Luận án Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng

 LỜI CẢM ƠN 
Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc 
đến GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc và PGS. TS. Cao Đăng Nguyên đã quan tâm giúp 
đỡ và hướng dẫn tận tình. 
Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, giảng viên của Phòng thí 
nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học, 
Đại học Huế; Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, 
Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. 
Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban Đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban 
Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Phòng Đào tạo Sau 
đại học Trường đại học Khoa học; Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường đại học 
Khoa học, Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học 
Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã có nhiều giúp đỡ quí báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất 
để chúng tôi hoàn thành luận án. 
Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tôi 
hoàn thành luận án. 
Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình 
đã đóng góp một phần không nhỏ trong việc hoàn thành luận án này. 
Huế, ngày 15 tháng 02 năm 2014 
 Tác giả 
 Võ Châu Tuấn 
 LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả 
trình bày trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai 
công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn 
trách nhiệm. 
 Tác giả 
 Võ Châu Tuấn 
 MỤC LỤC 
LỜI CÁM ƠN 
LỜI CAM ĐOAN 
MỤC LỤC 
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT 
DANH MỤC CÁC BẢNG 
DANH MỤC CÁC HÌNH 
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI............................................................... 1 
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ........................................................................ 3 
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN ................................................. 3 
4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................................ 4 
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 5 
1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ................................................................... 5 
1.1.1. Sơ lƣợc lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật ............................................... 5 
1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật ..................................................... 6 
1.1.2.1. Nuôi cấy callus .................................................................................. 6 
1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào ................................................................ 7 
1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào ............... 10 
1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào ................ 12 
1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn ............................................ 16 
1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC 
VẬT NUÔI CẤY IN VITRO................................................................................... 19 
1.2.1. Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật ......................................... 19 
1.2.2. Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật ................................ 19 
1.2.2.1. Nhóm terpene .................................................................................. 20 
1.2.2.2. Nhóm phenol ................................................................................... 20 
1.2.2.3. Các hợp chất chứa nitrogen ............................................................ 20 
 1.2.3. Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực 
vật .............................................................................................................................. 21 
1.2.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước ........................................................ 21 
1.2.3.2. Những nghiên cứu trong nước ........................................................ 25 
1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN .............................................................. 28 
1.3.2. Thành phần hóa học ............................................................................. 28 
1.3.3. Công dụng ............................................................................................. 30 
1.3.3.1. Công dụng cổ truyền ....................................................................... 30 
1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học .................................................................... 30 
1.3.4. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệ đen ................ 35 
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 37 
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 37 
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................ 37 
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 38 
2.3.1. Nuôi cấy callus ...................................................................................... 39 
2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào................................................................... 39 
2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác ............................. 39 
2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men .................................. 40 
2.3.3. Xác định khả năng sinh trƣởng của tế bào ........................................ 40 
2.3.4. Định lƣợng tinh dầu ............................................................................. 41 
2.3.5. Định lƣợng curcumin ........................................................................... 41 
2.3.6. Định lƣợng polysaccharide hòa tan trong nƣớc ................................ 42 
2.3.7. Xác định sesquiterpene ........................................................................ 42 
2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu .................................. 43 
2.3.9. Xử lý thống kê ....................................................................................... 43 
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 44 
3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN ................................................................ 44 
3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC .............. 47 
3.2.1. Ảnh hƣởng của cỡ mẫu nuôi cấy ......................................................... 47 
 3.2.2. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc .................................................................... 49 
3.2.3. Ảnh hƣởng của chất ĐHST ................................................................. 51 
3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA .......................................................................... 51 
3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D ...................................................................... 52 
3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA ........................................................... 52 
