Nghiên cứu chế tạo test thử nhanh phát hiện độc tố vi khuẩn tả

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 
18 
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TEST THỬ NHANH PHÁT HIỆN 
ĐỘC TỐ VI KHUẨN TẢ 
 Phạm Đức Minh*; Hoàng Văn Lương* 
TãM T¾T 
Mục tiêu: chế tạo que thử nhanh phát hiện độc tố vi khuẩn tả (VKT). Đối tượng và phương 
pháp nghiên cứu: sử dụng kháng thể đơn dòng kháng độc tố CTX của VKT. Que thử dựa trên 
nguyên lý phản ứng miễn dịch kháng nguyên - kháng thể xảy ra trên màng mỏng. Có đối chiếu 
với kỹ thuật ELISA trên mẫu nhiễm CTX. Kết quả: que thử có khả năng phát hiện được độc tố 
CTX ở nồng độ 50 ng/ml và có độ đặc hiệu 100%. Ở nồng độ 50 ng/ml và 25 ng/ml của độc tố 
CTX trên mẫu thử, que thử có độ nhạy lần lượt là 95% và 53% so với kỹ thuật ELISA. Que thử 
nhanh có giá thành thấp, dễ sử dụng, khả năng áp dụng cao trong thực tiễn y học và cộng 
đồng. Kết luận: Học viện Quân y đã bước đầu chế tạo thành công que thử nhanh phát hiện độc 
tố CTX của VKT. Que thử nhanh có giá thành thấp, dễ sử dụng, khả năng áp dụng cao. 
* Từ khóa: Vibrio cholerae; Độc tố tả; Que thử nhanh. 
Studying Development of Rapid Test to Detect Vibrio Cholerae Toxin 
Summary 
Objective: Production of test strips for rapid detection of Cholera toxin. Subjects and methods: 
The study used monoclonal antibodies against CTX toxin of Vibrio cholerae. The strips based 
on the principle of antigen-antibody immune response occur on thin films. The result will be 
compared to ELISA in samples infected with CTX. Results: The strips have the ability to detect 
CTX toxin at concentrations of 50 ng/mL and a specificity of 100%. At the concentration of 
50 ng/mL and 25 ng/mL of CTX toxin in the sample, the test strip has a sensitivity of 95% 
and 53%, respectively, compared to ELISA. The strips are low cost, easy to use, and have high 
applicability in medicine practice and community. Conclusion: Military Medical University has 
initial successfully made the rapid test strips to detect CTX toxin of Vibrio cholerae. The strips 
are low cost, easy to use, and have high applicability in medicine practice and community. 
* Key words: Vibrio cholerae; CTX; Rapid test. 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Vi khuẩn tả là một trong những mầm 
bệnh nguy hiểm, do nó có thể sinh ra độc 
tố gây dịch tiêu chảy cấp [1, 7]. Độc tố VKT 
còn có nguy cơ sử dụng trực tiếp như là 
một vũ khí sinh học nguy hiểm [4]. Hiện 
tại Việt Nam đã có vắcxin phòng bệnh tả, 
nhưng hiệu quả chỉ đạt từ 66 - 90% [6] 
và chưa phổ biến. Chẩn đoán nhanh và 
* Häc viÖn Qu©n y 
Người phản hồi (Corresponding): Ph¹m §øc Minh (drminh103@yahoo.com) 
Ngày nhận bài: 15/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 22/01/2015 
 Ngày bài báo được đăng: 26/01/2015 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 
19 
chính xác mẫu có chứa độc tố CTX của 
VKT sẽ giúp ích cho quá trình phát hiện, 
điều trị và dự phòng ngộ độc do độc tố 
của VKT [3, 4]. Hiện nay, que thử nhanh 
đã và đang chiếm ưu thế trong ứng dụng 
y học và các lĩnh vực liên quan [3]. 
Que thử nhanh được Singer J M và 
Plotz C M (1956) [8] nghiên cứu và phát 
triển, cho đến nay đã cải tiến nhiểu. Với 
ưu điểm giá thành thấp, dễ áp dụng, độ 
chính xác cao, que thử nhanh đang là 
mục tiêu của nhiều phòng thí nghiệm 
cũng như các công ty sản xuất sản phẩm 
liên quan đến sinh học phân tử. Học viện 
Quân y đang quản lý một dây chuyền sản 
xuất que thử nhanh. Hệ thống này được 
nhập từ Công ty Arista (Hoa Kỳ), có khả 
năng hoạt động tự động hoàn toàn hoặc 
bán tự động. 
