Luận án Theo dõi tải lượng HIV thường quy ở bệnh nhân điều trị thuốc kháng vi rút bậc một tại khu vực miền bắc Việt Nam

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG 
-----------------*------------------- 
TRƯƠNG THÁI PHƯƠNG 
THEO DÕI TẢI LƯỢNG HIV 
THƯỜNG QUY Ở BỆNH NHÂN ĐIỀU TRỊ 
THUỐC KHÁNG VI RÚT BẬC MỘT 
TẠI KHU VỰC MIỀN BẮC VIỆT NAM 
Chuyên ngành: Vi sinh y học 
Mã số: 62 72 01 15 
LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC 
Người hướng dẫn khoa học 1: PGS. TS. Vũ Tường Vân 
 2: TS. Phạm Hồng Thắng 
HÀ NỘI - 2021 
 LỜI CẢM ƠN 
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài này tôi đã nhận được rất nhiều sự 
giúp đỡ của Lãnh đạo cơ quan, các đơn vị, Thầy Cô, đồng nghiệp, các bệnh 
nhân, bạn bè và gia đình thân yêu của mình. 
Trước hết, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng tri ân sâu sắc tới người thầy 
PGS. TS. Vũ Tường Vân và TS. Phạm Hồng Thắng, là những người 
thầy, người hướng dẫn khoa học, đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi 
trong suốt quá trình học tập, trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện nghiên 
cứu, góp ý và sửa chữa luận án. 
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới GS. TS. Đặng Đức Anh Viện trưởng viện 
Vệ sinh Dịch tễ trung ương, PGS. TS. Lê Thị Quỳnh Mai, Phó viện trưởng 
Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương, Trưởng Bộ môn Vi sinh y học – Viện Vệ sinh 
Dịch tễ trung ương, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực 
hiện đề tài và hoàn thành luận án này. 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những thầy cô, đồng nghiệp, 
những người đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án: 
- Ban Lãnh đạo Viện, Phòng Đào tạo Sau Đại Học – viện Vệ sinh 
dịch tễ trung ương. 
- PGS. TS. Nguyễn Quốc Anh, Giám đốc Bệnh viện Bạch Mai 
- Tổ chức HAIVN đã hỗ trợ tôi hoàn thành luận án 
- Phòng SHPT khoa Vi sinh và các bạn đồng nghiệp khoa Vi sinh 
bệnh viện Bạch Mai đã luôn ủng hộ và hỗ trợ tôi trong quá trình học tập 
nghiên cứu. 
 - PGS. TS. Đỗ Duy Cường, Giám đốc Trung tâm bệnh nhiệt đới – bệnh 
viện Bạch Mai cùng toàn thể các cán bộ các nghiên cứu viên của Trung tâm, 
các thầy cô và các bạn đồng nghiệp. 
Xin được gửi lời cảm ơn đến các bệnh nhân cùng gia đình của họ đã 
giúp tôi có được các số liệu trong luận án này. 
 Xin cảm ơn các bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong quá trình 
học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án. 
Cuối cùng, tôi xin gửi lời thương mến và yêu thương chân thành tới gia 
đình, chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận án. 
 Hà Nội, tháng 01 năm 2020
 LỜI CAM ĐOAN 
Tôi là Trương Thái Phương, nghiên cứu sinh khóa 35 Viện Vệ sinh 
Dịch tễ trung ương, chuyên ngành Vi Sinh Y Học, xin cam đoan: 
1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của 
PGS. TS. Vũ Tường Vân và TS. Phạm Hồng Thắng. 
2. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực 
và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu. 
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. 
Hà Nội, ngày 06 tháng 01 năm 2020 
Người viết cam đoan 
Trương Thái Phương 
 MỤC LỤC 
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ HIV/AIDS ............................................................... 3 
1.1.1. Human Immunodeficiency Virus ..................................................... 3 
1.1.2. Sự nhân lên của vi rút ..................................................................... 11 
1.2. Dịch tễ học nhiễm HIV/AIDS ............................................................ 14 
1.2.1. Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới ...................................... 14 
