Luận án Xác định tỷ lệ nhiễm và genotype của Human Papillomavirus trên gái mại dâm tại Hải Phòng, Việt Nam

ĐẶT VẤN ĐỀ
	Human Papillomavirus (HPV) là tác nhân thường gặp nhất trong các nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục và là nguyên nhân quan trọng dẫn tới ung thư cổ tử cung (UTCTC), loại ung thư đứng hàng thứ hai trong các loại ung thư ở nữ giới [1]. 
	Hàng năm trên thế giới, ước tính có khoảng 529.000 ca mắc mới UTCTC, tử vong khoảng 275.000 trường hợp, trong đó 85% tổng số các trường hợp bệnh gặp ở những nước đang phát triển [2]. Mỗi năm, Châu Á có thêm khoảng 312.000 bệnh nhân UTCTC, chiếm 59% trường hợp mắc mới trên toàn thế giới đặc biệt ở khu vực Nam Á và Đông Nam Á, nơi có tỷ lệ nhiễm HPV cao nhất trong châu lục [1], [2]. Cùng với sự tăng nhanh tỷ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng, UTCTC thực sự trở thành gánh nặng bệnh tật toàn cầu, gây ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe và tâm lý của nữ giới.
HPV thuộc họ Papillomaviridea với hơn 200 genotype khác nhau về vật liệu di truyền trong đó đã được xác định khoảng 100 genotype, và khoảng 40 genotype HPV đã được xác định ở niêm mạc đường sinh dục người [3], [4]. Những genotype HPV "nguy cơ cao" gây tăng sinh, loạn sản và gây biến đổi tế bào cổ tử cung dẫn đến ung thư thường thuộc loại alpha mucosotropic -5, -6, -7, -9, -11 [5], [6]. Tám genotype HPV (HPV-16, -18, -31, -33, -35, -45, -52, và -58) được thống kê là những genotype phổ biến nhất, có liên quan tới hơn 90% các trường hợp UTCTC trên toàn thế giới và riêng HPV-16, -18 gặp ở 70% các trường hợp [7], [8].
	HPV không chỉ có mối liên quan mật thiết với UTCTC mà còn có vai trò quan trọng trong sự hình thành ung thư hậu môn, âm hộ, âm đạo, dương vật, ung thư phổi và một số ung thư vùng hầu họng. Đồng thời, HPV còn là nguyên nhân của nhiều bệnh cảnh lâm sàng trên da và niêm mạc như hạt cơm, sùi mào gà sinh dục-hậu môn, u nhú thanh quản trẻ sơ sinh...[9].
	Hiện nay, vắc xin phòng chống HPV-16 và HPV-18 đã góp phần đáng kể trong việc giảm tỷ lệ UTCTC trên thế giới. Tuy nhiên, sự phân bố các genotype HPV lại thay đổi theo từng vùng địa lý và theo từng sắc tộc khác nhau [10]. Hơn nữa, khả năng bảo vệ chéo của vắc xin phòng chống HPV-16, -18 được chứng minh là kém hiệu quả hơn đối với các genotype "nguy cơ cao" khác (dưới 1%) [11], [12]. Theo kết quả nghiên cứu dịch tễ học, HPV-16 và HPV-18 là những genotype phổ biến nhất tại châu Âu và châu Mỹ [13], ngược lại ở châu Á, HPV-16, HPV-52 và HPV-58 là những genotype chiếm tỷ lệ cao nhất [14]. Tại Nhật Bản, Philippine, Đài Loan và tỉnh Chiết Giang phía nam Trung Quốc, HPV-52 được xác định là genotype HPV thường gặp nhất [15], [16], [17], [18]. Vì vậy, nghiên cứu về sự phân bố dịch tễ học genotype HPV liên quan tới sự biến đổi tế bào theo vùng địa lý và chủng tộc là những thông tin rất cần thiết cho chương trình triển khai vắc xin phòng chống HPV và kế hoạch triển khai các phương pháp phát hiện, sàng lọc sớm HPV trong cộng đồng.
	Tại Việt Nam, theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới năm 2010, UTCTC hiện đang là loại ung thư chiếm tỷ lệ cao nhất ở nữ giới lứa tuổi 15 -44, với hơn 6000 ca nhiễm mới (tỷ lệ: 11,7 trên 100,000 phụ nữ) và tử vong hơn 3000 trường hợp mỗi năm [1]. Điều đặc biệt quan tâm là phần lớn các trường hợp UTCTC thường được phát hiện ở giai đoạn muộn, trong khi quá trình diễn tiến từ nhiễm vi rút đến ung thư thường trải qua trong một thời gian dài. Quá trình tiến triển từ mức độ loạn sản nhẹ, loạn sản vừa, loạn sản nặng đến ung thư tại chỗ (giai đoạn tổn thương có thể phục hồi) và đến giai đoạn ung thư xâm nhập có thể kéo dài từ 10 - 25 năm [19]. Đây chính là cơ hội có ý nghĩa cho việc phát hiện nhiễm HPV, sàng lọc những người có nguy cơ mắc UTCTC nhằm giúp quá trình điều trị hiệu quả các tổn thương tiền ung thư và ung thư giai đoạn sớm. Tuy nhiên, ở Việt Nam xét nghiệm tế bào mô bệnh học (xét nghiệm Pap smear) và phát hiện HPV DNA còn chưa phổ biến rộng rãi [20]. Hơn nữa, các kết quả nghiên cứu về sự phân bố dịch tễ học HPV trong cộng đồng còn hạn chế [14]. 
