Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN 
–––––––––––––––––– 
NGUYỄN THU HIỀN 
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN 
BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG 
PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 
THÁI NGUYÊN - 2013 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN 
–––––––––––––––––– 
NGUYỄN THU HIỀN 
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN 
BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG 
PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT 
Chuyên ngành: Di truyền học 
Mã số: 62 42 01 21 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 
Người hướng dẫn khoa học: 
1. PGS.TS. CHU HOÀNG HÀ 
2. GS. TS. CHU HOÀNG MẬU 
THÁI NGUYÊN - 2013 
1 
MỞ ĐẦU 
1. Đặt vấn đề 
 Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao và hằng năm trên thế 
giới đã có hơn nửa tỷ người mắc bệnh. Hiện nay, virus cúm A/H5N1- chủng 
virus nguy hiểm nhất ở gia cầm đã lan truyền trên 40 quốc gia ở châu Á, 
Trung đông, châu Âu và châu Phi. Ở nước ta, dịch cúm gia cầm H5N1 xảy ra 
từ những tháng cuối năm 2003 gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn 
nuôi gia cầm và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Việt Nam và Indonesia 
là hai quốc gia có số người nhiễm virus cúm A/H5N1 và có tỷ lệ tử vong cao 
nhất so với các quốc gia trên thế giới. Chính vì vậy nghiên cứu làm sáng tỏ 
bệnh cúm A/H5N1 và nhân tố gây bệnh để xây dựng biện pháp phòng và 
khống chế bệnh là yêu cầu thực tiễn đặt ra. 
 Dịch cúm gia cầm diễn biến ngày càng phức tạp vì hệ gen của virus cúm 
A luôn biến đổi. Bên cạnh đó, nguồn tàng trữ và lây lan bệnh là chim di cư và 
thủy cầm rất khó kiểm soát và khống chế. Hiện nay, việc phòng chống virus 
cúm A nói chung và H5N1 nói riêng, bên cạnh các biện pháp phòng chống 
dịch như tiêu độc, xử lý gia cầm bị bệnh, thanh lý gia cầm nhiễm hoặc nguy 
cơ nhiễm thì biện pháp sử dụng vaccine vẫn là hướng thiết yếu nhất để khống 
chế và ngăn chặn sự lây lan dịch sang người. Hiện nay, ngoài vaccine truyền 
thống, vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng các phương pháp tái tổ hợp và di 
truyền ngược đang được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, các loại vaccine này có 
nhược điểm như giá thành cao, khó bảo quản và mức độ an toàn thấp. Do vậy, 
các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những loại vaccine 
mới có tính ưu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản, an toàn và hiệu quả hơn. 
Vaccine ăn được từ thực vật là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ 
thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine thực vật có hoạt tính 
2 
tương tự như vaccine thông thường, chỉ khác là vaccine này được thực vật sản 
xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả và hạt. Vaccine thực vật có 
một số ưu điểm nổi bật so với các loại vaccine khác ở chỗ có thể ăn tươi hoặc 
nấu chín; dễ dàng sản xuất khối lượng lớn bằng cách tăng diện tích trồng cây 
chuyển gen có khả năng sản xuất kháng nguyên; vaccine thực vật có tính ổn 
định, an toàn cao, dễ bảo quản, dễ sử dụng và có hiệu quả kinh tế. 
Ở Việt Nam, đậu tương là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tương là 
nguồn thực phẩm chính cho vật nuôi và con người. Sự biểu hiện thành công 
gen gus trên cây đậu tương là cơ sở của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để 
sản xuất các chất có dược tính như vaccine trong hạt đậu tương. Với ưu điểm 
nổi bật như sản xuất đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh 
và có độ an toàn, vaccine sản xuất từ thực vật được xem là hướng đi phù hợp 
trong chiến lược chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang phát triển. 
Xuất phát từ lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án là: “Nghiên 
cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương 
phục vụ sản xuất vaccine thực vật”. 
2. Mục tiêu nghiên cứu 
Thiết kế được vector mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus 
cúm A/H5N1. 
Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc đoạn gen HA1 và 
biểu hiện được protein tái tổ hợp HA1 ở hạt đậu tương. 
