xuất vacxin ........................................... 30 
2.6.1. Chất bổ trợ của vacxin ........................................................................................ 30 
2.6.2. Muối khoáng ....................................................................................................... 33 
2.6.3. Chất nhũ tương ................................................................................................... 33 
2.6.4. Cytokine .............................................................................................................. 35 
2.6.5. Saponin ............................................................................................................... 35 
2.6.6. Các chất cao phân tử ........................................................................................... 35 
Phần 3. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu ........................................... 36 
3.1. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................... 36 
3.2. Thời gian nghiên cứu .......................................................................................... 36 
3.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 36 
3.4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 37 
3.4.1. Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do 
vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra .......................... 37 
3.4.2. Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của bộ giống sản 
xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, 
P. multocida và S. suis gây ra ............................................................................ 37 
3.4.3. Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh 
viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis 
gây ra ................................................................................................................... 37 
3.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 38 
3.5.1. Phương pháp nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn 
mắc bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. mutocida và S. suis gây ra ........ 38 
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của 
giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, 
P. multocida và S. suis gây ra ............................................................................. 41 
3.5.3. Phương pháp nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu 
phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, 
P. multocida và S. suis gây ra ............................................................................. 43 
iii 
3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 50 
Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 51 
4.1. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc 
bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra .................... 51 
4.1.1. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc 
bệnh do vi khuẩn A. pneumoniae gây ra ............................................................. 51 
4.1.2. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc 
bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra ................................................................ 54 
4.1.3. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc 
bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra ........................................................................... 56 
4.2. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất 
vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và 
S. suis gây ra ....................................................................................................... 59 
4.2.1. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất 
vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra ............................ 59 
4.2.2. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất 
vacxin phòng bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra .......................................... 65 
4.2.3. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất 
vacxin phòng bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra .................................................... 70 
4.3. Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh 
viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và 
S. suis gây ra ....................................................................................................... 75 
4.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng 
bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis 
gây ra ................................................................................................................... 75 
4.3.2. Kết quả đánh giá chất lượng vacxin bán thành phẩm ........................................... 77 
4.3.3. Kết quả so sánh khả năng sinh miễn dịch của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và 
vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu chống lại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, 
P. multocida và S. suis .......................................................................................... 83 
4.3.4. Kết quả xác định liều tiêm vacxin viêm phổi lợn ............................................... 90 
4.3.5. Kết quả xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu 
phòng bệnh viêm phổi ở lợn ............................................................................... 92 
iv 
4.3.6. Kết quả xây dựng quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu 
phòng bệnh viêm phổi cho lợn............................................................................ 99 
Phần 5. Kết luận và đề nghị ....................................................................................... 103 
5.1. Kết luận ............................................................................................................. 103 
5.2. Đề nghị .............................................................................................................. 104 
Danh mục công trình khoa học đã công bố có liên quan đến luận án .......................... 105 
Tài liệu tham khảo ........................................................................................................ 106 
Phụ lục.......................................................................................................117 
v 
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 
Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ 
aa Amino acid 
A. pleuropneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae 
BHI Brain Heart Infusion 
BNNPTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 
Bp Base pair 
CI Confidence Interval 
CHLB Cộng hòa liên bang 
cs Cộng sự 
DNA Deoxyribonucleic acide 
dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate 
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay 
FAO Food and Agriculture Organization 
HT Huyết thanh 
KHKT Khoa học kỹ thuật 
M. hyopneumoniae Mycoplasma hyopneumoniae 
NAD Nicotinamide adenine dinucleotide 
NXB Nhà xuất bản 
OIE Office International des Epizooties 
P. multocida Pasteurella multocida 
PCR Polymerase Chain Reaction 
PLLO Pleuropneumonia-like organism 
RNA Ribonucleic acid 
RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction 
S. suis Streptococcus suis 
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam 
THB 
TN 
Todd Hewitt Broth 
Thí nghiệm 
TSB Tryptic Soy Broth 
TT Thông tư 
vi 
Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ 
TYE Tryptone Yeast Extract Broth 
TW Tryptone water 
USA United States of America 
USD United States dollar 
VNUA Vietnam National University of Agriculture 
vii 
DANH MỤC BẢNG 
Thứ tự Tên bảng Trang 
3.1. Trình tự mồi dùng để xác định gen omlA của A. pleuropneumoniae .................. 39 
3.2. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định serotype A, D của Pasteurella 
multocida ............................................................................................................... 40 
3.3. Trình tự mồi dùng để xác định gen gdh của Streptococcus suis theo tiêu 
chuẩn quốc gia- TCVN 8400-2:2010 ...... ... pigs in the Netherlands (Part I). Veterinary quarterly. 7(4): 315-321. 
