Luận án Nghiên cứu vai trò của các yếu tố phiên mã nac đáp ứng với điều kiện hạn ở cây họ đậu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
---------- 
NGUYỄN HỮU KIÊN 
NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ 
PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN 
Ở CÂY HỌ ĐẬU 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 
HÀ NỘI – 2020 
ii 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
---------- 
NGUYỄN HỮU KIÊN 
NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ 
PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN 
Ở CÂY HỌ ĐẬU 
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 
Mã số: 9420201 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 
Người hướng dẫn khoa học: 
1. PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng 
2. TS. Trần Phan Lam Sơn 
HÀ NỘI - 2020 
i 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng 
dẫn của PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng và TS. Trần Phan Lam Sơn. Các kết quả 
trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp 
chí khoa học quốc tế và đã được sự đồng ý của tất cả các tác giả trong các bài 
báo, và chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để 
nhận học vị nào khác. Tất cả trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2020 
TÁC GIẢ 
Nguyễn Hữu Kiên 
ii 
LỜI CẢM ƠN 
Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn chương trình đào tạo hợp tác 
quốc tế IPA (International Program Associate) liên kết giữa Viện Khoa học 
Nông nghiệp Việt Nam (VAAS, Việt Nam) và Viện Nghiên cứu RIKEN Nhật 
(Bản) đã tạo mọi điều kiện và giúp đỡ trong suốt quá trình học tập, thực hiện 
và hoàn thành luận án. 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng 
(Nguyên Giám đốc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – 
Viện Di truyền Nông nghiệp) và TS. Trần Phan Lam Sơn (Trưởng Nhóm nghiên 
cứu về con đường dẫn truyền tín hiệu (nay đổi tên thành Nhóm nghiên cứu về đáp 
ứng với yếu tố bất lợi) thuộc Trung tâm Khoa học về nguồn tài nguyên bền vững, 
Viện RIKEN, Nhật Bản) đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi 
để tôi thực hiện và hoàn thành công trình nghiên cứu này. 
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các postdoc, kỹ thuật viên và nhân viên trong 
nhóm nghiên cứu của TS. Trần Phan Lam Sơn, nơi tôi thực hiện các nội dung 
của luận án đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện vể thời gian cho tôi hoàn 
thành công trình nghiên cứu này. 
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Đào tạo Sau đại học, thuộc Viện 
Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo 
điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án nghiên cứu. 
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình đặc biệt bố mẹ, anh chị và vợ luôn 
ủng hộ, động viên, khích lệ và là chỗ dựa về tinh thần cho tôi trong suốt quá 
trình học tập và hoàn thành luận án nghiên cứu. Ngoài ra, tôi cũng gửi lời cảm 
ơn tới bạn bè và đồng nghiệp đã luôn ủng hộ và có những ý kiến đóng góp quý 
báu để tôi có thể hoàn thành luận án nghiên cứu này. 
Hà Nội, ngày tháng năm 2020 
 TÁC GIẢ 
Nguyễn Hữu Kiên 
iii 
MỤC LỤC 
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i 
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii 
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... vii 
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... x 
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ xii 
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 
1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................... 1 
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án ............................................................ 2 
2.1. Mục tiêu tổng quát ............................................................................... 2 
2.2. Mục tiêu cụ thể ..................................................................................... 2 
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án ............................................ 3 
3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................. 3 
3.2. Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................. 3 
4. Những đóng góp mới của luận án ........................................................... 4 
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 6 
1.1. Hạn hán và những ảnh hưởng bất lợi của hạn hán đối với cây trồng ...... 6 
1.1.1. Những thiệt hại của ngành trồng trọt do hạn hán gây ra ............. 6 
1.1.2. Hạn hán và nguyên nhân gây ra hạn hán ở cây trồng ................ 11 
1.1.3. Ảnh hưởng của hạn đối với cây trồng .......................................... 12 
1.1.3.1. Ảnh hưởng của hạn tới sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng ...13 
1.1.3.2. Ảnh hưởng của hạn tới đặc điểm hình thái và giải phẫu ............ 14 
1.1.3.3. Ảnh hưởng của hạn tới mối quan hệ giữa cây và nước ............... 15 
