Luận án Tạo dòng bông (gossypium hirsutum l.) chống chịu thuốc trừ cỏ glufosinate và glyphosate bằng kỹ thuật chuyển gen qua trung gian agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH 
NGUYỄN THỊ NHÃ 
TẠO DÒNG BÔNG (Gossypium hirsutum L.) CHỐNG CHỊU 
THUỐC TRỪ CỎ GLUFOSINATE VÀ GLYPHOSATE BẰNG 
KỸ THUẬT CHUYỂN GEN QUA TRUNG GIAN 
Agrobacterium tumefaciens 
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 
Mã số: 9.42.02.01 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
TP. Hồ Chí Minh – Năm 2021 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH 
NGUYỄN THỊ NHÃ 
TẠO DÒNG BÔNG (Gossypium hirsutum L.) CHỐNG CHỊU 
THUỐC TRỪ CỎ GLUFOSINATE VÀ GLYPHOSATE BẰNG 
KỸ THUẬT CHUYỂN GEN QUA TRUNG GIAN 
Agrobacterium tumefaciens 
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 
Mã số: 9.42.02.01 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. PHAN THANH KIẾM 
 TS. BÙI MINH TRÍ 
TP. Hồ Chí Minh – Năm 2021
 i 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trong luận 
án hoàn toàn trung thực và là một phần trong đề tài “Nghiên cứu tạo giống bông kháng 
sâu và chịu thuốc trừ cỏ bằng kỹ thuật chuyển gen” mã số KC.06.11/11-15 thuộc 
Chương trình“Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ phục vụ sản xuất các sản 
phẩm chủ lực” do TS. Trần Thanh Hùng và TS. Trịnh Minh Hợp làm chủ nhiệm. 
Những số liệu trong luận án được phép công bố với sự đồng ý của Chủ nhiệm đề tài và 
chưa từng được sử dụng để bảo vệ học vị nào. 
Tác giả của luận án 
 Nguyễn Thị Nhã 
 ii 
LỜI CẢM ƠN 
Trong suốt thời gian thực hiện luận án, tôi luôn nhận được sự hướng dẫn, giúp 
đỡ tận tình của tập thể Quý thầy cô, các cơ quan và cá nhân. Nhân dịp này tôi xin 
được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: 
PGS. TS. Phan Thanh Kiếm và TS. Bùi Minh Trí là những người thầy hướng 
dẫn khoa học đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi thực hiện luận án; 
Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Phòng Đào tạo 
Sau Đại học, Bộ môn Công nghệ sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí 
Minh đã tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án; 
Tập thể Quý thầy cô giáo Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông 
Lâm TP. Hồ Chí Minh đã hướng dẫn và giúp tôi thời gian thực hiện luận án tại 
Trường; 
Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố, Chủ nhiệm 
đề tài “Nghiên cứu tạo giống bông kháng sâu và chịu thuốc trừ cỏ bằng kỹ thuật 
chuyển gen” mã số KC.06.11/11-15 đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất để thực hiện 
các nội dung nghiên cứu, Ban Giám hiệu Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành đã tạo 
điều kiện về thời gian để tôi hoàn thành các yêu cầu của Cơ sở đào tạo; 
Tất cả bạn bè và đồng nghiệp những người đã dành cho tôi sự giúp đỡ chân 
thành trong quá trình làm luận án; 
Chồng, con cùng những người thân trong gia đình đã luôn động viên, ủng hộ và 
là điểm tựa tinh thần to lớn cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. 
Nghiên cứu sinh 
 Nguyễn Thị Nhã 
 iii 
TÓM TẮT 
Các thí nghiệm của Luận án “Tạo dòng bông (Gossypium hirsutum L.) chống 
chịu thuốc trừ cỏ Glufosinate và Glyphosate bằng kỹ thuật chuyển gen qua trung gian 
Agrobacterium tumefaciens.” được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển 
Nông nghiệp Nha Hố-xã Nhơn Sơn-huyện Ninh Sơn-tỉnh Ninh Thuận, trên giống bông 
Coker310 và dòng Coker310FR; hai cấu trúc gen P35S-EPSPS-TNOS và PNOS-bar-
TNOS; hai vector chuyển gen pCB301:nptII và pCAMBIA1300:hpt; và vi khuẩn A. 
tumefaciens chủng C58/PGV2260. Thời gian thực hiện từ năm 2013 đến năm 2020. 
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là ứng dụng được phương pháp chuyển gen qua trung 
gian A.tumefaciens để chuyển gen EPSPS và bar vào cây bông và tạo được dòng bông 
chuyển gen chống chịu cao với thuốc trừ cỏ glyphosate/glufosinate. Kết quả cho thấy: 
Dòng Coker310FR chọn lọc qua tái sinh liên tục ba thế hệ của giống bông 
Coker310 có khả năng tái sinh rất cao, thể hiện qua tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi là 
95,6% và tỷ lệ cây tái sinh không dị dạng trên môi trường GR5 là 36,7%. 
Bốn vector chuyển gen, gồm pCAMBIA1300:hpt-bar, pCAMBIA1300:hpt-
EPSPS, pCB301:nptII-bar và pCB301:nptII-EPSPS được tái cấu trúc bằng cách chèn 
vùng P35S-EPSPS-TNOS và PNOS-bar-TNOS vào vector biểu hiện thực vật 
pCB301:nptII và pCAMBIA1300:hpt. Kiểm tra hiện diện của 04 gen đích và gen độc 
lực virC khẳng định 04 vector chuyển gen được biến nạp thành công vào vi khuẩn A. 
tumefaciens chủng C58/PGV2260. 
