Luận án Nghiên cứu tần suất, đặc điểm thalassemia và các bệnh hemoglobin trong cộng đồng dân tộc Khmer ở đồng bằng sông Cửu Long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO	 	 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
LÊ THỊ HOÀNG MỸ
Nghiªn cøu tÇn suÊt, ®Æc ®iÓm thalassemia 
vµ c¸c bÖnh hemoglobin trong céng ®ång d©n téc Khmer ë ®ång b»ng s«ng Cöu Long
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
HÀ NỘI - 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO	 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
LÊ THỊ HOÀNG MỸ
Nghiªn cøu tÇn suÊt, ®Æc ®iÓm thalassemia 
vµ c¸c bÖnh hemoglobin trong céng ®ång d©n téc Khmer ë ®ång b»ng s«ng Cöu Long
Chuyên ngành	: Huyết học và Truyền máu
	Mã số	: 62720151
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
GS. TS. Phạm Quang Vinh
PGS. TS. Huỳnh Nghĩa
HÀ NỘI - 2018
LỜI CẢM ƠN
Hoàn thành luận án, cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn và lời cảm ơn chân thành nhất tới:
Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Huyết học và Truyền máu - Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án Tiến sĩ.
Đảng ủy, Ban Giám Hiệu Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, đã ủng hộ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn của mình tới:
GS.TS. Phạm Quang Vinh – Chủ nhiệm Bộ môn Huyết học và Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội;
PGS.TS. Huỳnh Nghĩa – Phó chủ nhiệm Bộ môn Huyết học, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh;
TS. Dương Bá Trực – Nguyên Trưởng khoa Huyết học lâm sàng, Bệnh viện Nhi Trung Ương; 
Prof. Suthat Fucharoen – Trung tâm nghiên cứu Thalassemia, Viện Nghiên cứu Sinh học phân tử, Đại học Mahidol, Thái Lan; - những người Thầy đã luôn dành hết tâm sức hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô cùng quý giá; động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. 
Xin cho tôi được gửi lời tri ân đến Thầy – Cố PGS.TS. Bùi Văn Viên, người Thầy đã luôn nhiệt tâm hướng dẫn, động viên tôi trong quá trình thực hiện luận án, ngay cả khi Thầy nằm trên giường bệnh.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Trung tâm Chẩn đoán Y khoa Medic, thành phố Hồ Chí Minh; tập thể Trung tâm nghiên cứu Thalassemia, Viện nghiên cứu Sinh học Phân tử, Đại học Mahidol, Thái Lan; đơn vị dịch vụ Thalassemia, Trường Đại học Khon Khaen, Thái Lan; Sở Khoa học và công nghệ tỉnh Sóc Trăng, Sở Y tế, trung tâm Y tế, các trạm y tế xã, phường các tỉnh Sóc Trăng, Trà Vinh, Bạc Liêu, Hậu Giang đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thu thập số liệu và thực hiện nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, anh chị em đồng nghiệp tại Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, và bạn bè đã luôn dành cho tôi những tình cảm quý mến, những lời động viên, chia sẻ, giúp tôi có thêm động lực để hoàn thành luận án này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Lê Thị Hoàng Mỹ
LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Lê Thị Hoàng Mỹ, nghiên cứu sinh khóa 29 trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Huyết học và Truyền máu, xin cam đoan:
Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Phạm Quang Vinh và PGS.TS. Huỳnh Nghĩa.
Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam.
Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Người viết
Lê Thị Hoàng Mỹ
Lê Thị Hoàng Mỹ	
CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN
Viết tắt
Ý nghĩa
-α3.7
-α4.2
--SEA
--THAI
--/αa 
-a/aa
đột biến xóa đoạn 3,7 kb α+-thalassemia
đột biến xóa đoạn 4,2 kb α+-thalassemia
đột biến xóa đoạn α0-thalassemia South East Asia 
đột biến xóa đoạn α0-thalassemia Thailand
α0-thalassemia
α+-thalassemia
αCSα 
đột biến điểm gen globin α2 tạo Hb Constant Spring
αQSα
đột biến điểm gen globin α2 tạo Hb Quong Sze
αTα
đột biến điểm gen globin α2
ααT
đột biến điểm gen globin α1
α+-thal 
α-thal do các đột biến gây mất 1 gen globin-α 
α0-thal 
α-thal do các đột biến gây mất 2 gen globin-α 
AEBart’s
Bệnh lý hemoglobin E dị hợp tử kết hợp đột biến gây tổn thương 3 gen globin α do xóa đoạn hoặc không xóa đoạn 