Hiện tại có một số phương pháp thường 
dùng để phát hiện VKT và độc tố trong 
thực phẩm, bao gồm nuôi cấy, phương 
pháp ELISA, phương pháp khuếch đại 
gen (PCR), que thử nhanh... [1, 3, 4]. 
Trong đó, que thử có ưu thế trong sàng 
lọc và được ưu tiên sử dụng. Xuất phát từ 
những yêu cầu đó, đề tài này thực hiện 
nhằm: Chế tạo que thử nhanh phát hiện 
độc tố CTX của VKT. 
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
1. Đối tƣợng nghiên cứu. 
Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn 
các nhóm vi khuẩn sau: 
- Độc tố chuẩn: CTX code G-117 Lot # 
P5351 (Enza Life Sciences). 
- Độc tố đối chứng: độc tố không chịu 
nhiệt LT (heat labile toxin) của vi khuẩn E. coli; 
độc tố ruột SEB (Staphylococcal enterotoxin 
B) của vi khuẩn Staphylococcus aureus. 
2. Vật liệu nghiên cứu. 
* Dụng cụ, thiết bị: 
Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng của 
Khoa Vi sinh vật và Trung tâm nghiên cứu 
Y Dược học - Học viện Quân y. Hệ thống 
sản xuất que thử nhanh của Hãng Arista 
(Hoa Kỳ). 
* Kháng thể: 
Bảng 1: Các kháng thể sử dụng trong 
nghiên cứu. 
TÊN 
KHÁNG THỂ 
VẬT 
CHỦ 
TYPE: 
ISOTOPE 
KÝ HIỆU 
(Catalog #) 
HÃNG 
SẢN 
XUẤT 
MAb to Cholera 
Toxin 
Monoclonal 
Antibody to 
Cholera Toxin 
beta subunit 
Chuột MAb-IgG1 C01593M Meridian 
MAb to Cholera 
Toxin 
Monoclonal 
Antibody to 
Cholera Toxin 
beta subunit 
Chuột MAb-IgG1 C01594M Meridian 
Anti Mouse IgG Dê IgG ABCAM-
0500 
ABCAM 
Có 3 kháng thể được gắn lên màng: 
kháng thể phát hiện (KT1), kháng thể bắt 
giữ (KT2) và kháng thể kiểm tra (KT3). 
Kháng thể phát hiện (Detection Antibody) 
là C01594M, sẽ được gắn với hạt vàng, 
sau đó gắn lên màng chứa cộng hợp 
(Conjugate pad). Kháng thể bắt giữ (Capture 
antibody) là C01593M, sẽ được gắn lên 
màng NC ở vị trí test line. Kháng thể kiểm 
tra là ABCAM-0500, sẽ gắn lên màng NC 
ở vị trí vạch đối chứng (control line). 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 
20 
* Màng gắn trên que thử: 
Mỗi thanh test được cấu tạo bởi 5 bộ 
phận chính: màng hút mẫu (Sample pad); 
màng chứa chất cộng hợp màu (Conjugate 
pad); màng nitrocellulose (Nitrocellulose 
membrance); màng hút trên (Absorbent 
pad) và đế nhựa giữ (Plastic adhesive 
backing card) của que thử, đặt mua 
của Công ty Ahlstrom, P.O. Box 329, 
Salmisaarenaukio 1, FI-00180 Helsinki 
(Phần Lan) và của Công ty Advanced 
Microdevices (mdi), 20-21 Industrial Area, 
Ambala Cantt 133 006 (Ấn Độ). 
* Dung môi xử lý màng: 
Các màng đều có chức năng riêng biệt 
và để tối ưu hóa hoạt động của que thử, 
loại màng đều cần phải xử lý trước khi 
gắn lên test. Mỗi dung môi sẽ đặc hiệu 
cho một loại màng nhất định và làm tăng 
hoạt tính của màng sau xử lý. 
3. Phƣơng pháp nghiên cứu. 
* Phương pháp chế tạo que thử nhanh: 
- Thiết kế: chế tạo que thử nhanh 
dựa theo quy trình của Công ty Arista 
(Hoa Kỳ). Trước tiên, xử lý loại màng 
bằng các dung môi thích hợp, để khô. 