Nhiễm mẫu thân mầm giống bông Coker310 với A. tumefaciens mang gen 
EPSPS và bar ở mật độ, thời gian lây nhiễm, thời gian và nhiệt độ đồng nuôi khác 
nhau có ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ cảm ứng, sống sót và phát sinh phôi của mô sẹo 
chuyển gen. Kết quả tốt nhất đạt được khi lây nhiễm vi khuẩn với mật độ OD600 0,75 
trong 10 phút, đồng nuôi cấy 64 giờ ở nhiệt độ 22 oC. 
Tương tác giữa loại mẫu/giống với tác nhân chọn lọc ảnh hưởng đến tỷ lệ tái 
sinh và tỷ lệ cây mang gen chuyển. Hiệu quả chuyển vector pCAMBIA1300:bar vào 
mẫu lá mầm Coker310FR đạt cao nhất với 2,8% mô sẹo phát sinh phôi, 15,8 cây/mẫu 
được tái sinh, 76,0% số cây mang gen chuyển và 64,7% trong số đó hữu thụ. Hiệu 
 iv 
quả chuyển vector pCB301:bar vào mẫu thân mầm Coker310FR đạt cao nhất với 
2,1% mô sẹo phát sinh phôi, tái sinh được 20,6 cây/mẫu, 30,2% số cây mang gen 
chuyển và 82,5% trong số cây đó hữu thụ. 
Chọn được 5 dòng T2 chuyển gen bar B1, B9, B18 và BF8, BF17 mang 1 bản sao, có 
hoạt động phiên mã của gen chuyển, cây sinh trưởng đồng đều và có mức độ chống chịu 
thuốc trừ cỏ Glufosinate cao (0,6 kg ai./ha). 
Chọn được 5 dòng T2 chuyển gen EPSPS có 1 bản sao, có hoạt động phiên mã 
của gen chuyển và có mức độ chống chịu thuốc trừ cỏ Glyphosate là E7, E8, E19, 
EF14 và EF25, không có dòng chống chịu cao. 
Hai dòng bông chuyển gen T2 là B9 và BF17 mang 01 bản sao gen, di truyền 
gen chuyển theo quy luật Mendel, chống chịu cao với thuốc trừ cỏ Glufosinate ở nồng 
độ 0,6 kg ai./ha, không sai khác về đặc điểm thực vật học và khả năng chống chịu 
bệnh hại so với giống bông nền Coker310 không chuyển gen. 
 v 
SUMMARY 
The experiments of the thesis “Transformation of cotton plants (Gossypium 
hirsutum L.) for resisting to Glufosinate and Glyphosate herbicide using A. 
tumefaciens-mediated transgenic technique” were conducted at Nha Ho Research 
Institute for Cotton and Agriculture Development, Nhon Son Commune, Ninh Son 
District, Ninh Thuan Province. The research was applied on the cotton Coker310 
variety and the Coker310FR line; two gene structures P35S-EPSPS-TNOS and 
PNOS-bar-TNOS; two transgenic vectors pCB301:nptII and pCAMBIA1300:hpt; 
and A. tumefaciens strain C58/ PGV2260. The research was conducted from 2013 to 
2018. The research objective was to apply A.tumefaciens-mediated gene transfer 
method for transferring EPSPS and bar genes into cotton plants to create transgenic 
cotton lines which are high resistant to Glyphosate/Glufosinate herbicide. The results 
showed that: 
The Coker310FR line selected through three generation-regeneration of 
Coker310 cotton variety expressed a very high regeneration capacity, with the rate of 
callus-embryogenesis was 95.6% and the rate of normal regenerated plants growing 
on GR5 medium was 36.7%. 
Four transgenic vectors, including pCAMBIA1300:hpt-bar, pCAMBIA1300: 
hpt-EPSPS, pCB301:nptII-bar and pCB301:nptII-EPSPS were reconstructured by 
inserting the regions P35S-EPSPS-TNOS and PNOS-bar-TNOS into plant-expressed 
vector pCB301:nptII and pCAMBIA1300:hpt. The test for presence of 04 target 
genes and the virulent gene VirC confirmed that 04 transgenic vectors were 
successfully transformed into A. tumefaciens strain C58/PGV2260. 
The infection of A. tumefaciens containing EPSPS and bar genes on hypocotyl 
explants of the Coker310 plants at different densities, infection times, duration and 
temperatures significantly affected the rates of induction, survival and embryogenesis 
of transgenic callus. The best results were bacterial infection at a density of OD600 
0.75 for 10 minutes, co-culture for 64 hours at 22 °C. 
 vi 
The interaction between explant type/variety and the selection agents affected 
the rate of regeneration as well as rate of plants containing transgenes. The efficiency 
of transferring pCAMBIA1300:bar vector into Coker310FR cotyledon explants 
reached the highest rate of embryo-generated callus at 2.8%, 15.8 plants per explant 
were successfully regenerated, 76.0% of plants containing transgenes and 64.7% of 
them were fertility. The efficiency of transferring pCB301:bar vector into 
Coker310FR hypocotyl explants was highest with 2.1% of callus generated embryos, 
regenerating 20.6 plants per explant, 30.2% of them were transgenic plants in which 
82.5% were fertility. 
The combination of molecular and biological assessments resulted in the 
selection of 5 lines, i.e. B1, B6, B9, B18, and BF17. All of these lines were uniform 
growth plants containing single copy which expressed transcription activities of 
target genes and shown a high level of tolerance to Glufosinate. 