ARMS
amplification refractory mutation system: hệ thống khuếch đại đột biến có tính chất trơ
ASO
Allele specific oligonucleotide, mẫu dò đặc hiệu alen
β
gen globin-β, alen gen globin-β bình thường
β0
đột biến gen β0-thalassemia không tổng hợp chuỗi globin-β
β+
đột biến gen β+-thalassemia giảm tổng hợp chuỗi globin-β
βE
đột biến gen globin-β tạo HbE (codon 26 GAG>AAG)
β/βE, βE/βE 
Bệnh lý hemoglobin E dị hợp tử, hemoglobin E đồng hợp tử
βthal
đột biến β-thalassemia giảm hoặc không tổng hợp chuỗi globin β, không bao gồm đột biến βE 
(δβ)thal
đột biến mất đoạn DNA chứa gen β và δ
CE
Capillary Electrophoresis, điện di mao quản
ĐB
đột biến
ĐBSCL
Đồng bằng sông Cửu Long
DCIP
Dichlorophenolindophenol
ddNTP
dioxynucleotide triphosphat
DGGE
Denaturing gradient gel electrophoresis, Điện di gradient biến tính
DHT
Dị hợp tử
ĐHT
Đồng hợp tử
ĐLC
Độ lệch chuẩn
DNA
Deoxynucleotide acid
dNTP
Deoxynucleotide triphosphate
GTLN
Giá trị lớn nhất
GTNN
Giá trị nhỏ nhất
Hb
Hemoglobin: huyết sắc tố
HbCS
Hemoglobin Constant Spring
HC
Hồng cầu
HCT
Hematocrit, thể tích khối hồng cầu
HGB
Nồng độ hemoglobin
HPFH
Heriditary persistence of fetal hemoglobin, tồn lưu hemoglobin bào thai
HPLC
High Performance Liquid Chromatography, Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HRM
High resolution melting, đường cong nóng chảy có độ phân giải cao
HS
Hypersensitive site: vị trí rất nhạy cảm
IVS
Intervening sequence: trình tự đoạn chèn hay intron
KKU
Khon Khaen University, Đại học Khon Khaen Thái Lan
MAS-PCR
Multiplex allele specific Polymerase chain reaction
MCH
Mean Corpuscular Hemoglobin, lượng hemoglobin trung bình trong hồng cầu
MCHC
Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, nồng độ hemoglobin trung bình trong hồng cầu
MCV
Mean Corpuscular Volume, thể tích trung bình hồng cầu
MLPA
multiplex ligation-dependent probe amplification, khuếch đại đa đoạn dò phụ thuộc phản ứng nối
NST
Nhiễm sắc thể
OF test
osmotic fragility: xét nghiệm sức bền thẩm thấu 
PCR
polymerase chain reaction: phản ứng chuỗi trùng hợp
RDB
Reverse dot blot: kỹ thuật lai điểm ngược
RDW
Red cell distribution width, Độ rộng dải phân bố kích thước hồng cầu
RE
Ristriction enzyme, enzyme giới hạn
rpm
round per minute
RT-PCR
Realtime – PCR: phản ứng chuỗi trùng hợp ở thời gian thực
SLHC
Red Blood cell count - số lượng hồng cầu
TB
Giá trị trung bình
TPTTBMNV
Tổng phân tích tế bào máu ngoại vi
WHO
World Health Organisation, Tổ Chức Y Tế Thế giới
γ, ζ, ε
gen globin gamma, zeta, epsilon
δ
gen globin-delta
δβ
alen gen globin-delta beta bình thường
MỤC LỤC
CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. 	Phân loại bệnh hemoglobin	5
Bảng 1.2. 	Ưu và nhược điểm của các phương pháp phân tích đột biến đã biết trên gen globin	24
Bảng 1.3. 	Các phương pháp phân tích DNA chẩn đoán bệnh hemoglobin	27
Bảng 1.4. 	Tỉ lệ mang gen bệnh hemoglobin ở một số dân tộc Việt Nam	29
Bảng 1.5. 	Tỉ lệ mang gen thal và Hb E ở một số cộng đồng Châu Á	32
Bảng 2.1. 	Tiêu chuẩn chẩn đoán thiếu máu của WHO	40
Bảng 2.2. 	Mức độ thiếu máu phân loại theo WHO	40
Bảng 2.3. 	Trình tự các đoạn mồi trong phản ứng Gap-PCR	49
Bảng 2.4. 	Chu trình nhiệt của phản ứng Gap-PCR	50
Bảng 2.5. 	Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen globin-β trong kỹ thuật RDB	53
Bảng 2.6. 	Thành phần phản ứng HRM	56
Bảng 2.7. 	Trình tự mồi cho phản ứng HRM	56
Bảng 2.8. 	Chu trình nhiệt cho phản ứng HRM	57
Bảng 3.1. 	Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu	61
Bảng 3.2. 	Tỉ lệ các thể thalassemia và bệnh Hb trong nhóm có mang ĐB	64
Bảng 3.3. 	Tỉ lệ mang gen thalassemia và HbE theo nơi cư trú	64
Bảng 3.4. 	Tỉ lệ các kiểu gen globin-α trong nhóm có mang đột biến gen globin-α và trong cộng đồng	65
Bảng 3.5. 	Tỉ lệ các kiểu ĐBG globin-α trong cộng đồng	66
Bảng 3.6. 	Tỉ lệ kiểu gen và kiểu ĐB gen globin-β trong nhóm và trong 
cộng đồng	67
Bảng 3.7. 	Tỉ lệ các kiểu gen Hb E trong nhóm và trong cộng đồng	68
Bảng 3.8. 	Đặc điểm lâm sàng	69
Bảng 3.9. 	Chỉ số hồng cầu trong các thể a-thal đơn độc	70
Bảng 3.10. 	Chỉ số hồng cầu trong các thể b-thal đơn độc	71