	Với tầm quan trọng và ý nghĩa của việc các định genotype HPV cũng như xuất phát từ thực tiễn nêu trên, đề tài "Xác định tỷ lệ nhiễm và genotype của Human Papillomavirus trên gái mại dâm tại Hải Phòng, Việt Nam" được thực hiện với các mục tiêu sau:
1. 	Xác định tỷ lệ nhiễm Human Papillomavirus và một số yếu tố liên quan trên đối tượng gái mại dâm tại Hải Phòng, Việt Nam.
2. 	Khảo sát sự phân bố genotype của HPV ở gái mại dâm nhiễm HPV. 
3. 	Đánh giá sự liên quan giữa sự biến đổi tế bào cổ tử cung và các genotype HPV. 
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Đặc điểm chung của Human Papillomavirus (HPV)
Hình thái và cấu trúc của HPV
	HPV là nhóm vi rút có kích thước nhỏ, họ Papillomavirideae, không vỏ, đối xứng xoắn ốc. Hạt vi rút có đường kính 52 - 55nm, vỏ gồm 72 đơn vị capsomer. Mỗi đơn vị capsid gồm một pentamer của protein cấu trúc L1 kết hợp với một protein L2 (protein này là thành phần kháng nguyên được sử dụng trong phản ứng miễn dịch đặc hiệu).
L2 protein
L1 capsomer
(Pentamer của protein L1)
DNA hai chuỗi, hình vòng (8kb)
Hình 1.1. Hạt vi rút của HPV
Cả hai protein cấu trúc đều do vi rút tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) có kích thước khoảng 55 kDa và chiếm khoảng 80% tổng số protein của vi rút. Protein capsid phụ (L2) có kích thước khoảng 70 kDa [3].
Đặc điểm cấu trúc và chức năng các gen của HPV
Đặc điểm cấu trúc
	HPV có vật liệu di truyền là DNA, một mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại dạng siêu xoắn hình vòng (circular ds-DNA). Bộ gen của vi rút chiếm khoảng 12% trọng lượng của hạt vi rút, chiều dài từ 7800 đến 8000 cặp base (bp) trong đó guanosine và cytosine chiếm 42%. DNA của vi rút liên kết với histone của tế bào chủ tạo thành cấu trúc phức hợp giống Chromatin (Chromatin-like complex).
	Cấu trúc bộ gen của nhóm Papillomavirus nói chung tương tự nhau ở các loài vật chủ, tất cả các khung đọc mở ORF (Open Reading Frame) của vi rút đều trên một chuỗi DNA. Điều này có nghĩa là tất cả các gen của vi rút nằm trên một mạch DNA và quá trình phiên mã xảy ra trên một mạch duy nhất. Bộ gen của HPV có 10 khung đọc mở ORF được chia làm hai loại là khung đọc mở sớm và khung đọc mở muộn tùy theo vị trí của ORF trong bộ gen [21].
Hình 1.2. Cấu trúc bộ gen của Papillomavirus và HPV 16 [3]
Bộ gen của HPV được chia làm ba vùng quan trọng [21]:
1. Vùng điều hòa thượng nguồn URR (Upstream Regulatory Region) hay còn được gọi là vùng điều hòa dài LCR (Long Control Region), chứa DNA không mã hóa, có chức năng điều hòa quá trình sao chép DNA và quá trình phiên mã. Đây là vùng biến động nhất, chiếm khoảng 10% chiều dài của bộ gen, tương đương 800 đến 1000 bp tùy theo từng genotype khác nhau.
Trình tự vùng URR bao gồm:
Trình tự tăng cường: là nơi gắn của các nhân tố phiên mã như AP-1, NF1, otc 1, TEF1, TEF2, YY1
Promoter bao gồm cấu trúc TATA và vùng khởi đầu cho quá trình phiên mã tổng hợp RNA (P97 ở HPV16 và P105 ở HPV18). 