The combination of molecular and biological assessments resulted in the 
selection of 5 lines, i.e. E7, E8, E19, EF14 and EF25. All of these lines were uniform 
growth plants containing single copy which expressed transcription activities of 
target genes and shown a moderate level of tolerance to Glyphosate. 
Two T2 transgenic cotton lines, i.e. B9 and BF17, carried one copy of the gene, 
which genetically followed the Mendel's rules. These transgenic lines were highly 
resistant to Glufosinate herbicide at a concentration of 0.6 kg ai./ha, had no difference 
in botanical characteristics and disease resistance in comparison with original non-
transgenic Coker310 cotton plant. 
 vii 
KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 
1-PPT Phosphinothricin 
2,4-D 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid 
A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens 
AHAS Acetohydroxyacid synthase 
ALS Kháng thuốc gốc sulfonylurea 
aph(3’)-II Aminoglycoside 3’-phosphotransferase II 
RNA Ribonucleic acid 
Arabidopsis Arabidopsis thaliana 
AS acetosyringone 
ASA American Soybean Association -Hiệp hội Đậu nành Mỹ 
BA Benzyladenine 
BVTV Bảo vệ Thực vật 
bar Bialaphos 
BĐG Biến đổi gen 
CAAS Chinese Academy of Agricultural Sciences-Học viện Khoa học 
Nông nghiệp Trung Quốc 
Cb Carbenicillin 
CERA Center for environmental risk assessment-Trung tâm đánh giá 
rủi ro môi trường 
CI Callus induction-Cảm ứng mô sẹo 
CNSH Công nghệ Sinh học 
CP Môi trường nhân phôi 
ctv Cộng tác viên 
DNA Deoxyribonucleic acid 
dNTP 2'-deoxyribonucleoside 5'-triphosphate 
E.coli Escherichia coli 
EFSA European Food Safety Authority 
 viii 
EI Embryogenesis induction-ký hiệu môi trường cảm ứng phát 
sinh phôi 
EP Môi trường nuôi phôi 
EPSP 5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate 
EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase-Gen mã hóa 
enzyme 5-enolpyruvyl-shikimate-3-
phosphate (EPSP) synthase 
EU European Union 
FAO Food and Agriculture Organization-Tổ chức Nông Lương Liên 
Hợp Quốc 
GAA Gaelic Athletic Association 
GE Genetic engineering 
gfp Green fluorescent protein-protein huỳnh quang 
GM Gene modification 
GMP Good Manufacturing Practice 
GNA Galanthus nivalis agglutinin 
GOI Genes of interest 
GR Germination regeneration- môi trường nẩy mầm, tái sinh cây 
GUS Glucuronidase 
hpt Hygromycin phosphotransferase 
HR Herbicide resistance-Tính kháng thuốc trừ cỏ 
HT Herbicide tolerance-Tính chống chịu thuốc trừ cỏ 
Hv Hordeum vulgare L.-Lúa mạch 
Hy. Hygromycin B 
IAA indole-3-acetic acid 
IARC International Agency for Research on Cancer 
IBA Indole-3-butyric acid 
ICAC (International Cotton Advisory Committee) Ủy ban Tư vấn 
bông Quốc tế 
 ix 
ISAAA Acquisition of Agri-biotech Applications 
ISB Information systems for biotechnology-hệ thống thông tin công 
nghệ sinh học 
IR Insecticide Resistance-Tính kháng thuốc diệt côn trùng 
JAAS Jiangsu Academy of Agriculture Sciences-Học viện Khoa học 
Nông nghiệp Jiangsu 
Ka. Kanamycin 
LB Left border 
MCS Multiple cloning site 
MOA Mode of action 
MSB5 Môi trường chứa muối MS và vitamin B5 
NAA Naphthaleneacetic acid 
NGS Next generation sequencing-PP giải trình tự thế hệ mới 
NN & PTNT Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn 
nptII Neomycin phosphotransferase 
OD600 Optical density-mật độ quang ở bước sóng 600 nm 
PAT Phosphinothricin N-acetyltransferase 
PCR Polymerase Chain Reaction 
PEG Polyethylene glycol 
PPO Protoporphyrinogen oxydase 
PSII Photosystem II 
PTP Pollen tube pathway 
RB Righ border 
RG Reporter genes 
Rm Rifampicin 
RNA Ribonucleic acid 
S3P Shikimate-3-phosphate 
SMG Selection marker genes 
SG Seed germination-ký hiệu môi trường nảy mầm hạt 
 x 
Tc Tetracycline 
T-DNA Transfer DNA 
USDA United States Department of Agriculture (Bộ Nông nghiệp Mỹ) 
VIP3A Vegetative insecticidal protein-protein diệt côn trùng 
WHO World Health Organization-Tổ chức y tế thế giới 
 xi 
MỤC LỤC 
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... I 
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... II 
TÓM TẮT ............................................................................................................... III 
SUMMARY ............................................................................................................... V 
KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT........................................................................... VII 
MỤC LỤC ............................................................................................................... XI 
DANH MỤC HÌNH ẢNH ..................................................................................... XV 
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................... XVII 
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 
CHƯƠNG 1................................................................................................................ 5 
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 5 
1.1 Sơ lược về cây bông ............................................................................................. 5 
1.2 Thực trạng sản xuất và tiêu thụ bông trên thế giới ........................................ 5 
1.3 Cây trồng biến đổi gen chống chịu thuốc trừ cỏ .............................................. 6 
1.3.1 Cây trồng biến đổi gen chống chịu thuốc trừ cỏ ........................................... 6 
1.3.2 Cây bông biến đổi gen chống chịu thuốc trừ cỏ ............................................ 9 
1.4 Cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam ................................................................. 10 
1.5 Thuốc trừ cỏ và gen chống chịu thuốc trừ cỏ ................................................. 12 
1. ... ợp (tương đương 500 g) lên trên cùng. 