Bảng 3.11. 	Chỉ số hồng cầu trong các thể HbE đơn độc và kết hợp ở trẻ em	72
Bảng 3.12.	Chỉ số hồng cầu trong các thể HbE đơn độc và kết hợp ở người lớn	73
Bảng 3.13. 	Đặc điểm hồng cầu trong các thể α-thal	74
Bảng 3.14. 	Đặc điểm hồng cầu trong các kiểu gen β-thal	75
Bảng 3.15. 	Đặc điểm hồng cầu của các kiểu gen HbE kết hợp α -thal	76
Bảng 3.16. 	Thành phần Hb của các thể α-thal	77
Bảng 3.17. 	Thành phần Hb của các thể β-thal	78
Bảng 3.18. 	Thành phần Hb của các thể HbE kết hợp α-thal	79
Bảng 3.19. 	Các chỉ số hồng cầu và thành phần Hb của các đối tượng nghiên cứu trong 2 phả hệ	73
Bảng 3.20. 	Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và giá trị tiên đoán âm của các chỉ số MCV <85 fL, MCH <27 pg riêng biệt và kết hợp trong sàng lọc thal và HbE	86
Bảng 3.21. 	Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và giá trị tiên đoán âm của OF test, DCIP test riêng biệt và kết hợp trong sàng lọc thalassemia và HbE	87
Bảng 3.22. 	Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và giá trị tiên đoán âm của DCIP test trong sàng lọc HbE	88
Bảng 3.23. 	Giá trị của chỉ số MCV <85fL và/hoặc MCH <27pg và kết hợp MCV <85fL và/hoặc MCH <27pg và/hoặc DCIP (+) trong sàng lọc thalassemia và HbE	88
Bảng 4.1. 	Các kiểu đột biến gen globin-β trong các nghiên cứu	99
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. 	Phân bố các thể thalassemia và bệnh Hb trong cộng đồng dân tộc Khmer ĐBSCL	62
Biểu đồ 3.2. 	Tỉ lệ mang gen thalasemia và bệnh hemoglobin trong cộng đồng dân tộc Khmer ĐBSCL	63
Biểu đồ 3.3. 	Đường cong ROC của chỉ số MCV và MCH trong sàng lọc thalassemia và bệnh lý Hb	84
Biểu đồ 3.4. 	Đường cong ROC của các chỉ số MCHC, SLHC, HCT và RDW trong sàng lọc thalassemia và HbE	85
Biểu đồ 4.1. 	Biến thiên SLHC trong các dạng mang đột biến gen HbE và không mang đột biến ở người lớn	108
Biểu đồ 4.2. 	Biến thiên MCV và MCH trong các dạng mang đột biến gen HbE và không mang đột biến ở người lớn	110
Biểu đồ 4.3. 	Sự biến thiên của chỉ số MCV ở nhóm không mang ĐBG và các nhóm có mang ĐBG	112
Biểu đồ 4.4. 	Sự biến thiên của chỉ số MCH ở nhóm không mang đột biến và các nhóm có mang đột biến	113
Biểu đồ 4.5. 	Sự biến thiên của HbA2 trên điện di giữa nhóm không mang ĐBG và các nhóm có mang ĐBG	119
Biểu đồ 4.6. 	Sự biến thiên của HbE trên điện di ở các nhóm mang đột biến gen HbE	120
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: 	Cơ chế bệnh sinh thalassemia	8
Hình 1.2. 	Hình ảnh hồng cầu bệnh nhân HbH trên tiêu bản máu ngoại vi và nhuộm BCB 	13
Hình 1.3. 	Thay đổi hình thái hồng cầu trên tiêu bản máu ngoại vi	16
Hình 1.4.	Kết quả DCIP test trong các trường hợp (1) Hồng cầu người bình thường (2) HbE dị hợp tử (3) HbE/β-thalassemia và (4) HbE đồng hợp tử 	17
Hình 1.5. 	Nguyên lý hoạt động của hệ thống điện di mao quản	19
Hình 1.6. 	Nguyên lý của kỹ thuật lai điểm ngược	21
Hình 1.7. 	Nguyên lý kỹ thuật MLPA	26
Hình 1.8. 	Bản đồ hành chính khu vực ĐBSCL	33
Hình 2.1. 	Các mất đoạn α-thalassemia và các đoạn mồi trong kỹ thuật multiplex-gap PCR	50
Hình 2.2. 	Kết quả mất đoạn được phát hiện bởi điện di	51
Hình 2.3. 	Kết quả RDB âm tính	54
Hình 2.4. 	Kết quả RDB dương tính với mẫu dị hợp tử	54
Hình 2.5. 	Kết quả RDB với đột biến đồng hợp tử	55
Hình 2.6. 	Kết quả RDB với đột biến dị hợp tử kép	55
Hình 2.7. 	Kết quả RDB dương tính giả	55
Hình 2.8. 	Kết quả phân tích đường cong HRM	58
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Các bước tiến hành nghiên cứu	60
Sơ đồ 3.1. Phả hệ gia đình đối tượng mang gen Hb Tak thứ nhất	80
Sơ đồ 3.2. Phả hệ gia đình đối tượng mang gen Hb Tak thứ hai	81
ĐẶT VẤN ĐỀ
Thalassemia (thal) và bệnh lý hemoglobin (Hb biến thể) là nhóm bệnh di truyền đơn gen phổ biến nhất trên thế giới [1], [2]. Bệnh gây ra do đột biến gen có vai trò kiểm soát quá trình tổng hợp chuỗi globin trong hồng cầu dẫn đến thiếu máu do tan máu bẩm sinh [3], [4]. Trên thế giới, tỉ lệ mang gen ước tính khoảng 7%. Hàng năm, có khoảng 300.000 - 400.000 trẻ thal thể nặng được sinh ra [5], và khoảng 50.000 - 100.000 trẻ mắc bệnh tử vong [6]. Mặc dù được phát hiện ở khắp nơi, bệnh mang tính chất dân tộc và địa dư một cách rõ rệt [4], [7].