 Điểm khởi đầu sao chép ORI, các tiểu phần kích hoạt và một số chuỗi gen câm (Silencing gene)
2. Vùng gen sớm (Early region): Gồm 6 gen, ký hiệu là E1, E2, E4, E5, E6, E7 và các khung đọc mở ORF. Sản phẩm của vùng gen này là các protein chức năng giúp cho quá trình nhân lên của DNA vi rút, gây hiện tượng tăng sinh tế bào và gây biến đổi tế bào, hình thành tế bào bất tử.
3. Vùng gen muộn (Late region): Gồm 2 gen tổng hợp protein L1 và L2, là những protein cấu trúc capsid của vi rút. Đây là vùng gen mã hóa muộn hơn, do đó vùng chứa gen L1 và gen L2 còn được gọi là vùng sao chép muộn.
Chức năng các gen và sản phẩm của gen HPV
Chức năng gen E1
	HPV là vi rút sử dụng hoàn toàn các thành phần tế bào chủ để sao chép DNA. Gen E1 là một trong hai vùng gen bảo tồn nhất của HPV (cùng với L1) mã hóa các protein chức năng có vai trò cần thiết cho quá trình sao chép DNA và plasmid. Gen E1 gắn vào vị trí khởi đầu của quá trình nhân lên (ori), thực hiện quá trình chia tách DNA (helicase) và giúp các chuỗi gen của vi rút duỗi ra trong quá trình sao chép. Hoạt động tháo xoắn của gen E1 không phụ thuộc ATP.
	Tại cơ thể sống, gen E1 và E2 đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh quá trình nhân lên của vi rút. Gen E2 còn có khả năng gắn với chuỗi DNA đặc hiệu (vị trí gắn E2 - E2BSs) và protein E1. Tuy nhiên, cả hai chức năng của E2 đều do gen E1 điều chỉnh. Trong quá trình sao chép vi rút, có nhiều thành phần tế bào phụ thuộc gen E1 như DNA polymerase, chaperone protein, histone H1 và yếu tố sao chép A vì gen E1 có khả năng trực tiếp thúc đẩy các thành phần này.
Chức năng gen E2
	Ngoài chức năng trong sao chép DNA của vi rút, gen E2 còn đóng vai trò chủ đạo trong quá trình phiên mã cũng như trong quá trình điều hòa giải mã và duy trì chuỗi gen vi rút ở ngoài nhiễm sắc thể. Chức năng điều hòa giải mã của gen E2 được thực hiện do sự gắn kết với E2BSs trong chuỗi gen của vi rút có ái lực với gen E2 và những vị trí liên quan này xác định hiệu quả của gen E2 trong quá trình giải mã. 
Ở chuỗi gen của HPV nhóm "nguy cơ cao", gen E2 có khả năng ức chế quá trình sao chép từ yếu tố thúc đẩy bộc lộ các gen sớm của vi rút, do đó khi gen HPV nhóm "nguy cơ cao" xâm nhập vào nhiễm sắc thể vật chủ sẽ làm tăng khả năng bộc lộ gen gây ung thư E6 và E7. 
Chức năng gen E1^E4
	Giống như các protein khác của HPV, protein điều hòa E1^E4 là sản phẩm được tạo ra từ mRNA kết nối khi vòng mở dịch chuyển gen E1 và E4, có chức năng giúp cho quá trình trưởng thành và phóng thích vi rút ra khỏi tế bào mà không làm tan tế bào chủ.
Gen E1^E4 chứa 3 dạng chính tác động vào chu kỳ sống của vi rút gồm: (1) Dạng gen chứa nhiều leucine ở đầu tận cùng N liên quan đến keratin và cần thiết cho nhân lên của DNA; (2) Vùng chừa nhiều proline ở đoạn trung tâm, chứa vị trí threonine cần thiết cho khoảng nghỉ của chu kỳ tế bào tại giai đoạn G2/M và giải mã của phức hợp cyclinB/cdk1 ở bào tương; (3) Đầu tận cùng C chứa domain đơn dạng kiểu niêm mạc và điều hòa khả năng gen E1^E4 tạo ra sự olimerize, gắn với DEAD-box RNA helicase và tạo ra sự phá vỡ hệ thống sợi keratin. 
Chức năng gen E5
	Gen E5 mã hóa cho sản phẩm là protein E5, một protein chuỗi đôi kỵ nước, kích thước nhỏ nằm ở phần màng Golgi và lưới nguyên sinh chất của tế bào, cần thiết cho quá trình xâm nhập và tồn tại của vi rút trong tế bào chủ. Protein E5 là yếu tố tác động ngay trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm, tạo ra các phức hợp với các thụ thể của yếu tố kích thích tăng trưởng và biệt hóa tế bào đồng thời giúp cho vi rút lẩn trốn đáp ứng miễn dịch của chủ thể.
Mặt khác, protein E5 còn có vai trò trong việc ngăn chặn sự chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào khi có sự sai hỏng do chính vi rút gây ra. Khả năng của E5 gây nên sự biến đổi của tế bào do gen E5 có khả năng hoạt hóa receptor của yếu tố phát triển và ức chế ATPase không bào. 