1.1.3.4. Ảnh hưởng của hạn tới quá trình quang hợp .............................. 15 
1.1.3.5. Ảnh hưởng của hạn tới quá trình hô hấp ..................................... 17 
1.1.3.6. Ảnh hưởng của hạn tới sự hấp thu dinh dưỡng khoáng .............. 18 
1.1.3.7. Ảnh hưởng của hạn tới sự cân bằng hormone ............................. 18 
1.1.3.8. Ảnh hưởng của hạn tới hàm lượng protein, axit amin và khoáng chất ... 19 
iv 
1.1.3.9. Ảnh hưởng của hạn tới lipid ........................................................ 22 
1.1.3.10. Ảnh hưởng của hạn tới quá trình oxy hóa ................................. 22 
1.1.3.11. Ảnh hưởng của hạn tới các phân tử ........................................... 23 
1.2. Sự đáp ứng của cây trồng với hạn ..................................................... 24 
1.3. Vai trò của yếu tố phiên mã NAC trong quá trình đáp ứng với 
stress hạn của cây trồng ............................................................................ 27 
1.3.1. Tổng quan yếu tố phiên mã NAC ..................................................... 27 
1.3.2. Cấu trúc đặc trưng của các protein NAC ........................................ 29 
1.3.3. Chức năng của yếu tố phiên mã NAC trong quá trình đáp ứng với hạn 
ở cây trồng .................................................................................................... 29 
1.4. Vai trò của cây họ đậu ........................................................................ 35 
1.4.1. Vai trò của cây đậu tương ............................................................. 35 
1.4.2. Vai trò của cây đậu gà ................................................................... 37 
1.4.3. Ảnh hưởng của hạn tới cây đậu tương và đậu gà ........................ 39 
1.5. Cải thiện khả năng chống chịu hạn của cây họ đậu sử dụng kỹ 
thuật chuyển gen ........................................................................................ 43 
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 47 
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................. 47 
2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................. 47 
2.1.2. Các chủng khuẩn, nấm men và vector ......................................... 47 
2.1.3. Các cặp mồi được sử dụng cho PCR và qRT-PCR ...................... 47 
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................... 47 
2.2.1. Thời gian nghiên cứu .................................................................... 47 
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 48 
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 48 
2.3.1. Trồng và xử lý cây đậu tương ................................................... 48 
2.3.2. Tách chiết, tinh sạch RNA và tổng hợp cDNA cho tách dòng gen 
GmNAC085 ................................................................................................ 48 
2.3.3. Thiết kế cấu trúc vector và phân tích khả năng hoạt động phiên mã 
của GmNAC085 trong nấm men .............................................................. 49 
v 
2.3.4. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện gen GmNAC085 trong cây mô 
hình Arabidopsis ...................................................................................... 50 
2.3.5. Phương pháp biến nạp và sàng lọc cây Arabidopsis chuyển gen 
35S:GmNAC085 ....................................................................................... 52 
2.3.6. Phương pháp phân tích cây chuyển gen 35S:GmNAC085 bằng kỹ 
thuật lai southern blot .............................................................................. 53 
2.3.7. Đánh giá khả năng sinh trưởng của các cây Arabidopsis chuyển 
gen 35S:GmNAC085 trong điều kiện thường ........................................ 53 
2.3.8. Phương pháp đo hàm lượng diệp lục ở lá .................................... 54 
2.3.9. Đánh giá khả năng chịu hạn của cây Arabidopsis chuyển gen 
35S:GmNAC085 trong điều kiện xử lý hạn ............................................ 54 
2.3.9.1. Phương pháp đánh giá hạn trên cùng khay ................................. 55 
2.3.9.2. Phương pháp cân trọng lượng cốc .............................................. 55 
2.3.10. Phương pháp đo nhiệt độ bề mặt lá của cây WT và cây chuyển 
gen 35S:GmNAC085 trong điều kiện xử lý hạn ..................................... 56 
2.3.11. Đo tỷ lệ thành phần nước, mức độ rò rỉ ion và độ ẩm đất ......... 56 
2.3.12. Xác định hàm lượng malondiadehyde và khả năng hoạt động 
của các enzyme chống oxy hóa ............................................................... 57 
2.3.13. Phương pháp trồng, xử lý và thu mẫu của cây đậu gà .............. 57 
2.3.14. Tách chiết RNA, xử lý DNAseI, và tổng hợp cDNA cho phân 
tích qRT-PCR ........................................................................................... 58 
2.3.15. Phân tích sự biểu hiện của các gen bằng kỹ thuật qRT-PCR ... 58 