107. Windsor R. & Elliott S. (1975). Streptococcal infection in young pigs: IV. An 
outbreak of streptococcal meningitis in weaned pigs. Epidemiology và 
Infection. 75(1): 69-78. 
108. Wisselink H., Vecht U., Smith H. & Stockhofe-Zurwieden N. (2001). Protection of 
pigs against challenge with virulent Streptococcus suis serotype 2 strains by a 
muramidase-released protein and extracellular factor vaccine. Veterinary 
Record. 148(15): 473-477. 
109. Witte A., Wanner G., Sulzner M. & Lubitz W. (1992). Dynamics of PhiX174 
protein E-mediated lysis of Escherichia coli. Archives of microbiology. 157(4): 
381-388. 
110. Zhang Q., Young T. F. & Ross R. (1995). Identification and characterization of a 
Mycoplasma hyopneumoniae adhesin. Infection and immunity. 63(3): 1013-
1019. 
117 
PHỤ LỤC 
A. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI KHUẨN A. PLEUROPNEUMONIAE 
CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH 
I. Giữ giống bằng thạch lỏng 
1. Môi trường giữ giống 
Tryptone soy broth (TSB) bổ sung 20% glycerin 
2. Phương pháp giữ giống 
- Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae được nuôi cấy thuần trên môi trường 
thạch PPLO ở 370C trong điều kiện có 5% CO2 trong 24 giờ. 
- Lấy toàn bộ khuẩn lạc Actinobacillus pleuropneumoniaetrên thạch PPLO vào môi 
trường giữ giống (khuẩn lạc trên 1 đĩa thạch đưa vào 1 ml môi trường) 
- Chia ra các eppendorf 
- Kiểm tra lại các ống giữ giống bằng cách nuôi cấy trên môi trường thạch PPLO 
và thạch máu có cấy kèm Staphylococcus aureus, nếu đạt yêu cầu bảo quản ở - 800C. 
II. Giữ giống bằng phương pháp đông khô 
1. Môi trường giữ giống 
Skim milk, hấp vô trùng, chia 1- 2ml môi trường vào lọ nhỏ có nắp vặn 
2. Phương pháp giữ giống 
- Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae được nuôi cấy thuần trên môi trường 
thạch PPLO ở 370C trong điều kiện có 5% CO2 trong 24 giờ 
- Lấy toàn bộ khuẩn lạc Actinobacillus pleuropneumoniae trên thạch PPLO vào môi 
trường giữ giống (khuẩn lạc trên 3-4 đĩa thạch đưa vào 1 ml môi trường). 
- Hút hỗn dịch trên vào các ống đông khô đã hấp vô trùng, sao cho lượng hỗn dịch 
thấm ướt bông ở đáy ống. Lượng hỗn dịch còn lại dùng để kiểm tra lại các ống giữ giống 
bằng cách cấy trên thạch PPLO và thạch máu có cấy kèm Staphylococcus aureus. 
- Sử dụng máy đông khô hút hết không khí, tạo môi trường chân không trong các 
ống đông khô. 
- Hàn kín các ống đông khô, kiểm tra chân không. 
- Bao gói cẩn thận, tránh làm nứt, vỡ các ống giống, bảo quản ở -200C hoặc -800C. 
118 
B. PHƯƠNG PHÁP TĂNG CƯỜNG GIỐNG VI KHUẨN 
A. PLEUROPNEUMONIAE CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH 
I. Tăng cường giống bằng phương pháp tiêm chuột 
1. Chuẩn bị canh trùng 
- Lấy vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae từ thạch lỏng (hoặc ống giống đã 
đông khô) nuôi cấy trên môi trường thạch PPLO và thạch máu có cấy kèm Staphylococcus 
aureus, nuôi cấy ở 370C trong điều kiện có 5% CO2 trong 24 giờ. 
