Mitomycin C ức chế quá trình phát triển in vitro của phôi chuột trinh sản giai đoạn tiền làm tổ

 89
33(2): 89-94 Tạp chí Sinh học 6-2011 
MITOMYCIN C ứC CHế QUá TRìNH PHáT TRIểN IN VITRO 
CủA PHÔI CHUộT TRINH SảN GIAI ĐOạN TIềN LàM Tổ 
Lê Thành Long, Hoàng Nghĩa Sơn 
Viện Sinh học nhiệt đới, tp. Hồ Chí Minh 
Nguyễn Văn Đảm 
Công ty Công nghệ sinh học xanh, tp. Hồ Chí Minh 
Nguyễn Thị Th−ơng Huyền 
Tr−ờng đại học S− phạm, tp. Hồ Chí Minh 
Mitomycin C là một nhân tố hoá liệu pháp 
đ−ợc dùng trong điều trị khối u rắn [2]. Nó đ−ợc 
dùng nhiều trong điều trị ung th− nh− ung th− 
bàng quang, ung th− dạ dày, ung th− ruột và ung 
th− vú [3]. Tuy nhiên, việc điều trị ung th− sử 
dụng Mitomycin C có thể gây ra những tác dụng 
phụ khác nhất là đối với phụ nữ khi điều trị ung 
th− vú, nó có thể ảnh h−ởng đến quá trình sinh 
sản nhất là quá trình phát triển của phôi ở phụ 
nữ mang thai. Để hiểu rõ ảnh h−ởng của 
Mytomycin C, phôi chuột đ−ợc dùng làm mô 
hình cho việc đánh giá những tác dụng phụ của 
Mitomycin C lên quá phát triển in vivo. Việc sử 
lý phôi chuột giai đoạn phôi dâu sẽ làm giảm số 
l−ợng tế bào trong khối tế bào bên trong (ICM) 
của phôi nang [9]. Chuột đ−ợc tiêm Mitomycin 
C với liều 0,0707 mg/con sẽ làm giảm 50% số 
l−ợng trứng trong buồng trứng [8]. Hơn nữa, quá 
trình xử lý chuột mang thai với Mitomycin C có 
thể làm số l−ợng tế bào trong cả ICM và lớp 
d−ỡng bào (trophectoderm), làm giảm khả năng 
làm tổ của phôi nang và gây ra rất nhiều bất 
th−ờng trong quá trình phát triển của thai nh− 
gây ra sai hỏng thành bụng, sai hỏng vùng 
x−ơng s−ờn, giảm khối l−ợng của thai và gia 
tăng khối l−ợng của nhau thai [10]. 
Tuy nhiên, những nghiên cứu trên tập trung 
chủ yếu vào quá trình phát triển in vivo của phôi 
giai đoạn phôi nang và phôi giai đoạn sau khi 
làm tổ, đánh giá về mặt giải phẫu mô phôi mà 
ch−a nghiên cứu sâu vào việc phát triển của giai 
đoạn phôi tiền làm tổ in vitro cũng nh− tìm hiểu 
nguyên nhân làm giảm sự phát triển của phôi 
chuột đ−ợc xử lý với Mitomycin C. Do đó, trong 
nghiên cứu này chúng tôi khảo sát sự phát triển 
in vitro của phôi chuột trinh sản d−ới tác động 
của Mitomycin C. Những ảnh h−ởng của 
Mitomycin C sẽ đ−ợc khảo sát từ lúc hoạt hoá 
trứng chín và phát triển thành phôi ở các giai 
đoạn 2 tế bào, 4 tế bào cho đến giai đoạn phôi 
dâu và phôi nang cũng nh− những biến đổi của 
tế bào chất và nhân trong các tế bào phôi. 
I. PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 
1. Đối t−ợng 
Chuột chủng Swiss 8 tuần tuổi, có khối 
l−ợng 20 ± 2 g. Chuột đ−ợc cung cấp bởi Viện 
Pasteur, thành phố Hồ Chí Minh. 