2.3.16. Tiêu chuẩn lựa chọn gen CaNAC đáp ứng hạn tiềm năng ....... 59 
2.3.17. Phân tích ý nghĩa thống kê .......................................................... 60 
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 61 
3.1. Nghiên cứu chức năng của gen GmNAC085 trong quá trình đáp 
ứng với điều kiện hạn ở cây mô hình Arabidopsis ................................... 61 
3.1.1. Kết quả thiết kế cấu trúc vector và phân tích sự hoạt động phiên 
mã của GmNAC085 trong nấm men ....................................................... 61 
3.1.2. Kết quả phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen GmNAC085 
trong cây mô hình Arabidopsis ............................................................... 63 
vi 
3.1.3. Kết quả sàng lọc và lựa chọn các dòng cây Arabidopsis chuyển 
gen 35S:GmNAC085 ................................................................................ 66 
3.1.4. Kết quả đánh giá kiểu hình của cây Arabidopsis chuyển gen 
35S:GmNAC085 OE1 và OE2 ở điều kiện thường ................................ 68 
3.1.5. Kết quả đánh giá khả năng kháng hạn của cây Arabidopsis 
chuyển gen 35S:GmNAC085 ................................................................... 70 
3.1.6. Kết quả đánh giá mức độ phá hủy tế bào và tốc độ thoát hơi nước 
của các cây chuyển gen 35S:GmNAC085 ở điều kiện xử lý hạn .......... 72 
3.1.7. Sự biểu hiện của GmNAC085 tăng cường bảo vệ cây Arabidopsis 
chuyển gen chống lại phản ứng oxy hóa do stress hạn gây ra .............. 74 
3.1.8. Sự biểu hiện của GmNAC085 làm tăng mức biểu hiện của các 
gen chỉ thị trong cây Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 ở điều 
kiện stress hạn .......................................................................................... 77 
3.2. Đánh giá mức độ biểu hiện của các gen CaNAC trong cây đậu gà ở 
điều kiện xử lý hạn và ABA....................................................................... 84 
3.2.1. Kết quả so sánh tỷ lệ thành phần nước giữa hai giống đậu gà 
Hashem và ILC482 ở điều kiện xử lý mất nước ..................................... 84 
3.2.2. Đặc trưng biểu hiện của các gen CaNAC ở lá và rễ của giống Hashem và 
ILC482 trong điều kiện xử lý hạn ................................................................ 85 
3.2.3. Đặc trưng biểu hiện của các gen CaNAC ở lá và rễ của giống 
Hashem và ILC482 trong điều kiện xử lý ABA ...................................... 94 
3.2.4. Sự biểu hiện khác nhau của các gen CaNAC ở trong lá của 2 
giống ILC482 và Hashem ...................................................................... 102 
3.2.5. Sự biểu hiện khác nhau của các gen CaNAC trong rễ của 2 giống 
ILC482 và Hashem ................................................................................ 105 
3.2.6. Lựa chọn các gen CaNAC tiềm năng cho nghiên cứu chức năng 
sâu hơn ................................................................................................... 107 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................... 113 
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .. 115 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 116 
PHỤ LỤC ...................................................................................................... 134 
vii 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 
Chữ viết tắt Thuật ngữ tiếng anh Thuật ngữ tiếng việt 
ABA Abscisic acid Axit abscisic 
Ade Adenine A-đê-nin 
ABRC3 ABA response complex 3 Phức hợp đáp ứng ABA 3 
AD Activation domain Vùng trình tự hoạt hóa 
AP2/ERF APETALA2/Ethylene response 
element binding factors 
Các yếu tố liên kết đáp ứng 
với ethylene 
APX Ascorbate peroxidase Ascorbate peroxidase 
AREB/ABF Abscisic acid-responsive 
element binding 
Liên kết yếu tố đáp ứng ABA 
ATP Adenosine triphosphate Adenosine triphosphat 
bZIP bZIP transcription factor Yếu tố phiên mã bZIP 
CAT Catalase Catalaza 
CCA1 Circadian clock associated 1 Liên kết nhịp sinh học 1 
cDNA complementary DNA ADN bổ sung 
CO2 Carbon dioxide cacbon điôxít 
CSD1 Copper/Zinc superoxide 
dismutase 1 
Copper/Zinc superoxide 
dismutase 1 
D Drought Xử lý hạn 
DAD Days after drought Ngày sau xử lý hạn 
DNA Deoxinucleic acid Axit deoxinucleic 
DREB Dehydration responsive 
element-binding protein 
Protein liên kết với yếu tố đáp 
ứng mất nước 
ERD1 Early responsive to 
dehydration stress 1 
Đáp ứng sớm với bất lợi mất 
nước 1 
GM Germination medium Môi trường nảy mầm 
viii 
GR Glutathione reductase Glutathione reductase 
His Histidine Histidin 
IAA Indole-3-acetic acid Axit indole-3-acetic 
LB Lysogeny broth Môi  ... tomato”, Plant 
biotechnology journal 16, pp. 354-366. 
116. Thu N.B.A., Nguyen Q., Hoang X., Thao N., Tran L.S. (2014a), 
“Evaluation of drought tolerance of the Vietnamese soybean cultivars 
130 
provides potential resources for soybean production and genetic 
engineering”, Journal of Biomedicine and Biotechnology, pp. 809736. 