Chức năng gen E6 [4].
Gen E6 mã hóa cho protein E6, gồm khoảng 150 acid amin hình thành cấu trúc Cys-X-X-Cys gắn với kẽm (Zn) điều hòa, mã hóa cho khung đọc mở ORF đầu tiên trong chuỗi gen của HPV và là một trong các protein gây ung thư chính của HPV. 
Ba chức năng chính của gen E6 cũng là ba chức năng rất nguy hiểm đối với tế bào vật chủ: 
(1) Protein E6 của HPV nhóm “nguy cơ cao” liên kết hoặc không liên kết với protein E7 gây kích thích tế bào chủ phân chia mạnh mẽ và sự phân chia này là mãi mãi, gây bất tử hóa tế bào. Protein E6 có khả năng gây quá sản bằng cách ức chế chu kỳ nghỉ của vòng tế bào do sự phá hủy DNA và gây thúc đẩy sự tiến triển của tế bào. Khả năng gây ung thư của E6 được điều hòa bởi khả năng hoạt động như giá đỡ và điều hòa tương tác protein với protein. Một số tương tác protein mà được mã hóa trên chuỗi E6 gồm: p53, protein liên quan đến E6 (E6AP), protein gắn với E6 (E6BP), c-myc, p300/CBP, paxillin, protein PDZ, yếu tố điều hòa interferon 3 và đồng phần của Bcl-2 (Bak).
(2) Tương tác với p53 thông qua sự liên kết giữa E6 với E6AP bằng liên kết ligand, tạo ra thoái triển của p53 (yếu tố giải mã và ức chế ung thư, có vai trò điều hòa chính hoạt động ức chế tổng hợp DNA thông qua chu kỳ nghỉ của vòng tế bào). 
Bình thường, khi có tín hiệu phá hủy tế bào hoặc có sự nhân lên sai của DNA, gen ức chế ung thư p53 được hoạt hóa sẽ chuyển vòng tế bào sang chu kỳ nghỉ hoặc gây chết tế bào theo chương trình (apotosis) thông qua hoạt động giải mã của gen. 
Hơn nữa, E6 còn có khả năng gắn kết với protein PDZ dẫn đến sự thoái triển của protein PDZ, một protein được bảo tồn trong quá trình tiến hóa, cần thiết cho sự phát triển, kết dính, tăng sinh, biệt hóa và duy trì chu kỳ sống của tế bào. 
(3) Liên kết với gen ras trong quá trình bất tử hóa tế bào và kích thích sự phát triển của NIH 3T3, đồng thời hoạt hóa promoter E2 của Adenovirus.
Chức năng gen E7 [4], [7]
	Protein E7 được mã hóa từ gen E7 gồm 98 acid amin, tuy nhỏ hơn protein E6 nhưng cũng có vai trò không kém phần quan trọng trong cơ chế gây ung thư ở tế bào chủ. 
	Hoạt động chức năng của E7 trong cơ chế gây ung thư do (1) protein E7 có vùng bảo tồn đầu tận cùng N và có domain gắn Kẽm ở đầu C giúp liên kết chặt chẽ hơn với E6, hỗ trợ nhau trong cơ chế gây bất tử hóa tế bào; (2) E7 chứa motif gắn protein pocket (LXCXE) giúp E7 gắn kết với các gen ức chế khối u (như pRb) hoặc gắn với 2 protein pocket khác là p107 và p130 làm giải phóng một số lượng lớn yếu tố phiên mã E2F tự do, kích thích quá trình phiên mã, kéo dài tuổi thọ tế bào. 
Protein E7 của HPV nhóm “nguy cơ cao” cũng như của nhóm “nguy cơ thấp” đều có khả năng gắn kết với protein pocket. Tuy nhiên, sự ưu tiên gắn kết của protein E7 với protein pocket khác nhau giữa hai nhóm HPV. Ái lực liên kết này ở những type “nguy cơ cao” cao gấp 10 lần so với ở những type “nguy cơ thấp”. 
Thông thường, pRb bị thủy phân sớm ở chu kỳ của tế bào. Ở giai đoạn phosphorin hóa, pRb ngắn với yếu tố sao chép E2F/DP (phức hợp hoạt hóa sao chép điều khiển sự bộc lộ các gen ở giai đoạn S) gây ức chế quá trình hoạt hóa phức hợp sao chép. Sang giai đoạn G1 muộn, pRb được phosphorine hóa bởi phức hợp cyclin/cdk, giải phóng phức hợp E2E/DP do đó các gen thúc đẩy giai đoạn S được hoạt hóa và giải mã. 