2. Ph−ơng pháp 
a. Gây siêu bài no*n và thu trứng 
Chuột cái đ−ợc tiêm PMSG (Organon) 10 
IU/con. Sau 48 tiếng chuột đ−ợc tiêm hCG 
(Organon) 10 IU/con. Sau 14 tiếng, trứng chín 
đ−ợc thu từ ống dẫn trứng và đ−ợc chuẩn bị 
trong PBS/PVA 0,1%. 
b. Xử lý Mitomycin C, hoạt hóa trinh sản và 
nuôi trứng 
Trứng sau khi đ−ợc thu nhận sẽ đ−ợc xử lí 
với Mitomycin C (Sigma) ở các nồng độ 10 
àg/ml trong 0,5, 1, 2 giờ và ở các nồng độ 10, 
20, 30, 40, 50 àg/ml trong 2 giờ để khảo sát ảnh 
h−ởng của nồng độ và thời gian xử lý của 
Mitomycin C trên sự phát triển phôi trinh sản. 
Sau đó, trứng đ−ợc hoạt hóa trinh sản bằng môi 
tr−ờng KSOM chứa ethanol 7% trong vòng 5 
phút. Để ức chế sự sự hình thành thoi vô sắc, 
trứng sau khi hoạt hóa đ−ợc nuôi trong môi 
tr−ờng KSOM chứa Cytochalasin B (5 àg/ml) 
 90 
trong vòng 6 tiếng. Tiếp theo trứng đ−ợc nuôi 
trong môi tr−ờng KSOM và đánh giá sự phát 
triển ở các giai đoạn khác nhau. 
c. Nhuộm DAPI (4'-6-Diamidino-2-
phenylindole) (Molecular Probes) 
Phôi chuột trinh sản đ−ợc cố định trong 
dung dịch PBS chứa paraformaldehyade 4% 
trong vòng 30 phút, sau đó đ−ợc ủ với dung dịch 
PBS/PVA (0,1%) chứa Trixton X100 0,1% qua 
đêm, phôi đ−ợc rửa 2 lần với dung dịch 
PBS/PVA (0,1%) mỗi lần 10 phút. Sau đó, phôi 
đ−ợc nhuộm với DAPI (2 àg/ml) trong 30 phút. 
Sau đó phôi đ−ợc rửa 2 lần trong PBS/PVA 
(0,1%) mỗi lần 10 phút. Phôi đ−ợc cố định và 
quan sát trong phổ cho DAPI (Olympus). 
d. Nhuộm AO-PI (Acridine Orange-Propidium 
Iodide) 
Phôi đ−ợc nhuộm với thuốc nhuộm Acridine 
Orange (Sigma) 100 àg/ml và Propidium Iodine 
(Sigma) 100 àg/ml để xác định sự phân mảnh 
của tế bào chất và sự phân mảnh của nhân. Phôi 
đ−ợc quan sát trong phổ cho PI và AO 
(Olympus). 
e. Xử lý thống kê 
Số liệu thu đ−ợc từ các lô thí nghiệm đ−ợc 
phân tích bằng “One way Anova” theo “Tukey’s 
multiple range test”. Giá trị P nhỏ hơn 0,05 
đ−ợc đánh giá là có ý nghĩa thống kê. 
II. KếT QUả Và BàN LUậN 
1. ảnh h−ởng của thời gian xử lý MC lên sự 
phân chia của phôi trinh sản 
Sự phát triển in vitro của phôi từ trứng hoạt 
hoá trinh sản đ−ợc xử lý với Mitomycin C 10 
àg/ml ở các thời gian 0,5, 1, 2 giờ đều giảm 
(bảng 1).Tỉ lệ phôi phân chia ở 3 lô thí nghiệm 
đều nh− nhau (52,38%; 52,54%; 68,33%). Lô xử 
lí trong 2 giờ là có tỉ lệ phát triển phôi 2 tế bào 
bằng lô đối chứng (68,33% so với 74,19%). Tuy 
nhiên, trong quá trình phát triển của phôi từ giai 
đoạn 2 tế bào đến giai đoạn 4 tế bào, số l−ợng 
phôi giảm mạnh, điều đó cho thấy Mitomycin C 
làm cho phôi trinh sản giai đoạn 2 tế bào bị ức 
chế sự phát triển mạnh (hình 1.B, 1.E, 1.H). Tỷ lệ 
phôi bị ức chế sự phát triển càng tăng khi thời 
gian xử lý trứng chín với Mitomycin C càng lâu. 