117. Thu N.B.A., Hoang X.L., Doan H., Nguyen T.H., Bui D., Thao N.P., Tran 
L.S. (2014b), “Differential expression analysis of a subset of GmNAC genes 
in shoots of two contrasting drought-responsive soybean cultivars DT51 
and MTD720 under normal and drought conditions”, Molecular biology 
reports 41, pp. 5563-5569. 
118. Thu N.B.A., Hoang X.L.T., Nguyen T.D.H., Thao N.P., Tran L.S.P. 
(2014c), “Differential expression of two-component system-related 
drought-responsive genes in two contrasting drought-tolerant soybean 
cultivars DT51 and MTD720 under well-watered and drought conditions”, 
Plant Molecular Biology Reporter 33, pp. 1599-1610. 
119. Tizaoui K., Kchouk M.E. (2012), “Genetic approaches for studying transgene 
inheritance and genetic recombination in three successive generations of 
transformed tobacco”, Genetics and molecular biology 35, pp. 640-649. 
120. Tran L.S., Mochida K. (2010), “Functional genomics of soybean for 
improvement of productivity in adverse conditions”, Functional & 
integrative genomics 10, pp. 447-462. 
121. Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Simpson S.D., Fujita Y., Maruyama 
K., Fujita M., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2004), 
“Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC 
transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early 
responsive to dehydration stress 1 promoter”, Plant Cell 16, pp. 2481-2498. 
122. Tran L.S., Nishiyama R., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (2010), 
“Potential utilization of NAC transcription factors to enhance abiotic stress 
tolerance in plants by biotechnological approach”, GM crops 1, pp. 32-39. 
123. Voitsik A.M., Muench S., Deising H.B., Voll L.M. (2013), “Two recently 
duplicated maize NAC transcription factor paralogs are induced in response to 
131 
Colletotrichum graminicola infection”, BMC Plant Biol 13, pp. 85. 
124. Wang J., Zhang L., Cao Y., Qi C., Li S., Liu L., Wang G., Mao A., Ren S., 
Guo Y.D. (2018), “CsATAF1 positively regulates drought stress tolerance 
by ABA-dependent pathway and promoting ROS scavenging in cucumber” 
Plant and Cell Physiology 59, pp. 930-945. 
125. Wang H., Wang H., Shao H., Tang X. (2016a), “Recent advances in 
utilizing transcription factors to improve plant abiotic stress tolerance by 
transgenic technology”, Frontiers in plant science 7, pp. 67. 
126. Wang W., Wang C., Pan D., Zhang Y., Luo B., Ji J. (2018), “Effects of 
drought stress on photosynthesis and chlorophyll fluorescence images of 
soybean (Glycine max L.) seedlings”, Int J Agric Biol Eng 11, pp. 196–201. 
127. Wu H., Fu B., Sun P., Xiao C., Liu J.H. (2016), “A NAC transcription 
factor represses putrescine biosynthesis and affects drought tolerance”, 
Plant physiology 172, pp. 1532-1547. 
128. Xing Y., Jia W., Zhang J. (2007), “AtMEK1 mediates stress-induced gene 
expression of CAT1 catalase by triggering H2O2 production in Arabidopsis”, 
Journal of experimental botany 58, pp. 2969-2981. 
129. Xue G.P., Way H.M., Richardson T., Drenth J., Joyce P.A., McIntyre C.L. 
(2011), “Overexpression of TaNAC69 leads to enhanced transcript levels of 
stress up-regulated genes and dehydration tolerance in bread wheat”, 
Molecular plant 4, pp. 697-712. 
130. Yang M., Zhu L., Pan C., Xu L., Liu Y., Ke W., Yang P. (2015a), 
“Transcriptomic analysis of the regulation of rhizome formation in temperate and 
tropical lotus (Nelumbo nucifera)”, Scientific reports 5, pp. 13059. 
131. Yang X., Wang X., Ji L., Yi Z., Fu C., Ran J., Hu R., Zhou G. (2015b), 
“Overexpression of a Miscanthus lutarioriparius NAC gene MlNAC5 
confers enhanced drought and cold tolerance in Arabidopsis”, Plant cell 
reports 34, pp. 943-958. 
132 
132. Yang X., Kim M.Y., Ha J., Lee S.H. (2019), “Overexpression of the 
Soybean NAC Gene GmNAC109 Increases Lateral Root Formation and 
Abiotic Stress Tolerance in Transgenic Arabidopsis Plants”, Frontiers in 
Plant Science 10, pp. 1036. 
133. Yu X., Peng H., Liu Y., Zhang Y., Shu Y., Chen Q., Shi S., Ma L., Ma H., 
Zhang H. (2014), “CarNAC2, a novel NAC transcription factor in chickpea 
(Cicer arietinum L.), is associated with drought-response and various 
developmental processes in transgenic Arabidopsis”, Journal of Plant 
Biology 57, pp. 55-66. 