1.2.2. Tình hình nhiễm HIV/AIDS tại Việt Nam ..................................... 17 
1.3. Tình hình điều trị ARV tại Việt Nam .................................................... 22 
1.4. Xét nghiệm chẩn đoán nhiễm HIV tại Việt Nam ............................. 23 
1.4.1. Mục đích của xét nghiệm ............................................................... 23 
1.4.2 Nguyên tắc xét nghiệm .................... Error! Bookmark not defined. 
1.4.3 Các chiến lược xét nghiệm .............. Error! Bookmark not defined. 
1.4.4. Thực hiện xét nghiệm chẩn đoán nhiễm HIV ................................ 24 
1.5. Xét nghiệm theo dõi điều trị HIV/AIDS ........................................... 29 
1.5.1. Xét nghiệm đo tải lượng HIV......................................................... 29 
1.5.2. Xét nghiệm HIV kháng thuốc ARV ............................................... 31 
1.5.3. Xét nghiệm đếm tế bào lympho T-CD4 ......................................... 36 
1.6. THEO DÕI ĐIỀU TRỊ HIV/AIDS .................................................... 39 
1.6.1. Theo dõi lâm sàng .......................................................................... 39 
1.6.2. Theo dõi số lượng tế bào CD4 ....................................................... 40 
1.6.3. Theo dõi tải lượng HIV .................................................................. 41 
1.7. HIV KHÁNG THUỐC ....................................................................... 44 
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 
CỨU ................................................................................................................ 48 
 2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 48 
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 49 
2.2.1. Cỡ mẫu ........................................................................................... 49 
2.2.2. Thiết kế nghiên cứu ........................................................................ 49 
2.2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................. 50 
2.2.4. Phân tích số liệu ............................................................................. 50 
2.3. Thực hiện kỹ thuật xét nghiệm trong nghiên cứu ........................... 53 
2.3.1. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu xét nghiệm đo tải lượng vi rút, xét 
nghiệm DBS-PBS, lưu mẫu xét nghiệm gen kháng thuốc, xét nghiệm sinh 
hóa, huyết học........................................................................................... 53 
2.3.2. Sinh phẩm và hoá chất, kỹ thuật thiết bị thực hiện ........................ 54 
2.3.3. Các bước tiến hành nội dung nghiên cứu theo sơ đồ tiến trình ..... 54 
2.3.4. Các xét nghiệm ............................................................................... 55 
2.3.5. Kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu ....................................... 55 
2.4. Y Đức ................................................................................................... 59 
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 60 
3.1. Đặc điểm bệnh nhân tại thời điểm được chọn vào nghiên cứu ...... 60 
3.1.1. Đặc điểm về tuổi, giới và tình trạng hôn nhân của bệnh nhân ....... 60 
3.1.2. Đặc điểm đường lây truyền nhiễm HIV ......................................... 61 
3.1.3. Đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm về huyết học, hoá sinh, nhiễm 
trùng cơ hội và điều trị của bệnh nhân tại thời điểm trước khi bắt đầu điều 
trị ARV phác đồ bậc 1 .............................................................................. 62 
3.2. Kết quả theo dõi điều trị của bệnh nhân .......................................... 67 
3.2.1. Xét nghiệm đếm tế bào lympho T-CD4, đo tải lượng HIV ........... 67 
3.2.2. Xét nghiệm tải lượng vi rút ............................................................ 69 
3.2.3. Tiến triển giai đoạn lâm sàng và tuân thủ điều trị của bệnh nhân . 74 
3.3. So sánh TLVR huyết tương và DBS-PBS ......................................... 80 
 3.4. Đặc điểm kháng thuốc và gen kháng thuốc...................................... 84 
3.5. Một số yếu tố liên quan đến kết quả theo dõi điều trị ức chế TLVR 
của bệnh nhân ............................................................................................ 87 
Chương 4: BÀN LUẬN ................................................................................. 91 
4.1. Đặc điểm nhân khẩu học của nhóm bệnh nhân nhiễm HIV trong 
nghiên cứu .................................................................................................. 91 
4.1.1. Tuổi và giới tính ............................................................................. 91 
4.1.2. Tình trạng hôn nhân và việc làm .................................................... 92 
4.2. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng trước điều trị ARV ................ 93 
4.2.1. Đặc điểm lâm sàng ......................................................................... 93 
4.2.2. Đặc điểm cận lâm sàng .................................................................. 94 
4.2.3. Vai trò của xét nghiệm CD4 tại thời điểm trước điều trị ............... 95 
4.3. Xét ngiệm TLVR bằng kỹ thuật xét nghiệm tải lượng HIV từ mẫu 
DBS .............................................................................................................. 97 
4.4. Kết quả theo dõi điều trị và các yếu tố liên quan .......................... 103 
4.4.1. Theo dõi tải lượng vi rút thường quy ........................................... 103 
4.4.2. Các yếu tố liên quan đến ức chế tải lượng vi rút.......................... 107 