Trong trường hợp nhiễm HPV, sự bộc lộ gen E7 không cần quá trình phosphorine hóa pRb để hoạt hóa phức hợp sao chép E2F/DP. Sự kết hợp của E7 với pRb đã được khử phosphorin dẫn đến giải phóng phức hợp E2F/DP từ pRb và hoạt hóa tiếp theo của phức hợp E2F. Do đó, sự bất hoạt E7 của pRb tạo điều kiện cho HPV có khả năng vượt quả sự ức chế pRb trong chu kỳ tế bào. 
Chức năng gen L1 và L2
	L1 và L2 là hai vùng gen cấu trúc còn gọi là vùng gen mã hóa muộn cho protein vỏ capsid chính và phụ. Trên kính hiển vi điện tử, vỏ capsid của HPV chứa 72 capsomere có cấu trúc vòng bảy cạnh trên hàng rào dạng lưới icosahedral T=7 với kích thước đường kính khoảng 55nm. Gen L1 là vùng bảo tồn nhất của vi rút và được dùng để phát hiện cũng như trong phân loại Papillomavirus.
	Thành phần của vỏ capsid vi rút gồm protein capsid chính L1, và capsid phụ L2. Khi chỉ gen L1 bộc lộ, có thể hình thành các hạt giả vi rút hoặc phân tử giống vi rút (Virus like particles, VLPs), các thành phần này khó phân biệt với vi rút thực sự và đóng vai trò quyết định trong sản xuất vi rút, sản xuất vắc xin. Nếu L2 bộc lộ cùng với L1, nó cũng góp phần tạ ... of HBV Infection Among Different HIV-Risk Groups in Hai Phong, Vietnam. Journal of Medical Virology. 83:399–404. 
Linda D., Michael J.C., Nguyen T.L.A., et al. (2012). Hepatitis C virus in Vietnam: High prevalence in Dialysis and Multi-transfused Patients involving disease and novel virus variants. The journal of medical virology 7: 2166 - 2178.
Dorothy M.A., Seiji K., Hiroshi I., et al. (2005). Rapid spread of Hepatitis C Virus among Injecting-Drug Users in Philippine Implication for HIV Epidemics. The journal of medical virology 77:221-226.
Tatjana V.C., Ira G.M., Adriana V., et al. (2009). Seroprevalence, risk factors and Hepatitis C virus genotypes in Groups with high-risk Sexual behabior in Croatia. The journal of medical virology 81: 1348 - 1353.
Duong T.C., Nguyen T.H., Roger D., et al. (2008). Sexual risk and bridging behaviors among yong people in HaiPhong, Vietnam”. AIDS behaviors. 12 (4): 643 – 651. 
Iftner T., Villa L.L. (2003). Chapter 12: Human Papillomavirus Technologies. Journal of the National Cancer Institute Monographs. 31: 80 – 88.
Zaravinos A., Mammas I.N., Sourvinos G., Spandidos D.A. (2009). Molecular detection methods of human papillomavirus (HPV). Int J Biol Markers. 24:215-222.
Jones J., Powell N.G., Hibbitts S., et al. (2009). Comparison of the PapilloCheck DNA micro-array Human Papillomavirus detection assay with Hybrid Capture II and PCR-enzyme immunoassay using the GP5/6+ primer set. J Clin Virol. 10:100-104.
Ermel A., Qadadri B., Brown D., et al. (2010). Human papillomavirus detection and typing in thin prep cervical cytologic specimens comparing the Digene Hybrid Capture II Assay, the Roche Linear Array HPV Genotyping Assay, and the Kurabo GeneSquare Microarray Assay. J Virol Methods 169(1):154-61.
Gheit T., Landi S., Tommasino M., et al. (2006). Development of a sensitive and specific assay combining multiplex PCR and DNA microarray primer extension to detect high-risk mucosal human papillomavirus types. J Clin Microbiol. 44:2025–2031.
Inglis. S, Shawb A., Koenig S. (2006). Chapter 11: HPV vaccines: Commercial Research & Development. Vaccine. 24: 99–105.
Molijn A., Kleter B., Quint W., van Doorn L.J. (2005). Molecular diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections. J Clin Virol. 32 Suppl 1:S43-51.
Qu W., Jiang G., Burk R.D., et al. (1997). PCR detection of human papillomavirus: Comparison between MY09/MY11 and GP5+/GP6+ primer systems. J ClinMicrobiol 35: 1304–1310.
Christopher P., Derek W., Quade B.J. (2003). Cervical Cancer Screening: From the Papanicolaou Smear to the Vaccine Era. Journal of Clinical Oncology. 21(10): 224-230.
Paavonen J., Salmerón J., F. Struyf F., et al. (2009). Efficacy of human papillomavirus (HPV)-16/18AS04-adjuvanted vaccine against cervical infection and precancer caused by oncogenic HPV types (PATRICIA): final analysis of a double-blind, randomised study in young women. Lancet. 10(374): 301–314.