134. Yu X., Liu Y., Wang S., Tao Y., Wang Z., Shu Y., Peng H., Mijiti A., Wang 
Z., Zhang H., Ma H. (2016a), “CarNAC4, a NAC-type chickpea 
transcription factor conferring enhanced drought and salt stress tolerances 
in Arabidopsis”, Plant cell reports 35, pp. 613-627. 
135. Yu X., Liu Y., Wang S., Tao Y., Wang Z., Mijiti A., Wang Z., Zhang H., 
Ma H. (2016b), “A chickpea stress-responsive NAC transcription factor, 
CarNAC5, confers enhanced tolerance to drought stress in transgenic 
Arabidopsis”, Plant Growth Regulation 79, pp. 187-197. 
136. Zare M., Azizi M.H., Bazrafshan F. (2011), “Effect of drought stress on 
some agronomic traits in ten barley ( Hordeum vulgare ) cultivars”, Tech J 
Eng Appl Sci 1, pp. 57–62. 
137. Zhang L., Zhang L., Xia C., Zhao G., Jia J., Kong X. (2015), “The novel wheat 
transcription factor TaNAC47 enhances multiple abiotic stress tolerances in 
transgenic plants’’, Frontiers in plant science 6, pp. 1174. 
138. Zhao X., Yang X., Pei S., He G., Wang X., Tang Q., Jia C., Lu Y., Hu R., Zhou G. 
(2016), “The Miscanthus NAC transcription factor MlNAC9 enhances abiotic stress 
tolerance in transgenic Arabidopsis”, Gene 586, pp. 158-169. 
139. Zhu M., Chen G., Zhang J., Zhang Y., Xie Q., Zhao Z., Pan Y., Hu Z. 
(2014), “The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor 
133 
SlNAC4 regulates salt and drought tolerance and stress-related genes in 
tomato (Solanum lycopersicum)”, Plant Cell Reports 33, pp. 1851-1863. 
134 
PHỤ LỤC 
Phụ lục bảng 1. Các cặp mồi sử dụng cho PCR và qRT-PCR liên quan tới 
nội dung nghiên cứu chức năng gen GmNAC085 
Mục đích Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) 
Kích 
thước 
(bp) 
Phân tích phiên 
mã ở nấm men 
GmNAC085F-NdeI GATCATATGAACTCAAGTGCGCAAAAGGTTGA 549 
GmNAC085R-PstI ATACTGCAGTCAGTCCCTAAACCCGAACT 
Cặp mồi sử dụng 
giải trình tự 
trong vector tách 
dòng pKS 
T3 primer TTAATTGGGAGTGATTTCCC 
T7 primer GTAATACGACTCACTATAGGGCG 
Tách dòng gen 
GmNAC085 
GmNAC085F-NotI GTCGACATGGGAGTTCCAGAGAGAGAC 1035 
GmNAC085R-XhoI CCCGGGTCAGTCCCTAAACCCGAACTC 
35Spro-F CCCACTATCCTTCGCAA 
qRT-PCR 
Gen tham chiếu 
ở Arabidopsis 
ACT2-F2 GATCTCCAAGGCCGAGTATGAT 106 
ACT2-R2 CCCATTCATAAAACCCCAGC 
Các gen đích 
GmNAC085-F GCAATGGGTCATCACCTTCT 214 
GmNAC085-R GACCCAAATTCGGAAACTGA 
sAPX-F CCTCCGGAGGGTATCGTTATCTA 162 
sAPX-R ACAGCCAGAAACATTGTCCAAAAGG 
CAT1-F TGGGATTCAGACAGGCAAGAACG 162 
CAT1-R GTTTGGCCTCACGTTAAGACGAGT 
CSD1-F TGAACTCAGCCTGGCTACTGG 164 
CSD1-R AGCCACACACCAGAAGATACACAC 
NCED3-F CGGTGGTTTACGACAAGAACAA 103 