Tiếp theo, phun kháng thể lên màng, 
cuối cùng lắp ghép và giữ chặt các bộ 
phận trên một đế nhựa. Quá trình tiến 
hành ở điều kiện nhiệt độ khoảng 25oC, 
độ ẩm tương đối < 40%. Sau khi hoàn 
thành, cất giữ sản phẩm trong gói hàn 
nhiệt kín, có vật liệu chống ẩm bảo quản. 
1: Màng hút mẫu 
2: Màng chứa chất cộng hợp màu (chứa KT1). 
3: Màng phát hiện đầu tiên 
4: Màng Nitrocellulose 
5(a): Vạch phát hiện mẫu (chứa KT2) 
5(b): Vạch đối chứng (Chứa KT3) 
6: Màng hút trên 
7: Đế nhựa giữ 
Hình 1: Sơ đồ cấu tạo của test 
phát hiện nhanh. 
- Nguyên lý hoạt động của que thử: 
kháng thể phát hiện (KT1) sẽ gắn với 
kháng nguyên đặc hiệu và gặp kháng thể 
bắt giữ (KT2). Nếu phản ứng miễn dịch 
đặc hiệu xảy ra sẽ cho kết quả vạch 
dương tính. Tất cả các phức hợp đi tiếp 
gặp kháng thể kiểm tra (KT3) sẽ làm xuất 
hiện màu tại vạch đối chứng. 
- Tối ưu hóa: công đoạn tối ưu hóa sẽ 
cho công thức phối hợp tối ưu giữa nồng 
độ kháng thể cũng như các hóa chất khác 
trên que nhúng, phải đảm bảo nguyên tắc 
“sử dụng hàm lượng tối thiểu các chất để 
tạo được thiết bị có tính năng tối ưu”. 
* Phương pháp thử nghiệm que nhúng 
với mẫu thử: 
Que nhúng sẽ được đối chiếu với kỹ 
thuật ELISA trong thử nghiệm với mẫu 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 
21 
độc tố để xác định độ nhạy và độ đặc 
hiệu. Đánh giá độ nhạy của que thử qua 
khả năng phát hiện mẫu CTX ở các nồng 
độ pha loãng khác nhau từ 5 - 200 ng/ml. 
Kiểm chứng độ đặc hiệu với độc tố không 
chịu nhiệt LT của vi khuẩn E. coli và độc 
tố ruột SEB của vi khuẩn S. aureus. 
* Địa điểm và thời gian nghiên cứu: 
Nghiên cứu thực hiện tại Labo Vi sinh 
và các Mầm bệnh sinh học, Trung tâm 
Nghiên cứu Y Dược học Quân sự. Khoa 
Vi sinh vật, Bệnh viện Quân y 103 từ 10 - 
2012 đến 6 - 2014. 
* Xử lý số liệu: số liệu được quản lý và 
phân tích bằng phần mềm Epi.info 7. 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
1. Chế tạo và tối ƣu hóa que nhúng. 
* Nồng độ kháng thể trên màng que thử: 
Hình 2: Que thử có hàm lượng KT1: 0,25 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card. 
Hình 3: Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card. 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 
23 
Hình 4: Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 1 µg/card; KT3: 0,25 µg/card. 
(Vị trí KT3: vạch chứng; Vị trí KT2: vạch test) 
Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card đã 
cho tín hiệu có thể nhận biết được. 
* Khả năng phát hiện của que thử trên mẫu độc tố chuẩn: 
Hình 5: Thử que nhúng với độc tố CTX ở nồng độ 50 ng/ml. 
Hình 6: Thử que nhúng với độc tố CTX ở nồng độ 100 ng/ml. 
(Vị trí KT3: vạch chứng; Vị trí KT2: vạch test) 
Que thử cho kết quả dương tính (2 vạch) rõ nét khi mẫu CTX ở nồng độ 50 ng/ml 
(hình 5). 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 
24 
2. Tính đặc hiệu của que thử. 
Hình 7: Thử que nhúng với độc tố SEB nồng độ 100 ng/ml của vi khuẩn 
Staphycoccocus aureus. 
Hình 8: Thử que nhúng với độc tố LT nồng độ 100 ng/ml của vi khuẩn Escherichia coli. 
(Vị trí KT3: vạch chứng; Vị trí KT2: vạch test) 
Que thử cho kết quả âm tính (tín hiệu tại vạch chứng KT3) với độc tố SEB của vi 
khuẩn Staphylococcus aureus, độc tố LT của vi khuẩn Escherichia coli đều cho kết quả 
âm tính. 