3.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ............................................................. 54 
3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose ................................................................... 54 
3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose ................................................................... 56 
3.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN ..................... 59 
3.3.1. Khảo sát sinh trƣởng của tế bào ......................................................... 59 
3.3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy...................................................... 61 
3.3.2.1. Cỡ mẫu ............................................................................................ 61 
3.3.2.2. Tốc độ khuấy ................................................................................... 62 
3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí ......................................................... 63 
3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH 
SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆ ĐEN ......................................................... 65 
3.4.1. Hàm lƣợng tinh dầu ............................................................................. 65 
3.4.2. Hàm lƣợng polysaccharide hòa tan trong nƣớc tổng số ................... 67 
3.4.3. Hàm lƣợng curcumin ........................................................................... 68 
3.4.4. Xác định sesquiterpene ........................................................................ 73 
3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TẾ BÀO NGHỆ ĐEN ... 77 
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 80 
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƢỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
 .................................................................................................................................. 82 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 83 
PHỤ LỤC 
 BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT 
BAP : 6-benzylaminopurine 
BA : 6-benzyladenine 
CIB : centrifugal impeller bioreator 
cs : cộng sự 
DMSO : dimethyl sulfoxide 
ĐC : đối chứng 
ĐHST : điều hòa sinh trưởng 
HPLC : high performance liquid chromatography 
 (sắc ký hiệu năng cao áp) 
IAA : indoleacetic acid 
IBA : indolebutyric acid 
Kin : kinetin 
L : lít 
L-DOPA : L-3,4 -dihydrooxyphenylamine 
LPS : lipopolysaccharide 
MS : Murashige và Skoog (1962) 
NAA : naphthaleneacetic acid 
Nxb : nhà xuất bản 
TNF-α : tumor necrosis factor-alpha 
2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 
 DANH MỤC CÁC BẢNG 
TT Tên bảng Trang 
1 Bảng 3.1.Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro 44 
2 
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát 
sinh hình thái của callus 
46 
3 
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào 
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 
48 
4 
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào 
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 
50 
5 
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi 
cấy huyền phù trong bình tam giác 
51 
6 
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh trưởng của tế bào nuôi 
cấy huyền phù trong bình tam giác 
52 
7 
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh trưởng của tế 
bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 
53 
8 
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào 
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 
54 
9 
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào 
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 
56 
10 
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào 
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 
57 
11 
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào 
nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 
62 
12 
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế 
bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 
63 
13 
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế 
bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 
64 
 14 
Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi cấy 
trong hệ lên men 10 L 
66 
15 
Bảng 3.15. Hàm lượng polysaccharide của tế bào nghệ đen nuôi 
cấy trong hệ lên men 10 L 
67 
16 
Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy 
trong hệ lên men 10 L 
69 
17 
Bảng 3.17. Chiều cao phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene 
trong tế bào nuôi cấy ở hệ lên men 10 L và tế bào củ nghệ tự 
nhiên 
74 
18 Bảng 3.18. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen 78 
 DANH MỤC CÁC HÌNH 
TT Tên hình Trang 
1 Hình 2.1. Cây nghệ đen nuôi cấy in vitro 37 
2 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm 38 
3 
Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro 
(A) callus trắng và xốp, (B) callus trắng và mọng nước 
45 
4 Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn, rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy 47 
5 
Hình 3.3. Dịch huyền phù tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy 
trong bình tam giác trên môi trường có 3% sucrose 
55 
6 
Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình 
tam giác trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA và 
1,5 mg/L 2,4-D, lắc 120 vòng/phút 
58 
7 
Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml 
đặt trên máy lắc 
59 
8 Hình 3.6. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L 60 
9 
Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men 
nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 
mg/L 2,4-D ; khuấy 120 vòng/phút; sục khí 2,0 L/phút, cỡ mẫu 
100 g 
60 
10 
Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào 
nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 
61 
11 
Hình 3.9. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hê lên men 
nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 
mg/L 2,4-D ; khuấy 150 vòng/phút; sục khí 2,5 L/phút, cỡ mẫu 
200 g 
65 
12 Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin chuẩn (0,5 mg/ml) 71 
 13 
Hình 3.11. Phổ HPLC curcumin của củ nghệ đen 01 năm tuổi 
ngoài tự nhiên 
72 
14 
Hình 3.12. Phổ HPLC curcumin của tế bào nghệ đen sau 2 đến 
18 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít 
73 
15 
Hình 3.13. Phổ HPLC của sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự 
nhiên; B: tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L từ 2 
đến 18 ngày 
76 
16 Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen 77 
 1 
MỞ ĐẦU 
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 
Trong nhiều thế kỷ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là 
nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực 
vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược 
phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc 
các chất phụ gia thực phẩm có giá trị [132]. Những sản phẩm này được biết như 
là các chất trao đổi thứ cấp, được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây 
(thường nhỏ hơn 1% khối lượng khô) và chức năng trao đổi chất chưa được biết 
đầy đủ. Chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với 
môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật [177]. 
Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển 
từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX và đến nay có khoảng hơn 80.000 hợp chất 
thứ cấp khác nhau ở thực vật đã đuợc công bố [19], [23]. 
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng 
thảo dược làm thuốc để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe. Việc khai thác nguồn 
dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính 
toàn cầu và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn. Tuy nhiên, vấn đề 
đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc đang bị biến mất 
nhanh chóng do sự biến đổi của khí hậu toàn cầu cũng như sự khai thác bừa bãi 
của con người. Như vậy, sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật bằng con đường 
canh tác truyền thống và tổng hợp hóa học sẽ có nhiều hạn chế, khó ... y of some 
medicinal plants from Malaysia”, American Journal of Applied Sciences 
6(8), pp. 1613-1617. 
 97 
125. Prakash G., Srivastava A.K. (2007), “Azadirachtin production in stirred 
tank reactors by Azadirachta indica suspension culture”, Process 
Biochem 42, pp. 93-97. 
126. Priosoeryanto B.P., Sumarny R., Rahmadini Y., Nainggolan G.R.M., 
Andany S. (2001), “Growth inhibition effect of plants extract 
(Mussaenda pubescens and Curcuma zedoaria) on tumour cell lines in 
vitro”, Proceeding of the 2nd SEAG, South East Asian Germany Alumni-
Network, Los Barios, The Philippines on August, pp. 27-31. 
127. Raghuveer Gupta PS, Ali MM., Eranna D and Ramachandra SS. (2003), 
“Evaluation of anti-ulcer effect of root of Curcuma zedoaria in rats”, 
Indian Traditional Knowledge 2(4), pp. 375-377. 
128. Rajasekaran T., Ravishankar G.A., Venkataraman L.V. (1991), “Influence 
of nutrient stress on pyrethrin production by cultured cells of pyrethrum 
(Chrysanthemum cinerariaefolium)”, Curr Sci 60, pp.705-707. 
129. Ramawat K.G., Merillon J.M. (2004), Biotechnology Secondary 
Metabolites, Science Publishers, Inc. Plymouth, UK. 
130. Rao B.R., Kumar V., Amrutha N., Jalaja N., Vaidyanath K., Rao A.M., 
Polavarapu S.R.R., Kishor P.B.K. (2008), “Effect of growth regulators, 
carbon source and cell aggregate size on berberine production from cell 
cultures of Tinospora cordifolia Miers”, Current Trends in 
Biotechnology and Pharmacy, 2(2), pp. 269-276. 
131. Rao B.S., Shintre V.P., Simonsen J.L. (1928), “Essential oil from rhizome of 
Curcuma zedoaria Rosc.”, Soc Chem Ind 47, pp. 171-172. 
132. Rao S.R., Ravishankar G.A. (2002), “Plant cell cultures: chemical factories 
of secondary metabolites”, Biotechnology Advances 20, pp. 101-153. 
133. Ritterhaus E., Ulrich J., Westphal K. (1990), “Large-scale production of 
plant cell cultures”, Iaptc Newsl 61, pp. 2-10. 
 98 
134. Rodríguez-Monroy M., Trejo-Espino J.L., Jimenez-Aparicio A., de la Luz 
M.M., Villarreal M.L., Trejo-Tapia G. (2004), “Evaluation of 
morphological properties of Solanum chrysotrichum cell cultues in a 
shake flask and fermentor and rheological properties of broths”, Food 
Technol. Biotechnol. 42 (3), pp. 153-158. 