4.5. Gen kháng thuốc ............................................................................... 109 
4.5.1. Tỉ lệ kháng thuốc .......................................................................... 109 
4.5.2. Gen đột biến kháng thuốc ............................................................ 115 
4.6. Hạn chế của đề tài ............................................................................. 116 
KẾT LUẬN .................................................................................................. 118 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
PHỤ LỤC 
 DANH MỤC CÁC BẢNG 
Bảng 1.1. Tình hình nhiễm HIV trên thế giới, 2018 ....................................... 15 
Bảng 2.1. Danh sách các đột biến đề kháng thuốc ARV trong 3 nhóm NRTI, 
NNRTI và PI ................................................................................. 57 
Bảng 3.1. Đặc điểm nhân khẩu học ................................................................ 60 
Bảng 3.2. Đặc điểm về nghề nghiệp và trình độ học vấn ............................... 61 
Bảng 3.3. Đặc điểm lâm sàng tại thời điểm trước khi bắt đầu điều trị ARV 
phác đồ bậc 1 ................................................................................. 62 
Bảng 3.4. Một số đặc điểm về điều trị HIV của bệnh nhân ............................ 64 
Bảng 3.5. Đặc điểm về xét nghiệm CD4 và xét nghiệm TLVR ..................... 64 
Bảng 3.6. Một số đặc điểm về tiền sử nghiện chất (thuốc lá, rượu/bia) của 
bệnh nhân ...................................................................................... 65 
Bảng 3.7. Đặc điểm xét nghiệm máu của bệnh nhân ...................................... 66 
Bảng 3.8. Đặc điểm một số xét nghiệm huyết thanh học viêm gan, men gan 66 
Bảng 3.9. Tỷ lệ phân bố bệnh nhân có CD4<200 TB/mm3 tại các thời điểm 68 
Bảng 3.10. Tỉ lệ duy trì điều trị cộng dồn tại từng thời điểm ......................... 76 
Bảng 3.11. Đặc điểm TLVR huyết tương và DBS-PBS trước và sau điều trị 
ARV .............................................................................................. 80 
Bảng 3.12. Độ nhạy và độ đặc hiệu của TLVR DBS-PBS so với TLVR huyết 
tương ............................................................................................. 81 
Bảng 3.14. Số lượng gen kháng theo từng nhóm thuốc .................................. 86 
Bảng 3.15: Phân bố TLVR, gen theo từng nhóm thuốc ca lâm sàng. ............. 85 
Bảng 3.16. Liên quan giữa CD4, TLVR và giai đoạn lâm sàng tại thời điểm 
ban đầu .......................................................................................... 88 
Bảng 3.17. Một số yếu tố liên quan đến ức chế TLVR ở người bệnh nhân ... 89 
 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ 
Biểu đồ 1.1. Số liệu mới mắc HIV/AIDS 2017 so với cùng kỳ năm 2016 .......... 17 
Biểu đồ 1.2. Phân bố ca nhiễm HIV theo nhóm tuổi trong năm 2018 ............ 19 
Biểu đồ 1.3. Tỉ lệ nhiễm HIV theo giới tính từ 1993 – 9/2015. ..................... 19 
Biểu đồ 1.4. Phân bố tỉ lệ nhiễm HIV theo đường lây qua các năm ............... 20 
Biểu đồ 1.5. Phân bố tỉ lệ nhiễm HIV theo đường lây trong năm 2018 ................. 20 
Biểu đồ 1.6. Tỷ lệ nhiễm HIV trong các nhóm nguy cơ cao .......................... 21 
Biểu đồ 1.7. Số lượng phòng khám HIV/AIDS từ 2012 – 2018..................... 22 
Biểu đồ 1.8. Số lượng điều trị ARV và số tử vong tương ứng từ 2004-2018 23 
Biểu đồ 1.9. Phân bố triển khai theo dõi TLVR tại các quốc gia thu nhập thấp 
và trung bình tính đến tháng 7/2019 ......................................... 43 
Biểu đồ 1.10. Số lượng theo dõi TLVR thường quy tại Việt Nam ................. 44 
Biểu đồ 3.1. Đặc điểm về đường lây truyền HIV ........................................... 61 
Biểu đồ 3.2. Các nhiễm trùng cơ hội thường gặp của bệnh nhân tại thời điểm 
thời điểm trước khi bắt đầu điều trị ARV phác đồ bậc 1` ........ 63 
Biểu đồ 3.3. Tiến triển về trung vị số lượng tế bào CD4 ................................ 67 
Biểu đồ 3.4. Tiến triển về trung vị tải lượng vi rút ......................................... 69 
Biểu đồ 3.5. Tỉ lệ bệnh nhân có TLVR<20 bản sao/ml tại các thời điểm ...... 70 
Biểu đồ 3.6. Tỉ lệ bệnh nhân có TLVR<20 bản sao/ml tại các thời điểm theo 
vùng địa lý ................................................................................ 71 
Biểu đồ 3.7. Tỉ lệ bệnh nhân có TLVR<20 bản sao/ml tại các thời điểm theo 
giới tính ..................................................................................... 72 
Biểu đồ 3.8. Tỉ lệ bệnh nhân có TLVR<20 bản sao/ml tại các thời điểm theo 
nhóm tuổi .................................................................................. 73 
Biểu đồ 3.9. Tiến triển về giai đoạn lâm sàng 1 & 2 tại các thời điểm........... 74 
Biểu đồ 3.10. Tỉ lệ tuân thủ tốt chế độ điều trị tại các thời điểm.................... 75 
Biểu đồ 3.11. Tỉ suất duy trì điều trị của bệnh nhân theo thời gian ................ 76 
Biểu đồ 3.12. Tỉ suất tử vong theo phân nhóm TLVR ................................... 77 
 Biểu đồ 3.13. Tỉ suất tử vong theo giới tính ................................................... 77 
Biểu đồ 3.14. Tỉ suất tử vong theo phân nhóm tuổi ........................................ 78 
Biểu đồ 3.15. Tỉ suất tử vong theo vùng địa lý ............................................... 79 
Biểu đồ 3.16. Đường cong ROC TLVR Plasma và TLVR DBS-PBS ở 
ngưỡng 1000 bản sao/ml .......................................................... 82 
Biểu đồ 3.17. Đường cong ROC TLVR Plasma và TLVR PBS ở ngưỡng 5000 
bản sao/ml ............................................... ... g 
còn lại khuếch đại đoạn gen RT. Ghi mã số mẫu trên thân tuýp. 