3. Nội dung nghiên cứu 
3.1. Thiết kế và tổng hợp gen HA và đoạn gen HA1, nhân dòng gen HA và 
đoạn gen HA1 trong tế bào vi khuẩn E.coli và tạo vector chuyển gen mang 
cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1. 
3 
3.2. Biến nạp cấu trúc vector chuyển gen mang gen HA và đoạn gen HA1 vào 
vi khuẩn A. tumefaciens. Lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào 
mô lá thuốc lá và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen HA và đoạn 
gen HA1; 
3.3. Phát triển hệ thống tái sinh đa chồi phục vụ chuyển gen ở cây đậu tương; 
3.4. Chuyển cấu trúc vector mang gen gus biểu hiện ở hạt vào cây đậu tương. 
Đánh giá hiệu quả chuyển gen gus ở giống đậu tương ĐT12 và DT84; 
3.5. Chuyển cấu trúc vector mang đoạn gen HA1 vào cây đậu tương và phân 
tích sự có mặt của đoạn gen chuyển HA1 ở cây đậu tương của thế hệ T0; 
3.6. Phân tích dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 bằng kỹ thuật PCR và lai 
Western blot để xác định sự biểu hiện của protein HA1 ở hạt đậu tương. 
4. Những đóng góp mới của luận án 
4.1. Hai cấu trúc vector mang gen HA và mang đoạn gen HA1 biểu hiện trong 
hạt đã được thiết kế thành công và tạo được chủng vi khuẩn Agrobacterium 
tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus cúm 
A/H5N1. 
4.2. Giống đậu tương ĐT12 và DT84 đã được thử nghiệm chuyển gen gus. 
Hiệu suất chuyển gen được kiểm tra ở giai đoạn hạt là 7,8% đối với giống 
ĐT12 và 4,3 % với giống DT84. 
4.3. Chuyển cấu trúc SLHEP-HA1 vào cây đậu tương và thu được 8 dòng cây 
đậu tương ở thế hệ T0 mang cấu trúc vector biểu hiện đặc trưng trong hạt 
SLHEP-HA1. 
4.4. Ở thế hệ T1 đã thu được dòng đậu tương H11 chuyển gen mang đoạn gen 
HA1 và biểu hiện thành công protein HA1 trong hạt của dòng đậu tương H11. 
4 
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 
Về khoa học: Đã thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và 
đoạn gen HA1 biểu hiện ở hạt thực vật. Biểu hiện thành công gen gus ở hạt. 
Đã hoàn thiện được quy trình tái sinh đa chồi ở cây đậu tương. Với việc lây 
nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tương đã tổn thương, 
tạo cây đậu tương chuyển gen và đã biểu hiện thành công protein HA1 của 
virus H5N1 trong hạt đậu tương. 
Về thực tiễn: Với kết quả protein HA1 đã được biểu hiện thành công trong hạt 
đậu tương ở thế hệ T1 là cơ sở của việc tiếp tục kiểm tra đáp ứng khả năng 
miễn dịch của gia cầm, đồng thời làm tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất 
vaccine ăn được ở thực vật. 
5 
Chương 1 
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 
1.1. BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1 
1.1.1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5N1 
 Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của 
gia cầm, do nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra [38]. Đây 
là nhóm virus có biên độ rộng, được phân chia thành nhiều phân type khác 
nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus. 
Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9 phân type NA 
(từ N1 đến N9) và sự tái tổ hợp giữa các phân type HA và NA sẽ tạo ra nhiều 
phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh [42]. 
 Virus cúm A/H5N1 có độc lực cao và gây bệnh trên người vào những 
năm 1996-2008 [106]. Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên 
gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Sau đó, cúm A/H5N1 đã tái 
xuất hiện tại Quảng Đông (1996) và Hồng Kông (1997) với sự biến đổi sâu 
sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng trên người và gây chết 
người bệnh [142]. Năm 2003, virus H5N1 gây ra dịch cúm trên gia cầm tại 
Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia ở châu Á, châu 
Âu và châu Phi, trong đó có Việt Nam. Cấu trúc virus cúm A/H5N1 vẫn như 
trước đó, nhưng xét về độc lực , loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên-
miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với những 
biến chủng H5N1 trước đây. Các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc phân dòng 
Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) xuất hiện cuối năm 2005, bắt 
đầu lan sang một số nước vùng Trung Á, Nga rồi tràn ngập vào các nước 
vùng Tây Á, bao gồm cả Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc-Trung Phi, trong đó Ai 
Cập và Nigeria là các nước chịu thiệt hại nhiều nhất [25]. 