NCED3-R CAGAAGCAATCTGGAGCATCAA 
LEA14-F GATTTCTTCTGATCGACAAAACCTA 92 
LEA14-R AGCAAACCCAACTTATTACATTACG 
RD20-F TTAGCTCCGGTCACCAGTCA 69 
RD20-R CATGTATGGTTTTGGTAATGTTTCC 
RD29B-F GCAAGCAGAAGAACCAATCA 71 
RD29B-R CTTTGGATGCTCCCTTCTCA 
AtNAC019-F CGCTAACTGCGGTGACTCTA 250 
AtNAC019-R CAATCCTCGCAGCTTCATCT 
Các cặp mồi sử dụng cho PCR và qRT-PCR được thiết kế dựa trên phần mềm Primer3 
( 
135 
Phụ lục bảng 2. Các cặp mồi của các gen CaNAC sử dụng cho qRT-PCR 
ở cây đậu gà 
STT Gen Mồi xuôi (5’ – 3’) Mồi ngược (5’ – 3’) 
Kích 
thước 
(bp) 
1 CaNAC02 CCATGGGAGCTACCAAAGAA TTTCGATCTCTCGGGCTAAA 71 
2 CaNAC04 AACAAGACCACCTGACCCTG AATGCGTCGATTTCTCAACC 89 
3 CaNAC05 CTAAGGCAACGTTCGGAGAG TTTGGCCTAGCACCATTAGG 79 
4 CaNAC06 GTCCCTTCTGTGTCCACGAT GCTCCACCACTCTGAACCTC 86 
5 CaNAC16 CACCAAAGGGCCTCAAGACAG GCCTCATGGATCCAATTTGCCTAT 93 
6 CaNAC19 AGAGGTTTGGTTTGTTGGTG CCAAACACATGGTGAGGAAA 86 
7 CaNAC21 CTTACCCTTTACCCGCTTCC TCTTCTCCCAAATCACCTGG 88 
8 CaNAC24 TGCCACCAGGTTTTAGGTTC AATGATGGAAACAGGCAAGG 98 
9 CaNAC27 GCTTTGTTTGGGGATGAAGA ACCTGCACCAGCTGCTCTAT 93 
10 CaNAC40 ACGATCCTTGGGATCTTCCT ATATTTCCTGTCTCGTGGCG 80 
11 CaNAC41 CCTGAAGAGGCAATTGACAGA TCACCACTGCAGTCAAAGGT 77 
12 CaNAC43 CACTGGTGTTCTACGCTGGA GCCGGCTGATCTATCAACAT 95 
13 CaNAC44 CCCACATGGTACTCGTACTGG TTGCAAGCCAGAAGAAGGAT 85 
14 CaNAC46 TATTGGAAGGCAACAGGGTC TTTCTTAGGCCAACAATGCC 71 
15 CaNAC47 TTTCACACGGATTCAAGCTG ACAAATTCGTTCCACTTGGG 95 
16 CaNAC50 CCCACCGATGAAGAACTTGT TACTGGAAGGGGTGCAGAAG 66 
17 CaNAC52 GCTACATCAAAGCCATGCCC GGCCTCACTCCATTTGGGTA 143 
18 CaNAC57 GTGGTATGCAGGACCAAGCA GGTGGTGGACGATGGTGATT 193 
19 CaNAC67 ACAGGAGGAGAAGCTCGGAT TCCTCATCCCGCTTTGAACC 233 
20 IF4a TGGACCAGAACACTAGGGACATT AAACACGGGAAGACCCAGAA 60 
Các cặp mồi sử dụng cho qRT-PCR được lấy từ công trình nghiên cứu trước đó của [43]. 
136 
Phụ lục bảng 3. Giá trị Ct của gen quản gia ACT2 trong phân tích mức độ 
biểu hiện của các gen chỉ thị đáp ứng với hạn trong cây Arabidopsis chuyển 
gen 35S:GmNAC085 
Xử lý 
STT 
mẫu 
Giá trị Ct của gen quản gia ACT2 qua các lần lặp lại 
Lần 1 Lần 1 Lần 3 
WT-tưới nước 
đầy đủ 
1 18.17 19.63 18.73 
2 17.71 19.33 18.86 
3 17.98 19.52 18.68 
OE1-tưới nước 
đầy đủ 
4 17.55 19.72 18.54 
5 17.9 19.75 18.83 
6 18.14 19.72 18.93 
OE2-tưới nước 
đầy đủ 
7 18.42 19.46 19.16 
8 18.24 19.46 19.37 
9 18.68 19.85 18.72 
WT-xử lý hạn 
10 18.89 20.19 19.94 
11 18.65 20.25 19.91 
12 18.93 20.62 19.9 
OE1-xử lý hạn 
13 18.72 20.3 20.3 
14 18.86 20.37 20.75 
15 18.85 20.3 20.61 
OE2-xử lý hạn 
16 19.59 20.59 20.38 