Tỷ lệ phôi dâu hình thành ở các lô thí nghiệm 
cũng bị giảm mạnh. Hầu hết không có phôi nào 
phát triển đến giai đoạn phôi nang. Tất cả các 
phôi đều bị dừng sự phát triển ở giai đoạn phôi 
dâu (hình 1.C, 1.F, 1.I). Chúng không hình thành 
đ−ợc khoang phôi (blastocoel) và bị thoái hóa. 
Trong khi đó, phôi trinh sản phát triển bình 
th−ờng đến giai đoạn phôi nang ở nhóm đối 
chứng (hình 1K, 1L, 1M). 
2. ảnh h−ởng của nồng độ Mitomycin C lên 
sự phân chia của phôi trinh sản 
Trong thí nghiệm khảo sát ảnh h−ởng của 
thời gian xử lý Mitomycin C lên sự phát triển của 
phôi trinh sản, thời gian xử lý 2 giờ cho kết quả 
ức chế sự phát triển phôi 2 cao nhất, nên kết quả 
này đ−ợc sử dụng trong việc đánh giá tác động 
của nồng độ Mitomycin C lên sự phát triển in 
vitro của phôi trinh sản. Trứng chín đ−ợc xử lí 
với Mitomycin C ở các nồng độ khác nhau sau 
khi đ−ợc hoạt hoá trinh sản đều bị ức chế sự phát 
triển ở giai đoạn phôi 2 tế bào (bảng 2). Tỉ lệ ức 
chế sự phát triển giữa các nồng độ 10, 20, 30, 40 
àg/ml không khác nhau về mặt thống kê (P < 
0,05). Nồng độ 50 àg/ml, Mitomycin C ức chế sự 
phát triển của phôi trinh sản nhiều nhất, không 
qua phôi nào có thể v−ợt qua quá trình ức chế sự 
phát triển phôi ở giai đoạn này. Không có bất cứ 
phôi trinh sản nào có thể phát triển đến giai đoạn 
phôi dâu cũng nh− phôi nang. Kết quả trên cho 
thấy, trứng chuột bị xử lý Mitomycin C nồng độ 
50 àg/ml trong 2 giờ sẽ làm phôi bị ức chế hoàn 
toàn trong quá trình phát triển phôi sau hoạt hóa. 
3. Mitomycin C làm chậm quá trình phân 
chia đầu tiên của tế bào phôi chuột trinh 
sản 
Mitomycin C không chỉ lảm giảm quá trình 
phát triển của phôi chuột trinh sản, mà nó còn 
làm chậm quá trình phân chia tế bào đầu tiên 
của phôi. Bình th−ờng phôi chuột sẽ hoàn tất 
phân chia lần đầu tiên sau khi đ−ợc hoạt hoá 24 
giờ [7]. Tuy nhiên, trứng chín ở tất cả các nhóm 
xử lý Mitomycin C theo thời gian sau khi hoạt 
hoá thành phôi đều mất 48 giờ để hoàn tất quá 
trình phân chia lần đầu tiên (Bảng 3). Điều đó 
cho thấy, Mitomycin C không chỉ ảnh h−ởng 
đến quá trình akyl hoá DNA của phôi, mà nó 
còn làm chậm động lực phân chia của tế bào 
phôi liên quan đến thoi vô sắc, nó ảnh h−ởng 
đến một số protein trong quá trình phân bào. 
Quá trình làm chậm phân chia diễn ra chủ yếu ở 
prometaphase hoặc metaphase II [5]. 
 91
Bảng 1 
Tác động của thời gian lên sự phát triển in vitro phôi trinh sản 
Số phôi phát triển Thời gian xử lí 
(giờ) 
Số trứng hoạt 
hoá Phôi 2 tế bào 
(%) 
Phôi 4 tế bào 
(%) 
Phôi dâu 
(%) 
Phôi nang 
(%) 
0,5 63 33(52,38)a 19(30,15)a 14(22,22) 1(1,59) 
1 59 31(52,54)a 15(25,42)b 6(10,17) 0(0) 
2 60 41(68,33)ab 5(8,33)c 1(1,67) 0(0) 
Đối chứng 62 46(74,19)b 44(70,96)d 43(69,35) 34(54,84) 
Ghi chú: a, b, c, d. khác biệt có ý nghĩa thống kê (P ≤ 0,05). 