6 
 Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đến tháng 3/2013, đã 
có tới 622 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó có 371 trường hợp đã tử 
vong, chiếm 59,65%. Trong đó quốc gia có số người mắc bệnh và số tử vong 
cao là các nước Ai cập, Indonesia và Việt Nam. Kết quả điều tra dịch tễ học 
cho thấy, hầu hết những ca nhiễm cúm gia cầm H5N1 trên người đều có liên 
quan đến tiếp xúc với gia cầm bị bệnh hoặc trung gian qua thực phẩm chế 
biến từ gia cầm bị bệnh hoặc qua tiếp xúc trực tiếp như giết mổ, vận chuyển, 
mua bán gia cầm. 
 Việt Nam được WHO xác định là quốc gia “điểm nóng” do virus cúm 
A/H5N1 có các điều kiện thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành 
virus của người. Ở Việt Nam, đại dịch bùng phát từ năm 2003, đã tái phát qua 
bốn đợt dịch. Đợt thứ nhất xảy ra ở 57 tỉnh, thành phố; đợt dịch thứ tư gần đây 
nhất xảy ra ở 21 tỉnh, thành phố, đã tiêu hủy trên 50 triệu gia cầm các loại, thiệt 
hại lên đến hàng ngàn tỷ đồng [9]. 
 Qua điều tra dịch tễ, các trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 trên người 
được ghi nhận đồng thời với thời điểm có dịch cúm trên gia cầm. Mặc dù số 
ca nhiễm ít nhưng tỷ lệ tử vong rất cao (59%) và chi phí điều trị rất tốn kém, 
do vậy biện pháp tốt nhất là dự phòng để tránh mắc bệnh [7]. 
1.1.2. Virus cúm A/H5N1 
1.1.2.1. Đặc tính của virus cúm A/H5N1 
 Virus cúm A/H5N1 mẫn cảm với nhiệt độ, với các dung môi hòa tan 
lipid, với các loại hóa chất sát trùng và oxy hóa, với formaldehyde và với các 
tia phóng xạ. Các hạt virus tồn tại trong pH từ 6,5 đến 7,9. Trong điều kiện 
quá acid hoặc quá kiềm đều làm giảm khả năng lây nhiễm. Virus A/H5N1 bị 
bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được 15 ngày ánh sáng 
thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy được kháng 
nguyên của virus. Tuy nhiên, virus bị phá hủy hoàn toàn ở 100oC hoặc 30 
7 
phút ở 60oC, tồn tại 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm), và hàng 
năm ở -70 oC. Trong phủ tạng gia cầm (40oC) tồn tại được 25-30 ngày, nhưng 
trong cơ thể người (37oC) chỉ sống được 7-8 ngày, còn ở nước 30oC tồn tại 
được 4 ngày [24] [26] [75]. 
 Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau. Các phân 
type (subtype) là kết quả tái tổ hợp của 15 HA (H1-H15) và 9 NA (N1-N9). 
Hemagglutinin mới, dạng thứ 16 (H16), được tìm thấy năm 2005 từ con mòng 
biển đầu đen. Trình tự H16 có độ tương đồng cao với H13 [25] [32]. Các phân 
type gây nhiễm cho hầu hết các loài sinh vật bao gồm loài người, các loài lông 
vũ (gà, thủy cầm), lợn, ngựa, chim, chồn đất, hải cẩu, cá voi... Chúng thích ứng 
hầu hết với mọi loại vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên 
những vụ dịch cúm kinh hoàng trong lịch sử ở động vật và người [140]. Do đặc 
tính biến đổi gen nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới lan 
truyền trong quần thể sinh vật, cúm A là nhóm virus nguy hiểm truyền bệnh từ 
động vật sang người .Virus A/H5N1 được coi là loại biến chủng có mức độ độc 
lực cao nhất đối với các loài động vật và người, có nhiều minh chứng khoa học 
cho thấy chủng này bắt nguồn từ H6N2 hoặc và trao đổi gen thông qua H9N2 
trên lợn [77]. 