17 19.43 20.45 20.54 
18 19.64 20.42 20.52 
137 
Phụ lục bảng 4. Giá trị Ct của gen quản gia IF4a trong phân tích mức độ biểu 
hiện của các gen CaNAC ở cây đậu gà 
Giống 
đậu gà 
Điều kiện xử lý 
Loại mẫu STT 
Giá trị Ct của gen quản 
gia IF4a 
Lần 1 Lần 1 Lần 3 
Hashem 
Đối chứng ngâm nước 
(2 giờ) 
Lá 1 21.62 21.16 20.26 
2 21.66 21.62 20.72 
3 21.71 21.56 20.66 
Rễ 4 21.19 21.09 20.2 
5 21.24 21.29 20.39 
6 21.29 21.36 20.48 
Xử lý ABA 
(2 giờ) 
Lá 7 22.27 21.92 21 
8 22.05 21.48 20.59 
9 22.48 22.17 21.27 
Rễ 10 21.05 21.08 20.16 
11 21.06 21.14 20.22 
12 21.13 21.26 20.31 
Xử lý mất nước 
(2 giờ) 
Lá 13 21.85 21.97 21.1 
14 21.68 21.82 20.94 
15 21.57 21.8 20.9 
Rễ 16 21.65 21.56 20.65 
17 21.22 21.72 20.85 
18 20.95 21.11 20.22 
Đối chứng ngâm nước 
(5 giờ) 
Lá 19 21.64 21.7 20.82 
20 21.78 21.88 20.98 
21 21.75 21.62 20.7 
Rễ 22 20.87 21.25 20.34 
23 20.82 21.21 20.31 
24 20.82 21.29 20.39 
Xử lý ABA 
(5 giờ) 
Lá 25 22.22 22.38 21.5 
26 22.08 22.31 21.42 
27 22.09 22.35 21.45 
Rễ 28 21.46 21.95 21.06 
29 21.28 22.07 21.16 
30 21.23 21.78 20.85 
Xử lý mất nước 
(5 giờ) 
Lá 31 21.69 22.69 21.82 
32 21.73 22.17 21.28 
33 21.89 22.49 21.55 
Rễ 34 21.53 21.64 20.74 
138 
35 21.56 22.51 21.59 
36 21.45 21.84 20.9 
ILC482 
Đối chứng ngâm nước 
(2 giờ) 
Lá 37 21.97 20.12 21.51 
38 21.8 20.28 21.3 
39 21.93 20.07 21.47 
Rễ 40 20.97 19.74 20.46 
41 21.46 20.29 20.95 
42 21.09 19.9 20.6 
Xử lý ABA 
(2 giờ) 
Lá 43 22.16 21.26 21.68 
44 22.15 21.19 21.63 
45 22.31 31.69 21.81 
Rễ 46 21.36 28.03 20.87 
47 20.93 19.94 20.44 
48 21.28 21.88 20.8 
Xử lý mất nước 
(2 giờ) 
Lá 49 21.7 30.55 21.22 
50 21.92 20.78 21.43 
51 22.05 27.57 21.58 
Rễ 52 21.59 20.32 21.09 
53 21.36 26.29 20.86 
54 21.33 26.79 20.82 
Đối chứng ngâm nước 
(5 giờ) 
Lá 55 21.7 20.32 21.2 
56 21.7 26.74 21.22 
57 21.79 20.8 21.32 
Rễ 58 21.69 20.89 21.19 
59 21.34 21.2 20.82 
60 21.46 21.45 20.92 
Xử lý ABA 
(5 giờ) 
Lá 61 22.3 21.75 21.8 
62 22.04 22.76 21.56 
63 22.33 22.71 21.85 
Rễ 64 22.55 22.87 22.04 
65 22.2 23.21 21.68 
66 22.02 23.03 21.55 
Xử lý mất nước 
(5 giờ) 
Lá 67 21.5 22.25 20.99 
68 21.89 21.79 21.43 
69 22.12 22.13 21.59 
Rễ 70 21.72 21.85 21.2 
71 21.36 21.59 20.84 
72 21.35 21.28 20.82 
139 
Phụ lục bảng 5. Trình tự DNA và amino axit mã hóa cho GmNAC085 
Vùng Trình tự DNA (5’ – 3’) 
Trình tự amino 
axit 
Vùng trình 
tự mã hóa 
đầy đủ gen 
GmNAC085 
ATGGGAGTTCCAGAGAGAGACCCTCTTGCACAATTGAGC
TTGCCTCCTGGATTTAGATTTTATCCCACTGATGAGGAGC
TTTTGGTTCAGTACCTTTGCCGCAAGGTTGCTGGCCATC