Nielsen A., Kjaer S.K., Munk C., Iftner T. (2008). Type-specific HPV infection and multiple HPV types: prevalence and risk factor profile in nearly 12,000 younger and older Danish women. Sex Transm Dis.35: 276–282.
van der Graaf Y., Molijn A., van den Tweel J., et al. (2002). Human papillomavirus and the long-term risk of cervical neoplasia. Am J Epidemiol. 156:158 – 64.
Herrero R., Hildesheim A., Bratti C., et al. (2000). Population-based study of human papillomavirus infection and cervical neoplasia in rural Costa Rica. J Natl Cancer Inst. 2000;92:464 – 74.
Fife K.H., Cramer H.M., Schroeder J.M., Brown D.R. (2001). Detection of multiple human papillomavirus types in the lower genital tract correlates with cervical dysplasia. J Med Virol. 64:550 – 9.
WHO. (2005). World Health Survey, Vietnam. Available at: 
Domingo E.J., Noviani R., Quinn M.A., et al. (2008). Epidemiology and Prevention of Cervical Cancer in Indonesia, Malaysia, the Philippines, Thailand and Vietnam. Vaccine.26S M71–M79.
Pista A., de Oliveira C.F., Real O., et al. (2012). Risk factors for human papillomavirus infection among women in Portugal: The CLEOPATRE Portugal Study. Int J Gynaecol Obstet. 118:112-116.
Spinillo A., Dal Bello B., Gardella B., et al. (2009). Multiple human papillomavirus infection and high grade cervical intraepithelial neoplasia among women with cytological diagnosis of atypical squamous cells of undetermined significance or low grade squamous intraepithelial lesions. Gynecol Oncol. 113: 115–119.
Bosch F.X., Lorincz A., Munoz N., et al. (2002). The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. J Clin Pathol. 55: 244– 265.
Greenberg J., Magder L., Aral S. (2002). Age at first coitus: a marker for risky sexual behavior in women. Sex Transm Dis. 19:331–334.
Jessica A., Susan L., Burd D., et al. (2002). Mediators of the Association Between Age of First Sexual Intercourse and Subsequent Human Papillomavirus Infection. Pediatric. 109 (10). 1 – 8.
Nicol A.F., Fernandes A.T.G., Bonecini-Almeida M.G. (2005). Immune response in cervical dysplasia induced by human papillomavirus: the influence of human immunodeficiency virus-1 co-infection – Review. Mem Inst Oswaldo Cruz. 100(1): 1-12.
Grayman J.H., Nhan D.T., Minh T., et al. (2005). Factors associated with HIV testing, condom use, and sexually transmitted infections among female sex workers in Nha Trang, Vietnam. AIDS Behav  9(1):41-51.
zur Hausen H. (2009). Papillomaviruses in the causation of human cancers – a brief historical account. Virology 384, 260–265.
Schwarz E., Freese U.K., zur Hausen H.,et al. (1985). Structure and transcription of human papillomavirus sequences in cervical carcinoma cells. Nature.  314(6006):111-4.
Elizabeth I., Garner O. (2003). Cervical Cancer: Disparities in Screening, Treatment, and Survival. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 12: 242–247.
Yugawa T., Kiyono T. (2009). Molecular mechanisms of cervical carcinogenesis by high-risk human papillomaviruses: novel functions of E6 and E7 oncoproteins. Reviews in Medical Virology. 97-113.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
=========
HOÀNG THỊ THANH HUYỀN
X¸c ®Þnh tû lÖ nhiÔm vµ genotype cña 
Human Papillomavirus trªn g¸i m¹i d©m 
t¹i H¶i Phßng, ViÖt Nam
CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH Y HỌC
Mã số: 62720112
LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC
Cố vấn khoa học:
GS.TS. HIROSHI ICHIMURA
Hướng dẫn khoa học:
GS.TS. TẠ THÀNH VĂN
PGS.TS. TRẦN VĂN HỢP
HÀ NỘI – 2014 
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi muốn được bày tỏ là lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Thầy Tạ Thành Văn, GS.TS. Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, là người hướng dẫn khoa học, đã luôn giúp đỡ tôi, tận tình truyền đạt những kiến thức và những kinh nghiệm quý báu để tôi có thể hoàn thành luận án. Những kết quả tôi đạt được ngày hôm này có sự dày công vun đắp của Thầy, Người tôi luôn kính trọng.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trần Văn Hợp, phó chủ tịch Hội Gan mật Việt Nam, Chủ tịch Hội đồng Trung tâm nghiên cứu phòng chống ung thư, giáo viên đồng hướng dẫn. Thầy đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo, động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án này.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn trân trọng tới GS.TS. Hiroshi Ichimura, Trưởng khoa Virus học và hợp tác Sức khỏe Quốc tế,Trường Đại học Kanazawa, Nhật Bản, là người đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án ngày hôm nay.