135. Ryu D.D.Y., Lee S.O., Romani R.J. (1990), “Determination of growth rate 
for plant cell cultures: comparative studies”. Biotechnol Bioeng 35, pp. 
305-311. 
136. Sakato K., Misawa M. (1974), “Effects of chemical and physical conditions 
on growth of Camptotheca acuminata cell cultures”, Agri Biol Chem 
38, pp. 491-497. 
137. Saralamp P., Chuakual W., Temsirikul R., Clayton T. (2000), Medicinal 
plants in Thailand. Volume 1, Amerin Printing and Publishing Public 
Co., Ltd., Bangkok, Thailand. 
138. Sarin R. (2005), “Useful metabolites from plant tissue cultures”, Biotechnol 
4, pp. 79-93. 
139. Seo W.G., Hwang J.C., Kang S.K., Jin U.H., Suh S.J., Moon S.K. (2005), 
“Suppressive effect of Zedoariae rhizome on pulmonary metastasis of 
B16 melanoma cells”, Ethnopharmacol 101, pp. 249-257. 
140. Sheper T. (2001), Advances in biochemical engineering biotechnology-
plant cells (Vol 72), Springer-Verlag, Berlin Heideberg. 
141. Shimomura K., Kitazawa T., Okamura N., Yagi A. (1991), “Tanshinone 
production in adventitious roots and regenerates of Salvia miltiorrhiza”, 
Nat Prod 54 (6), pp. 1583 -1587. 
142. Shin K.H., Yoon K.Y., Cho T.S. (1994), “Pharmacologycal activities of 
sesquiterpenes from the rzhome of Curcuma zedoaria”, Saengyak 
Hakhoechi 25, pp. 221-225. 
 99 
143. Shiobara Y., Asakawa Y., Kodama M., Yasuda K., Takemoto T. (1985), 
“Curcumenone, curcumanolide A and cucumanolide B, three 
sesquiterpenoids from Curcuma zedoaria”, Phytochemistry 24, pp. 
2629-2933. 
144. Shuler M.L., Kargi F. (2002), Bioprocess Engineering, Basic Concepts, 2nd 
edn. Prentice Hall, NJ, USA. 
145. Singh G., Singh O.P., Maurya S. (2002), “Chemical and biocidal 
investigations on essential oils of some Indian Curcuma species”, Prog 
Crystal Growth and Charact 45, pp.75-81. 
146. Smith J.I., Smart N.J., Misawa M., Kurz W.G.W., Tallevi S.G., DiCosmo F. 
(1987), “Increased accumulation of indole alkaloids by some cell lines 
of Catharanthus roseus in response to addition of vanadyl sulphate”, 
Plant Cell Rep 6, pp. 142-145. 
147. Smollny T.H., Wichers T., Risk D., Van Zwam A., Shasavari A., 
Alfermann A.W. (1992), “Formation of lignans in suspension cultures 
of Linum album”, Planta Med Suppl 58, pp. 622. 
148. Srivastava S., Srivastava A.K. (2007), “Hairy root culture for mass-
production of high-value secondary metabolites”, Crit Rev Biotechnol 
27, pp. 29-43. 
149. Srvidya A.R., Yadev A.K., Dhanbal S.P. (2009), “Antioxidant and 
antimicrobial activity of rhizome of Curcuma aromatica and Curcuma 
zeodaria, leaves of Abutilon indicum”, Arch Pharm Sci & Res 1(1), pp. 
14-19. 
150. Stanly C., Bhatt A., Keng C.L. (2010), “A comparative study of Curcuma 
zedoaria and Zingiber zerumbet plantlet production using different 
micropropagation systems”, African Journal of Biotechnology 9(28), 
pp. 4326-4333. 
 100 
151. Sun Y.L., Tang J., Gu X.H., Li D.Y. (2005), “Water-soluble 
polysaccharides from Angelica sinensis (Oliv.) Diels: Preparation, 
characterization, and bioacitivity”, Int Biol Macromol 36, pp. 283-
289. 