3. So sánh que thử với kỹ thuật ELISA trong phát hiện độc tố CTX. 
Bảng 2: Kết quả thử nghiệm que thử nhanh và ELISA trên mẫu thực phẩm nhiễm 
CTX nồng độ 50 ng/ml. 
 K Õ t q u ¶ 
ELISA T æ n g 
(+) (-) 
Que thử nhanh 
(+) 38 0 38 
(-) 2 0 2 
Tổng 40 0 40 
Độ nhạy [95%CI] = 0.95 [0.82 - 0.99] 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 
25 
Bảng 3: Kết quả thử nghiệm que thử nhanh và ELISA trên mẫu thực phẩm nhiễm 
CTX nồng độ 25 ng/ml. 
 K Õ t q u ¶ 
ELISA T æn g 
(+) (-) 
Que thử nhanh 
(+) 21 0 21 
(-) 19 0 19 
Tổng 40 0 40 
Độ nhạy [95%CI] = 0.53 [0.36 - 0.68] 
Ở nồng độ 50 ng/ml và 25 ng/ml của độc tố CTX trên mẫu thử, que thử có độ nhạy 
lần lượt là 95% và 53% so với kỹ thuật ELISA. 
BÀN LUẬN 
1. Quy trình chế tạo que thử nhanh. 
Nghiên cứu sử dụng kết quả từ một khảo 
sát trước đó trên 04 kháng thể đơn dòng 
phát hiện độc tố CTX cho thấy những 
kháng thể có khả năng phát hiện kháng 
nguyên khác nhau, xếp theo thứ tự tăng 
dần của độ nhạy lần lượt là kháng thể 
C01238M, C01592M, C01593M, C01594M [2]. 
Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng sử 
dụng phương pháp Western blot để kiểm 
tra sự phát hiện chính xác tiểu phần B 
độc tố CTX của VKT gây bệnh bằng kháng 
thể đơn dòng, cho thấy các kháng thể 
đều phát hiện ra độc tố CTX tiểu phần B, 
đây là phần quan trọng nhất quyết định 
hoạt tính của độc tố. Trong đó, kháng thể 
C01594M có khả năng phát hiện chính 
xác độc tố của vi khuẩn V. cholerae với độ 
nhạy cao nhất (5 ng/ml). 
Dựa trên các kết quả đó, quá trình 
sàng lọc và lựa chọn sẽ cho cặp kháng 
thể tối ưu để sử dụng trên que thử. Kết 
quả khảo nghiệm cho thấy, khi nồng độ 
kháng thể tại màng cộng hợp và màng 
NC < 0,5 µg/card, tín hiệu tại que thử 
không có hoặc yếu. Tín hiệu rõ khi hàm 
lượng kháng thể > 0,5 µg/card và rất rõ 
khi > 1 µg/card. 
Trong sản xuất que thử, cần quan tâm 
đến giá thành sản phẩm, nên sử dụng 
lượng nguyên liệu tối thiểu để đưa ra được 
sản phẩm đạt yêu cầu. Chính vì những lý 
do này nên công thức phối hợp tối ưu về 
hàm lượng kháng thể tại màng cộng hợp 
(KT1-kháng thể phát hiện), vạch kiểm tra 
(KT2-kháng thể bắt giữ), vạch đối chứng 
(KT3) lần lượt là: 0,5; 0,5; 0,25 µg/card. 
Trong tương lai, có thể nghiên cứu 
dùng kháng thể polyclonal thay thế cho 
monoclonal nhằm tăng ngưỡng phát hiện 
và giảm chi phí tạo kit. 
Độ ẩm khi phun kháng thể là một trong 
những yêu cầu rất quan trọng, nếu độ ẩm 
cao > 45% sẽ dẫn đến nhòe vạch phun, 
khả năng kháng thể bám dính vào màng 
không tốt, dẫn đến độ ổn định và độ bền 
của que thử không cao. 
2. Khả năng phát hiện của que thử 
nhanh với độc tố CTX của VKT. 