- Lấy toàn bộ khuẩn lạc Actinobacillus pleuropneumoniae trên thạch PPLO vào môi 
trường TYE (khuẩn lạc trên 5 đĩa thạch đưa vào 100 ml TYE), nuôi cấy lắc ở 370C, trong 
6 giờ. 
- Chuyển canh trùng đã nuôi cấy lắc: từ 100 ml canh trùng chuyển vào bình có 200 
ml TYE, nuôi cấy lắc ở 370C, trong 10 giờ. 
- Chuyển canh trùng đã nuôi cấy lắc: từ 300 ml canh trùng chuyển vào bình có 500 
ml TYE, nuôi cấy lắc ở 370C, trong 20 giờ. 
- Đếm số vi khuẩn trước khi tiêm cho chuột (số lượng vi khuẩn trung bình sau khi 
nuôi cấy lắc đạt khoảng 4 – 6 x 108 vi khuẩn/ml). 
2. Tiêm chuột 
- Sử dụng chuột nhắt trắng khỏe mạnh, mỗi giống vi khuẩn tiêm cho 5 chuột. 
- Liều tiêm canh trùng: 0,5 ml. 
- Đường tiêm: phúc xoang. 
- Theo dõi chuột trong 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ sau khi tiêm. 
- Phân lập lại vi khuẩn từ máu tim. 
- Sau khi đã phân lập, nuôi cấy thuần vi khuẩn, tiến hành giữ giống theo phương 
pháp như trên. 
II. Tăng cường giống bằng phương pháp tiêm trên bản động vật (lợn) 
1. Chuẩn bị canh trùng 
Cách làm tương tự như tiêm chuột. 
2. Tiêm lợn 
- Sử dụng lợn 30- 45 ngày tuổi, khỏe mạnh, chưa tiêm vacxin phòng viêm phổi do 
Actinobacillus gây ra. 
- Liều tiêm: 6 ml 
119 
- Đường tiêm: vịnh tĩnh mạch cổ. 
- Theo dõi lợn trong 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ sau khi tiêm. 
- Phân lập lại vi khuẩn từ máu tim, gan, phổi, dịch họng lợn. 
- Sau khi phân lập, nuôi cấy thuần vi khuẩn, tiến hành giữ giống theo phương pháp 
như trên. 
C. PHƯƠNG PHÁP TĂNG CƯỜNG GIỐNG VI KHUẨN 
P. MULTOCIDA CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH 
1. Tăng cường giống vi khuẩn Pasteurella multocida trên chuột bạch: 
- Chuột bạch có trọng lượng 18-20 g/con, khỏe mạnh. 
- Giống vi khuẩn: Chủng vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A và D thuần nhất 
- Chủng vi khuẩn được giữ từ thạch lỏng được ria cấy lên 1 đĩa thạch BHI 5% máu 
cừu, nuôi cấy ở 370C/ 24h, chọn khuẩn lạc điển hình đứng riêng lẻ. 
- Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường nước BHI, bồi dưỡng 18 -20 giờ 
ở nhiệt độ 370 C. 
- Tiêm phúc xoang, liều tiêm canh trùng 0,2 ml/ 1 chuột mỗi chủng tiêm 2 chuột. 
- Theo dõi thời gian chết chuột và số chuột chết của từng chủng vi khuẩn kiểm tra. 
- Chuột chết được mổ khám, lấy máu tim nuôi cấy trên môi trường nước thịt BHI 
và thạch BHI 5% máu cừu để phân lập lại vi khuẩn. 
- Lựa chọn chủng vi khuẩn gây chết 100% chuột thí nghiệm trong thời gian ngắn 
nhất để giữ giống vi khuẩn. 
2. Tăng cường giống vi khuẩn Pasteurella multocida trên lợn thí nghiệm: 
2.1. Vi khuẩn gây bệnh: 
Chủng vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A và D có đầy đủ các đặc tính sinh 
vật hóa học điển hình của vi khuẩn P. multocida, tính kháng nguyên ổn định, có độc lực 
cao gây chết 100% động vật thí nghiệm, số lượng kháng nguyên đủ để tiến hành gây bệnh 
bệnh thực nghiệm trên lợn. 
2.2. Lợn thí nghiệm: 
Lợn thí nghiệm có trọng lượng 12- 15kg/ con, chưa được tiêm loại vacxin nào có 
chứa loại vi khuẩn Pasteurella multocida dùng để gây bệnh. 