13) Blotting từ 18-24 giờ ở nhiệt độ phòng. 
14) Tháo dỡ màng: Đeo găng tay, cẩn thận loại bỏ từng phần trên gel, dùng bút chì 
mềm chọc thủng các giếng để đánh dấu vị trí các giếng trên màng. Bóc gel và 
giấy Whatman 3MM ra khỏi màng, dùng kẹp đặt màng lên miếng giấy 
Whatman 3MM khác (đã ngâm trong 2X SSC) sau đó phủ 1 miếng nữa lên trên. 
15) Lấy màng ra, rửa trong 2X SSC, sau cố định RNA bằng cách nướng ở 120 oC 
trong 30 phút hoặc UV Crosslink màng trên máy UV trong 3 phút/mặt. 
16) Sử dụng ngay hoặc cất trong túi nilon để trữ trong ngăn mát tủ lạnh. 
IV. Đánh dấu mẫu dò (theo kít “Dig Northern Starter Kit”, Cat. số : 12 039 672 910 
của Hãng Roche). 
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 
Bước 1: Bổ sung 1 µg hoặc 4µl sản phẩm RT-PCR (100 – 200 ng) sạch RNase, xử lí 
bằng DMPC hoặc DEPC, thêm nước cất 2 lần sao cho thể tích cuối cùng trong ống 
phản ứng là 10µl 
Bước 2: Bổ sung các chất trong điều kiện lạnh 
Thuốc thử Thể tích 
Labeling mix, 5x (ống 1a) 4 µl 
Transcription buffer 5x (ống 1b) 4 µl 
RNA polymerase (T7 và T3) 2 µl 
- Mix đều và spin 
 - Ủ trong 1 giờ ở 42 oC 
Bước 3: Bổ sung 2 µl Dnase I, sạch RNase để loại bỏ DNA mẫu. 
 Ủ trong 15 phút ở 37 oC 
Bước 4: Ngừng phản ứng bằng cách thêm 2 µl EDTA 0,2M (pH = 8.0) 
V. Lai mẫu dò với màng northern blot 
 149 
1) Để màng trong ống lai và thêm đệm tiền lai (đã làm nóng ở 68 oC) cho ngập màng 
(25-30 ml). Tiền lai màng ở 68 oC trong 30 phút, quay ống lai 12 vòng/phút. Đây 
là điều kiện cần trước khi lai. 
2) Thêm mẫu dò đã biến tính (ủ 5 phút ở 100 oC, sau đó để ngay lên đá) vào đệm lai 
(đã làm nóng ở 68 oC) và mix thật kỹ (sử dụng 25 ng mẫu dò/ml đệm lai). Tất cả 
đều thao tác trên đá. Sử dụng 8ml đệm lai/ màng 10cm x 10 cm. 
3) Loại bỏ đệm tiền lai và thay thế bằng dung dịch lai. Việc lai nên được thực hiện 
ở 42 oC trong 4giờ - qua đêm, tốc độ quay tương tự lúc tiền lai, không để bọt khí 
xuất hiện (dung dịch lai chứa mẫu dò có thể được tái sử dụng nếu trữ ở - 20 oC và 
trước khi sử dụng lại thì ủ ở 68 oC trong 10 phút). 
4) Loại bỏ dịch lai và thay thế bằng dung dịch rửa I. Rửa ở 15-25 oC trong 5 phút. 
Loại bỏ dịch rửa và lặp lại. 
5) Loại bỏ dung dịch rửa I và rửa với dung dịch rửa II (đã được làm nóng ở 68 oC 
trong 5 phút). Để ở 68 oC trong 30 phút, tốc độ quay ống tương tự lúc lai. Loại 
bỏ dung dịch rửa và lặp lại. 
6) Loại bỏ dịch rửa II và thay thế bằng dung dịch rửa III. Rửa ở nhiệt độ phòng trong 
1-5 phút. 
7) Loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa, ủ trong 100ml dung dịch Blocking ở nhiệt độ 
phòng 
8) Loại bỏ dung dịch Blocking, ủ 30 phút trong 30 ml dung dịch kháng thể ở nhiệt 
độ phòng 
9) Loại bỏ dung dịch kháng thể, rửa 2 x 15 phút trong 100ml dịch rửa III 
10) Loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa, cân bằng 2-5 phút trong 40 ml đệm dò 
11) Đặt màng vào hộp hiện phim (mặt có RNA ngửa lên trên), nhỏ 1 ml CSDP, ngay 
lập tức đóng hộp để cho cơ chất lan rộng, chú ý tránh bọt. Ủ 5 phút ở 15-25 oC, 
sau đó ủ 10-15 phút ở 37 oC để tăng cường phản ứng phát quang. 
12) Phủ phim lên trên và ủ 15-25 phút hoặc lâu hơn ở 15-25 oC. 
13) Hiện phim X-ray. 