Ghi ký hiệu phản ứng PCR (PR2: đoạn gen PR; RT2: đoạn gen 
RT) và số thứ tự của mẫu trong lần thực hiện phản ứng trên cả 
thân và nắp tuýp PCR. Đặt các tuýp PCR trên khay lạnh. 
 Chuẩn bị hai tuýp 1,5 ml, ký hiệu MPR và MRT để 
pha HHPƯ 
 Trộn đều dung dịch trong ống chứa mồi, dNTPs, 
Buffer bằng máy lắc, ly tâm nhanh các ống. 
 Lưu ý: Không đảo trộn mạnh ống chứa enzyme. Ly 
tâm nhanh nếu cần thiết. 
 Pha HHPƯ cho PCR vòng 2: 
TT Thành phần 
Nồng 
độ 
Nồng 
độ của 
1 mẫu 
Đoạn 
PR n 
mẫu 
Đoạn RT 
n mẫu 
1 H20 không có nuclease 15,9 15,9 x n 15,9 x n 
2 10X High Fidelity PCR Buffer 10X 1X 2,5 2,5 x n 2,5 x n 
3 dNTPs 10 mM 0,5 0,5 x n 0,5 x n 
4 MgSO4 50 mM 2,0 2,0 x n 2,0 x n 
5 Mồi xuôi 10µM 0,5 0,5 x n 0,5 x n 
6 Mồi ngược 10µM 0,5 0,5 x n 0,5 x n 
7 
Platinum Taq DNA 
polymerase 0,1 0,1 x n 0,1 x n 
 Tổng thể tích 22,00 
 Đảo trộn nhẹ nhàng để đồng nhất HHPƯ, ly tâm 
nhanh ống. 
 Chia đều 22 µl HHPƯ vào từng tuýp PCR 0,2 ml 
đặt trên giá lạnh. 
- Tra sản phẩm PCR vòng 1 vào HHPƯ trong tủ PCR Chamber (tại 
p.Amplification): 
 Đặt các tuýp PCR 0,2 ml chứa HHPƯ trên khay 
lạnh. 
 Trộn đều và ly tâm nhanh các ống chứa sản phẩm 
PCR vòng 1 đã được chuẩn bị trước. 
 Sắp xếp các mẫu theo thứ tự phù hợp. 
 Tra 3 µl sản phẩm PCR vòng 1 vào các tuýp 0,2 ml 
tương ứng chứa HHPƯ cho PCR vòng 2. Hút pipet lên xuống 3 
lần để đồng nhất hỗn hợp. 
 Ly tâm nhanh các tuýp 0,2 ml. 
- Thực hiện phản ứng PCR (tại phòng Amplification): 
 Đặt riêng rẽ các tuýp PCR 0,2 ml PR2 và RT2 vào 
các máy PCR Proflex 
 Lựa chọn chương trình nhiệt trong thư mục 
“IHHIVDRM” đã được cài đặt trên máy. Kiểm tra tổng thể tích 
phản ứng là 25 µl. 
 Khuếch đại đoạn PR, chọn chương trình 
“PCR2PR”. Kiểm tra thể tích khai báo. 
 Khuếch đại đoạn RT, chọn chương trình 
“PCR2RT”. Kiểm tra thể tích khai báo 
- Khi kết thúc quá trình chạy PCR, bảo quản sản phẩm PCR tại tủ 4oC 
trong phòng Detection trong 24 giờ hoặc tủ -20oC trong phòng Amplification 
trong thời gian lâu hơn. 
- Lưu ý: Khi không thể khuếch đại cả đoạn RT hoặc chất lượng giải 
trình tự đoạn RT không đảm bảo, thực hiện tách đoạn RT để khuếch đại riêng 
rẽ RT-Begin và RT-Middle bằng PCR vòng 1 và PCR vòng 2. 