 2.3. Chuẩn bị canh trùng gây bệnh: 
- Chủng vi khuẩn Pasteurella multocida được giữ từ thạch lỏng được ria cấy lên 1 đĩa 
thạch BHI 5% máu cừu, nuôi cấy ở 370C/ 24h, chọn khuẩn lạc điển hình đứng riêng lẻ. 
120 
- Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường nước BHI, để tủ ấm 370C /18 -20h. 
- Xác định liều gây bệnh của các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida dùng để 
gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp đếm số trên thạch đĩa. 
2.4. Tiến hành thí nghiệm: 
Mỗi chủng vi khuẩn cần gây bệnh được tiêm cho 02 lợn thí nghiệm với liều tiêm 
6ml/ 1 lợn đường tiêm tĩnh mạch cổ. Và 05 lợn đối chứng không tiêm. 
Theo dõi trong thời gian 7- 10 ngày. 
- Các lợn thí nghiệm chết được mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy lấy máu tim nuôi 
cấy trên môi trường nước thịt BHI và thạch BHI 5% máu cừu để phân lập lại vi khuẩn. 
Lựa chọn chủng vi khuẩn gây chết 100% lợn thí nghiệm trong thời gian ngắn nhất để giữ 
giống vi khuẩn. 
D. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA 
CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH 
1. Chuẩn bị: 
- Giống vi khuẩn Pasteurella multocida thuần nhất 
- Thạch BHI 5% máu cừu 
- Nước thịt BHI (Brain heart infusion) 
- Effendorf vô trùng 
- Pipet tip vô trùng 
- Pipetman 
- Glycerol vô trùng 
2. Tiến hành 
- Cấy giống vi khuẩn Pasteurella multocida cần giữ lên môi trường thạch BHI 5% 
máu cừu (chú ý cấy tách khuẩn lạc riêng rẽ), nuôi trong tủ ấm 370C/18- 20h 
- Chọn 1 khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn (đứng tách riêng) cấy vào môi trường nước 
thịt BHI. Để trong tủ ấm 370C từ 8 – 10h 
- Sau 8 – 10h bổ sung Glycerol (theo tỷ lệ BHI:85% và Glycerol: 15%) vào canh 
trùng đã nuôi cấy. 
- Lắc đều canh trùng với Glycerol 
- Dùng pipetman hút canh trùng chia đều vào các Effendorf (1-1,5ml/tube) 
- Dán nhãn 
- Giữ ở nhiệt độ âm sâu – 20 đến – 800C 
121 
3. Kiểm tra độ thuần khiết và tính chất mọc của vi khuẩn giữ giống 
Sau khi chia đều canh trùng vào Effendorf. Dùng que cấy chọc vào phần canh trùng 
còn thừa trong lọ BHI, ria lại trên thạch máu, cất tủ ấm 370C/24h. Sau 24 h, kiểm tra trên 
đĩa thạch vi khuẩn mọc thuần nhất thì quá trình giữ giống bằng thạch lỏng đảm bảo đạt yêu 
cầu. 
4. Quy trình đông khô giống vi khuẩn. 
I. Chuẩn bị giống vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A và D thuần nhất 
II. Chuẩn bị dụng cụ và môi trường để đông khô 
1. Môi trường: 
- Thạch BHI 5% máu bê hoặc cừu 
- Skim milk (2gram/100ml nước cất) 
2. Dụng cụ: 
- Ống đông khô (có nút bông) vô trùng 
- Pipet Pasteur 
- Serotype có nút vặn 
- Tăm bông vô trùng 
- Đèn khò 
- Máy hút chân không 
- Máy kiểm tra chân không 
3. Cách tiến hành: 
1. Cấy các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida cần đông khô lên môi trường 
thạch BHI 5% máu, với điều kiện các khuẩn lạc phải thuần nhất. (370C/ 18 giờ) 
2. Pha Skim milk trong nước cất rồi chia nhỏ vào các serotype có nút vặn 
(1ml/serotype), hấp vô trùng 1210C/15 phút. 
3. Dùng tăm bông vô trùng thu hoạch hết khuẩn lạc có trong đĩa thạch máu, sau đó 
gạt tăm bông vào serotype Skim milk (mỗi 1 chủng vi khuẩn sử dụng 1 serotype Skim 
milk). 