	Đông Nam châu Á là một ‘vùng dịch tễ’ thalassemia và bệnh lý Hb với 4 thể phổ biến là a-thal, b-thal, HbE và Hb Constant Spring (HbCS). Theo một số nghiên cứu, tỉ lệ mang gen a-thal trong khu vực thay đổi từ 4,5% - 40%; b-thal từ 1 - 9%; HbCS từ 1 - 8%. Bệnh HbE có thể được xem là ‘nét đặc trưng’ của vùng Đông Nam Á, là Hb bất thường phổ biến nhất trong số những người nói tiếng Môn-Khmer, Lào, Ấn Độ, Bangladesh, Sri Lanka với tỉ lệ mang gen ở một số vùng có thể lên đến 50 - 60% [8]. Hiện nay, có hơn 200 đột biến gây b-thal [9], [10] và hơn 150 đột biến gây a-thal [11], sự phối hợp giữa các đột biến này gây ra hơn 60 hội chứng thal khác nhau, làm cho Đông Nam Á trở thành khu vực có kiểu gen thal phức tạp nhất trên thế giới [8]. 
	Biểu hiện lâm sàng của các hội chứng thal rất thay đổi, từ dạng không có triệu chứng đến phụ thuộc truyền máu, thậm chí tử vong trong bào thai như thể đồng hợp tử a0-thal. Điều trị các thể bệnh nặng hiện nay chủ yếu là truyền máu và thải sắt định kỳ, suốt đời, đã tạo ra gánh nặng cho gia đình bệnh nhân và xã hội. 
	Dự phòng sinh ra các thể bệnh nặng với các chương trình sàng lọc người mang gen trong cộng đồng, tham vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh là các bước can thiệp quan trọng nhất nhằm giảm gánh nặng do bệnh gây ra [12]. Để làm được điều này, cần phải có các dữ kiện về tần suất mang gen bệnh, sự phân bố các kiểu đột biến gen và đặc điểm lâm sàng, huyết học các thể bệnh trong cộng đồng.	
	Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đaay cho thấy tần suất mang gen 
β-thal thay đổi từ 1,5 - 25% và HbE từ . trong cộng đồng các dân tộc ít người, tăng dần khi đi từ bắc vào nam [13]. Dân tộc Khmer là một trong các dân tộc ít người có dân số cao nhất nước với khoảng gần 1,3 triệu người, sinh sống tập trung ở một số tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long [14]. Theo y văn, tỉ lệ mang gen HbE ở người Khmer từ 20% - 30% [15]; và tỉ lệ mang gen β-thal khoảng 1,56 - 1,7% [16], do đó sẽ có nhiều nguy cơ xuất hiện những thể bệnh phối hợp. Nhằm góp phần cung cấp một số dữ kiện về thalassemia và bệnh hemoglobin trong cộng đồng người Khmer, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tần suất, đặc điểm thalassemia và các bệnh hemoglobin trong cộng đồng dân tộc Khmer ở đồng bằng sông Cửu Long” với các mục tiêu sau: 
Xác định tần suất các thể thalassemia và bệnh hemoglobin, tỉ lệ các kiểu đột biến gen globin trong cộng đồng dân tộc Khmer ở đồng bằng sông Cửu Long. 
Mô tả một số đặc điểm lâm sàng và huyết học các thể thalassemia và bệnh hemoglobin trong cộng đồng dân tộc Khmer ở đồng bằng sông Cửu Long. 
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 131.
147. Mu-Chin Shih, Kang-His Wu, Su-Ching Liu (2005). Hb Tak: a β chain elongation at the end of the β chain in a Taiwanese. Hemoglobin, 29 (1):65-67.
148. Charoenkwan P., Thanarattanakorn P., Chaovaluksakul S. (2003). Hematological and molecular characterization of Beta-thalassemia/Hb Tak compound heterozygote. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 24 (3):415-419.
149. Tanphaichitr VS., Viprakasit V., Veerakul G. (2003). Homozygous Hemoglobin Tak causes symptomatic secondary poycythemia in a Thai boy. Clinical and Laboratory Obervationss, 25 (3):262-265.
150. Teawtrakul N., Sirijirachai C., Chansung G. (2010). Compound heterozygous Hb Tak/Hb E causes secondary erythrocytosis in a Thai family. Hemoglobin, 34 (2):165–168.
151. Singha K., Fucharoen S. (2014 ). Five Hemoglobin Variants in a Double Heterozygote for α- and β-Globin Chain Defects. Acta Haematol, 131 (2):71-75.
152. Tongprasert F., et al. (2017). Secondary erythrocytosis caused by hemoglobin Tak/β0-thalassaemia disease during pregnancy: A case report. J Obstet Gynaecol., 37 (2):252-253.