 150 
Phụ lục 11.1. Số cây mọc, số cây kháng, tỷ lệ (%) kháng kanamycin và chống chịu 
Glufosinate của cây chuyển gen pCB301:bar (tháng 3/2014) 
Mô sẹo T0 
Số 
cây 
mọc 
Tỷ lệ (%) 
kháng 
kanamycin 
Đánh giá tính chống 
chịu Glufosinate (0,6 kg 
ai./ha) 
PCR 
bar 
Số bản 
sao 
Số cây 
sống 
Tỷ lệ 
(%) 
Dòng 
chọn 
barII1 CB1 125 21,6 0 
barII1 CB2 30 23,3 0 
barII2 CB3 112 23,2 8 7,1 x + 1 
barII3 CB4 70 18,6 0 
barII4 CB5 36 19,4 6 16,7 + 
barII5 CB6 8 25,0 0 
barII1 CB7 26 23,1 0 
barII1 CB8 11 27,3 0 
barII2 CB9 43 23,3 4 9,3 + 
barII5 CB10 86 22,1 0 
barII5 CB11 35 17,1 0 
barII4 CB12 19 36,8 3 15,8 + 
barII4 CB13 47 31,9 7 14,9 + 
barII5 CB14 26 23,1 0 
barII2 CB15 95 29,5 11 11,6 x + 1 
barII3 CB16 54 20,4 0 
barII3 CB17 83 19,3 0 
barII3 CB18 102 21,6 0 
barII3 CB19 24 29,2 0 
barIIF1 CFB1 49 28,6 0 
barIIF2 CFB2 73 16,4 11 15,1 x + 1 
barIIF3 CFB3 21 33,3 0 
barIIF4 CFB4 36 25,0 0 
barIIF5 CFB5 14 21,4 0 
 151 
Mô sẹo T0 
Số 
cây 
mọc 
Tỷ lệ (%) 
kháng 
kanamycin 
Đánh giá tính chống 
chịu Glufosinate (0,6 kg 
ai./ha) 
PCR 
bar 
Số bản 
sao 
Số cây 
sống 
Tỷ lệ 
(%) 
Dòng 
chọn 
barIIF6 CFB6 107 31,8 15 14,0 x + 1 
barIIF1 CFB7 62 21,0 0 
barIIF1 CFB8 28 28,6 0 
barIIF3 CFB9 37 29,7 0 
barIIF3 CFB10 16 37,5 0 
barIIF3 CFB11 29 20,7 0 
barIIF6 CFB12 61 27,9 8 13,1 + 
barIIF6 CFB13 84 40,5 14 16,7 + 
barIIF6 CFB14 72 30,6 11 15,3 + 
barIIF4 CFB15 38 21,1 0 
barIIF4 CFB16 29 13,8 0 
barIIF2 CFB17 16 31,3 2 12,5 + 
barIIF2 CFB18 42 31,0 9 21,4 + 1 
barIIF2 CFB19 69 23,2 6 8,7 + 
barIIF5 CFB20 75 17,3 0 
barIIF2 CFB21 87 28,7 8 9,2 + 
barIIF5 CFB22 11 36,4 0 
barIIF5 CFB23 36 27,8 0 
barIIF2 CFB24 45 31,1 7 15,6 + 
barIIF5 CFB25 17 29,4 0 
barIIF2 CFB26 68 30,9 12 17,6 + 
barIIF2 CFB27 93 24,7 9 9,7 + 
barIIF5 CFB28 34 35,3 0 
 Coker310 35 0 0 
 152 
Phụ lục 11.2. Số cây mọc, số cây kháng, tỷ lệ (%) kháng hygromycin và chống chịu 
Glufosinate cây chuyển gen pCAMBIA1300:bar 
Mô sẹo T0 
Số 
cây 
mọc 
Tỷ lệ 
(%) 
kháng 
hygro
mycin 
Đánh giá tính chống chịu 
Glufosinate (0,6 kg ai./ha) 
PCR Bar 
Số bản 
sao Số cây 
sống 
Tỷ lệ 
(%) 
Dòng 
chọn 
barI1 B1 132 79,5 82 62,1 x + 1 
barI2 B2 16 81,3 13 81,3 x + 2 
barI3 B3 84 78,6 59 70,2 x + 
barI2 B4 42 71,4 34 81,4 x + 2 
barI4 B5 16 37,5 0 
barI3 B6 66 77,3 45 68,2 x + 1 
barI1 B7 8 50,0 4 50,0 + 
barI* B8 59 33,9 17 28,8 + 
barI4 B9 198 72,2 142 71,7 x + 1 
barI1 B10 14 71,4 8 57,1 + 
barI1 B11 26 65,4 15 57,7 + 
barI4 B12 2 100 0 
barI* B13 25 48,0 9 36,0 + 
barI4 B14 26 38,5 0 
barI1 B15 50 60,0 28 56,0 + 
barI1 B16 44 65,9 23 52,3 + 
barI4 B17 17 17,6 0 
barI4 B18 111 36,9 36 32,4 x + 1 
barI* B19 23 43,5 10 43,5 + 
barI3 B20 36 88,9 32 62,8 x + 
barI4 B21 29 31,0 0 
barI4 B22 9 22,2 0 
barI4 B23 20 35,0 0 
 153 
Mô sẹo T0 
Số 
cây 
mọc 
Tỷ lệ 
(%) 
kháng 
hygro
mycin 
Đánh giá tính chống chịu 