 Về danh pháp, để ký hiệu và lưu trữ một cách khoa học và đầy đủ, các 
chủng virus cúm sau khi phân lập phải được ký hiệu theo danh pháp quy định 
với trật tự như sau: tên serotype/loài bị nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời 
gian phân lập/loại hình subtype (HA (H) và NA (N)) [35] [25]. Ví dụ: virus 
cúm có ký hiệu A/chicken/Vietnam/HG4/ 2005(H5N1) có thông tin về danh 
pháp là cúm nhóm A, loài nhiễm là gà (chicken), nơi phân lập là Việt Nam, số 
hiệu chủng là HG4 – Hậu Giang 4, thời gian phân lập là năm 2005, phân type 
là H5N1. 
8 
 Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: (1) 
loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza) và (2) loại độc 
lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza). Cả hai loại đều cùng tồn 
tại trong tự nhiên [30]. HPAI là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương 
nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 
100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 giờ sau nhiễm. Loại này rất nguy 
hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi 
gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [29]. LPAI là 
loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có 
triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là loại virus lây 
truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này 
có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng 
một tế bào và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [68] [155]. 
1.1.2.2. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A/H5N1 
Hệ gen của virus cúm A/H5N1 có khoảng 13500 nucleotide, gồm 8 phân 
đoạn gen mã hoá cho 8 phân tử protein [34]. Các phân đoạn 1, 2 và 3 là những 
phân đoạn mã hóa tổng hợp các enzyme trong phức hợp polymerase (RNA 
transcriptase) của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, cụ thể là: 
Phân đoạn 1 (gen PB2) mã hóa tổng hợp enzyme PB2, là tiểu đơn vị 
thành phần trong phức hợp polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu 
phiên mã RNA virus. PB2 có khối lượng phân tử 87.103 Da [38]. Tính thích 
nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ được cho là có liên quan đến vị trí amino 
acid 627 ở protein PB2 (ở virus cúm gia cầm vị trí này là Glu - thích ứng với 
nhiệt độ cơ thể gia cầm khoảng 40oC, còn ở virus thích nghi trên người là Lys 
- thích ứng nhiệt độ cơ thể người khoảng 37oC) [63]. 
Phân đoạn 2 (gen PB1) mã hóa tổng hợp enzyme PB1 - tiểu đơn vị xúc 
tác của phức hợp enzym polymerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu 
9 
trách nhiệm gắn mũ RNA [38]. Gần đây, đã có phát hiện thêm một protein 
(PB1-F2) được mã hóa bởi một khung đọc mở khác của PB1, có vai trò gây ra 
hiện tượng apoptosis (hiện tượng tế bào chết theo chương trình) [38]. 
Phân đoạn 3 (gen PA) là phân đoạn gen bảo thủ cao, mã hóa tổng hợp 
protein enzyme PA có khối lượng phân tử là 96.103 Da. PA là một tiểu đơn vị 
của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình 
tổng hợp RNA của virus [8]. 
Các phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein (HA và NA) bề mặt capsid 
của virus, có tính kháng nguyên đặc trưng theo từng chủng virus cúm A, cụ 
thể như sau: 
Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm 
A Gen HA mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm, 
gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2. Vùng nối giữa HA1 và HA2 gồm một số 
amino acid mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, đó là 
điểm cắt của protease và đây là vùng quyết định độc lực của virus [8 ]. 
Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63.103 Da (nếu không được 
glycosyl hóa) và 77.103 Da (nếu được glycosyl hóa, trong đó HA1 là 48.103 Da 
và HA2 là 29.103 Da) [ ... Haire, D. Stevens, R. Russell, S. 
Gamblin, J. Skehel, and Y. Kawaoka (2006), Haemagglutinin mutations 
responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses to human-type 
receptors. Nature, 444(7117): pp 378-382. 