153. Jindadamrongwech S., Tungbuppha N., Chuncharunee S. (2010). Hb Tak and Hb Q-Thailand in Thai patients are S-window hemoglobin variants revealed by High Performance Liquid Chromatography. Hemoglobin, 34 (2):161-164.
154. Singh S. P., et al. (2008). Effectiveness of red cell osmotic fragility test with varying degrees of saline concentration in detecting beta - thalassaemia trait. Singapore Med J., 49 (10):823-826.
155. Chow J, Phelan L., Bain BJ. (2005). Evaluation of Single-Tube Osmotic Fragility as a Screening Test for thalassemia American Journal of Hematology, 79:198-201.
156. Ansari SH. (2014). Sensitivity and specificity of single-tube osmotic fragility test and its different methods as screening test for thalassemia trait: an alternative to expensive laboratory tests for resource-limited countries. Eur J Haematol., 93 (6):516-520.
157. Sangkitporn S. (2005). Validation of osmotic fragility test and dichlorophenol indophenol precipitation test for screening of thalassemia and HbE. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 36 (6):1538-1542.
158. Sanchaisuriya K., Fucharoen S., Fucharoen G. (2005). A reliable screening protocol for thalassemia and hemoglobinopathies in pregnancy. Hematopathology, 123 (11):113-118.
5,18,20,22-25,27-32,34-53,56-57,59-61,64-79,83,86-107,109,111,114-11
TRƯỜNG ĐH Y DƯỢC CẦN THƠ
MÃ SỐ:
PHIẾU THU THẬP THÔNG TIN
1. HÀNH CHÁNH
1.1. Địa điểm: xã 	
1.2. Tên người thu thập: 	Chữ ký:..
1.3. Họ và tên đối tượng: 	
1.4. Ngày tháng năm sinh:	Giới: □ Nam	□ Nữ
1.5. Địa chỉ: ấp	
1.6. Nghề nghiệp:	
	□ Làm ruộng	□ Làm vườn	□ Làm mướn	
	□ Buôn bán	□ Khác (ghi rõ)____________________
1.7. Dân tộc Khmer:	
	□ Ông nội	□ Bà nội	□ Ông ngoại	□ Bà ngoại
	□ Cha	□ Mẹ	□ Chồng/vợ
1.8. Tình trạng hôn nhân	
□ Độc thân	□ Đã lập gia đình	□ Khác
1.9. Số con: ________
2. CHUYÊN MÔN
2.1. Biểu hiện thiếu máu: 	
2.1.1. Niêm mạc nhợt	□ Có 	□ Không
2.1.2. Lòng bàn tay nhợt	□ Có 	□ Không
2.1. Biểu hiện vàng da:	
	2.1.1. Vàng da	□ Có 	□ Không
	2.1.2. Củng mạc mắt vàng	□ Có 	□ Không	
2.2. Biến dạng xương mặt: 	□ Có 	□ Không
2.3. Công thức máu:
Chữ ký người XN:
	RBC	:	HGB	:	NEU	:
HCT	:	MCV	:	LYM	:
MCH	:	RDW	:
2.4. Hình thái hồng cầu trên tiêu bản máu ngoại vi:
	- Kích thước:
	□ Bình thường 	
	□ HC nhỏ	
□ HC to
□ anisocytosis	
	- Màu sắc
	□ Bình sắc	
□ Nhược sắc	
□ polychromasia
- Hình dạng
□ Bình thường
	□ HC bia (_________%)
	□ poikilocytosis
- Khác
	□ HC có hạt kiềm
	□ Còn nhân (_______%)	
□ Thể vùi
□ Ngưng kết HC, chuỗi tiền
2.5. OF test:	□ Dương tính	□ Âm tính
2.6. DCIP test:	□ Dương tính	□ Âm tính
2.7. Điện di Hb:
	□ HbA ______	□ HbA2 ______	□ HbF _______□ HbE _______
	□ HbH ______	□ Hb Bart’s ________	□ Hb khác ______
2.8. Đột biến gen
□ α-thalassemia:
	□ β-thalassemia:
	□ HbE:.	
□ Khác............
PHỤ LỤC 1
QUI TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA
PHƯƠNG PHÁP TỦA BẰNG ΜUỐI (SALTING – OUT)
Dụng cụ, trang thiết bị
Týp 1,5 mL (Eppendorf®) đã được khử khuẩn.
Micropipette (Gilson®) loại 100 – 1000 mL, 20 – 200 mL
Đầu tip 1000 mL, 200 mL (Axygen Scientific®) 
Máy ly tâm týp (Hettich Mikro® 200)
Máy vortex (Genie® 2)
Hóa chất, thuốc thử
Dung dịch ly giải hồng cầu
Dung dịch ly giải tế bào (Cell lysis solution - Qiagen®)
Dung dịch kết tủa protein (Protein precipitate solution - Qiagen®)
Dung dịch isopropanol (Merck®)
Ethanol 70% được pha từ cồn tuyệt đối (Merck®)
Đệm TE (Promega®) 
Các bước tiến hành
Chuẩn bị 2 týp 1,5 mL cho mỗi mẫu, ghi mã số mẫu và ngày tách lên týp 2.