Glufosinate (0,6 kg ai./ha) 
PCR Bar 
Số bản 
sao Số cây 
sống 
Tỷ lệ 
(%) 
Dòng 
chọn 
barI4 B24 11 81,8 0 
barI3 B25 30 63,3 17 56,7 + 
barI4 B26 12 66,7 0 
barI* B27 18 38,9 5 27,8 + 
barI* B28 37 56,8 18 48,6 + 
barI* B29 46 41,3 15 32,6 + 
barI4 B30 32 18,8 0 
barIF1 BF1 43 72,1 0 
barIF2 BF2 58 44,8 21 36,2 + 
barIF3 B20 36 88,9 32 62,8 x + 
barIF7 BF4 16 37,5 0 
barIF8 BF5 30 86,7 22 73,3 + 
barIF6 BF6 13 30,8 1 7,7 + 
barIF5 BF7 48 37,5 6 12,5 + 
barIF3 BF8 102 61,8 52 51,0 x + 
barIF1 BF9 36 22,2 0 
barIF2 BF10 53 50,9 18 34,0 + 
barIF1 BF11 18 16,7 0 0 + 
barIF2 BF12 91 45,1 36 39,6 x + 
barIF1 BF13 11 63,6 0 
barIF5 BF14 16 31,3 3 18,8 + 
barIF3 BF15 35 45,7 15 42,9 + 
barIF8 BF16 26 80,8 21 80,8 + 
barIF3 BF17 82 59,8 42 51,2 x + 1 
barIF1 BF18 24 37,5 0 
 154 
Mô sẹo T0 
Số 
cây 
mọc 
Tỷ lệ 
(%) 
kháng 
hygro
mycin 
Đánh giá tính chống chịu 
Glufosinate (0,6 kg ai./ha) 
PCR Bar 
Số bản 
sao Số cây 
sống 
Tỷ lệ 
(%) 
Dòng 
chọn 
barIF6 BF19 51 21,6 6 11,8 + 
barIF1 BF20 14 57,1 0 + 
barIF3 BF21 26 69,2 14 53,8 + 
barIF4 BF22 31 74,2 23 74,2 + 
barIF1 BF23 12 16,7 0 
barIF1 BF24 7 57,1 0 
barIF4 BF25 42 78,6 30 71,4 x + 
barIF3 BF26 36 66,7 19 52,8 + 
barIF3 BF27 25 76,0 14 56,0 + 
barIF2 BF28 62 33,9 21 33,9 + 
barIF3 BF29 41 68,3 22 53,7 + 
barIF3 BF30 12 91,7 7 58,3 + 
barIF6 BF31 19 52,6 0 
barIF6 BF32 27 29,6 0 
barIF3 BF33 16 56,3 8 50,0 + 
barIF2 BF34 54 53,7 23 42,6 + 
barIF3 BF35 22 72,7 14 63,6 + 
barIF5 BF36 34 41,2 8 23,5 + 
barIF6 BF37 19 31,6 0 
barIF5 BF38 48 29,2 11 22,9 + 
barIF3 BF39 18 77,8 9 50,0 + 
Coker 310 0 0 0 
Coker 310 0 0 0 
 155 
Phụ lục 11.3. Tỷ lệ (%) cây kháng kháng sinh và chống chịu Glufosinate của các 
dòng bông chuyển gen bar thế hệ T2 
TT T1 
T2-
dòng 
Tỷ lệ 
cây 
kháng 
KS 
Tỷ lệ 
chống 
chịu 
thuốc 
trừ cỏ 
TT T1 
T2-
dòng 
Tỷ lệ 
cây 
kháng 
KS 
Tỷ lệ 
chống 
chịu 
thuốc 
trừ cỏ 
1 B1 1 100,0 100,0 44 3 90,3 86,7 
2 2 85,4 83,5 45 4 85,6 83,2 
3 3 86,7 83,3 46 5 81,3 77,1 
4 4 86,0 93,5 47 B20 1 85,6 85,6 
5 5 87,3 85,5 48 2 89,6 84,0 
6 6 90,0 89,3 49 3 85,8 84,9 
7 7 90,0 88,6 50 4 98,9 97,9 
8 8 85,7 82,3 51 5 84,2 73,7 
9 9 86,7 84,0 52 B33 1 82,1 77,4 
10 10 87,2 86,5 53 2 100,0 100,0 
11 11 100,0 100,0 54 3 90,5 90,5 
12 B3 1 88,1 85,1 55 4 97,7 93,8 
13 2 94,5 92,7 56 5 88,1 86,0 
14 3 100,0 100,0 57 6 87,9 87,1 
15 4 100,0 100,0 58 B38 1 86,7 85,6 
16 5 83,3 82,5 59 2 100,0 94,9 
17 6 100,0 99,3 60 3 82,4 70,6 
18 7 92,9 88,8 61 4 100,0 97,5 
19 B6 1 98,9 95,5 62 5 91,8 88,4 
20 2 92,0 85,0 63 6 95,5 91,7 
21 3 88,6 84,3 64 7 85,7 83,9 
22 4 79,6 78,2 65 8 97,8 95,5 
 156 
TT T1 
T2-
dòng 
Tỷ lệ 
cây 
kháng 
KS 
Tỷ lệ 
chống 
chịu 
thuốc 
trừ cỏ 
TT T1 
T2-
dòng 
Tỷ lệ 
cây 
kháng 
KS 
Tỷ lệ 
chống 
chịu 
thuốc 
trừ cỏ 
23 5 93,7 92,0 66 9 93,0 85,0 
24 6 100,0 100,0 67 10 92,3 87,2 