152. Zeng, P., Vadnais D.A. , Zhang Z. and Polacco J.C. (2004) Refined 
glufosinate selection in Agrobacterium-mediated transformation of 
soybean [Glycine max (L.) Merrill]. Plant Cell Rep. 22: pp.478–482. 
153. Zhang, Z., Xing A., Staswick P. and. Clemente T.E (1999) The use of 
glufosinate as a selective agent in Agrobacteriummediated 
transformation of soybean. Plant Cell Tissue Organ Cult. 56: pp.37–46. 
131 
154. Zhao, Z., Shortridge K., M.G. M, Guan Y., and Wan X. (2008), 
Genotypic diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza 
viruses. J Gen Virol, 89(9): pp.2182-2193. 
155. Zhou H., Jin M., Yu Z., Xu X., Peng Y., Wu H., Liu J., Liu H., Cao 
S., and Chen H. (2007), Effective small interfering RNAs targeting 
matrix and nucleocapsid protein gene inhibit influenza A virus 
replication in cells and mice. Antiviral Res, 76(2): pp.186-193. 
156. Zyprian E. and Kado C.I (1990), “Agrobacterium – mediated plant 
transformation by novel mini- T- vectors in conjunction with a high- 
copy vir region helper plasmid”. Pant Mol. Biol, 15, pp . 245 – 256. 
i 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết 
quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày 
trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các Tạp chí khoa 
học chuyên ngành và trong Kỷ yếu Hội nghị Khoa học-Công nghệ với sự 
đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố 
trong bất kỳ công trình nào khác. 
Tác giả 
Nguyễn Thu Hiền 
ii 
LỜI CẢM ƠN 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Chu 
Hoàng Hà đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi 
trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. 
Tôi xin cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, xin chân 
thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn cùng toàn thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào 
thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt những kinh 
nghiệm quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án. 
Xin cảm ơn sự giúp đỡ của nhóm nghiên cứu và các đồng nghiệp. 
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm cùng tập thể cán 
bộ Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận 
lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận án. 
Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Sinh-Kỹ thuật Nông nghiệp và Phòng 
Quản lý sau đại học, trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, xin 
cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Sư phạm và lãnh đạo Đại học Thái Nguyên. 
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Ban chủ nhiệm khoa Khoa 
học cơ bản, Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược – Đại học Thái Nguyên. 
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong 
suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận án này. 
 Nghiên cứu sinh 
 Nguyễn Thu Hiền 
iii 
MỤC LỤC 
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................................................................... 1 
1. Đặt vấn đề .............................................................................................................................................................................. 1 
2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................................................................... 2 
3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................................................................................. 2 
4. Những đóng góp mới của luận án ................................................................................................................ 3 
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ......................................................................................................................... 4 
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................................................... 5 
1.1. BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1 ....................................................... 5 
1.1.1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5N1 ................................................................... 5 
1.1.2. Virus cúm A/H5N1 ............................................................................................................................................ 6 
1.2. VACCINE PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM A/H5N1 ............................................................ 19 
1.2.1. Các loại vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 ..................................................... 19 
1.2.2. Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 ................... 22 
1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG NGHIÊN CỨU SẢN 
XUẤT VACCINE THỰC VẬT ............................................................................................................................ 27 
1.3.1. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương .............................................................................. 27 