Lấy mẫu máu ra khỏi tủ trữ đông, để ở nhiệt độ phòng 15 phút.
Trộn đều bằng cách dốc ngược nhiều lần, hút 400 mL máu vào týp 1. 
Thêm 1000 mL dung dịch ly giải hồng cầu cho vào mỗi týp
Trộn đều bằng cách dốc ngược nhẹ nhàng nhiều lần, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Quay ly tâm 12.000 rpm trong 1 phút 
Nhẹ nhàng đổ bỏ dịch nổi màu hồng, để lại cặn lắng bên dưới.
Làm rã khối cặn lắng bằng cách lướt nhẹ đáy týp trên giá đựng ống nghiệm đến khi khối cặn rã hoàn toàn.
Lặp lại các bước (4) – (8). Thực hiện bước này đến khi nhìn thấy khối cặn lắng màu trắng đục (lớp bạch cầu) ở đáy týp (thường lặp lại 1 lần).
Thêm 300 mL dung dịch ly giải tế bào vào týp
Vortex khoảng 20 giây
Tiếp tục thêm 100 mL dung dịch kết tủa protein 
Vortex khoảng 1 phút
Quay ly tâm 12.000 rpm trong 5 phút
Chuyển dịch nổi trong suốt (chứa DNA) sang týp 2 đã ghi mã số và ngày tách chiết, bỏ týp 1.
Thêm 300 mL dung dịch isopropanol týp 2
Dốc ngược lên – xuống nhẹ nhàng khoảng 50 lần đến khi thấy có cuộn DNA màu trắng đục
Quay ly tâm 12.000 rpm trong 1 phút
Nhẹ nhàng đổ bỏ lớp dịch nổi, tránh đổ phần DNA lắng dưới đáy týp.
Dùng tay búng nhẹ đáy týp để tách DNA khỏi thành týp
Thêm 300 mL ethanol 70% vào týp, trộn đều 
Quay ly tâm 12.000 rpm trong 1 phút
Đổ bỏ lớp dịch nổi, tránh đổ bỏ DNA bên dưới.
Gạn thật sạch ethanol bằng giấy thấm
Để khô týp trong không khí ở nhiệt độ phòng trong > 15 phút
Thêm 30 – 50 mL dung dịch đệm TE 
Để týp ở nhiệt độ phòng trong khoảng 24 giờ
Sau 24 giờ, trữ DNA ở 40C hoặc -200C đến khi sử dụng
Hình 1.1. Máy quay ly tâm Hettich Mikro 200 và máy vortex
PHỤ LỤC 2
QUY TRÌNH ĐO NỒNG ĐỘ DNA BẰNG QUANG PHỔ KẾ
Nguyên lý hoạt động
	Sức căng bề mặt được sử dụng để giữ một cột mẫu ở vị trí để ánh sáng truyền qua thuận tiện cho phép đo. Người sử dụng chỉ cần dùng pipette nhả trực tiếp một thể tích nhỏ (0,5 – 2 mL) mẫu vào vị trí đo, có một tay cầm nơi có sợi cáp quang ấn xuống vị trí đặt mẫu, sau đó thả nhẹ để tạo một khoảng cách nhỏ dưới tác dụng của sức căng bề mặt, cột chất lỏng của mẫu được kéo lên. Lúc này có thể thực hiện phép đo với thời gian < 10 giây. Biểu đồ quang phổ và các kết quả phân tích hiện lên trên màn hình máy tính đi kèm.
Dụng cụ, trang thiết bị
Micropipette 0,2 – 2 mL.
Nước cất
Đầu típ 10 mL 
Giấy lau
Máy đo quang phổ NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Specific®) và phần mềm cài đặt trên máy tính.
Các bước thực hiện
Mở phần mềm: nhấp chuột 2 lần vào biểu tượng NanoDrop 2000 trên máy tính
Chọn chương trình đo: chọn thanh Nucleic Acid
Xác minh bước sóng thường quy: dùng giấy lau sạch bệ đo (pedestal) bên dưới và trên cánh tay của NanoDrop, hạ cánh tay xuống và click OK, máy sẽ chạy vài giây để kiểm tra. 
Blank trước khi sử dụng: tải 1 mL nước cất trực tiếp lên bệ đo của NanoDrop, hạ cánh tay máy xuống, nhấp chuột vào nút Blank trên màn hình. Máy sẽ tiếp tục chạy vài giây để blanking. Sau khi blank xong, nút Measure sẽ hiện rõ trên màn hình.
Tiến hành đo mẫu: nhập mã số mẫu vào ô ID, nâng cánh tay lên, lau sạch bệ đo bên dưới và trên cánh tay bằng giấy thấm, nhỏ 1 mL sản phẩm DNA lên vị trí đo, hạ cánh tay máy xuống, nhấp chọn nút Measure. Sau khi chương trình đo hoàn thành, máy sẽ hiển thị 1 cửa sổ cho phép lưu các số liệu vừa đo, có thể tạo 1 folder để lưu kết quả. Kết quả đo được hiển thị lên màn hình, với nồng độ ng/ mL. Đối với DNA, cần quan tâm đến tỉ số hấp thụ quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm (A260/A280). Tỉ số này nằm trong khoảng từ 1,8 – 2,0 cho biết sản phẩm DNA tinh sạch, nếu A260/A280 <1,6; mẫu có thể bị nhiễm ethanol, muối; cần tách chiết DNA lại. Mỗi mẫu tiến hành đo 2 lần để đảm bảo nồng độ đo được là chính xác.