10.4. Điện di sản phẩm PCR vòng 2 (Tại phòng Detection) 
- Điện di sản phẩm PCR vòng 2 theo hướng dẫn công việc “Điện di axit 
nucleic” (HDCV09) với các điều kiện điện di: 
 Hiệu điện thế: 100 V 
 Thời gian: 30 phút 
- Sử dụng gel agarose 1% và thang chuẩn ADN 1kb. 
- Với giếng cho thang chuẩn ADN: tra 5µl thang chuẩn ADN (nồng độ 
0.1 µg/µl). Với các giếng cho mẫu: tra 1µl 6X Loading Dye và 5µl sản phẩm 
PCR vòng 2. 
- Sản phẩm ADN được nhân lên có kích thước: đoạn PR (573bp), đoạn 
RT (1139bp). 
- Đánh giá kết quả điện di sản phẩm PCR vòng 2 và xác định các mẫu 
có băng sản phẩm đặc hiệu để tinh sạch và pha loãng. 
10.5. Chuẩn bị mẫu cho phản ứng Cycle Sequencing 
10.5.1. Pha loãng sản phẩm PCR 
- Lượng ADN cần thiết cho phản ứng Cycle Sequencing (thể tích 10 µl), sử 
dụng sinh phẩm BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing là 05 - 20 ng. 
- Xác định hệ số pha loãng mẫu để có lượng ADN phù hợp cho vào 
phản ứng Cycle Sequencing bằng 2 cách: 
 Xác định nồng độ ADN bằng phương pháp đo 
quang phổ (tham khảo HDTB38 về cách sử dụng máy đo quang 
phổ). 
 Xác định nồng độ ADN tương đối bằng cách so 
sánh độ sáng của băng điện di sản phẩm PCR đặc hiệu với vạch 
có kích thước tương ứng trong thang chuẩn ADN. 
Thang 
ADN A B C D E 
Hình 1. Minh họa về cách xác định tỷ lệ pha loãng mẫu khi so sánh độ sáng 
của các băng điện di đặc hiệu với thang chuẩn ADN 
Mẫu A B C D E 
Tỉ lệ pha loãng 1:40 Không pha loãng 1:5 1:15 1:20 
- Tại phòng Amplification: 
 Thực hiện pha loãng sản phẩm PCR đã tinh sạch 
trong tủ PCR chamber. 
 Chuẩn bị số lượng tuýp 0,2 ml phù hợp. Ghi rõ mã 
số mẫu và tỉ lệ pha loãng trên các tuýp. Đặt các tuýp trên khay 
lạnh theo thứ tự cần pha loãng. 
 Đặt các tuýp chứa sản phẩm PCR cần pha loãng trên 
khay lạnh theo thứ tự tương ứng. 
 Tra nước không chứa nuclease vào tuýp 0,2 ml với 
thể tích đã tính toán. 
 Tra sản phẩm PCR đã tinh sạch vào tuýp 0,2 ml 
tương ứng để có nồng độ ADN cần thiết. 
 Hút pipet lên xuống 3 lần để đồng nhất hỗn hợp. 
Sau đó ly tâm nhanh. 
 Bảo quản sản phẩm PCR gốc (chưa pha loãng hết) ở 
tủ -20oC tại P. Amplification. 
10.6. Thực hiện phản ứng cycle sequencing 
10.6.1. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng (HHPƯ) cho Cycle Sequencing (phòng 
Reagent): 
- Rã đông các ống chứa thành phần phản ứng tại nhiệt độ phòng: 
 Mồi (nồng độ 2 µM): 2 mồi (PCR_F2, PCR_R4) 
cho đoạn PR và 4 mồi (PCR_F4, SEQ_F2, PCR_R2, SEQ_R1) 
cho đoạn RT. 
 Nước không có nuclease. 
 5X Big Dye Buffer . 
- Lưu ý: Lấy ống Big Dye v3.1 Reaction Mix từ tủ -20oC và giữ trên 
khay lạnh. 
- Chuẩn bị số lượng thanh 8 tuýp 0,2 ml phù hợp với số lượng mẫu. Ghi 
mã số mẫu trên thanh phản ứng và ghi vị trí tuýp ương ứng với biểu mẫu trên 
từng tuýp 0,2 ml. 
- Chuẩn bị 1 tuýp 1,5 ml để pha HHPƯ. 
- Dùng máy lắc để trộn đều dung dịch trong ống chứa mồi, ống 5X Big 
Dye Buffer. Sau đó, ly tâm nhanh các ống. 
- Lưu ý: Không đảo trộn mạnh ống chứa enzyme. Ly tâm nhanh nếu 
cần thiết. 