152. Syu W.J., Shen C.C., Don M.J., Ou J.C., Lee G.H., Sun C.M. (1998), 
“Cytotoxicity of curcuminoids and some novel compounds from 
Curcuma zedoaria”, Nat Prod 61, pp. 1531-1534. 
153. Taiz L., Zeiger E. (2006), Plant physiology, Sinauer Associates, Inc 
Publishers, Massachusetts, pp. 315-344. 
154. Tal B., Rokem J.S., Goldberg I. (1983), “Factors affecting growth and 
product formation in plant cells grown in continuous culture”, Plant 
Cell Rep 2, pp. 219-222. 
155. Tepsorn R. (2009), Antimicrobial activity of Thai traditional medicinal 
plants extract incorporated alginate-tapioca starch based edible films 
against food related Bacteria including foodborne pathogens, PhD 
Thesis, University of Hohenheim, Thailand. 
156. Teramoto S., Komamine A. (1988), Biotechnology in agriculture and 
forestry, Medicinal and aromatic plants IV. Springer-Verlag, Berlin, 
Heidelberg, pp. 209-224. 
157. Thanh N.T., Ket N.V., Yoeup P.K. (2007), “Effecting of medium 
composition on biomass and ginsenoside production in cell suspension 
culture of Panax vietnamensis Ha et Grushv”, VNU Journal of sicence 
Natural and Technology 23, pp. 269-274. 
158. Thanh N.T., Ket N.V., Yoeup P.K. (2008), “Effects of macro elements on 
biomass and ginsenoside production in cell suspension culture of Ngoc 
Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, VNU Journal of 
sicence Natural and Technology 23, pp. 269-274. 
 101 
159. Thanh N.T., Yu K.W., Hahn E.J., Peak K.Y., Murthy H.N. (2005b), “High 
density cultivation of Panax ginseng cells in balloon type bioreactors: 
role of oxygen supply on biomass and ginsenoside production”, 
Genetics and Applications 2, pp. 7-13. 
160. Thengane S.R., Kulkarni D.K., Shrikhande V.A., Joshi S.P., Sonawane 
K.B., Krishnamurthy K.V. (2003), “Influence of medium composition 
on callus induction and camptothecin(s) accumulation in Nothapodytes 
foetida”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 72, pp. 247-251. 
161. Trejo-Tapia G., Arias-Castro C., Rodríguez-Mendiola M. (2003), 
“Influence of the culture medium constituents and inoculum size on the 
accumulation of blue pigment and cell growth of Lavandula spica”. 
Plant Cell Tiss Org Cult 72, pp. 7-12. 
162. Vanisree M., Lee C.Y., Shu-Fung L., Nalawade S.M.L., Yih C., Tsay H.S. 
(2004), “Studies on the production of some important secondary 
metabolites from medicinal plants by plant tissue cultures”, Bot Bull 
Acad Sin 45, pp.1-22. 
163. Vanisree M., Tsay H.S. (2004), “Plant cell cultures-an alternative and 
efficient source for the production of biologically important secondary 
metabolites”, Int J Appl Sci Eng 2, pp. 29-48. 
164. Vasil I.K. (2008), “A history of plant biotechnology: from the cell theory of 
Schleiden and Schwann to biotech crops”, Plant Cell Rep 27, pp. 1423-1440. 
165. Verpoorte R., Contin A., Memelink J. (2002), “Biotechnology for the 
production of plant secondary metabolites”, Phytochem Rev 1, pp.13-25. 
166. Véronique J., Genestier S., Courduroux J. C. (1992), “Bioreactor studies on 
the effect of dissolved oxygen concentration on growth and 
differentiaton of carrot (Daucus carota L.) cell culture”, Plant Cell 
report 11(12), pp. 605-608. 
 102 
167. Vijaya S.N., Udayasri P.V.V., Aswani K.Y., Ravi B.B., Phani K.Y., Vijay 
V.M. (2010), “Advancements in the production of secondary 
metabolites”, Natural Products 3, pp. 112-123. 