Que thử nhanh sau khi tối ưu đã được 
thử với độc tố CTX ở các nồng độ khác 
nhau. Kết quả cho thấy tín hiệu của que 
thử có thể phát hiện được bằng mắt 
thường khi nồng độ độc tố trong mẫu thử 
là 50 ng/ml. 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 
25 
Que thử nhanh cho kết quả trong vòng 
5 - 10 phút. Chính vì vậy, trên thực tế que 
thử nhanh sẽ giúp ích trong công tác sàng 
lọc nhanh các mẫu thực phẩm nhiễm độc 
tố trước khi tiến hành xét nghiệm sâu 
hơn, điều này sẽ làm giảm chi phí trong 
xét nghiệm chẩn đoán. Khi phương pháp 
này được áp dụng cùng với các phương 
pháp khác, đặc biệt là phương pháp 
khuếch đại gen định lượng và miễn dịch 
định lượng, các nhà khoa học đã có thể 
trả lời nhanh và chính xác về chủng loại 
vi khuẩn, số lượng mầm bệnh bị nhiễm 
trong thực phẩm và nồng độ độc tố có 
trong mẫu [4]. 
Để đánh giá tính đặc hiệu của que thử, 
đối tượng được chọn là độc tố không chịu 
nhiệt LT (heat labile toxin) của vi khuẩn 
E. coli và độc tố ruột SEB (Staphylococcal 
enterotoxin B) của vi khuẩn Staphylococcus 
aureus. Trong đó, độc tố LT của E. coli có 
cấu trúc và cơ chế gây bệnh rất giống với 
độc tố CTX. Kết quả cho thấy que thử 
không có phản ứng chéo với 2 loại độc tố 
LT và SEB. 
So sánh khả năng phát hiện độc tố 
CTX với kỹ thuật ELISA trên mẫu nghiên 
cứu ở nồng độ khác nhau cho thấy que 
thử có độ tương đồng cao (95%) với 
ELISA ở nồng độ 50 ng/ml và thấp hơn 
(53%) ở nồng độ 25 ng/ml. Điều này có 
thể do ngưỡng phát hiện của ELISA (10 
ng/ml) thấp hơn nhiều so với que thử 
nhanh (50 ng/ml) [2], nên khả năng phát 
hiện của ELISA nhạy hơn so với que thử 
nhanh, đặc biệt là những mẫu có nồng độ 
thấp. Trên thực tế, để chẩn đoán chính 
xác cần phối hợp một số kỹ thuật, trong 
đó que thử nhanh thường chỉ là nghiệm 
pháp sàng lọc [3, 4]. 
KẾT LUẬN 
Đã chế tạo thành công que thử nhanh 
phát hiện độc tố vi khuẩn Vibrio cholera. 
Que thử sử dụng kháng thể phát hiện là 
C01594M với khối lượng 0,5 µg/card, 
kháng thể bắt giữ là C01593M với khối 
lượng 0,5 µg/card và kháng thể kiểm tra 
là ABCAM-0500 với khối lượng 0,25 µg/card. 
Que thử có khả năng phát hiện được độc 
tố CTX ở nồng độ 50 ng/ml, có độ đặc hiệu 
tuyệt đối và độ nhạy 95% so với kỹ thuật 
ELISA. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Phùng Đắc Cam. Vibrio cholerae và bệnh 
dịch tả. NXB Y học. 2003. 
2. Phạm Đức Minh, Nguyễn Hùng Long, 
Hoàng Văn Lương. Nghiên cứu ứng dụng kỹ 
thuật ELISA phát hiện độc tố VKT. Tạp chí Y 
học Việt Nam. 2014, tập 419, số 6 (1), tr.46-49. 
3. Trần Linh Thước. Phương pháp phân 
tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và môi 
trường. NXB Giáo dục. 2002. 
4. CDC. Laboratory Methods for the Diagnosis 
of Epidemic Dysentery and Cholera. 1999. 
5. CDC. Agents for Bioterrorism. 2003. 
6. Anh DD, Lopez AL, Tran HT, Cuong NV, 
Thiem VD, Ali M, Deen JL, von Seidlein L, 
Sack DA. Oral cholera vaccine development 
and use in Vietnam. PLoS Med. 2014, Sep 2, 
11 (9). 
7. Dalsgaard A, Forslund A, Tam NV, Vinh 
DX, Cam PD. Cholera in Vietnam: changes in 
genotypes and emergence of class I integrons 
containing aminoglycoside resistance gene 
cassettes in vibrio cholerae O1 strains 
isolated from 1979 to 1996. J Clin Microbiol. 
1999, Mar, 37 (3), pp.734-941. 
8. Singer J M & Plotz C M. The latex fixation 
test. Application to the serologic diagnosis of 
rheumatoid arthritis. American Journal of 
Medicine. 1956, 21, pp.888-992.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 
26