- Pha HHPƯ cho Cycle sequencing: 
TT Thành phần Cho 1 phản ứng (µl) 
Cho n phản 
ứng (µl) 
1 Big Dye v3.1 Reaction Mix 1,0 1,0 x n 
2 5X Big Dye Buffer 2,0 2,0 x n 
3 dH20 3,0 3,0 x n 
 Tổng thể tích 6,0 6,0 x n 
- Chia HHPƯ vào từng tuýp 0,2 ml của thanh phản ứng với thể tích 6 
µl/tuýp. 
- Tra các loại mồi (nồng độ 2µM) vào từng tuýp 0,2 ml tương ứng trên 
thanh phản ứng với thể tích 2 µl/ tuýp. Nồng độ cuối của mồi là 0,4 µM. 
- Đảo trộn nhẹ nhàng để đồng nhất HHPƯ. 
10.6.2. Tra sản phẩm PCR đã chuẩn bị vào HHPƯ (phòng Amplification): 
- Đặt các thanh phản ứng trên khay lạnh. 
- Trộn đều và ly tâm nhanh các ống chứa sản phẩm PCR đã được chuẩn 
bị cho phản ứng Cycle Sequencing. 
- Sắp xếp các ống chứa mẫu theo thứ tự phù hợp. 
- Tra 2 µl mẫu vào các tuýp 0,2 ml chứa HHPƯ Cycle Sequencing 
tương ứng. 
- Hút pipet lên xuống 3 lần để đồng nhất hỗn hợp. Ly tâm nhanh các 
thanh phản ứng. 
- Đặt các thanh phản ứng vào máy PCR Proflex. 
- Lựa chọn chương trình nhiệt “HIVSEQ” trong thư mục 
“IHHIVDRM” đã được cài đặt trên máy. Kiểm tra tổng thể tích phản ứng là 
10µl. 
- Khi kết thúc chương trình nhiệt, bọc giấy bạc các sản phẩm Cycle 
Sequencing và bảo quản tại tủ 4oC trong phòng Detection. 
10.7. Tinh sạch sản phẩm Cycle sequencing bằng hóa chất 
- Tinh sạch sản phẩm phản ứng Cycle Sequencing theo hướng dẫn công 
việc “Giải trình tự ADN sử dụng sinh phẩm BigDye Terminator v3.1 Cycle 
Sequencing trên máy ABI 3130”. 
10.8. Giải trình tự bằng phương pháp điện di mao quản trên 
máy ABI 3130 
- Tra 10µl mẫu vào các giếng trên đĩa 96 giếng Micro Amp theo đúng 
vị trí. 
- Thực hiện điện di mao quản theo hướng dẫn “Giải trình tự ADN sử 
dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing trên máy ABI 3130” . 
 Sử dụng mao quản có chiều dài 50 mm và sinh 
phẩm POP-7 để chạy điện di. 
 Chương trình chạy: RUN_POP7_50. 
 Chương trình phân tích: Sequencing_POP7_V3.1 
10.9. Phân tích kết quả 
10.9.1. Xử lý dữ liệu kết quả 
- Kết quả điện di mao quản được thu thập và xử lý bằng phần mềm 
DNA sequencing analysis v5.1 trên máy tính kết nối với máy ABI 3130. Sao 
chép kết quả ra đĩa CD/DVD và lưu vào máy tính IVVI-CPU-08. 
- Kiểm tra chất lượng từng trình tự thu được theo các tiêu chuẩn. 
- Sử dụng phần mềm SeqMan để tổng hợp trình tự nucleotide thu được 
từ các mồi riêng biệt thành 1 trình tự gen hoàn chỉnh. 
- Xác định trình tự nucleotide. Trình tự tổng hợp cần được khẳng định 
dựa trên dữ liệu từ tối thiểu 2 trình tự riêng biệt. 
- Trình tự nucleotide tổng hợp cần được kiểm tra lại bởi một nhân viên 
khác để có kết quả thống nhất trước khi đăng tải lên trang web phân tích. Sử 
dụng biểu mẫu “Kết quả giải trình tự” để tổng hợp kết quả. 
- Lưu trình tự gen đã tổng hợp bằng 2 dạng file: FASTA và SQD theo 
từng mẫu trên máy tính IVVI-CPU-08. 
- Trình tự gen đã tổng hợp được đăng tải lên trang web 
 và được phân tích 
bởi phần mềm trực tuyến để xác định kiểu gen và những đột biến kháng thuốc 
trên đoạn gen PR và RT của virus HIV-1. 
10.9.2. Báo cáo kết quả 
- In bản báo cáo kết quả từ trang web và lưu giữ cùng các biểu mẫu 
thực hiện quy trình trong tập hồ sơ: “Xác định kiểu gen và phân tích đột biến 
kháng thuốc của HIV (In-house)”. 