4. Dùng pipet Pasteur hút Skim milk vào từng ống đông khô, tùy mục đích sử dụng 
mà dùng 1 hay nhiều serotype đông khô. Chú ý dùng pipet Pasteur hút lên hút xuống 
Skim milk cho đến khi phần bông ở đáy ống thấm đều Skim milk. 
5. Dùng kéo cắt phần bông thừa nút trên ống đông khô. Đồng thời dùng 1 que nhọn 
đẩy nút bông xuống phía dưới, gần chạm vào phần bông ở đáy ống đông khô. 
122 
6. Bật đèn khò. Cho ngọn lửa đèn khò vào vị trí chính giữa của ống đông khô, xoay 
tròn, cho đến nhiệt độ nóng chảy thích hợp, dùng hai tay kéo đều 2 bên của ống đông khô 
7. Giữ ống đông khô trên ngăn đá của tủ lạnh trong 12 giờ. 
8. Cắm các ống đông khô vào máy hút chân không, bật máy hút trong vòng 12 giờ. 
9. Sau 12 giờ, thu hoạch ống đông khô. 
4. Kiểm tra ống đông khô 
Dùng máy kiểm tra chân không, nếu thấy ống đông khô có màu sáng xanh thì chứng 
tỏ không có không khí trong ống. Ngược lại, ống đông khô vẫn có không khí bên trong, 
ống đông khô không đảm bảo chất lượng. 
5. Bảo quản: 
Ống đông khô được bảo quản ở nhiệt độ thường, tránh để lẫn với các vật nặng hay 
sắc nhọn. 
E. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS 
CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH 
1. Quy trình giữ giống vi khuẩn bằng thạch lỏng 
1.1. Chuẩn bị 
- Giống vi khuẩn thuần nhất 
- Thạch máu cừu 5% 
- Nước thịt BHI (Brain heart infusion) 
- Effendorf vô trùng 
- Pipet tip vô trùng 
- Pipetman 
- Glycerol vô trùng 
1.2. Tiến hành 
- Cấy giống vi khuẩn cần giữ lên môi trường thạch máu cừu 5% (chú ý cấy tách khuẩn 
lạc riêng rẽ), nuôi trong tủ ấm 370C/24h. 
- Chọn 1 khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn (đứng tách riêng) cấy vào môi trường nước 
thịt BHI. 
- Để trong tủ ấm 370C từ 8 – 10h. 
123 
- Sau 8 – 10h bổ sung Glycerol (theo tỷ lệ BHI:85% và Glycerol: 15%) vào canh 
trùng đã nuôi cấy. 
- Lắc đều canh trùng với Glycerol. 
- Dùng pipetman hút canh trùng chia đều vào các Effendorf (1-1,5ml/tube). 
- Dán nhãn. 
- Giữ ở nhiệt độ âm sâu 
1.3. Kiểm tra độ thuần khiết và tính chất mọc của vi khuẩn giữ giống 
Sau khi chia đều canh trùng vào Effendorf. Dùng que cấy chọc vào phần canh trùng 
còn thừa trong lọ BHI, ria lại trên thạch máu, cất tủ ấm 370C/24h. Sau 24 h, kiểm tra trên 
đĩa thạch vi khuẩn mọc thuần nhất thì quá trình giữ giống bằng thạch lỏng đảm bảo đạt 
yêu cầu. 
2. Quy trình đông khô giống vi khuẩn 
III. Chuẩn bị giống vi khuẩn thuần nhất 
IV. Chuẩn bị dụng cụ và môi trường để đông khô 
3. Môi trường: 
- Thạch máu bê hoặc cừu 
- Skim milk (2 gram/100ml nước cất) 
4. Dụng cụ: 
- Ống đông khô (có nút bông) vô trùng 
- Pipet Pasteur 
- Serotype có nút vặn 
- Tăm bông vô trùng 
- Đèn khò 
- Máy hút chân không 
- Máy kiểm tra chân không 
V. Cách tiến hành: 
10. Cấy các chủng vi khuẩn cần đông khô lên môi trường thạch máu, với điều kiện các 
khuẩn lạc phải thuần nhất. 
11. Pha Skim milk trong nước cất rồi chia nhỏ vào các serotype có nút vặn 
(1ml/serotype), hấp vô trùng 1210C/15 phút. 