Giữa các lần đo, dùng giấy thấm khô, không bụi lau sạch bệ đo bên dưới và trên cánh tay.
Sau khi hoàn thành đợt đo mẫu, dùng 3-5 mL nước cất lau sạch bệ đo trên và dưới, lưu kết quả lại hoặc xuất file excel để lưu.
Đóng phần mềm và thoát khỏi chương trình NanoDrop bằng cách nhấn nút Close và Exit.
Hình 2.1. Máy quang phổ kế NanoDrop 2000
PHỤ LỤC 3
QUI TRÌNH ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR CỦA PHẢN ỨNG GAP-PCR
Dụng cụ
Máy điện di nằm ngang (Gibthai Co., Ltd.)
Khay đổ gel, lược
Micropipette (Gilson®) loại 2 – 20 mL
Lò vi sóng
Camera đèn cực tím đọc gel (DNR Bio-Imaging Systems UV camera)
Hình 3.1. Camera đèn cực tím đọc gel DNR
Hóa chất
Agarose (Sigma Aldrich®)
Đệm TAE 
Nước cất 
Dung dịch Ethidium Bromide (Sigma Aldrich®)
Chất đệm tải nồng độ 6X (Thermo Fisher Specific®)
Thang chuẩn 100 kb plus (Thermo Fisher Scientific®)
Các bước tiến hành
Nồng độ gel agarose được sử dụng cho sản phẩm PCR là 1,5%.
Làm tan hoàn gel agarose trong lò vi sóng (gel lỏng trong suốt)
Đúc gel: cài lược vào khay đổ khuôn, đổ gel lỏng vào khay, đổ gel vào khoảng ¾ chiều cao lược
Chờ đến khi gel đặc lại, khoảng 25 – 30 phút
Nhẹ nhàng rút lược ra khỏi khối gel
Lấy bản gel ra khỏi khay
Đặt bản gel vào buồng điện di
Trộn 1 µL chất đệm tải và 5 µL sản phẩm PCR
Tải hỗn hợp vào giếng, chất đệm tải (Thermo Fisher Scientificâ Loading dye) có màu xanh giúp nhìn thấy gel chạy đến đâu. Ngoài ra, chất đệm tải chứa glycerol nồng độ cao, glycerol với tỉ trọng nặng hơn nước, sẽ kéo mẫu xuống đáy giếng, ngăn cản chúng bị khuếch tán vào dung dịch đệm.
Tải 4 mẫu chứng dương -α3.7, -α4.2, --SEA và --THAI vào các giếng và mẫu chứng âm (mẫu nội chuẩn) vào 1 giếng
Cuối cùng tải 1 µL thang chuẩn (DNA ladder) 100 kb plus vào giếng cuối cùng (hoặc giếng đầu tiên)
Đậy nắp buồng điện di lại sau khi tải xong các mẫu
Gắn điện cực, cắm điện
Bật máy, chỉnh điện áp 100V, 400 mA, thời gian 50 - 60 phút
Để gel chạy đến khi màu xanh của chất đệm tải khoảng ¾ bản gel
Tắt máy và rút điện
Mở nắp, nhấc bản gel ra khỏi buồng điện di.
Cho bản gel vào dung dịch Ethedium bromide khoảng 5 phút. Lưu ý, ethidium bromide là một chất gây ung thư, bỏ găng tay sau khi cho bản gel vào dung dịch ethium bromide.
Rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước cất khoảng 15 phút
Đọc gel bằng máy Gel Doc: đặt bản gel vào máy, dưới máy chụp ảnh đèn cực tím, được kết nối với máy tính. Các băng DNA được nhuộm ethidium bromide sẽ sáng lên dưới đèn cực tím
Lưu lại hình chụp bản gel để đọc kết quả.