- Tham khảo thông tin về đột biến kháng thuốc theo phụ lục 2,3 và 4 
của quy trình. 
- Kết quả báo cáo tổng hợp bởi trang web gồm 5 phần: 
Phần 1: Dữ liệu tổng quát: 
 Số lượng bộ 3 mã hóa trên từng đoạn gen PR và RT 
(số lượng bộ 3 tối thiểu của đoạn PR: 10-95 codon và đoạn RT: 
41-238 codon). 
 Thông tin về những nucleotide được chèn thêm 
hoặc mất đi. 
 Xác định kiểu gen của virus HIV-1: Kiểu gen của 
virus HIV-1 được xác định dựa trên độ tương đồng về trình tự 
nucleotide khi so sánh trình tự gen cần phân tích với trình tự gen 
tham khảo của các kiểu gen khác nhau của virus HIV-1 (kiểu gen 
A, B, C, D, F, G, H, J, K, CRF01_AE và CRF02_AG). 
Phần 2: Đánh giá chất lượng của trình tự gen (QA): 
- Chất lượng của trình tự gen được báo cáo bằng bảng và biểu đồ cột: 
 Bảng báo cáo bao gồm các hạng mục đánh giá sau: 
 Đoạn trình tự gen có chứa bộ ba kết thúc hoặc 
bị dịch chuyển khung dịch mã acid amin khi chèn thêm 
hoặc mất đi nucleotide. 
 Đoạn trình tự gen có chứa các nucleotide 
không rõ ràng như: N (tổng hợp của A, C, G, T); B (tổng 
hợp của C, G, T); D (tổng hợp của A, G, T); H (tổng hợp 
của A, C, T) và V (tổng hợp của A, C, G). 
 Đoạn trình tự gen có chứa nhiều các đột biến 
không thường gặp. Các đột biến này không gây ra kháng 
thuốc và tần suất xuất hiện < 0,05%. 
 Biểu đồ hình cột: 
 Cột màu xanh: Vị trí các bộ 3 mã hóa trên đoạn gen của 
mẫu khác với trình tự gen tham khảo của virus HIV 
subtype B. 
 Cột cao màu xanh: Vị trí các đột biến có liên quan tới 
kháng thuốc. 
 Cột màu đỏ: Vị trí các bộ 3 mã hóa có vấn đề về chất 
lượng trình tự, được nêu chi tiết trong bảng báo cáo. 
Phần 3: Kết quả về các đột biến kháng thuốc trên vùng PR 
 Liệt kê các loại đột biến kháng thuốc: 
 Đột biến kháng thuốc chính: gây ra kháng thuốc HIV. 
 Đột biến kháng thuốc thứ yếu: có thể gây ra kháng thuốc 
HIV hoặc khi phối hợp với các đột biến khác cũng sẽ gây 
ra kháng thuốc HIV. 
 Đột biến khác: là những đột biến thường gặp (kể cả ở 
những bệnh nhân chưa được điều trị) và ảnh hưởng không 
đáng kể tới kháng thuốc HIV. 
 Liệt kê khả năng kháng với 8 loại thuốc gây ức chế 
enzyme Protease (Atazanavir, Darunavir, Fosamprenavir, 
Indinavir, Lopinavir, Nelfinavir, Saquinavir và Tipranavir). 
 Các mức độ kháng thuốc bao gồm: 
 Không bị kháng. 
 Có khả năng kháng thấp hoặc kháng mức độ thấp. 
 Có khả năng kháng hoặc kháng mức độ trung bình. 
 Kháng mức độ cao. 
 Giải thích ảnh hưởng của từng đột biến kháng thuốc 
với 8 loại thuốc trên. 
Phần 4: Kết quả về các đột biến kháng thuốc trên vùng Reverse 
Transcriptase 
 Liệt kê các đột biến: 
 Đột biến kháng nhóm thuốc Nucleoside Reverse 
Transcriptase Inhibitors (NRTI). 
 Đột biến kháng nhóm thuốc Non-Nucleoside Reverse 
Transcriptase Inhibitors (NNRTI). 
 Đột biến khác. 
 Liệt kê khả năng kháng với: 
 7 loại thuốc nhóm NRTI (Lamivudine, Abacavir, 
Zidovudine, Stavudine, Didanosine, Emtricitabine, 
Tenofovir). 
 4 loại thuốc nhóm NNRTI (Delavirdine, Efavirenz, 
Etravirine, Nevirapine). 
 Các mức độ kháng thuốc. 
 Giải thích ảnh hưởng của từng đột biến kháng thuốc 
với 11 loại thuốc trên. 
Phần 5: Tính điểm cho các đột biến kháng thuốc 
 Với mỗi đột biến kháng thuốc phát hiện được, mức 
độ các đột biến gây kháng với thuốc kháng HIV được thể hiện 
dưới dạng điểm số. Không gây kháng thuốc: 0 điểm. Điểm số 
càng cao thì mức độ kháng càng tăng. 