Hình 1. Sự phát triển của phôi chuột trinh sản. Phôi trinh sản tại các thời điểm 2 tế bào, 4 tế bào và 
giai đoạn phôi nang ở các thời gian xử lý Mitomycin C 10 àg/ml trong 0,5 giờ (A-C), 1,0 giờ (D-F), 
2,0 giờ (G-I). K-M: sự phát triển của phôi trinh sản không xử lý Mitomycin C (nhóm đối chứng) ở 
các giai đoạn 2 tế bào, 4 tế bào và phôi nang. Quá trình làm giảm sự phát triển của phôi giai đoạn 2 
tế bào (mũi tên trắng) và giai đoạn phôi dâu (mũi tên đen) diễn ra ở tất cả các lô thí nghiệm và lô đối 
chứng. Dấu sao trắng (C) cho thấy phôi nang ở lô phôi xử lý Mitomycin C trong 0,5 giờ và ở lô đối 
chứng (M) không xử lý Mitomycin C. 
 92 
Bảng 2 
Tác động của nồng độ Mitomycin C lên sự phát triển in vitro phôi trinh sản 
Số phôi phát triển Nồng độ 
Mitomycin C 
(àg/ml) 
Số trứng hoạt 
hoá Phôi 2 tế bào 
(%) 
Phôi 4 tế bào 
(%) 
Phôi dâu (%) Phôi nang 
(%) 
10 60 41(68,33)a 5(8,33)a 0 0 
20 61 38(62,23)a 4(6,56)a 0 0 
30 66 38(57,58)a 4(6,06)a 0 0 
40 78 59(75,64)a 3(3,85)a 0 0 
50 91 31(34,07)b 0(0)b 0 0 
Ghi chú: a, b: khác biệt có ý nghĩa thống kê (P ≤ 0,05). 
4. Sự phân ly bất th−ờng của nhiễm sắc thể 
Những phôi đ−ợc xử lý với Mitomycin C 10 
àg/ml trong 0,5 giờ ch−a đi vào quá trình 
apoptosis có quá trình phân chia nhiễm sắc thể 
bất th−ờng. Trong quá trình phát triển thành 
phôi 4 tế bào, nhiễm sắc thể tr−ớc khi phân chia 
hình thành cấu trúc giống metaphase II, (hình 
2A). Sự phân chia số l−ợng nhiễm sắc thể về hai 
cực tế bào phôi không đều và một số nhiễm sắc 
thể không di chuyển về hai cực tế bào (hình 2B, 
2C). Điều đó cho thấy Mitomycin C không chỉ 
là tác nhân akyl hoá DNA [11] mà nó còn có thể 
akyl hoá protein. Sự bất th−ờng trong phân ly 
nhiễm sắc thể là nguyên nhân dẫn tới hầu hết 
các phôi xử lý với Mitomycin C bị ức chế và 
không thể phát triển đ−ợc đến giai đoạn phôi 
nang. 
5. Mitomycin C cảm ứng quá trình 
apoptosis ở phôi trinh sản 
Các lô thí nghiệm đều có phôi biểu hiện các 
đặc điểm hình thái của quá trình apoptosis nh− 
tế bào chất phôi phân mảnh, nhân phân mảnh và 
nhiễm sắc chất cô đặc lại, màng nhân biến mất 
và phôi sẽ bắt màu cả Acrindine Orange và
Propodium Iodide trong quá trình apoptosis 
muộn [1]. Phôi xử lý 10 àg/ml Mitomycin C 
trong 0,5 giờ bị phân mảnh sau 48 tiếng hoạt 
hoá (hình 3A). Ph−ơng pháp nhuộm AO-PI cho 
thấy phôi đang trong quá trình apoptosis, phần 
tế bào chất phôi phân mảnh bắt màu cả 
Acrindine orange và Propidium Iodide 
(hình 3D). 