Tôi xin mãi khắc ghi sự tận tâm của Người Thầy, GS.TS. Phạm Văn Thức, Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hải Phòng. Thầy là người luôn định hướng cho tôi trong nghiên cứu, truyền dạy cho tôi biết bao kiến thức khoa học và cuộc sống. Sự trưởng thành của tôi trên mỗi bước đường khoa học cũng như trong sự nghiệp đều có bàn tay và khối óc của Thầy. Sự động viên, giúp đỡ và dìu dắt của Thầy đã cho tôi thêm nghị lực để vượt lên chính mình, vượt lên những khó khăn trở ngại. 
Bằng tình cảm yêu mến và lời cám ơn chân thành, tôi xin gửi tới các Thầy Cô, các anh chị và các bạn đồng nghiệp Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein của Trường Đại học Y Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận án.
 Tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới: 
Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học, Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội.
Ban Giám hiệu, Bộ môn Hóa sinh, Khoa Cử nhân kỹ thuật Y học, Khoa xét nghiệm Trường Đại học Y Hải Phòng.
Ban lãnh đạo cùng toàn thể các nghiên cứu viên và thành viên của Khoa Virus học, Khoa giải phẫu bệnh Trường Đại học Kanazawa, Nhật Bản.
Ban Lãnh đạo cùng toàn thể cán bộ và nhân viên của Trung tâm phục hồi nhân phẩm Thanh Xuân, Hải Phòng.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các đối tượng nghiên cứu đã tình nguyện hợp tác giúp tôi thực hiện được nghiên cứu này.
Cuối cùng, tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng và tình yêu thương của Cha mẹ tôi, Cha mẹ Chồng cùng sự ủng hộ, động viên, thương yêu chăm sóc, khích lệ của Chồng, con và anh chị em trong gia đình, những người đã luôn ở bên tôi, là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận án.
Hải Phòng, tháng năm 2014
Hoàng Thị Thanh Huyền
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
	Đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi, tất cả những kết quả và số liệu trong luận án do chính tôi thực hiện.
	Tất cả số liệu và kết quả được trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước và nước ngoài.
	Phần còn lại trong luận án chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.
Tác giả luận án
Hoàng Thị Thanh Huyền
	Nghiên cứu được thực hiện dựa trên thỏa thuận hợp tác nghiên cứu khoa học giữa Trường Đại học Y Hải Phòng, Việt Nam và Khoa Y Trường Đại học Kanazawa, Nhật Bản với đề tài hợp tác nghiên cứu "Giám sát các bệnh lây truyền qua đường tình dục ở đối tượng gái mại dâm tại Hải Phòng, Việt Nam". 
	Đại diện phía Việt Nam:	GS.TS. PHẠM VĂN THỨC
	Đại diện phía Nhật Bản:	GS.TS. HIROSHI ICHIMURA
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ASC-H
Atypical squamous cell cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion.
Tế bào biểu mô vảy không điển hình nhưng chưa loại trừ tổn thương nội biểu mô vảy độ cao.
ASC-US
Atypical squamous cell of undetermined significance
Tế bào biểu mô vảy không điển hình, ý nghĩa chưa xác định
bp
base pair
Cặp bazơ
C. trachomatis
Clamydia trachomatis
CIN
Cervical intraepithelial neoplasia. 
Tân sản nội biểu mô.
DNA
DeoxyRibonucleic Acid
dNTP
Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA
EthyleneDiamineTetraacetic Acid
FDA
United State Food and Drug Administration
Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ
G3PDH
Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
Gp
Glycoprotein
HBV
Hepatitis B virus
Vi rút viêm gan B
HCV
Hepatitis C virus
Vi rút viêm gan C
HIV
Human immunodeficiency virus 
Vi rút gây suy giảm miễn dịch mắc phải ở người
HPV
Human Papillomavirus
Vi rút gây u nhú ở người
HSIL
High-grade squamous intraepithelial lesion
Tổn thương nội biểu mô vảy độ cao.
LCR
Long Control Region
Vùng điều hòa dài
LSIL
Low-grade squamous intraepithelial lesion
Tổn thương nội biểu mô vảy độ thấp.
N. gonorrhoeae
Neisseria gonorrhoeae
NILM
Negative for Intraepithelial lesion or malignancy.
Không có tổn thương biểu mô hoặc tổn thương ác tính.
OD
Optical Density
Mật độ quang
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng khuếch đại chuỗi
RNA
RiboNucleic Acid
SD
Standard Deviation
Độ lệch chuẩn
SDS
Sodium Dodecyl Sulphate
STIs
Sexually Transmitted Infections.
Nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục
TM
Melting temperature
Nhiệt độ biến tính	
IARC
International Agency for Research on Cancer
Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. 	Tỷ lệ nhiễm HPV trên gái mại dâm ở một số nước trên thế giới	31
Bảng 2.2.	Trình tự nucleotide của các mồi GP5+/GP6+	36
Bảng 3.1. 	Mối liên quan của tuổi, tình trạng hôn nhân, trình độ học vấn, tình trạng hút thuốc lá và sử dụng ma túy đến tỷ lệ nhiễm HPV	58
Bảng 3.2. 	Mối liên quan của tiền sử sản phụ khoa đến tỷ lệ nhiễm HPV	60
Bảng 3.3. 	Mối liên quan của các bệnh lây truyền qua đường tình dục đến tỷ lệ nhiễm HPV	62
Bảng 3.4. 	Kết quả phân tích hồi quy đa biến giữa một số yếu tố liên quan có ý nghĩa thống kê với tình trạng nhiễm HPV	64
Bảng 3.5.	 Kết quả xác định genotype HPV bằng giải trình tự gen sau tách dòng	68
Bảng 3.6. 	Sự phân bố genotype HPV trên gái mại dâm tại Hải Phòng	73
Bảng 3.7. 	Tình trạng đơn nhiễm và đa nhiễm genotype HPV trên gái mại dâm tại Hải Phòng	75
Bảng 3.8. 	Mối liên quan của lứa tuổi và tình trạng đơn, đa nhiễm genotype HPV	77
Bảng 3.9. 	Mối liên quan của tình trạng hôn nhân và tình trạng đơn, 78đa nhiễm genotype HPV	78
Bảng 3.10. 	Mối liên quan của tình trạng hút thuốc lá và tình trạng đơn, đa nhiễm genotype HPV	79
Bảng 3.11. 	Mối liên quan của tiền sử có thai và tình trạng đơn, đa nhiễm genotype HPV	80
Bảng 3.12. 	Mối liên quan của tình trạng nhiễm HIV và tình trạng đơn, đa nhiễm genotype HPV	81
Bảng 3.13. 	Mối liên quan của tình trạng nhiễm C.trachomatis và tình trạng đơn, đa nhiễm genotype HPV	82
Bảng 3.14. 	Kết quả xét nghiệm tế bào cổ tử cung trên gái mại dâm tại Hải Phòng	83
Bảng 3.15. 	Mối liên quan giữa biến đổi tế bào cổ tử cung và HPV	85
Bảng 3.16. 	Mối liên quan giữa biến đổi tế bào cổ tử cung và một số yếu tố nguy cơ khác	87
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. 	Hạt vi rút của HPV	4
Hình 1.2. 	Cấu trúc bộ gen của Papillomavirus và HPV 16 	5
Hình 1.3. 	Cây phả hệ của 118 genotype Papillomavirus dựa trên trình tự gen vùng L1 ORF. Chuỗi gen được xử lý bằng phần mềm Phylip version 3.572 và phân tích phả hệ bằng Treeview program 	12
Hình 1.4. 	Chu kỳ sống của HPV 	16
Hình 1.5. 	Phương pháp lai phân tử phát hiện HPV 	21
Hình 1.6. 	Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ phát hiện HPV 	24
Hình 1.7. 	Sự phân bố tỷ lệ nhiễm HPV ước tính trên thế giới 	30
Hình 2.1. 	Kit xác định genotype HPV bằng kỹ thuật DNA microarray	38
Hình 2.2. 	Genotype HPV phát hiện bằng kỹ thuật DNA microarray trên máy scan	47
Hình 2.3. 	Vectơ tách dòng pCR®2.1	49
Hình 3.1. 	Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và định lượng nồng độ DNA tổng số trên máy NanoDrop	55
Hình 3.2. 	Kết quả khuếch đại 140 bp vùng gen L1 HPV bằng phản ứng PCR với mồi GP5+/GP6+ original và GP5+/GP6+ modified	56
Hình 3.3.	Kết quả xác định genotype HPV bằng kỹ thuật DNA microarray	66
Hình 3.4. 	Kết quả biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng InVαF’	67
Hình 3.5 . 	Kết quả giải trình từ gen sau tách dòng(mãu HPV-2-068 khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng mồi GP5+/GP6+ modified).	70
Hình 3.6. 	So sánh kết quả giải trình gen sau tách dòng (mẫu HPV-2-068) với trình tự gen đã công bố trên GeneBank.	71
Hình 3.7. 	Sơ đồ kết quả xác định tỷ lệ nhiễm và genotype HPV trên gái mại dâm tại Hải Phòng.	72
Hình 3.8. 	Sự phân bố genotype HPV trên gái mại dâm tại Hải Phòng	74
Hình 3.9. 	Tình trạng đơn nhiễm và đa nhiễm genotype HPV ở gái mại dâm tại Hải Phòng	76
Hình 3.10. 	Kết quả xét nghiệm tế bào cổ tử cung trên gái mại dâm tại Hải Phòng	83