ATTTCTCTCTTCCAATCATTGCTGAAGTTGATTTGTACAA
GTTTGATCCATGGGTTCTTCCAGGTAAGGCAGCGTTTGG
AGAGAAGGAGTGGTACTTCTTCAGTCCAAGAGACAGGA
AGTACCCGAATGGTTCACGACCAAACAGAGTTGCGGGT
TCTGGGTATTGGAAAGCCACTGGAACTGACAAAATCATC
ACCACTGAAGGTAGAAAAGTTGGCATAAAAAAAGCACT
TGTTTTCTACGTTGGCAAAGCACCCAAAGGCTCCAAAAC
CAATTGGATCATGCACGAGTATCGCCTTCTCGACTCTTCC
CGCAAACACAACCTCGGAACCGCAAAGCTTGATGATTG
GGTTCTGTGTCGTATCTATAAGAAGAACTCAAGTGCGCA
AAAGGTTGAGGCAAATCTTTTGGCTATGGAATGTAGCAA
TGGGTCATCACCTTCTTCATCGTCCCACGTGGACGACAT
GCTGGAATCGTTGCCGGAGATCGATGATCGGTGCTTCAC
CCTGCCGCGAGTGAACTCAGTCAGAACAATGCAGCAGC
AGGACGAGAAATTCGGATTTCAGAACATGGGATCCGGGT
TTTTCACCGATTGGGTCAACCCGACGGATCTTGATTCAGT
TTCCGAATTTGGGTCGGGTTGCCAAACCCAAGGGATGGT
GAATTATGATTGTAATGACTTATTTGTCCCTTCTGTGCCGC
CCTTCGGCCACAGCCATGTAAACTACATGGTGGGGGCAC
CACCGTCCGAGGAGGAGGTTCAAAGCGGTGTGAGGACT
CAACAGGCCGATGGGGCCGCATGTTTTCAGCAGAACCC
AAATGCCCGATTGTTACCGGGCTCGGGCGACCCATTTGG
GTTTGGGTTCATCATGGGTCAGCAAGTTGAGTTCGGGTT
TAGGGACTGA 
MGVPERDPLAQLS
LPPGFRFYPTDEEL
LVQYLCRKVAGHH
FSLPIIAEVDLYKF
DPWVLPGKAAFG
EKEWYFFSPRDRK
YPNGSRPNRVAGS
GYWKATGTDKIIT
TEGRKVGIKKALV
FYVGKAPKGSKTN
WIMHEYRLLDSSR
KHNLGTAKLDDW
VLCRIYKKNSSAQ
KVEANLLAMECS
NGSSPSSSSHVDD
MLESLPEIDDRCFT
LPRVNSVRTMQQQ
DEKFGFQNMGSGF
FTDWVNPTDLDSV
SEFGSGCQTQGMV
NYDCNDLFVPSVP
PFGHSHVNYMVG
APPSEEEVQSGVR
TQQADGAACFQQ
NPNARLLPGSGDP
FGFGFIMGQQVEF
GFRD* 
Vùng TRR ở 
đầu C- của 
GmNAC085 
AACTCAAGTGCGCAAAAGGTTGAGGCAAATCTTTTGGCT
ATGGAATGTAGCAATGGGTCATCACCTTCTTCATCGTCCC
ACGTGGACGACATGCTGGAATCGTTGCCGGAGATCGATG
ATCGGTGCTTCACCCTGCCGCGAGTGAACTCAGTCAGAA
CAATGCAGCAGCAGGACGAGAAATTCGGATTTCAGAAC
ATGGGATCCGGGTTTTTCACCGATTGGGTCAACCCGACG
GATCTTGATTCAGTTTCCGAATTTGGGTCGGGTTGCCAA
ACCCAAGGGATGGTGAATTATGATTGTAATGACTTATTTG
TCCCTTCTGTGCCGCCCTTCGGCCACAGCCATGTAAACT
ACATGGTGGGGGCACCACCGTCCGAGGAGGAGGTTCAA
AGCGGTGTGAGGACTCAACAGGCCGATGGGGCCGCATG
TTTTCAGCAGAACCCAAATGCCCGATTGTTACCGGGCTC
GGGCGACCCATTTGGGTTTGGGTTCATCATGGGTCAGCA
AGTTGAGTTCGGGTTTAGGGACTGA 
NSSAQKVEANLLA
MECSNGSSPSSSSH
VDDMLESLPEIDD
RCFTLPRVNSVRT
MQQQDEKFGFQN
MGSGFFTDWVNP
TDLDSVSEFGSGC
QTQGMVNYDCND
LFVPSVPPFGHSHV
NYMVGAPPSEEEV
QSGVRTQQADGA
ACFQQNPNARLLP
GSGDPFGFGFIMG
QQVEFGFRD* 
140 
Phụ lục hình 1. Cấu trúc vector tách dòng pKS 
141 
Phụ lục hình 2. Cấu trúc vector pGBKT7 sử dụng cho phân tích khả năng 
hoạt động phiên mã của GmNAC085 trong nấm men 
142 
Phụ lục hình 3. Cấu trúc vector biểu hiện pGKX được xây dựng dựa trên 
nền vector pGreenII 
143 
Phụ lục hình 4. Kết quả PCR kiểm tra sản phẩm gắn đoạn gen GmNAC085 
vào vector biểu hiện pGKX 
Chú thích: M, thang chuẩn 1 kb ladder; 1-6, các khuẩn lạc; (-), đối chứng âm