1.3.2. Thành tựu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong chọn giống đậu tương................. 39 
1.3.3. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu sản xuất vaccine thực 
vật ...................................................................................................................................................................................................... 44 
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 49 
2.1. VẬT LIỆU ................................................................................................................................................................... 49 
2.1.1. Nguyên liệu thực vật .................................................................................................................................... 49 
2.1.2. Chủng vi khuẩn và các loại vector ................................................................................................ 49 
2.1.3. Hóa chất ..................................................................................................................................................................... 49 
2.1.4. Thiết bị ........................................................................................................................................................................ 49 
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................................................... 50 
2.2.1. Nhóm phương pháp sử dụng để thiết kế vector chuyển gen.................................. 51 
iv 
2.2.2. Các phương pháp sử dụng trong xây dựng mô hình tái sinh và chuyển gen in 
vitro ................................................................................................................................................................................................... 57 
2.2.3. Phương pháp phân tích cây chuyển gen .................................................................................. 62 
2.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THÀNH LUẬN ÁN............................ 63 
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................... 64 
3.1. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN HA VÀ ĐOẠN 
GEN HA1 CỦA VIRUS H5N1 ......................................................................................................................... 64 
3.1.1. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang gen HA ...................................................... 64 
3.1.2. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen HA1 ................................... 79 
3.2. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN MANG ĐOẠN 
GEN HA1 .................................................................................................................................................................................. 87 
3.2.1. Phát triển hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở hai giống đậu tương 
ĐT12 và DT84 ..................................................................................................................................................................... 87 
3.2.2. Kết quả chuyển gen gus vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn ................ 95 
3.2.3. Kết quả chuyển cấu trúc đoạn gen HA1 vào cây đậu tương ........................ 100 
3.3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN MANG 
ĐOẠN GEN HA1 ......................................................................................................................................................... 102 
3.3.1. Phân tích sự có mặt của đoạn gen HA1 ở các dòng cây đậu tương 
chuyển gen ở thế hệ T0 ............................................................................................................................................. 102 
3.3.2. Phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 ............................. 104 
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................................................................. 108 
CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ........................ 110 
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................................................. 111 
v 
DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 
AS Acetosyrigone 
A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens 
BAP 6-benzyladenine purin 
bp Base pair 
CCM Cocultivation medium 
DNA Deoxyribonucleic acid 
dNTP Deoxynucleoside triphosphate 
đtg Đồng tác giả 
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid 
E. coli Escherichia coli 
GA3 Gibberellic acid 
GM Môi trường nảy mầm 
gus Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase 
IAA Indoleacetic acid 
IBA Indole-3-butyric acid 
kb Kilo base 
LB Luria and Bertani 
MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) 
NAA α-Naphthaleneacetic acid 
nptII Neomycin phosphotransferase gene 