124 
12. Dùng tăm bông vô trùng thu hoạch hết khuẩn lạc có trong đĩa thạch máu, sau đó gạt 
tăm bông vào serotype Skim milk (mỗi 1 chủng vi khuẩn sử dụng 1 serotype Skim 
milk). 
13. Dùng pipet Pasteur hút Skim milk vào từng ống đông khô, tùy mục đích sử dụng mà 
dùng 1 hay nhiều serotype đông khô. Chú ý dùng pipet Pasteur hút lên hút xuống 
Skim milk cho đến khi phần bông ở đáy ống thấm đều Skim milk. 
14. Dùng kéo cắt phần bông thừa nút trên ống đông khô. Đồng thời dùng 1 que nhọn đẩy 
nút bông xuống phía dưới, gần chạm vào phần bông ở đáy ống đông khô. 
15. Bật đèn khò. Cho ngọn lửa đèn khò vào vị trí chính giữa của ống đông khô, xoay 
tròn, cho đến nhiệt độ nóng chảy thích hợp, dùng hai tay kéo đều 2 bên của ống đông 
khô. 
16. Giữ ống đông khô trên ngăn đá của tủ lạnh trong 12 giờ. 
17. Cắm các ống đông khô vào máy hút chân không, bật máy hút trong vòng 12 giờ. 
18. Sau 12 giờ, thu hoạch ống đông khô. 
VI. Kiểm tra ống đông khô. 
Dùng máy kiểm tra chân không, nếu thấy ống đông khô có màu sáng xanh thì chứng tỏ 
không có không khí trong ống. Ngược lại, ống đông khô vẫn có không khí bên trong, 
ống đông khô không đảm bảo chất lượng. 
VII. Bảo quản: 
Ống đông khô được bảo quản ở nhiệt độ thường, tránh để lẫn với các vật nặng hay 
sắc nhọn. 
125 
G. PHƯƠNG PHÁP TĂNG CƯỜNG GIỐNG VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS 
CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH 
1. Tăng cường qua động vật thí nghiệm: 
- Chuột bạch: trọng lượng 20gram/con 
- Nước thịt BHI (Brain Heart Infusion) bổ sung 2% huyết thanh ngựa 
- Vi khuẩn S. suis được cấy thuần nhất trên 1 đĩa thạch máu bê 
- Vét khuẩn lạc vi khuẩn S. suis vào 10ml BHI đã bổ sung 2% huyết thanh ngựa 
- Để tủ ấm 370C/24 giờ 
- Tiêm phúc xoang chuột với liều tiêm 0,5ml/con, mỗi chủng vi khuẩn tiêm 02 
chuột. 
- Theo dõi chuột 
- Nếu chuột chết, mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy bệnh phẩm là máu tim, ria cấy 
lại trên thạch máu và nước thịt BHI. Để tủ ấm 370C/24 giờ. Kiểm tra hình thái khuẩn lạc, 
làm phản ứng sinh hóa và các test để khẳng định lại là vi khuẩn S. suis 
- Giữ giống vi khuẩn S. suis từ máu tim chuột 
2. Tăng cường giống vi khuẩn S. suis trên bản động vật 
- Lợn có trọng lượng 10-12kg/con 
- Cấy giống S. suis đang giữ từ thạch lỏng ra thạch máu đĩa, để tủ ấm 370C/24 giờ. 
Sau 24h, cấy chuyển sang thạch máu đĩa lần 2, mỗi chủng vi khuẩn cấy lên 3 đĩa thạch 
máu. 
- Chuẩn bị 200ml nước BHI đã bổ sung 2% huyết thanh ngựa 
- Vét toàn bộ khuẩn lạc của vi khuẩn S. suis đã cấy trên 3 đĩa thạch máu vào 200ml 
nước BHI 
- Để tủ ấm 370C/24 giờ 
- Sau 24h, đếm số lượng vi khuẩn S. suis có trong 1ml canh trùng nuôi cấy. 
- Tiêm 30ml canh trùng/01 lợn với đường tiêm tĩnh mạch cổ 
- Theo dõi triệu chứng bệnh của lợn sau khi tiêm canh trùng 
- Lợn chết, mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy bệnh phẩm gồm: não, dịch khớp, máu 
tim và phổi 
- Ria cấy lại trên thạch máu và nước THB 
- Phân lập lại vi khuẩn S. suis từ bệnh phẩm của lợn chết 
- Giữ giống S. suis.