Để xác định những biến đổi của nhân trong 
quá trình apoptosis, ph−ơng pháp nhuộm đơn 
DAPI đ−ợc sử dụng để đánh hình thái của nhân 
và nhiễm sắc chất trong nhân [6]. Phôi apoptosis 
ở lô xử lý với Mitomycin C 10 àg/ml trong 0,5 
giờ cho thấy nhiễm sắc chất cô đặc lại, nhân 
phân mảnh và tách nhóm, màng nhân bắt đầu 
đứt g‚y (hình 3B) [4]. Phôi apoptosis đ−ợc xử lý 
với Mitomycin C 10 àg/ml trong 1 giờ cũng cho 
thấy nhân phân mảnh và nhiễm sắc chất đặc lại, 
màng nhân đứt g‚y hoàn toàn (mũi tên trắng), 
hình dạng nhân trở nên cong hơn do quá trình 
tách nhóm của các phần nhiễm sắc chất cô đặc 
(hình 3C) [4]. Hiện t−ợng nhân phân mảnh diễn 
ra nhiều nhất ở lô phôi đ−ợc xử lý Mitomycin C 
trong vòng 2 giờ, phôi xuất hiện rất nhiều thể 
apoptosis (hình 3E). 
Bảng 3 
Mitomycin C làm chậm sự phân chia đầu tiên theo thời gian xử lý 
Số phôi phân chia 
(2 tế bào) 
Thời gian xử lý 
Mitomycin C 
(giờ) 
Số trứng xử lý 
24h 48h 
0,5 63 5 32a 
1 59 1 30a 
2 60 0 40ab 
Đối chứng 62 46b 
Ghi chú: a, b: khác biệt có ý nghĩa thống kê (P ≤ 0,05) 
 93
Hình 2. Sự bất th−ờng trong quá trình phân chia nhiểm sắc thể. Cấu trúc giống metaphase II hình 
thành ở phôi xử lý Mitomycin C 10 àg/ml trong 0,5 giờ (A) (vòng tròn trắng). Nhiễm sắc thể phân 
chia không đồng đều về hai cực tế bào phôi (B, C) (vòng tròn trắng). 
Hình 3. Phôi apoptosis nhuộm với DAPI và AO-PI. Tế bào chất của phôi đ−ợc xử lý Mitomycin C 
10 àg/ml trong 0,5 giờ phân mảnh sau 48 tiếng hoạt hoá (A). Mũi tên trắng (D) cho thấy tế bào chất 
phần phôi phân mảnh đang trong quá trình apoptosis. Hình thái nhân của phôi apoptosis ở lô xử lý 
Mytomicyn C 10 àg/ml trong 0,5, 1 và 2 giờ có nhiễm sắc chất đang trong quá trình cô đặc và nhân 
phân mảnh (mũi tên trắng) (B, C, E). Tế bào phôi có nhân bình th−ờng (mũi tên đen) bên cạnh tế 
bào chứa nhân phân mảnh (C). Hình thái nhân phôi nang trinh sản phát triển bình th−ờng ở lô không 
xử lý Mitomycin C (F) không có sự phân mảnh hay nhiễm sắc chất cô đặc 
Điều đó cho thấy, thời gian xử lý 
trứng chín với Mytomicin C càng lâu, quá 
trình apoptosis diễn ra càng mạnh, thể 
apoptosis xuất hiện càng nhiều. Trong khi đó, 
lô phôi trinh sản không sử lý với Mitomycin C 
phát triển bình th−ờng đến giai đoạn phôi nang 
(hình 3F), hình thái nhiễm sắc chất và nhân 
bình th−ờng. 
III. KếT LUậN 
1. Mitomycin C làm chậm quá trình phân 
chia đầu tiên của phôi chuột trinh sản. 
2. Mitomycin C làm giảm quá trình phát triển 
in vitro của phôi chuột trinh sản thông qua những 
tác động gây apoptosis và những sai hỏng trong 
quá trình phân chia nhiễm sắc thể của phôi chuột. 
 94 
TàI LIệU THAM KHảO 
1. Antti Saraste, 1999: Morphologic criteria 
and detection of apoptosis. Herz, Urban & 
Voge1. 