OD Optical density 
PCR Polymerase Chain Reaction 
PPT Phosphinothricin 
RM Môi trường ra rễ 
SDS Sodium dodecylsulfat 
vi 
SIM Môi trường tạo chồi 
SEM Môi trường kéo dài chồi 
Taq Thermus Aquaticus 
T-DNA Vùng DNA plasmid chuyển vào thực vật 
Ti- plasmid Plasmid tạo khối u 
T0, T1, T2 Các thế hệ cây đậu tương chuyển gen 
T0 Cây đậu tương chuyển gen tái sinh từ chồi 
T1 Hạt của cây chuyển gen T0 nảy mầm thành cây T1 
T2 Hạt của cây chuyển gen T1 nảy mầm thành cây T2 
Vir Virulence Region 
v/p vòng/phút 
X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide 
YEP Yeast extract peptone 
vii 
DANH MỤC BẢNG 
TT Tên bảng Trang 
Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 51 
Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 51 
Bảng 2.3 Thành phần phản ứng ligation 53 
Bảng 2.4 Thành phần hóa chất tách plasmid 53 
Bảng 2.5 Thành phần phản ứng LR 55 
Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế 56 
Bảng 2.7 Thành phần môi trường nuôi khuẩn 57 
Bảng 2.8 Thành phần các loại môi trường tái sinh in vitro 58 
Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi XhoI-HA/HindIII-HA 67 
Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi XhoI-HA1/HindIII-HA1 79 
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng nảy 
mầm hạt 
88 
Bảng 3.4 Kết quả tái sinh đa chồi trên các môi trường chứa BAP 
nồng độ khác nhau 
91 
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của GA3 và IAA đến khả năng kéo dài chồi 92 
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ 94 
Bảng 3.7 Kết quả chuyển gen gus vào nách lá mầm đậu tương 
thông qua vi khuẩn A. tumefacines 
96 
Bảng 3.8 Khả năng tái sinh thông qua nách lá mầm của giống đậu 
tương ĐT12 sau khi biến nạp cấu trúc gen HA1 
102 
viii 
DANH MỤC HÌNH 
TT Tên hình Trang 
Hình 1.1 Hình thái, mô hình cấu tạo, cấu trúc ribonucleoprotein 
của virus cúm A/H5N1 
11 
Hình 1.2 Mô hình cấu trúc protein Hemagglutinin 15 
Hình 1.3 Sơ đồ xâm nhiễm của virus cúm A/H5N1 trong tế bào chủ 18 
Hình 1.4 Khối u thực vật do A. tumefaciens 30 
Hình 1.5 Cấu trúc Ti- Plasmit 32 
Hình 1.6 Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens 34 
Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 50 
Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tương 60 
Hình 3.1 Trình tự (A) và cấu trúc của đoạn gen nhân tạo 
(SLHEP) (B) 
65 
Hình 3.2 Trình tự gen HA đã được thay đổi mã bộ ba (HAop) 67 
Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen 
HAop bằng XhoI-HA/HindIII-HA (M: Thang DNA 
chuẩn 1kb) 
68 
Hình 3.4 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel 69 
Hình 3.5 Sơ đồ thí nghiệm ghép nối gen HA/HA1 vào vector 
p201-SLEHP tạo p201-SLEHP-HA/HA1 
70 
Hình 3.6 Hình ảnh kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli 71 
Hình 3.7 Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả chọn dòng plasmid 
tái tổ hợp p201-SLHEP-HAop 
72 
ix 
Hình 3.8 Sơ đồ thiết kế cấu trúc p201-HA/HA1 vào vector 
pPhaso-dest tạo pPhaso-dest-HA/HA1 
73 
Hình 3.9 Hình ảnh điện di kiểm tra vector tái tổ hợp pPhaso-HAop 75 
Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra vector biến 
nạp trong chủng A. tumefaciens CV58 
76 
Hình 3.11 Sơ đồ mô tả sự tái sinh và chuyển gen HA ở cây thuốc lá 78 
Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra gen chuyển 
HAop trong cây thuốc lá 
78 
Hình 3.13 Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen 
HA1 bằng XhoI-HA/HindIII-HA (M: Thang DNA 
chuẩn 1kb) 
80 
Hình 3.14 Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của 
đoạn gen HA1op 
81 
Hình 3.15 Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả chọn dòng plasmid 
tái tổ hợp p201-SLHEP-HA1 
83 
Hình 3.16 Hình ảnh điện di kiểm tra vector chuyển gen mang cấu 
trúc pPhaso-SLEHP-HA1 
84 
Hình 3.17. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra vector biến 
nạp trong chủng CV58 
85 
Hình 3.18 Kết quả điện di sản phẩn PCR kiểm tra cây thuốc lá 
chuyển gen HA1 
86 
Hình 3.19 Hạt nảy mầm sau các thời gian khử trùng khác nhau 89 
Hình 3.20 Cụm chồi tạo được sau 4 tuần nuôi cấy trên SIM 91 
Hình 3.21 Cụm chồi trên môi trường kéo dài SEM 93 
x 
Hình 3.22 Đậu tương tái sinh đa chồi (A) và chọn lọc cây chuyển 
gen trên môi trường chứa kháng sinh kanamycine (B) 
96 
Hình 3.23 Biểu hiện gen gus trên cây đậu tương chuyển genA, B: 
lá mầm hạt non; C, D: mảnh lá; A, C: cây không 
chuyển gen; B, D: cây chuyển gen; E: cây đậu tương 
mang gen gus 
97 
Hình 3.24 Sơ đồ mô tả quy trình tái sinh phục vụ chuyển gen ở 
cây đậu tương ĐT12 
99 
Hình 3.25 Quy trình chuyển gen ở giống đậu tương ĐT12 101 
Hình 3.26 Các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 được trồng 
trong nhà lưới 
102 
Hình 3.27 Phân tích cây đậu tương chuyển gen mang đoạn gen 
HA1op ở thế hệ T0 
103 
Hình 3.28 Phân tích sản phẩm PCR bằng cặp mồi đặc hiệu XhoI-
HA/ HindIII-HA với các dòng cây đậu tương thế hệ T1 
105 
Hình 3.29 Phân tích protein HA1op trong hạt đậu tương chuyển 
gen bằng western blot 
106