25 B9 1 100,0 97,1 68 BF12 1 91,5 78,7 
26 2 91,6 85,3 69 2 96,3 93,9 
27 3 100,0 100,0 70 3 88,6 84,8 
28 4 95,1 82,0 71 4 84,2 79,8 
29 5 87,9 79,3 72 5 82,7 79,6 
30 6 100,0 91,3 73 BF17 1 100,0 100,0 
31 7 81,8 75,8 74 2 86,0 82,5 
32 8 94,3 94,3 75 3 77,6 76,6 
33 9 92,0 90,5 76 4 97,6 97,6 
34 10 87,6 87,6 77 5 91,1 88,7 
35 11 80,8 80,8 78 6 75,0 72,3 
36 12 91,5 86,8 79 7 92,3 89,4 
37 13 97,7 88,4 80 8 88,3 85,2 
38 14 100,0 96,9 81 BF25 1 98,1 95,7 
39 15 100,0 93,3 82 2 100,0 96,3 
40 16 92,7 92,7 83 3 81,0 73,8 
41 17 91,2 85,4 84 4 91,4 87,1 
42 B18 1 100,0 100,0 85 5 87,4 87,4 
43 2 92,2 88,3 
 157 
Phụ lục 12.1. Số cây mọc, tỷ lệ (%) kháng kanamycin và tỷ lệ cây chống chịu 
Glyphosate của cây chuyển gen pCB301:EPSPS thế hệ T1 (tháng 10/2014) 
Dòng 
T1 
Tên 
T0 
Số 
cây 
mọc 
Tỷ 
lệ 
(%) 
kháng 
kanamycin 
Đánh giá tính chống chịu 
Glyphosate (2,88 kg ai./ha) 
PCR 
EPSPS 
Số bản 
sao 
Số cây 
sống 
Tỷ lệ 
(%) 
Dòng 
chọn 
CE1 CE1 48 43,8 15 31,3 + 
CE2 CE2 26 34,6 0 
CE3 CE3 78 59,0 12 15,4 + 
CE4 CE4 92 22,8 11 12,0 + 
CE5 CE5 31 80,6 12 38,7 x + 1 
CE6 CE6 15 53,3 0 
CE7 CE7 27 44,4 0 
CE8 CE8 51 19,6 0 
CE9 CE9 39 66,7 16 41,0 + 1 
CE10 CE10 67 23,9 12 17,9 + 
CE11 CE11 22 31,8 0 
CE12 CE12 8 62,5 0 
CE13 CE13 17 47,1 0 
CE14 CE14 34 35,3 3 8,8 + 
CE15 CE15 26 23,1 0 
CE16 CE16 72 36,1 0 
CFE1 CFE1 111 36,9 36,0 32,4 + 1 
CFE2 CFE2 59 33,9 17,0 28,8 + 
CFE3 CFE3 25 48,0 9,0 36,0 + 
CFE4 CFE4 50 60,0 20,0 40,0 + 
CFE5 CFE5 44 65,9 21,0 47,7 + 
CFE6 CFE6 23 43,5 0 
 158 
Dòng 
T1 
Tên 
T0 
Số 
cây 
mọc 
Tỷ 
lệ 
(%) 
kháng 
kanamycin 
Đánh giá tính chống chịu 
Glyphosate (2,88 kg ai./ha) 
PCR 
EPSPS 
Số bản 
sao 
Số cây 
sống 
Tỷ lệ 
(%) 
Dòng 
chọn 
CFE7 CFE7 36 33,3 0 
CFE8 CFE8 29 31,0 0 
CFE9 CFE9 9 22,2 0 
CFE10 CFE10 20 35,0 0 
CFE11 CFE11 30 63,3 10,0 33,3 
CFE12 CFE12 11 81,8 0 
CFE13 CFE13 30 23,3 0 
CFE14 CFE14 170 20,6 28,0 16,5 
CFE15 CFE15 62 19,4 10 16,1 
CFE16 CFE16 41 63,4 19 46,3 x + 1 
CFE17 CFE17 86 54,7 38 44,2 
CFE18 CFE18 37 35,1 8 21,6 
CFE19 CFE19 12 16,7 0 
Coker310 0 0 - - 
Coker310FR 0 0 - 
Phụ lục 12.2. Số cây mọc, tỷ lệ (%) kháng hygormycin và tỷ lệ cây chống chịu 
Glyphosate của cây chuyển gen pCAMBIA1300:EPSPS thế hệ T1 
Mô sẹo Tên T0 
Số 
cây 
mọc 
Tỷ lệ (%) 
kháng 
hygromycin 
Đánh giá tính chống chịu 
Glyphosate 
PCR 
EPSPS 
Số bản 
sao 
Số 
cây 
sống 
Tỷ lệ 
(%) 
Dòng 
chọn 
EPSI1 E1 12 75,0 0 
 159 
Mô sẹo Tên T0 
Số 
cây 
mọc 
Tỷ lệ (%) 
kháng 
hygromycin 
Đánh giá tính chống chịu 
Glyphosate 
PCR 
EPSPS 
Số bản 
sao 
Số 
cây 
sống 
Tỷ lệ 
(%) 
Dòng 
chọn 
EPSI1 E2 8 12,5 0 
EPSI1 E3 16 18,8 0 
EPSI1 E4 23 39,1 0 
EPSI1 E5 14 57,1 0 
EPSI1 E6 47 23,4 0 
EPSI2 E7 19 73,7 11 57,9 x + 1 
EPSI3 E8 26 46,2 10 38,5 x + 1 
EPSI4 E9 15 26,7 0 
EPSI5 E10 34 41,2 14 41,2 + 
EPSI4 E11 21 38,1 0 
EPSI4 E12 36 30,6 0 
EPSI4 E13 25 68,0 0 