 Trong trường hợp phần 4 không giải thích rõ ảnh 
hưởng của các đột biến gây kháng với thuốc nào thì căn cứ vào 
điểm số để quyết định khả năng kháng thuốc của các đột biến. 
10.10. Ghi dữ liệu file kết quả 
Lưu dữ liệu kết quả xét nghiệm vào đĩa ghi dữ liệu “Xác định kiểu gen 
và phân tích đột biến kháng thuốc HIV (In-house)” định kỳ ít nhất 2 tháng/ 
lần. 
11. Kết quả và biện luận 
11.1. Hiệu lực xét nghiệm: 
- Lần xét nghiệm được coi là đạt khi: 
 Mẫu chứng dương có trình tự nucleotide rõ ràng và 
không có đột biến kháng thuốc. 
 Mẫu chứng âm: không có băng ADN khi điện di 
kiểm tra sản phẩm PCR vòng 2. 
- Nếu kết quả xét nghiệm không đạt, QLCL, QLKT và nhân viên xét 
nghiệm cần thực hiện thủ tục “Xác định và kiểm soát sự không phù hợp” 
(MS-TT08). 
11.2. Nhận định kết quả 
- Trình tự nucleotide xác định bởi từng mồi được coi là đạt khi đảm bảo 
các tiêu chuẩn nêu trong HDCV21. 
- Đối với mỗi mẫu, trình tự nucleotide tổng hợp từ các mồi được coi là 
đạt khi: 
 Trình tự tổng hợp cần được khẳng định dựa trên tối 
thiểu 2 trình tự. 
 Số lượng bộ 3 mã hóa cần thiết tối thiểu của đoạn 
PR: 10-95 codon và đoạn RT: 41-238 codon. 
 Không có bộ ba kết thúc trong trình tự nucleotide 
phân tích. 
- Khi có các vấn đề về chất lượng trình tự nucleotide, thảo luận để đưa 
ra biện pháp xử lý thích hợp: 
 Tổng hợp và phân tích lại kết quả trình tự nucleotide 
trên phần mềm SeqMan. 
 Thực hiện lại xét nghiệm từ phản ứng Cycle 
Sequencing hoặc phản ứng PCR nếu cần thiết. 
Phụ lục 5 
DANH SÁCH CÁC ĐỘT BIẾN CẦN THEO DÕI (SDRMs) 
Đột biến với NRTIs 
Đột 
biến 
Điểm(1) 
Đột 
biến 
cần 
giám 
sát 
Tỷ lệ đột biến % không 
có thêm 
đột biến 
chính 
khác(2) 
Mức độ kháng kiểu hình 
Bệnh 
nhân 
chưa tiếp 
xúc ARV 
Bệnh 
nhân đã 
điều trị 
ARV 
3TC ABC AZT TDF 
(1)Điểm tính mức độ kháng thuốc theo ngân hàng dữ liệu kháng thuốc HIV của Stanford, 
(2) tỷ lệ mẫu bệnh nhân có đột biến kháng thuốc không có thêm đột biến chính khác 
kháng NRTIs (điểm ≥ 30)/tổng số mẫu có đột biến kháng thuốc. 
Đột biến với NNRTIs 
Đột 
biến 
Điểm(1) 
Đột 
biến 
cần 
giám 
sát 
Tỷ lệ đột biến % không 
có thêm 
đột biến 
chính 
khác(2) 
Mức độ kháng kiểu hình 
Bệnh 
nhân 
chưa tiếp 
xúc ARV 
Bệnh 
nhân đã 
điều trị 
ARV 
NVP EFV ETR RPV 
(1)Điểm tính mức độ kháng thuốc theo ngân hàng dữ liệu kháng thuốc HIV của Stanford, 
(2) tỷ lệ mẫu bệnh nhân có đột biến kháng thuốc không có thêm đột biến chính khác 
kháng NNRTIs (điểm ≥ 60/tổng số mẫu có đột biến kháng thuốc. 
Đột biến với PIs 
Đột biến Điểm(1) 
Đột 
biến 
cần 
giám 
sát 
Tỷ lệ đột biến 
% không có 
thêm đột 
biến chính 
khác(2) 
Mức độ kháng kiểu hình 
Bệnh nhân 
chưa tiếp 
xúc ARV 
Bệnh nhân 
đã điều trị 
ARV 
ATV DRV LPV 
(1)Điểm tính mức độ kháng thuốc theo ngân hàng dữ liệu kháng thuốc HIV của Stanford, 
(2) tỷ lệ mẫu bệnh nhân có đột biến kháng thuốc không có thêm đột biến chính khác kháng 
PIs (điểm ≥ 30)/tổng số mẫu có đột biến kháng thuốc.