168. Villarreal M.L., Arias C., Feria-Velasco A., Ramirez O.T., Quintero R. 
(1997), “Cell suspension culture of Solanum chrysotrichum (Schldl)- A 
plant producing an antifungal spirostanol saponin”, Plant Cell Tissue 
and Organ Culture, 50, pp. 39-44. 
169. Wang G.L., Luo H.M., Fang H.J., Jiang D., Huang H.G. (2004), 
“Fractionation of polysaccharide from Curcuma zedoaria Rosc. and its 
bioactivities”, Ying Yang Hsueh Pao 26(5), pp. 366-369. 
170. Wang G.L., Luo H.M., Fang H.J., Jiang D., Huang H.G. (2004), 
“Fractionation of polysaccharide from Curcuma zedoaria Rosc and its 
bioactivities”, Ying Yang Hsueh Pao 26(5), pp. 366-369. 
171. Wang G.R., Qi N.M., Wang Z.M. (2010), “Application of a stir-tank 
bioreactor for perfusion culture and continuous harvest of Glycyrrhiza 
inflata suspension cells”, African Journal of Biotechnology 9 (3), pp. 
347-351. 
172. Wang S.J., Zhong J.J. (1996), “A novel centrifugal impeller bioreactor. I. 
Fluid circulation, mixing, and liquid velocity profiles”, Biotechnol 
Bioeng 51, pp. 511-519. 
173. Wang W., Zhong J.J. (2002), “Manipulation of ginsenoside heterogeneity in 
cell cultures of Panax notoginseng by addition of jasmonates”, Biosci 
Bioeng 93, pp. 48-53. 
174. Wang X., Morris-Natschke S.L., Lee K.H. (2007), “New developments in 
the chemistry and biology of the bioactive constituents of Tanshen”, 
Med Res Rev 27, pp. 133-148. 
 103 
175. Watanabe K., Shibata M., Yano S., Cai Y. Shibuya H., Kitagawa I. (1986), 
“Antiulcer activity of extracts and isolated compound from zedoary 
(Gajustsu) cultivated in Yakushima (Japan)”, Yakugaku Zasshi 106(12), 
pp. 1137-1142. 
176. Wilson B., Abraham G., Manju V.S., Mathew M., Vimala B., 
Sundaresan S., Nambisan B. (2005), “Antibacterial activity of 
Curcuma zedoaria and Curcuma malabarica tubers”, 
Ethnopharmacol 99, pp. 147-151. 
177. Wink M. (1999), Biochemistry of plant secondary metabolism. Annual 
plant reviews, vol 2, Sheffield Academic Press. 
178. Woerdenbag H.J., Van U.W., Frijlink H.W., Lerk C.F., Pras N., Malingre 
T.M. (1990), “Increased podophyllotoxin production in Podophyllum 
hexandrum cell suspension cultures after feeding coniferyl alcohol as β-
cyclo dextrin complex”, Plant Cell Rep 9, pp. 97-100. 
179. Xingyi (1999), "The chemical constituents of the essential oil from 
Curcuma zedoaria (Christm) Rosc”, Guang Zhiwu 19 (1), pp. 95-96. 
180. Yasuda S., Satosh K., Ishi T., Furuya T. (1972), Studies on the cultural 
conditions of plant cell suspension culture. Fermentation 
technology today, Society for fermentation Technology, Osaka, 
Japan, pp. 697-703. 
181. Yesil-Celiktas O., Gurel A., Vardar-Sukan F. (2010), Large scale 
cultivation of plant cell and tissue culture in bioreactors, Transworld 
Research Network, Kerala, India. 
182. Yoshioka T., Fujii E., Endo M., Wada K., Tokunaga Y., Shiba N., Hohsho 
H., Shibuya H., Muraki T. (1998), “Antiinflammatory potency of 
dehydrocurdione, a zedoary-derived sesquiterpene”, Inflamm Res 
47(12), pp. 476-481. 
 104 
183. Zenk M.H. (1978), “The impact of plant cell culture on industry”, in 
Frontiers of Plant Tissue Culture 1978 (Thorpe, T. A., ed.), Intl. 