EPSI5 E14 37 35,1 11 29,7 + 
EPSI6 E15 14 64,3 0 
EPSI6 E16 14 42,9 0 
EPSI7 E17 42 40,5 16 38,1 + 
EPSI6 E18 26 26,9 0 
EPSI7 E19 31 71,0 17 54,8 x + 1 
EPSI7 E20 44 31,8 10 22,7 + 
EPSI7 E21 17 41,2 6 35,3 + 
EPSI8 E22 9 55,6 0 
EPSI7 E23 22 36,4 5 22,7 + 
EPSIF1 EF1 33 42,4 0 
EPSIF1 EF2 16 18,8 0 
 160 
Mô sẹo Tên T0 
Số 
cây 
mọc 
Tỷ lệ (%) 
kháng 
hygromycin 
Đánh giá tính chống chịu 
Glyphosate 
PCR 
EPSPS 
Số bản 
sao 
Số 
cây 
sống 
Tỷ lệ 
(%) 
Dòng 
chọn 
EPSIF1 EF3 11 72,7 0 
EPSIF4 EF4 47 61,7 22 46,8 x + 1 
EPSIF5 EF5 21 28,6 0 
EPSIF5 EF6 14 42,9 0 
EPSIF5 EF7 16 68,8 0 
EPSIF5 EF8 10 40,0 0 
EPSIF6 EF9 31 41,9 8 25,8 + 
EPSIF5 EF10 34 26,5 0 
EPSIF5 EF11 25 32,0 0 
EPSIF5 EF12 13 46,2 0 
EPSIF5 EF13 6 33,3 0 
EPSIF4 EF14 22 77,3 12 54,5 x + 1 
EPSIF7 EF15 18 33,3 0 
EPSIF4 EF16 25 60,0 11 44,0 
EPSIF7 EF17 15 26,7 0 
EPSIF7 EF18 24 37,5 0 
EPSIF7 EF19 17 17,6 0 
EPSIF4 EF20 12 83,3 6 50,0 + 
EPSIF6 EF21 34 35,3 11 32,4 + 
EPSIF6 EF22 36 16,7 5 13,9 + 
EPSIF6 EF23 14 57,1 5 35,7 + 
EPSIF6 EF24 23 52,2 9 39,1 + 
EPSIF8 EF25 17 76,5 11 64,7 x + 
EPSIF9 EF26 25 24,0 0 
 161 
Mô sẹo Tên T0 
Số 
cây 
mọc 
Tỷ lệ (%) 
kháng 
hygromycin 
Đánh giá tính chống chịu 
Glyphosate 
PCR 
EPSPS 
Số bản 
sao 
Số 
cây 
sống 
Tỷ lệ 
(%) 
Dòng 
chọn 
EPSIF9 EF27 28 17,9 0 
EPSIF9 EF28 15 60,0 0 
EPSIF9 EF29 20 25,0 0 
EPSIF10 EF30 16 43,8 0 
EPSIF10 EF31 11 72,7 0 
EPSIF8 EF32 42 21,4 5 11,9 + 
EPSIF10 EF33 37 27,0 0 
EPSIF8 EF34 11 54,5 4 36,4 + 
EPSIF8 EF35 23 39,1 6 26,1 + 
Coker 310 0 0 0 
Coker 310 0 0 0 
Phụ lục 12.3. Tỷ lệ (%) kháng kanamycin và tỷ lệ cây chống chịu Glyphosate của 
cây chuyển gen EPSPS thế hệ T2 (tháng 8 năm 2015) 
TT T1 
T2-
Dòng 
số 
Tỷ lệ 
(%) cây 
kháng 
KS 
Tỷ lệ 
(%) cây 
chống 
chịu 
thuốc trừ 
cỏ 
TT T1 
T2-
Dòng 
số 
Tỷ lệ 
(%) cây 
kháng 
KS 
Tỷ lệ 
(%) cây 
chống 
chịu 
thuốc trừ 
cỏ 
1 E8 
2 100,0 100,0 24 
3 53,1 49,0 
2 7 100,0 100,0 25 4 90,2 90,2 
3 E17 1 76,4 70,8 26 CE17 1 81,8 76,4 
 162 
TT T1 
T2-
Dòng 
số 
Tỷ lệ 
(%) cây 
kháng 
KS 
Tỷ lệ 
(%) cây 
chống 
chịu 
thuốc trừ 
cỏ 
TT T1 
T2-
Dòng 
số 
Tỷ lệ 
(%) cây 
kháng 
KS 
Tỷ lệ 
(%) cây 
chống 
chịu 
thuốc trừ 
cỏ 
4 2 81,9 77,1 27 
2 52,1 50,2 
5 E27 
1 78,0 73,7 28 3 93,5 90,2 
6 2 80,8 77,9 29 4 84,4 84,4 
7 
E37 
1 100,0 100,0 30 5 73,4 54,8 
8 4 100,0 100,0 31 6 100,0 94,4 
9 8 100,0 100,0 32 7 83,2 83,2 
10 10 100,0 100,0 33 8 47,1 45,3 
11 E48 
1 75,0 71,9 34 9 30,9 30,9 
12 2 65,9 65,9 35 10 96,8 92,2 
13 ME2 
1 77,8 72,8 36 11 88,9 87,2 
14 2 100 100 37 12 100,0 100,0 
15 3 51,7 51,7 38 13 64,4 61,5 
16 4 96,4 91,7 39 CE32 
1 78,1 75,8 
17 5 87,5 87,5 40 2 92,5 81,8 
18 6 57,1 48,4 41 3 60,6 60,6 
19 CE5 
1 78,1 74,9 42 4 97,3 95,1 
20 2 96,1 91,4 43 5 100,0 97,9 
21 3 84,7 75,9 44 6 48,0 46,7 
22 CE9 
1 78,2 75,9 45 7 87,9 83,6 
23 2 100,0 100,0