Bỏ gel trong thùng có ký hiệu “Gel nhiễm ethidium bromide” (KHÔNG được bỏ trong thùng rác)
Sử dụng giấy tẩm cồn 70% lau sạch bề mặt bàn máy Gel Doc bị nhiễm ethium bromide
PHỤ LỤC 4
MỘT SỐ DUNG CỤ, THIẾT BỊ XÉT NGHIỆM
Hình 4.1. Máy Vortex Stuart Scientific
Hình 4.2. Máy spin down Cubee
Hình 4.3. Máy Real-time PCR CFX Bio-Rad
Hình 4.4. Micropipette (Gilson®)
Hình 4.5. Máy luân nhiệt Bio-rad® MyCyclerTM
Hình 4.6. Bể cách thủy Memmert®
PHỤ LỤC 5
MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN
1. Kết quả Gap-PCR
M
-a3.7/aa
-a3.7/-a3.7
--SEA/aa
aa/aa
-a3.7/aa
Hình 5.1. Kết quả điện di sản phẩm Gap-PCR xác định các đột biến xóa đoạn trên gen globin-a 
Giếng M: thang đo chuẩn (Thermo Fisher Scientific®)
Giếng 3.7: mẫu chứng dị hợp tử đột biến -α3.7 
Giếng 4.2: mẫu chứng dị hợp tử đột biến -α4.2 
Giếng THAI: mẫu chứng dị hợp tử đột biến --THAI 
Giếng SEA: mẫu chứng dị hợp tử đột biến --SEA
Các giếng còn lại là các giếng chứa mẫu thử
2. Kết quả RDB
(1)
(4))
(3))
(2))
Hình 5.2. Kết quả RBD xác định đột biến gen globin-b
Hình (1): đồng hợp tử bE/bE
Hình (2): dị hợp tử bIVSII-654/b 
Hình (3): dị hợp tử bCd17/b 
Hình (4): dị hợp tử bE/b
-a3.7/aa
--SEA/aa
-a3.7/aa
-a3.7/aa
--SEA/aa
-a4.2/aa
 aCSa/aa
 aCSa/aa
 aCSa/aa
 aCSa/aa
3. Kết quả StripAssay chẩn đoán đột biến gen globin-a
Hình 5.4. Kết quả StripAssay (ViennaLab) xác định các đột biến gen globin-a 
Hình 5.5. Kết quả giải trình tự gen globin-b xác định đột biến Hb Tak (HBB:c.441_442insAC) [đối tượng S.H.C (v972), sinh năm 1971, phường Vĩnh Phước, thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng]
Chèn 2 nu AC vào giữa trình tự CTA ® CACTA
 Kết quả giải trình tự gen globin-b xác định đột biến HbTak 
Hình 5.6. Kết quả giải trình tự HbTak/HbE (con trai đối tượng S.H.C, sinh năm 2003)
THÔNG TIN CHO NGƯỜI THAM GIA NGHIÊN CỨU
Giới thiệu về nghiên cứu
Bệnh thalassemia là một bệnh di truyền gây thiếu máu do tan máu bẩm sinh. Theo y văn, bệnh được phát hiện ở khắp nơi trên thế giới; và tỷ lệ mắc bệnh cao ở các nước trong khu vực Đông Nam châu Á, trong đó có Việt Nam, đặc biệt cao ở các dân tộc ít người. Bệnh thể hiện ở nhiều thể lâm sàng khác nhau từ dạng hoàn toàn khỏe mạnh như người bình thường đến dạng cần được truyền máu suốt đời tạo ra gánh nặng cho gia đình và cả xã hội. Tuy nhiên, thực tế từ nhiều quốc gia trên thế giới cho thấy bệnh thalassemia có thể được dự phòng để giảm tỷ lệ mắc bệnh môt cách đáng kể nếu có chiến lược đúng đắn.  là một tỉnh có khá đông đồng bào dân tộc ít người cư trú xen kẽ với dân tộc Kinh, do đó tỉ lệ mắc bệnh có thể rất cao. 
Mục đích của nghiên cứu
Xác định tỷ lệ mang gen thalassemia, các kiểu đột biến gen α – và globin-β; khảo sát đặc điểm lâm sàng, và xét nghiệm của các thể bệnh; từ đó cung cấp thông tin về các đặc điểm của bệnh trong cộng đồng các dân tộc Khmer ở tỉnh  làm cơ sở đề xuất các biện pháp nhằm sàng lọc và dự phòng bệnh một cách hiệu quả.
Nội dung nghiên cứu
Phỏng vấn một số thông tin cá nhân: tên, tuổi, nghề nghiệp, dân tộc, tôn giáo
Thăm khám: phát hiện các biểu hiện thiếu máu tan máu như nhìn da lòng bàn tay, mắt, mặt 
Tiến hành lấy 3 mL máu ở khuỷu tay, xét nghiệm máu xác định có mang gen bệnh hay không
Các kết quả xét nghiệm bất thường sẽ được thông báo cho người tham gia và tư vấn hướng điều trị, dự phòng. Thông tin của người tham gia nghiên cứu được bảo mật hoàn toàn, và chỉ nhằm phục vụ cho mục đích nghiên cứu khoa học. Việc tham gia nghiên cứu là hoàn toàn tự nguyện, người tham gia nghiên cứu có quyền từ chối tham gia bất cứ lúc nào.
Chi phí xét nghiệm do chủ nhiệm đề tài chi trả, người tham gia nghiên cứu không phải chi trả bất cứ khoản chi phí nào.
Thông tin liên hệ 
Mọi thắc mắc liên quan đến nghiên cứu xin vui lòng liên hệ với: ThS. Lê Thị Hoàng Mỹ - Bộ môn Huyết học, Trường ĐH Y Dược Cần Thơ. Điện thoại cơ quan: 07103. 739730; điện thoại cá nhân: 0913. 848691
Xin chân thành cảm ơn ông/bà đã đồng ý/ đồng ý cho cháu tham gia vào nghiên cứu của chúng tôi.
PHIẾU XÁC NHẬN ĐỒNG Ý THAM GIA NGHIÊN CỨU
Tôi tên: 	
Năm sinh: 	
Giới: 	
	Tôi đã đọc về các thông tin của nghiên cứu, sau khi được giải thích về lơi ích và nguy cơ khi tham gia nghiên cứu, tôi đã hiểu rõ và:
¨ Đồng ý tham gia nghiên cứu
¨ Không đồng ý tham gia nghiên cứu
	, ngày tháng năm 201
	Ký tên
4,6,7,9-15
1-3,5,8,16-
8,121-142