Assoc. Plant Tissue Culture, Univ. of Calgary Printing Services, pp. 
1-13. 
184. Zenk M.H., EI-Shagi H., Schulte U. (1975), “Anthraquinone production by 
cell suspension cultures of Morinda citrifolia”, Planta Med Suppl, pp. 
79-101. 
185. Zhang Q., Rich J.O., Cotterill I.C., Pantaleone D.P., Michels P.C. (2005), “14-
Hydroxylation of opiates: Catalytic direct autoxidation of codeinone to 14-
hydroxycodeinone”, Am Chem Soc 127, pp. 7286-7287. 
186. Zhang Z.Y., Zhong J.J. (2004), “Scale-up of centrifugal impeller bioreactor 
for hyperproduction of ginseng saponins and polysaccharide by high-
density cultivation of Panax notoginseng cells”, Biotechnol Prog 20, 
pp.1076-1081. 
187. Zhang Z.Y., Zhong J.J. (2004), “Scale-up of centrifugal impeller bioreactor 
for hyperproduction of ginseng saponins and polysaccharide by high-
density cultivation of Panax notoginseng cells”, Biotechnol Prog 20, 
pp.1076-1081. 
188. Zhao J., Verpoorte (2007), “Manipulating indole alkaloid production by 
Catharanthus roseus crll culture in bioreactors: from biochemical 
processing to metabolic engineering”, Phytochem Rev 6, pp. 435-457. 
189. Zhao D., Xing J., Li M., Lu D., Zhao Q. (2001), “Optimization of growth and 
jaceosidin production in callus and cell suspension cultures of Saussurea 
medusa”, Plant Cell Tissue and Organ Culture 67, pp. 227-234. 
190. Zhao J., Zhu W., Hu Q. (2001b), “Enhanced catharanthine production in 
Catharanthus roseus cell cultures by combined elicitor treatment in 
shake flasks and bioreactors”, Enzyme Microb Technol 28, pp. 673-681. 
 105 
191. Zhong J.J., Yoshida T. (1995), “High-density cultivation of Perilla 
frutescens cell suspensions for anthocyanin production: Effects of 
sucrose concentration and inoculum size”, Enzyme and Microbial 
Technology 17, pp. 1073-1079. 
192. Zhu L. (1993), Aromatic plants and essential constituents, Hai Feng 
Publishing Co., Hong Kong. 
193. Ziv M. (2000), “Bioreactor technology for plant micropropagation”, 
Horticultural Reviews, 24, pp. 14-23. 
PHỤ LỤC 
Phụ lục 1: Môi trƣờng cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) 
Muối khoáng Nồng độ (mg/l) 
Potasium nitrate (KNO3) 1900 
Amonium nitrate (NH4NO3) 1650 
Calcium chloride (CaCl2.H2O) 440 
Magnesium sulfate (MgSO4.7H2O) 370 
Potassium phosphate (KH2PO4) 170 
Na2EDTA.2H2O 37,2 
Manganese sulfate (MnSO4.4H2O) 22,3 
Ferrous sulfate (FeSO4.7H2O) 27,8 
Zinc Sulfate (ZnSO4.7H2O) 8,6 
Boric Acid (H3BO3) 6,2 
Potassium Iodine (KI) 0.83 
Sodium molybdate (Na2MoO4.2H2O) 0,25 
Colbalt chloride (CoCl2.6H2O) 0,025 
Cupric Sulfate (CuSO4.5H2O) 0,025 
Vitamin Nồng độ (mg/l) 
Myo-inositol 100 
Nicotinic acid 0,5 
Pyridoxine HCl 0,5 
Thiamine HCl 0,1 
Glycine 2 
Sucrose 30 g/l 
Agar 8 g/l 
Phụ lục 2: Hình ản h thí nghiệm 
Hình: Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml, trên máy lắc 
Hình: Tế bào nghệ đen để lắng trong bình tam giác 250 ml 
Hình: Sinh khối tươi của tế bào nghệ đen thu được sau kh nuôi cấy 14 ngày 
trong hệ lên men 10 L