2. Crooks S. T., Bradner W.T., 1976: Cancer 
Treat. Rev., 3: 121:139. 
3. Danshiitsoodol N., de Pinho C. A., 
Matoba Y., Kumagai T., Sugiyama M., 
2006: J. Molec Biol., 360(2): 398-408. 
4. Kerr J. F. R., Winterford C. M., Harmon 
B. V., 1994: Cancer, 73: 2013-2026. 
5. Marta Sikora-Polaczek, Anna 
Hupalowska, Zbigniew Polanski, Jacek Z. 
Kubiak and Maria A. Ciemerych, 2006: 
Biology of Reproduction, 74: 734-743. 
6. Steve M Nguyen, Christopher J. Lieven
and Leonard A. Levin, 2006: J. Neurosci 
Methods, 161(2): 281-284. 
7. Taesaeng Choi, Fugaku Aoki, Makoto 
Mori, Masakane Yamashita, Yoshitaka 
Nagahama and Kaoru Kohmoto, 1991: 
Development, 113: 789-795. 
8. Takizawa K., Yokoo I., Shima Y., Inou 
Y., Sato M., Iguchi T., Takeda Y., 1989: 
Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi, 41(6): 
715-722. 
9. Tam P. P., 1988: Teratology, 37(3): 205-
212. 
10. Tetsuji Nagao, Yoshiaki Saitoh, Shinsuke 
Yoshimura, 2000: Teratology, 61: 248-261. 
11. Tomasz, Maria, 1995: Chemistry and 
Biology, 2(9): 575-579. 
MITOMYCIN C INHIBITS MOUSE PARTHENOGENIC EMBRYO 
DEVELOPMENT IN PREIMPLANTATION STAGE 
Le Thanh Long, Nguyen Van Dam, 
Nguyen Thi Thuy Huyen, Nguyen Thi Thuong Huyen 
SUMMARY 
To investigate effects of Mitomycin C on mouse parthenogenic embryo in vitro development, we 
exmanined mouse parthenogenic in vitro development treated by Mitomycin C. Matured oocytes collected 
from oviduct were treated in KSOM medium supplemented Mitomycin C 10 àg/ml for 0.5, 1, 2 hours and 
KSOM medium supplemented Mitomycin C 10, 20, 30, 40 and 50 àg/ml for 2 hours. Results demonstrated 
that Mitomycin C degraded parthenogenic embryo in vitro development from all groups. Most of embryos 
could not reach to blastocyst stage and prevented by first block on developing from 2-cell embryo stage to 4-
cell embryo stage. 4-cell embryo development rates following Mitomycin C treatment times of 0.5, 1, 2 hours 
were 30.15%, 25.42% and 8.33%, all of them were lower than control group (70.96%). 
4-cell embryo development rates following Mitomycin C treatment concenstrations of 10 àg/ml (8.33%), 
20 àg/ml (6.56%), 30 àg/ml (6.06), 40 àg/ml (3.85) and 50 àg/ml (0%) were very low, especially no embryo 
could reached to 4-cell embryo stage in 50 àg/ml group. In the other hand, Mitomycin C elongated the time of 
cell division from one-cell embryo stage to 2-cell embryo stage. All most Mitomycin C treated embryos 
divided into 2-cell embryo after 48 hours but in control group, parthenogenic embryo divided after 24 hours. 
This result showed that Mitomycin C not only effects on DNA but also effects on some proteins concerning to 
cell division. Blocked embryos showed apoptotic morphologies such as cytoplasm fragment, chromatin 
condensation and nucleus fragment. Mitomycin C also produced abnormalities of chromosome division in 
embryos. DAPI - stained embryos showed that number of dividing chromosome were not unequal in mitosis. 
In control group, Mitomycin C - untreated mouse parthenogenic embryos could reach to blastocyst and had 
normal morphologies of cytoplasm and nucleus. Thus, Mitomycin C degraded mouse parthenogenic in vitro 
development in preimplantation, produced abnormalities and drived embryos to apoptosis. 
Key words: Apoptosis, embryo blocking, Mitomycin C, first cell division, nucleus fragment, cytoplasmic 
fragment, parthenogenesis. 
Ngày nhận bài: 3-10-2010